Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка и стандартизация липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом, полученных на основе природных триацилглицеринов

На правах рукописи

0

Павлов Игорь Артурович

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИПОСОМ С 4-ТИОУРЕНДОИМИНОМЕТИЛПИРИДИНИЙ ПЕРХЛОРАТОМ, ПОЛУЧЕННЫХ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ-2010

003493713

Диссертационная работа выполнена в Байкальском институте природопользования Сибирского отделения РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Раднаева Лариса Доржиевна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

профессор

Николаева Галина Григорьевна

кандидат химических наук, доцент Корсун Лариса Николаевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» Федерального агентства по образованию

Защита состоится « 08 » апреля 2010 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул.Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте Института общей и экспериментальной биологии СО РАН http://igaeb.bol.ru

Автореферат разослан «^>> марта 2010г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук

Хобракова В.Б.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В России за последние десятилетия возросла заболеваемость населения туберкулезом. По данным информационного центра Министерства здравоохранения Бурятии следует, что республика входит в число неблагополучных регионов России по уровню заболеваемости населения туберкулезом. В городе Улан-Удэ превышение эпидемического порога наблюдали в 1995 году, а к 2009 году число заболевших увеличилось и составило 154,8 чел. на 100 тысяч населения, что значительно превышает среднероссийский уровень. Особенно высока заболеваемость детей до 17 лет - 61,9 чел. на 100 тысяч детского населения, что в 4 раза выше аналогичного показателя по России (пресс-служба администрации г. Улан-Удэ). Одним из факторов, сдерживающих улучшение ситуации, является прерывание курса химиотерапии или снижение доз туберкулостатических препаратов из-за их высокой токсичности и развития побочных реакций со стороны желудочно-кишечного тракта, печени, почек, иммунной системы и т.д.

В Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН совместно со специалистами Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ разработано новое высокоэффективное противотуберкулезное средство в виде таблеток: 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат. Средство эффективно действует против микобактерий туберкулеза и активность его по отношению к отдельным штаммам туберкулеза в 200 и 400 раз выше, чем у стандартных лекарственных средств, токсичность его в 2,4 и 1,9 раза меньше изониазида и стрептомицина; установлено отсутствие мутагенности. Несмотря на перечисленные преимущества, данное средство обладает умеренной токсичностью, что может негативно отразиться при курсовом лечении больных туберкулезом.

В связи с этим актуальным представляется разработка липосом с включением указанного противотуберкулезного средства, обогащение липосом полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) природного происхождения (из жира сурка и кедрового масла, широко используемых в народной медицине при лечении туберкулеза), что значительно повысит фармакотерапевтическое влияние и снизит его токсичность. По своей химической природе ПНЖК близки к кислотам, входящим в структуру клеточной мембраны, т.е. являются биосовместимыми, включаются в биохимические процессы, обладают фармакологической активностью и отличаются отсутствием отрицательных реакций при длительном использовании.

Практический интерес представляет опыт народной медицины, который с давних времен при простудных заболеваниях органов дыхания использует жир сурка. Наряду с этим, известны лечебные свойства семян сосны сибирской (кедровые орехи), настойки и отвары которой обладают вяжущим, обезболивающим, противовоспалительным действием и являются потенциальным источником биологически активных веществ.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что разработка липосом на основе жира сурка и кедрового ореха с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората, позволит усилить фармакологическую активность противотуберкулезных препаратов и уменьшить их токсическое действие.

Целью настоящей работы является разработка и стандартизация липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом, полученных на основе природных триацилглицеринов.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие основные задачи:

• исследовать физико-химические характеристики подкожного, полостного и бурого жира сурка сибирского;

• получить и исследовать концентрат полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка;

• изучить физико-химические характеристики экстракта околоплодной пленки кедрового ореха;

• разработать компонентный состав липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората и вспомогательных веществ;

• разработать методики качественного и количественного определения степени включения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомы и изучить стабильность полученной композиции;

• разработать проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) и лабораторный регламент на получение липосом с содержанием 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората.

Научная новизна работы

Исследован и определен физико-химический состав подкожного, полостного и бурого жира сурка сибирского. Наибольшее содержание полиненасыщенных жирных кислот отмечено в подкожном жире (80%). Получен концентрат ПНЖК из подкожного жира сурка и установлен его химический состав. Показано, что основными компонентами концентрата являются незаменимые жирные кислоты, такие как линолевая и линоленовая. Определены основные параметры получения концентрата ПНЖК из жира сурка, обеспечивающие максимальный выход продукта.

Исследован физико-химический состав экстракта околоплодной пленки кедрового ореха; установлено наличие ПНЖК в количестве 65 %.

Разработана оптимальная композиция состава липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората.

Разработаны методики стандартизации качества липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората методом гель-проникающей хроматографии, определены средние размеры липосом методом электронной микроскопии и спектротурбидиметрии.

Установлены показатели качества, которые включены в проект нормативной документации.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

-лабораторный регламент на получение липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом;

-проект ФСП «Липосомы с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом»;

Апробация работы и публикации Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

• всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Новые технологии добычи и переработки природного сырья в условиях экологических ограничений», 26-30 июля 2004г., г. Улан-Удэ;

• научно-практической конференции Восточно-Сибирского государственного технологического университета, 18-20 апреля 2006г., г. Улан-Удэ;

• XIV Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2007», 10-12 апреля 2007 г., г. Москва;

• седьмой региональной межвузовской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 80-летию заслуженного деятеля науки РФ, профессора Б.И. Кузника и 70-летию академика РАМН В.Н. Иванова «Медицина завтрашнего дня», 15-16 мая 2008 г., г. Чита;

• III Internationa] scientific conference «Traditional medicine: a current Situation and perspectives of development», 18-22 August, 2008, Ulan-Ude;

• V школе-семинаре молодых ученных России «Проблемы устойчивого развития региона», 5-10 июня 2009 г., г. Улан-Удэ.

По результатам исследований опубликовано 12 научных работ, из них 3 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК, МО и науки РФ.

Работа выполнена в рамках исследований по программам и проектам: комплексная программа РАН «Фундаментальные науки -медицине»; проекты «Новый противотуберкулезный препарат

«Перхлозон» и его композиции с природными соединениями», «Изучение композиций противотуберкулезного препарата «Перхлозон» с природными соединениями» (РФФИ - Байкал); фант Федерального агентства по науке и инновациям №2005-РИ-111.0/003 «Выполнение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ молодыми учеными и преподавателями во время проведения стажировок в российских научно-образовательных центрах».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, экспериментальных глав, заключения, выводов, библиографии и приложения.

Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и содержит 35 рисунков, 28 таблиц. Раздел библиографии включает 124 источника, в том числе 79 отечественных работ и 45 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании данных литературы рассматривается применение, свойства полиненасыщенных жирных кислот растительного и животного происхождения. Обсуждены данные исследований жира сурка, его основные свойства и биологическая активность. Также показаны свойства и биологическая ценность кедрового ореха. Рассмотрен вопрос по антиоксидантным свойствам веществ -стабилизаторов жиров. Широко освещено использование липосом в качестве модельных систем по доставке лекарственных препаратов. Проведен сравнительный анализ о существующих химиотерапевтических средствах для лечения больных туберкулезом с оценкой их преимуществ и недостатков.

Во второй главе приведены сведения об объектах исследований, приводится аргументация используемых методов и приборов, а также другие данные методического характера, применяемых в работе.

В третьей главе представлены экспериментальные данные по физико-химическому исследованию природных триацилглицеринов: жира сурка сибирского, экстракта выделенного то оболочки кедрового ореха. Проведен сравнительный анализ их качественного и количественного состава.

Глава четвертая посвящена технологии получения липосом с включением противотуберкулезного средства

4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората. Разработаны методики качественного и количественного содержания 4-

т иоу ре н до Ii м н но м етил п ир иди н и й перхлората в липосомах, на основании которых разработана схема получения экспериментальных серий готовых форм препарата.

Основное содержание работы Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили жир сурка сибирского (Marmota sibirica Radde) трех видов: подкожного, полостного и бурого, добытых с 2003 по 2006 гг. (весеннего и осеннего периода) на территории Республики Бурятии; густой экстракт околоплодной пленки кедрового ореха получен из Иркутского института химии им. А.Е.Фаворского СО РАН.

Определение показателей качества объектов проводили по общепринятым тестированным методикам РФ.

В качестве исходного лекарственного вещества в работе использовано новое противотуберкулезное средство, разработанное в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН совместно со специалистами Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ, 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат:

*г\ ©

HN у— ch=n-nh-c-nh2 ■ сю4

S

ИК-спектры жира регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре марки IFS25. Спектры ЯМР записывали на приборе Bruker DPX-400 в CDC13 при 26°С. Для исследования качественного и количественного состава объектов использовали газо-хромато-масс-спектрометрическую (ГХМС) систему Agilent 6890/5973N. Количественное и качественное исследования 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent Technologies 1200 Series, укомплектованном масс-спектрометрическим детектором типа ионная ловушка Ion Trap LS/MS 6330. Размеры липосом оценивали с помощью микроскопа марки MC-300(TFXS), Fluorescent System Set. Концентрацию инкапсулированного противотуберкулезного средства определяли на УФ-спектрофотометре марки Apel PD 303 UV.

Результаты исследования Исследование физико-химических характеристик жира сурка (ЖС) сибирского. Жир сурка сибирского представляет собой светло-желтую жировую ткань, плавящуюся на воздухе уже при комнатной температуре, со специфическим вкусом и слабым запахом.

Изучены физико-химические показатели различных видов жировой ткани сурка сибирского: подкожный, полостной и бурый (табл. 1). Найденные высокие значения йодных чисел образцов свидетельствуют о высокой степени ненасыщенности жира, а низкие значения кислотных и

перекисных чисел - о хорошем качестве жира. Меньшие значения йодных чисел для бурого жира по сравнению с остальными видами жира свидетельствуют о более низкой степени его ненасыщенности. При сравнительном анализе жировой ткани животных разного пола различий по исследованным физико-химическим показателям не выявлено.

Таблица 1

Физико-химические показатели жира сурка сибирского _(Marmota sibirica Radde)__

Показатель Самец (Подкожный/ Полостной/ Бурый) Самка (Подкожный/ Полостной/ Бурый)

Цвет Запах Йодное число. г/100г Перекисное число, г/100 1г Кислотное число Число омыления светло-желтый/ светло- желтый/бурый слабый, специфический 110/108/72 0,04/0,09/0,19 0,5 188,85 светло-желтый/све гло- желтый/бурый слабый, специфический 112/109/75 0,03/0,07/0,15 0,5 188,35

Методом ГХМС определен жирнокислотный состав жира сурка и идентифицировано 36 высокомолекулярных жирных кислот (ЖК), установлено, что в наибольшем количестве содержаться следующие кислоты: С16:0, С16:1п7, С18:1п9, С18:1п11, С18:2п6, С18:ЗпЗ (табл. 2). Как видно из полученных данных, в жире сурка содержится необычно высокое для наземных животных количество ненасыщенных жирных кислот (до 80%), что подтверждает биологическую ценность данного продукта.

Таблица 2

Процентное содержание основных жирных кислот жира сурка сибирского

(Marmota Sibirica Radde).

Кислоты Подкожный жир, (%) Полостной жир, (%) Бурый жир, (%)

Гексадекановая, С16:0 16,58±0,20 15,87+0,52 18,39±0.61

Цис-7-гексадеценовая, С16:1п7 1,53±0,00 1,41±0,12 1,32±0,09

Цис-9-октадеценовая, С18:1 п9 48,23±0,05 50,56±1,66 52.01 ±0,51

Цис-П-октадеценовая, С18:1п11 1,89±0,01 2,00±0,21 3,18±0,28

Цис-9,12-октадекадиеновая, С18:2п6 8,19±0,02 7,78±0,43 7,22±0,37

Цис-9,12,15-октадекатриеновая, С18:ЗпЗ 15,77±0,04 15,90+0,94 12,05±1,14

£ насыщенных жирных кислот 18,17 18,26 20,90

£ мононесыщенных жирных кислот 57,30 56,57 58,54

£ полинесыщенных жирных кислот 23,94 24,54 20,04

Данные жирнокислотного состава, полученные с помощью ГХМС, были обработаны с использованием метода главных компонентов (МГК) для представления в наглядной форме результатов эксперимента. Этот проекционный метод статистического анализа позволяет интегрировать информацию обо всех объектах и показателях одновременно в п-мерном

пространстве и получить график, который является проектированием всех образцов на двумерную систему, где оси системы - первая и вторая (или третья) главные компоненты (ГК).

Основываясь на вышеописанном подходе и используя программный пакет Sirius® фирмы Pattern Recognition Systems, построили модель для анализа состава жирных кислот по видам жировой ткани (рис.1).

ПС2 (13.6%)

Подножный жир

Полостной жир

net («,ич

ГК2 05.5%)

Подножный жир

Бурый жир

IX« («Л*)

а) 6)

Рис.1. Метод главных компонентов: а) распределение образцов подкожного и полостного жира сурка сибирского; б) распределение образцов подкожного и бурого жира сурка сибирского.

На рис. 1а показана проекция точек данных, полученных в результате измерения содержания 36 ЖК для каждого вида подкожного и полостного жира 14 особей, где первая ГК описывает 49,0% данных, а вторая ГК - 13,6%. На рис.1б приведена проекция точек данных для подкожного и бурого жиров, где первая ГК описывает 48,8% данных, а вторая ГК - 15,5%. Обработка полученных данных МГК позволяет выявить различия жирнокислотного состава образцов жира. Согласно приведенным данным степень ненасыщенности зависит от вида жира. При этом, чем ближе к поверхности тела сурка залегает жир, тем больше в нем ненасыщенных жирных кислот, биологически наиболее активных, и ниже температура его плавления. Таким образом, подкожный жир содержит больше непредельных жирных кислот, чем внутренний и бурый, что подтверждено методом ГХМС (табл. 2).

Разработка и оптимизация метода получения концентратов полиненасыщенных жирных кислот из подкожного жира сурка сибирского. Для получения концентратов ПНЖК наиболее оптимальным методом является комплексообразование жирных кислот с мочевиной. Насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты образуют комплексы с мочевиной, которые в дальнейшем выкристаллизовываются

на холоду и отделяют фильтрованием при обычных условиях (Haagsma и др. (1982) и КаШауаке и др. (1988)). На выход продукта при использовании данного метода влияют три основных фактора: отношение мочевины к свободным жирным кислотам (СЖК), время кристаллизации и температура кристаллизации.

Получение свободных жирных кислот из жира проводили согласно схеме представленной на рисунке 2. Жир омыляли под слоем газообразного азота водно-этанольным раствором едкого кали. Неомыляемую фракцию экстрагировали гексаном, а омыляемую фракцию регенерировали соляной кислотой, после чего проводили обработку гексаном. Растворитель отгоняли на роторном испарителе при температуре кипения. Полученные СЖК в герметичном сосуде хранили под слоем аргона при температуре от 0 до +4°С для дальнейшего использования.

КОНр-р

'Жир гтпкяш^пвсктв

95% этанол Г

ц

Вода

Гексам ! Ч

ч

р-р на Ш

Д«фн«гмаш1яп(\а слоем аргона

еремшшвпние

к

Экстракциях I Водная фракция

Подселение <рН»1 -О >

>п.........

} Разделение фракций на детшельноАг воронке

I

£<теод н ы й Геьслновля фр акщ и

-1

фгртътряцнч

I

Фильтрат 1

Гекхановая фракция

Водна* фракция

гидрат N»2504

Выпаривание

I

СуоДоднце жчтиыг

КНГЛОТЫ

Рис. 2. Схема получения свободных жирных кислот из жира сурка сибирского.

Разделение кислот по степени ненасыщенности из смеси гидролизованных жирных кислот ЖС проводили методом комплексообразования с мочевиной согласно схеме, представленной на рисунке 3. Полученные кристаллы, карбамиднокомплексную фракцию

(ККФ), отделяли от жидкости, некарбамиднокомплексной фракции (НККФ), фильтрованием на воронке Бюхнера.

ПНЖК экстрагировали из НККФ гексаном после регенерации их соляной кислотой. Смесь насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот из ККФ выделяли тем же способом. Растворитель (гексан) отгоняли на роторном испарителе.

Полученные фракции взвешивали и рассчитывали процентный выход продукта. Жирнокислотный состав полученного продукта определяли методом ГХМС.

Своводнмгжпрнмгыклотм

| Выпари&анпе [—| | Выпаривание |

| Гексан ^ ^ Гексан

Кздбмин. комдтгктая Нгеарвммдно^.шккшая

«»ямдиКИР »цякщмНККЧ;

Рис. 3. Схема получения концентратов полиненасыщенных жирных кислот из ЖС.

Для оптимизации метода получения концентратов ПНЖК из жира учитывали влияние трех переменных: отношение мочевины к СЖК, время кристаллизации и температура кристаллизации, что позволяло аргументировать параметры, при которых достигается максимальное содержание ПНЖК в полученном концентрате. Полученные данные по оценке влияния каждого параметра на выход продукта позволили сделать вывод о том, что наилучшими условиями, при которых концентрация

ПНЖК в концентрате достигает 67%, являются - отношение мочевины к СЖК - 4:1 (рис. 4, а.); время кристаллизации - 24 часа (рис. 4, б.); температура кристаллизации - -10°С (рис. 4, в.).

а) ге б) га,

5 и ® м

45

ночевина/жирные мспогы

в) 75

3"

3 *

1С II 12 13 И 1& 10 17 10 19 20 21 2? 23 24 2Ь 26

Время(часы)

\

Я за -15 -10 5 Ч о

%пкрпур<(С) \

Рис. 4. Зависимость выхода продукта: а) ог отношения мочевины к жирным кислотам: 6) от времени кристаллизации; в) от температуры кристаллизации.

При исследовании жирнокислотного состава полученного концентрата методом ГХМС, выявлен широкий спектр ПНЖК; при этом в наибольших количествах в составе концентрата содержатся линолевая и линоленовая кислоты: 21,7% и 45,3 % соответственно (рис. 5).

Пию пемо вея

кислот»

Кислот* * 1 **

1 и , 1 а.. . — ..

Рис. 5. Хроматограмма концентрата ПНЖК, выделенною из подкожного жира сурка сибирскою (ГХМС).

Определение физико-химических характеристик экстракта околоплодной пленки кедрового ореха. Околоплодная пленка кедрового ореха является одним из основных отходов при обработке кедрового ореха. Разработка способа утилизации этого биологически активного сырья является важной задачей. Экстракт околоплодной пленки кедрового

ореха, полученный по методу Блайя-Дайэра, предоставлен Иркутским институтом химии им. А.Е. Фаворского СО РАН и представляет собой желтую гелеобразную субстанцию со слабым вкусом и запахом кедрового масла. Определены йодные и перекисные числа экстракта. Высокие йодные (110-120) и низкие перекисные (0,30) числа близки таковым кедрового масла (140 и 0,4 соответственно) и свидетельствуют о хорошем качестве полученного экстракта (табл. 3).

Таблица 3

Физико-химические показатели экстракта околоплодной пленки

кедрового ореха

Показатель Характеристика

Цвет Запах Йодное число, г/100г Перекисное число, г/100 йода Кислотное число Число омыления желтый специфический 110-120 0.30 2,5 112

Исследование жирнокислотного состава экстракта околоплодной пленки кедрового ореха методом ГХМС выявило наличие 20 жирных кислот (табл. 4). В наибольшем количестве обнаружены С 16:0, С 18:0, С18:1п9, С18:2п9, С18:2п6, С18:3п6, С20:1п9, С21:0 кислоты.

Таблица 4

Кислоты Содержание, %

Тстрадекановая кислота, 14:0 0,0«±0,01

¡зо -пентадекановая кислота, ¡15:0 0,12±0,00

агво-пентадекановая кислота, а/15:0 0,14±0,01

Пентадекановая кислота, ¡5:0 0,07±0,01

Гексадекановая кислота, 16:0 18,42±0,28

Гексадекадиеновая кислота, 16:2п6 0,15±0,01

1яо- Гептадекановая кислота, ¡17:0 ОД5±0,01

Гептадекаиовая кислота, 17:0 0,12±0,01

9-гептадеценовая кислота, 17:1п9 0,08±0,01

Октадекановая кислота, 18:0 10,63±0,07

Цис-9-октадсценовая кислота, 18:1п9 52,74±0,46

Цис-7- октадеценовая кислота 18:1п7 0,66±0,03

Цис-5- октадеценовая кислота 18:1п5 2,21 ±0,06

Цис-9, 12-октадекадиеновая, 18:2п6 5.3Ш.38

6,9,12,15 - октадекатетраеновая кислота, 18:4пЗ 0,14±0,02

Эйкозановая кислота, 20:0 2,03±0.02

Цис-9-зйкозановая кислота, 20:1п9 2,48±0,02

Докозановая кислота, 22:0 1,19±0,02

Цис-7,10,13,16,19-Докозапентаеновая кислота, 22:5п7 0,82±0,04

Тетракозановая кислота, 24:0 2,31 ±0,10

Сумма насыщенных жирных кислот 35,36

Сумма мононесышенных жирных кислот 58,17

Сумма полииесышенных жирных кислот 6,47

Характерным для высших растений является распределение жирных кислот с преобладанием четноцепочных соединений. Пальмитиновая, олеиновая, линолевая кислоты составляют 76,52 % от всех кислот. Моно- и диеновые кислоты представлены главным образом кислотами С18, в то время как все остальные кислоты в подавляющем большинстве присутствуют в виде насыщенных структур.

Таким образом, высокое содержание ненасыщенных кислот свидетельствует о потенциальной биологической активности экстракта околоплодной пленки кедрового ореха и перспективности его использования.

Разработка способа получения и стандартизация липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората. В

качестве основного компонента для получения липосом мы использовали фосфолипиды, в первую очередь фосфатидилхолин. Основные биохимические и физико-химические характеристики, органолептические показатели фосфолипидов, полученные по стандартной методике из желтков куриных яиц, представлены в таблице 5.

Для увеличения биологической ценности липосом предложено их обогащение ПНЖК концентратов жира сурка и экстракта из кедровой околоплодной пленки.

Таблица 5

Органолептические показатели фосфолипидов, использованных для

формирования липосом.

Показатели Фосфолипиды

Запах слабовыраженный, свойственный фосфолипидам

Вкус слабовыраженный, свойственный фосфолипидам

Консистенция мазеподобная (агломерат)

Цвет от белого до светло-желтого

Экспериментальные серии образцов получали следующим образом: навеску фосфолипидов не менее 10% из расчета от содержания их в готовой форме растворяли в хлороформе, одновременно добавляя, полученный концентрат ПНЖК из подкожного жира сурка или густой экстракт выделенный из околоплодной пленки кедрового ореха, в объеме 66,7% от общего объема фосфолипидов, далее добавляли антиоксидант -а-токоферол в количестве 5% от общего количества липидов. Смесь выдерживали, периодически помешивая до полного растворения липидов.

После полного растворения липидов, проводили выпаривание хлороформа в роторном испарителе. Образовавшуюся тонкую пленку липидов на стенках колбы продували газообразным азотом или аргоном для предотвращения окисления липидов. В колбу с пленкой добавляли 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат, растворенный в трис-буфере с рН 7,4, колбу встряхивали в течение нескольких минут для

полного снятия пленки со стенок колбы и получения гомогенной суспензии. Полученную суспензию обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (Украина), не давая перегреваться смеси, так как повышение температуры отрицательно сказывается на качестве получаемых липосом.

Также на качество липосом влияет длительность ультразвуковой обработки. Как показали экспериментальные исследования, при продолжительном ультразвуковом воздействии стабильность липосом возрастает прямо пропорционально, но при этом снижается загрузка липосом, что негативно может сказаться на дозировке средства. Опытным путем установлено, что оптимальное время ультразвуковой обработки составляет 7 минут, при этом степень загрузки превышает 56% от общего количества 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората и соответствует терапевтической дозе (табл. 6).

Таблица 6

Зависимость времени ультразвуковой обработки липосом

Время, мин. 3 4 5 6 8 9 (0

Степень включения яипосом,(%) 87,0+5 80,2±3.4 76,0±4 72,0±2,5 56,514,1 45,7±3,6 27,9+4,8 22,0±2,7

Диаметр, нм 1000+150 864±98 720±98 640±69 445±55 360±50 220±48 150+36

Для стандартизации липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом были подобраны основные параметры, влияющие на качество липосомальных везикул, и предложены следующие методики исследования: 1) определение степени включения 4-тиоурендоиминометилпиридиния перхлората в липосомы; 2) определение средних размеров липосом, 3) количественное определение 4-тиоурендоиминометилпиридиния перхлората в липосомах.

Определение степени включения

4-тиоурендоиминометилпиридинш перхлората в липосомы. Степень включения - один из важнейших параметров полученных липосом и один из основных показателей качества, так как от объема включившегося вещества внутрь липосом зависит эффективность его терапевтического действия. Количество вещества определяется отношением массы вещества, ассоциированного с липосомами, к общей массе вещества, взятого для приготовления липосомальной дисперсии. Невключившееся вещество отделяется гель-проникающей хроматографией. Первая фракция, поглощающая при 310 нм, содержит нагруженные липосомы, а вторая - свободный 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат (рис. 6). Концентрацию 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомах и его степень включения рассчитывали по измерениям

оптической плотности при 310 нм после разрушения липосом 5%-ным раствором дезоксихолатом натрия.

Расчетная формула степени включения вещества в липосомы:

Ли = 0,ХУ|/(0|ХУ,+Е>2ХУ2), гДе

- оптическая плотность фракции липосом после добавления дезоксихолата натрия; Э2 - оптическая плотность фракции, содержащей невключившееся

вещество после добавления дезоксихолата натрия; V! - суммарный объем фракции липосом, мл; У2- суммарный объем фракции невключившегося вещества, мл.

(мин.)

Рис. 6. Зависимость оптической плотности от времени выхода препарата при длине волны 310 нм после гель-фильтрации.

Полученные данные позволили сделать вывод о том, что степень загрузки липосом составляет 56,53% от общего количества растворенного 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората, относительная ошибка при этом не превышает 8,91% (табл.7).

Таблица 7

Метрологические характеристики определения степени включения

4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомах

п X 5! 5 Р «РЛ Дх Е,% Я,

5 56.53 19.22 4.38 95 2.57 5.04 ±8.91 1.96

Определение средних размеров липосом. Размеры липосом определяли с помощью микроскопа МС-300(ТРХ8). На рисунке 7 хорошо заметна сферическая структура липосом, при их определении установлено, что средний размер загруженных везикул колеблется от 100 до 600 нм.

Также для определения средних размеров везикул использовали метод спектротурбидиметрии. Из полученных результатов и математических расчетов, определен средний радиус липосом г = 245,22 нм, а диаметр соответственно (1 = 2г = 2x245,22 = 490,45 нм, что хорошо согласуется с данными электронной микроскопии.

Рис.7. Микрофотографии липосом (увеличение 10х10(>).

Определение 4~тиоурендоиминометштиридиний перхлората в липосомах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для подтверждения качественного состава инкапсулированного в липосомальную оболочку 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората использован метод ВЭЖХ (после разрушения липосом дезоксихолатом натрия). Полученная хроматограмма и масс-спектры высвобожденного соединения (рис. 8, а, б) с применением стандартного раствора 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората (рис. 8, в) позволяют сделать вывод об идентичности выделенного соединения

чистому веществу, а) "

• !

\ \

6)

в)

73 1С0 ' '12!

100 » I» (Г5 2Са„

Рис. 8. Данные полученные методом ВЭЖХ. а) хроматограмма 4-тноурендоиминометиллирилиний перхлората после разрушения липосом; б) масс-спекгр анализируемой пробы; в) масс-спектр стандартного раствора 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората

Разработка методик количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомах. Наличие системы сопряжения в структуре 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората обусловливает сильный батохромный сдвиг в электронном спектре поглощения и соответственно желтую окраску вещества, а также значительную величину удельного показателя экстинкции в максимумах поглощения. Это позволяет использовать для количественного и качественного определения данного вещества метод УФ-спектрофотометрии. Концентрацию инкапсулированного

противотуберкулезного средства определяли на УФ-спектрофотометре марки Аре1 РО 303 11У, после разрушения липосомальной оболочки при длине волны 310 нм.

Количественную оценку содержания 4-

тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомах проводили спектрофотометрическим методом после разрушения липосомальной оболочки дезоксихолатом натрия (рис.9).

При расчете процентной концентрации (X) 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в растворах формула имеет вид:

оци-'юо

где, £> - оптическая плотность испытуемого раствора;

е - удельный показатель экстинкции для данного раствора;

К - объем лекарственной формы, взятый для разведения, мл;

К/ - общий объем анализируемого раствора, мл.

IV - разведение.

Рис. 9. УФ-спектры растворов 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората: 1 - стандартного раствора, 2 - раствора в образце после разрушения липосом.

Результаты количественного определения

4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората приведены в таблице 8. Из таблицы видно, что среднее значение содержания данного вещества составляет 38,996%, относительная ошибка не превышает 0,350%.

Таблица 8

Результаты количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората после разрушения липосомальной оболочки методом УФ-спектрофотометрии

Масса Найдено, Метрологические характеристики (п = 5, Р = 95%)

навески.г % Х% Б 8 Дх К.% 5.4

0,15 38,850

0.15 38,990

0.15 39,170 38,996 0,014 0,118 2,571 0.136 ±0,350 0,053

0,15 38,940

0.15 39,030

Также количественное определение указанного

противотуберкулезного средства проводили методом ВЭЖХ. Для разработки методики количественного определения был применен метод калибровочного графика. Хроматограммы, полученные при различном объеме вводимой пробы - от 1 до 5 мкл (содержание компонента при этом составило от 0,15 до 0,75 мкг), показаны на рисунке 10. Установлено, что в области рабочих концентраций определяемого вещества наблюдается линейная зависимость площади пика от содержания 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в растворе (рис. 11).

.........

Рис.10. Хроматограммы, полученные при различном объеме вводимой пробы раствора 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората от I до 5 мкл.

5000 1000 зооо 2000 • 1000

о .

о

а, мкг

Рис.11. Калибровочный график для определения содержания 4-тиоурендоиминометилииридиний перхлората.

Количественное определение 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората определяли с помощью градуировочного коэффициента. Результаты, полученные по разработанной методике, представлены в таблице 9. Из таблицы следует, что среднее значение содержания данного вещества составляет 39,028%, относительная ошибка при этом не превышает 0,330%.

Таблица 9

Результаты количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората после разрушения _ липосомальной оболочки методом ВЭЖХ _

Масса навески, г Найдено, % Метрологические характеристики (п = 5, Р = 95%)

Х% Б2 Я «РЛ) Дх Е.%

0,15 38,930 39,028 0,012 0,111 2,571 0,128 ±0,330 0,050

0.15 39,000

0,15 39,200

0,15 38,940

0,15 39,070

Сравнительная оценка результатов количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората спектрофотометрическим методом и методом ВЭЖХ показала, что оба метода дают хорошо воспроизводимые результаты, погрешность определения спектрофотометрическим методом составляет 0,350%, а методом ВЭЖХ -0,330%. Разработанные методики с применением УФ и ВЭЖХ валидированы, с помощью статистических методов доказаны их правильность, достоверность, воспроизводимость.

Технологическая схема производства липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората. Установлены нормы качества липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом. Проведено исследование по установлению сроков годности препарата.

По разработанной технологической схеме (рис. 12) получали пять серий липосом с однородной структурой и размерами. При хранении в течение 8 месяцев изменений внешнего вида суспензии, количества и качества липосом с включенным 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом не обнаружено. Определение показателей качества липосом проводили ежемесячно при условиях хранения: температура от 0 до +4°С, относительная влажность не более 70%.

В разработанные проекты нормативных документов (ФСП, лабораторный регламент) включены следующие показатели качества липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом: описание внешнего вида, подлинность, средний размер везикул, степень включения вещества в липосомы.

Концентрат ПНЖК

Фосфолилиды--

Токоферол —1

Приготовление л ипидной пленки

Д-тиоурендоимино-

метилпиридиний

перхлорат

Вода Трис-буфер —

Органические вещества

Растворение 4-тиоурендоимино-метилпиридиний перхлората

ТП Приготовление

1. коллоидного

раствора

4-тмоурендоимино-

метилпирадиний

перхлората

ТП Ультразвуковая

обработка

коллоидного раствора

4-тиоурендоимино-

метилпиридиний

перхлората

Центрифугирование коллоидного раствора 4-тиоу ренд оимино-метилпиридиний перхлората

Фильтрация супернзтанта

ТП

Приготовление лмпосомс 4-тиоурендоимино-метилпиридиний перхлоратом

Не прореагировавшие вещества

УМ С Фасовка и упаковка коллоидного растЕора 4-тиоурендоимино-метиллиридиний перхл ората

л

На склад

Потери

Рис. 12. Технологическая схема производства липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората

Выводы

1. Определены физико-химические характеристики и химический состав триацилглицеринов жира сурка сибирского трех видов: подкожного, полостного и бурого; установлено, что в качестве сырья для получения концентрата ПНЖК наиболее перспективным является подкожный жир.

2. Оптимизировано получение концентрата ПНЖК из подкожного жира сурка методом комплексообразования с мочевиной.

3. Установлены физико-химические показатели и исследован жирнокислотный состав экстракта густого, полученного из околоплодной пленки кедрового ореха и показано, что экстракт имеет близкий химический состав к липидам кедрового масла.

4. Разработан способ получения липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиния перхлората и концентратов ПНЖК из жира сурка сибирского и околоплодной пленки кедрового ореха.

5. Разработаны методики качественного и количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиния перхлората в липосомах.

6. На основании полученных результатов разработаны технологическая схема производства липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом и проекты нормативных документов: фармакопейная статья предприятия и лабораторный регламент на данную готовую форму.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хобракова, В.Б. Влияние перхлозона и его липосомальной формы на состояние иммунной системы организма / В.Б. Хобракова, С.М. Николаев, И.А. Павлов, Л.Д. Раднаева, Е.С. Аверина, Г.В. Долгушин, H.A. Тыхеева, Б. Б. Бадмаев, Б.Г. Сухов, Г.Н. Малханова // Сибирский медицинский журнал. - Иркутск, 2007. -№8. - С. 25-27.

2. Павлов, И.А. Исследование жирнокислотного состава жира сурка сибирского (Marmota sibirica Radde) / И.А. Павлов, Л.Д. Раднаева, Н.Б. Болданова, С.М. Николаев, Е.С. Аверина, Б.Б. Бадмаев, Е.А. Хамидулина // Химия в интересах устойчивого развития. - Новосибирск, 2008. - т. 16. №2. - С. 203-207.

3. Самбуева, З.Г. Влияние липосомальной формы перхлозона на морфо-функциональное состояние печени и почек у белых крыс / З.Г. Самбуева, Г.Н. Малханова, И.А. Павлов, С.М. Гуляев, А.Г. Мондодоев, С.М. Николаев, Л.Д. Раднаева // Сибирский медицинский журнал. - Иркутск, 2009. - №4. - С. 24-26.

4. Хамидулина, Е.А. Жир сурка как источник биологически важных веществ / Е.А. Хамидулина, Е.А. Гапоненко, Л.Д. Раднаева, И.А. Павлов, Б.Г. Сухов // Химический журнал Казахстана, 2007. - №16. - С.272-274.

5. Павлов, И.А. Исследование жира сурка и разработка лекарственного препарата на его основе и "Перхлозона" / И.А. Павлов, A.B. Цыренжапов, Е.С. Аверина, В.Б. Хобракова, А.Г. Мондодоев, H.A. Тыхеева, Б.Б. Бадмаев, С.М. Николаев, Л.Д. Раднаева // Материалы Всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Новые технологии добычи и переработки природного сырья в условиях экологических ограничений» 26-30 июля 2004 г. г. Улан-Удэ. - С. 156-159.

6. Цыренжапов, A.B. Оценка гепатопротекторной активности перхлозона в липосомальной форме / A.B. Цыренжапов, И.А. Павлов, H.A. Тыхеева, Е.С. Аверина // Материалы Всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Новые технологии добычи и переработки природного сырья в условиях экологических ограничений». 26-30 июля 2004г. г. Улан-Удэ. -С. 166-169.

7. Павлов, И.А. Исследование физико-химического состава жира сурка сибирского (Marmota-sibirica) / И.А. Павлов, Л.Д. Раднаева, И.В. Звонцов, Б.Б. Бадмаев // Научно практическая конференция Восточно-Сибирского

государственного технологического университета, г. Улан-Удэ, 18-20 апреля 2006г.

8. Павлов, И.А. Разработка противотуберкулезных препаратов на основе природного сырья / И.А. Павлов, Л.Д. Раднаева, С.М. Николаев, Б.Б. Бадмаев, Е.А. Хамидулина // Материалы IV школы-семинара молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона». 4-8 июня 2007г., г. Улан-Удэ. - С. 146-147.

9. Павлов, И.А. Перспективы использования жира сурка сибирского для получения лекарственных препаратов / И.А. Павлов // XIV Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2007» 11-14апреля 2007г. г. Москва - С 455.

10. Гуляев, С.М. Влияние перхлозона в липосомальной форме на морфофуикциональное состояние печени белых крыс 1 С.М. Гуляев. Г.Н. Малханова, И.А. Павлов // Материалы седьмой региональной межвузовской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 80-летию заслуженного деятеля науки РФ, профессора Б.И. Кузника и 70-летию академика РАМН В.Н. Иванова. «Медицина завтрашнего дня». 15-16 мая 2008г. г. Чита, - С. 133-134.

11. Pavlov, LA. Liposomal form of natural triglycérides with the antituberculous drug "Perkhlozon" / I.A. Pavlov, L.D. Radnaeva, Z.G. Sambueva // Materials of lhe III international scientific conférence «Traditional medicine: a current situation and perspectives of development», 18-22 August, 2008, Ulan-Ude. - P. 46-47.

12. Раднаева, Л.Д. контроль качества липосомальной формы перхлозона / Л.Д. Раднаева, В.Н. Елохина, И.А. Павлов // Материалы V школы-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона», 5-10 июня 2009 г, г. Улан-Удэ. - С. 230-232.

Подписано в печать 04.03.2010 г. формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1.4 печ. л. Тираж 100. Заказ №6.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН. 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахъяновой, 6.

Актуальность темы.

В России за последние десятилетия возросла заболеваемость населения туберкулезом. По данным информационного центра Министерства здравоохранения Бурятии следует, что республика входит в число неблагополучных регионов России по уровню заболеваемости населения туберкулезом. В городе Улан-Удэ превышение эпидемического порога наблюдали в 1995 году, а к 2009 году число заболевших увеличилось и составило 154,8 чел. на 100 тысяч населения, что значительно превышает среднероссийский уровень. Особенно высока заболеваемость детей до 17 лет - 61,9 чел. на 100 тысяч детского населения, что в 4 раза выше аналогичного показателя по России (пресс-служба администрации г. Улан-Удэ). Одним из факторов, сдерживающих улучшение ситуации, является прерывание курса химиотерапии иди снижение доз туберкулостатических препаратов из-за их высокой токсичности и развития побочных реакций со стороны желудочно-кишечного тракта, печени, почек, иммунной системы и т.д.

В Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН совместно со специалистами Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ разработано новое высокоэффективное противотуберкулезное средство в виде таблеток: 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлорат. Средство эффективно действует против микобактерий туберкулеза и активность его по отношению к отдельным штаммам туберкулеза в 200 и 400 раз выше, чем у стандартных лекарственных средств, токсичность его в 2,4 и 1,9 раза меньше изониазида и стрептомицина; установлено отсутствие мутагенности [1]. Несмотря на перечисленные преимущества, данное средство обладает умеренной токсичностью, что может негативно отразиться при курсовом лечении больных туберкулезом.

В связи с этим актуальным представляется разработка липосом с включением указанного противотуберкулезного средства, обогащение липосом полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) природного происхождения (из жира сурка и кедрового масла, широко используемых в народной медицине при лечении туберкулеза), что значительно повысит фармакотерапевтическое влияние и снизит его токсичность. По своей химической природе ПНЖК близки к кислотам, входящим в структуру клеточной мембраны, т.е. являются биосовместимыми, включаются в биохимические процессы, обладают фармакологической активностью и отличаются отсутствием отрицательных реакций при длительном использовании.

Практический интерес представляет опыт народной медицины, который с давних времен при простудных заболеваниях органов дыхания использует жир сурка. Наряду с этим, известны лечебные свойства семян сосны сибирской (кедровые орехи), настойки и отвары которой обладают вяжущим, обезболивающим, противовоспалительным действием и являются потенциальным источником биологически активных веществ.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что разработка липосом на основе жира сурка и кедрового ореха с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората, позволит усилить фармакологическую активность противотуберкулезных препаратов и уменьшить их токсическое действие.

Целью настоящей работы является разработка и стандартизация липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом, полученных на основе природных триацилглицеринов.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие основные задачи:

• исследовать физико-химические характеристики подкожного, полостного и бурого жира сурка сибирского;

• получить и исследовать концентрат полиненасыщенных жирных кислот из жира сурка;

• изучить физико-химические характеристики экстракта околоплодной пленки кедрового ореха;

• разработать компонентный состав липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората и вспомогательных веществ;

• разработать методики качественного и количественного определения степени включения 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората в липосомы и изучить стабильность полученной композиции;

• разработать проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) и лабораторный регламент на получение липосом с содержанием 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората.

Научная новизна работы

Исследован и определен физико-химический состав подкожного, полостного и бурого жира сурка сибирского. Наибольшее содержание полиненасыщенных жирных кислот отмечено в подкожном жире (80%). Получен концентрат ПНЖК из подкожного жира сурка и установлен его химический состав. Показано, что основными компонентами концентрата являются незаменимые жирные кислоты, такие как линолевая и линоленовая. Определены основные параметры получения концентрата ПНЖК из жира сурка, обеспечивающие максимальный выход продукта.

Исследован физико-химический состав экстракта околоплодной пленки кедрового ореха; установлено наличие ПНЖК в количестве 65 %.

Разработана оптимальная композиция состава липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората.

Разработаны методики стандартизации качества липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлората методом гель-проникающей хроматографии, определены средние размеры липосом методом электронной микроскопии и спектротурбидиметрии.

Установлены показатели качества, которые включены в проект нормативной документации.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- лабораторный регламент ЛР № 15-001-09 на получение липосом с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом;

- проект ФСП № 42- «Липосомы с 4-тиоурендоиминометилпиридиний перхлоратом».

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:

• всероссийской научно-технической конференции с международным участием «Новые технологии добычи и переработки природного сырья в условиях экологических ограничений», 26-30 июля 2004г., г. Улан-Удэ;

• научно-практической конференции Восточно-Сибирского государственного технологического университета, 18-20 апреля 2006г., г. Улан-Удэ;

• XIV Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2007», 10-12 апреля 2007 г., г. Москва;

• седьмой региональной межвузовской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 80-летию заслуженного деятеля науки РФ, профессора Б.И. Кузника и 70-летию академика РАМН В.Н. Иванова «Медицина завтрашнего дня», 15-16 мая 2008 г., г. Чита;

• III International scientific conference «Traditional medicine: a current situation and perspectives of development», 18-22 August, 2008, Ulan-Ude;

• V школе-семинаре молодых ученных России «Проблемы устойчивого развития региона», 5-10 июня 2009 г., г. Улан-Удэ.

По результатам исследований опубликовано 12 научных работ, из них 3 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Работа выполнена в рамках исследований по проектам: проект «Новый противотуберкулезный препарат «Перхлозон» и его композиции с природными соединениями», «Изучение композиций противотуберкулезного препарата «Перхлозон» с природными соединениями» (РФФИ - Байкал № 05-03-97209); Комплексная программа РАН «Фундаментальные науки - медицине»; грант Федерального агентства по науке и инновациям №2005-РИ-111.0/003 «Выполнение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ молодыми учеными и преподавателями во время проведения стажировок в российских научно-образовательных центрах».

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты физико-химического исследования подкожного, полостного и бурого жира сурка сибирского;

• оптимизация метода получения концентрата полиненасыщенных жирных кислот из подкожного жира сурка сибирского;

• разработка и обоснование технологии получения липосом из природных триацилглицеринов с включением 4-тиоурендоимино-метилпиридиний перхлората;

• результаты исследований стандартизации липосом с 4-тиоурен-доиминометилпиридиний перхлоратом по основным критериям подлинности и норм качества содержания основного компонента на данную готовую форму.

выводы

1. Определены физико-химические характеристики и химический состав триацилглицеринов жира сурка сибирского трех видов: подкожного, полостного и бурого; установлено, что в качестве сырья для получения концентрата ПНЖК наиболее перспективным является подкожный жир.

2. Оптимизировано получение концентрата ПНЖК из подкожного жира сурка методом комплексообразования с мочевиной.

3. Установлены физико-химические показатели и исследован жирнокислотный состав экстракта густого, полученного из околоплодной пленки кедрового ореха и показано, что экстракт имеет близкий химический состав к липидам кедрового масла.

4. Разработан способ получения липосом с включением 4-тиоурендоиминометилпиридиния перхлората и концентратов ПНЖК из жира сурка сибирского и околоплодной пленки кедрового ореха.

5. Разработаны методики качественного и количественного определения 4-тиоурендоиминометилпиридиния перхлората в липосомах.

6. На основании полученных результатов разработаны технологическая схема производства липосом с 4-тиоурендоимино-метилпиридиний перхлоратом и проекты нормативных документов: фармакопейная статья предприятия и лабораторный регламент на данную готовую форму.