Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Создание и биофармацевтическое изучение липосомальной лекарственной формы нового противоопухолевого препарата OR-2011 производного нитрозомочевины

На правах рукописи

Альбасспт Басель

СОЗДАНИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛИПОСОМАЛЫЮЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ НОВОГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА 011-2011 ПРОИЗВОДНОГО НИТРОЗОМОЧЕВИНЫ

14.04.01- технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005557952

Москва- 2015

005557952

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздрава России и Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина»

Научные руководители:

Краснюк Иван Иванович -.доктор фармацевтических наук, профессор Барышников Анатолий Юрьевич -.доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Алексеев Константнн Викторович - доктор фармацевтических наук, профессор, заместитель директора ФГБНУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова" по инновационной деятельности.

Василенко Иван Александрович - доктор химических наук, генеральный директор испытательной лаборатории ОлФарма. Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. .Ломоносова»

Защита диссертации состоится «7<f» AAqtfJä 2015 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119991, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49 и на сайте ГБОУ ВПО Первый МГМУ им.И.М. Сеченова http:// www.mma.ru

Автореферат разослан « » 2015 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время химиотерапия занимает лидирующую позицию в лечении большинства злокачественных опухолей. Новые подходы к совершенствованию химиотерапии рака сфокусированы на разработке новых систем доставки лекарств непосредственно к злокачественной клетке без повреждения нормальной ткани. Одним из наиболее многообещающих направлений в данной области является разработка липосомальных лекарственных форм новых противоопухолевых препаратов.

Поиск новых активных соединений в ряду производных нитрозоалкилмочевины связан с попытками расширить спектр их противоопухолевого действия, снизить побочные и токсические эффекты, увеличить избирательность противоопухолевого действия, а также обусловлен тем, что опухоли не обладают перекрестной резистентностью к различным представителям этой группы препаратов. Сотрудниками УрО РАН синтезирована новая субстанция 011-2011.

В связи с этим актуальным направлением исследований является создание рациональной лекарственной формы нового противоопухолевого препарата 011-2011, позволяющей обеспечить его стабильность и эффективность.

Степень разработанпостп темы исследования. В институте органического синтеза УРО РАН им. И.Я.Постовского на основе хлорэтильного производного нитрозомочевины и Ь- гомоцитруллина был создан новый оригинальный высокоэффективный отечественный противоопухолевый препарат Лизомустин. В настоящее время там же синтезирован его аналог, получивший название 011- 2011. В экспериментальных исследованиях данное вещество, на которое разработан проект ФСП, проявило высокую противоопухолевую активность.

Цель исследования. Разработка лиофилизированной стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы нового противоопухолевого лекарственного препарата OR-2011.

Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На основании технологических исследований выбрать состав лиофилизированной стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы (ЛЛЛФ) OR-2011.

2. Разработать технологию изготовления ЛЛЛФ OR-2011.

3. Определить химико-фармацевтические параметры качества для стандартизации ЛЛЛФ OR-2011. Разработать методики качественного и количественного анализа.

4. На основании проведенных исследований составить проект ФСП на липосомальной лекарственной формы нового противоопухолевого лекарственного препарата OR-2011.

5. Изучить противоопухолевую активность ЛЛЛФ OR-2011 в опытах in vitro и in vivo.

Научная новизна результатов исследования. Впервые предложен состав и разработана технология получения отечественного противоопухолевого препарата - липосомальный OR-2011 в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций. Разработан режим лиофилизации липосомальной лекарственной формы OR-2011. Разработаны методики качественного (ТСХ) и количественного анализа (спектрофотомерия) ЛФ OR-2011. В опытах in vitro и in vivo установлено противоопухолевое действие ЛЛЛФ в сравнении с субстанцией OR-2011.

Теоретическая значимость работы. В работе обоснован состав и разработаны методы получения липосом OR-2011, выбран режим сублимационной сушки липосомальной дисперсии OR-2011.

Практическая значимость результатов исследования. Технология изготовления ЛЛЛФ OR-2011 внедрена в работу лаборатории разработки

лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» и в учебный процесс кафедры фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.

Разработан проект ФСП на «OR-2011 липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 40 мп>.

Методология и методы исследования. Методологическую основу исследования составили труды российских ученых: В.П.Краснова, Н.А.Оборотовой, И.И. Краснюка, А.Ю. Барышникова, и др, работы которых в области химического синтеза, фармацевтической технологии и анализа, а также фармакологической активности позволили создать основы биофармацевтической науки.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 статьи - в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

— Результаты исследований по разработке состава и технологии изготовления ЛЛЛФ OR-2011.

— Методики качественного и количественного анализа и показатели качества ЛЛЛФ OR-2011.

— Результаты изучения цитотоксического действия ЛЛЛФ OR-2011 в опытах in vitro и противоопухолевого эффекта- in vivo.

Степень достоверности результатов. Диссертация представляет собой научно-исследовательскую работу, достоверность полученных результатов который подтверждена использованием общепринятых методик анализа и статистической обработкой полученных результатов. Выводы и положения, выносимые на защиту, обоснованы и логичны.

Апробация диссертации. Материалы проведенных исследований представлены на Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые

препараты», Минск, 23-25 мая 2013 года; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «противоопухолевая терапия: от эксперимента к клинике», Москва, 20-21 марта 2014 года.

Личный вклад автора. Автор лично участвовал в разработке состава и технологии получения ЛЛЛФ OR-2011, проводил аналитическую и статистическую обработку полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 - технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава Российской Федерации «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической технологии «Разработка научных основ технологии, стандартизации и организации производства лекарственных средств».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 листах машинописного текста, включает 11 таблиц, 32 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, Трех глав собственного исследования, выводов, приложения, библиографического указателя, включающего 206

источников, из них 103 иностранных. Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость работы. В обзоре литературы отражены состояние разработки липосомальных препаратов и способы приготовления липосом и их характеристика. Во второй главе описаны материалы и методики исследования. В третьей главе приведены данные исследования технологии изготовления липосом и результаты фармацевтического анализа липосомальной лекарственной формы препарата . В четвертый - результаты разработки методики ТСХ для качественного анализа липосомальной лекарственной формы и изучение стабильности ЛЛЛФ СЖ-2011 в процессе хранения. В пятой - результаты изучения цитотоксической активности и противоопухолевого действия лиофилизированной липосомальной лекарственной формы СШ.-2011.

Приложение включает разработанный проект ФСП «СЖ-2011 липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 40 мг».

В исследованиях использовалась субстанция OR-2011, структурная формула которого отражена на рис 1. OR-2011 синтезирован в институте органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения Российской академии наук, в работе использовали три серии субстанции OR-2011, которые соответствуют всем показателям ФСП на субстанции OR-2Q11.

рис.1. Структурная формула OR-2011 Для получения липосом использовали фосфатидилхолин (ФХ, Е PC S Lipoid GmbH, Германия), холестерин (Хол, SIGMA, Германия),

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

дистеароилфосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль-2000 (ДСФЭ-ПЭГ-2000, Lipoid GmbH, Германия).

При проведении технологических, химико-фармацевтических и биологических исследований липосомальной лекарственной формы OR-2011 использовали химические субстанции и реактивы, которые соответствовали требованиям нормативной документации (ГОСТов, ТУ, ФСП).

Технологическая схема получения липосомальной лекарственной формы ОЯ-2011 представлена на рис. 2

Рис.2. Технологическая получения ЛЛЛФ OR-2011

Получение дисперсии многослойных липосом OR-2011

Точные навески ФХ , Хол , ДСФЭ-ПЭГ-2000 переносят в колбу вместимостью 150 мл и растворяют в 8 мл хлороформе. Раствор упаривают на роторном испарителе при температуре 35 ± 2°С под вакуумом 24мм рт.ст. до образования пленки на стенках колбы и сушат в течение 40 мин под вакуумом. Отдельно берут 0,2 г навеску субстанции OR-2Q11 и растворяют в

S

10 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. С помощью этого раствора смывают липидную пленку со стенок колбы.

Получение дисперсии однослойных липосом OR-2011 Полученные 10 мл дисперсии многослойных липосом OR-2011 пропускают через мембранные фильтры фирмы "Nucleopor" с размером пор (0.4, 0.2 0,1 мкм) и экструдируют в среднем от 7 до 11 раз с помощью ручного мини-экструдера (Avanti Polar Lipids). В результате получают малые однослойные липосомы. Полученную липосомальную дисперсию разбавляют 5% раствором натрия гидроксида до значения рН=7,0 и добавляют криопротектор сахарозы 0,4 г. Далее полученные дисперсии разливают в стеклянные флаконы вместимостью 10 мл.

Определепие размера липосом Размер липосом определялют методом динамической спектроскопии светорассеяния на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США) при длине волны 632,8 нм.

Определение эффективности включения ОН-2011в липосомы Для определения включившегося в липосомы и не включившегося в везикулы лекарственного средства OR-2011 применяют метод гель-фильтрации на колонке С 10/20 «GE Healthcare» с использованием гель-сорбента Sephadex G-50. Для разделения фракций используют проточный спектрофотометр АКТА prime plus (Healthcare, Швеция), регистрацию пиков производят при длине волны 215 нм.

Количественное определение OR-2011 Количественное определение лекарственного препарата проводят методом спектрофотомерии в УФ-области на спектрофотометре Сагу 100 (Varian, Inc., Австралия), при длине волны 229±2 нм. В качестве раствора сравнения используют спирт 95%.

Изучение цптотокспческой активности Для оценки цитотоксичности субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 в лунку с клетками добавляют по 20 мкл исследуемого образца в концентрациях 0,015,

0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг/мл. Каждую концентрацию ставили в триплете. В контрольные лунки с клетками добавлялют по 20 мкл воды для инъекций. Планшеты с клетками помещают в СОг-инкубатор. Через 24, 48 и 72 ч в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора 3-(4,5 диметилтиазолил-2) -2,5 - дифенилтетразолий (МТТ) (концентрация 5 мг/мл) и инкубируют 4 ч при 37 °С в 5 % СОг-инкубаторе. После образования формазана надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют, добавляя в лунки по 200 мкл ДМСО. Планшеты помещают на 5-7 минут в термостат при температуре 37 °С. Затем планшеты встряхивают на шейкере, после чего интенсивность окрашивания среды измеряют на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций АИФР-01 «униплан» при длине волны 530 нм. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток. Для каждого препарата строят график цитотоксичности и определяют ИК50 (концентрация, вызывающая ингибирование пролиферации на 50%). Все эксперименты повторяют не менее чем 3 раза.

Определение противоопухолевого действия Противоопухолевую активность ЛЛЛФ OR-2011 изучают на мышах самках, гибридах первого поколения BDF1 (С57В1/6 х DBA/2) с подкожно растущей опухолью эпидермоидной карциномой легкого Льюиса (LLC).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка состава лппосомальнои дисперсии OR-2011 На основании предварительных исследований и анализа литературы выбраны основные компоненты состава липосом. Для изготовления липидного бислоя используют ФХ и EPCS. Хол добавляют для придания жесткости структуре бислоя и повышения стабильности структуры везикул. Для увеличения продолжительности циркуляции липосом в кровяном русле добавляют ДСФЭ-ПЭГ-2000. Молярные соотношения компонентов подбирают экспериментально. Для выбора состава ЛЛЛФ оценивают следующие критерии: размер липосом, значение рН, эффективность включения.

Влияние состава лппосом на размер, значение рН и эффективность включения

В таблице №1 представлены характеристики моделей липосомальной лекарственной формы по следующим параметрам: рН, размер липосом и эффективность включения в процентах. Как видно из таблицы 1, самая высокая эффективность включения 43± 2% и оптимальный размер везикул 122±10 нм получены в составе №6,который выбран для дальнейшего изучения.

Таблица 1

Характеристика липосомальной лекарственной формы (Ж-2011

№ Состава Молярные соотношения липидов ФХ, Хол, ДСФЭ-ПЭГ-2000 Эффективность включения (%) Значение РН Размер (нм)

1 8,6: 1,5: 0,23 26 ±2 6,8 ±0,4 150±15

2 7:4:0,15 22 ±2 7,2 ±0,2 140±14

3 8,2: 3,2:0,11 30 ±3 6,9 ±0,5 122±8

4 6,3: 1,4: 0,8 29 ±3 7,3 ±0,1 135 ±6

5 8:3,35:0,15 32 ±2 7,2 ±0,2 125 ±12

6 0,4: 7,4: 2,8 43±2 7.3±0,3 122±10

Влияние лиофплизации на размер липосомальной дисперсии (Ж-2011

Основными проблемами разработки технологии липосомальных препаратов является их нестабильность, неконтролируемое изменение размера везикул в процессе хранения, деградация липидного бислоя и внутреннего содержимого - водных растворов лекарственных соединений, вытекание включенного в липосомы лекарства, гидролитическое разрушение липидного состава или лекарственного препарата. Основным компонентом,

обеспечивающим целостность везикул в процессе высушивания, является криопротектор. Он обеспечивает снижение температуры фазового перехода липидов, входящих в состав бислоя и сохраняет их в жидкокристаллическом состоянии. В предварительных экспериментах нами было установлено, что сахароза позволяет проводить сублимационную сушку липосомальной дисперсии без больших изменений размера везикул и сохранить эффективность включения лекарственных форм. В таблице 2 показано изменение размера везикул в ЛЛЛФ 011-2011 при использовании разных соотношений сахарозы. При анализе составов 1,2 и 3 видно, что статически достоверно размер липосом после лиофилизации уменьшается приблизительно на 25 мкм.

Процесс лиофилизации проводят следующим образом: липосомальную дисперсию 011-2011 дозируют по 2 мл во флаконы вместимостью 10 мл и помещают для быстрого замораживания в морозильную камеру до температуры - 80°С. Замороженный препарат выдерживают в течение 3 часов, после этого переносят на полку лиофильной сушки и выдерживают сначала при температуре -50°С в течение 30 мин. Далее повышают температуру с -50°С до -10°С под давлением 0,525 мБар в течение 3 ч, после этого еще повышают температуру до -5°С и оставляют на 1 ч, потом опять повышают температуру уже до 0°С и выдерживают еще 1 ч. Далее повышают температуру до +20 °С под давлением 0,852 мБар и оставляют на 18 ч досушиваться в лиофильной сушке. После этого вынимают флаконы, закрывают их пробками и ставят на хранение в морозильную камеру при температуре -18 "С. Общее время сушки препарата составляет 22-23 часа.

Влияние лпофилизация на размер липосом

Таблица 2

№ Состава Молярное соотношение «суммарный липид: сахароза» Размер нм

До лиофилизация После лиофилизация

1 1:0,6 150±2 125±3

2 1:1,0 153±3 122±5

3 1:1,4 149±2 124 ±4

4 1:1,8 150±5 127 ±2

5 1:2,0 145±3 129± 5

Из таблице 2 видно, что сахароза показала хорошие результаты при использовании в процессе замораживания и лиофилизации и позволила контролировать диаметр везикул в лиофилизированой лекарственной форме. Таблица 3 Эффективность включения (СЖ-2011) в липосомы

Эффективность Метрологические

№ Составы включения (Ж-2011 в липосомы, % характеристики

1 43,05 Х= 42,7

2 43,15 Бх= 0,59686

3 42,10 Б х~= 0,266926

4 42,00 Л х"= 0,74205428

5 43,20 £ = 1,73 %

Как видно из таблицы 3, Эффективность включения составляет 42,7 ±0,10% и ошибка среднего результата не превышает 1,73%

Разработка методики спектрофотометрии для качественного и количественного анализа (ЛЛЛФ)

Процедура разработки спектрофотометрической методики количественного определения СЖ-2011 в лекарственной форме включала: 1-изучение спектра поглощения УФ излучения действующим веществом в спирте; 2- определение максимума поглощения и их интенсивности; 3-проверку соблюдения основного закона светопоглощения Бугера-Ламберта Бера; выбор рабочих концентраций исследуемых растворов, при которых оптическая плотность составляет 0,2-0,8 оптических единиц. Количественное определение ЛЛЛФ (Ж-2011 проводят методом спектрофотометрии на спектрофотометре Сагу 100. На электронном спектре поглощения спиртового разведения (0,0032 %) (Ж-2011 максимум поглощения наблюдают при 229±2 нм (рис.3), липосомальную лекарственную форму и субстанцию растворяют в спирте 95%.

1.0 -!

200 220 Z40 260 280 ^SOO

■ИЛИКй В0.1ИЫ. нм

Рис. 3. Электронный спектр поглощения спиртовых растворов субстанции 1- OR-2011, 2- ЛЛЛФ OR-2011 и 3- «пустых» липосом.

Показано, что вспомогательные ингредиенты пустых липосом не изменяют спектральных характеристик OR-2011 и практически не имеют собственного поглощения в области 229±2 нм.

Расчет содержания OR-2011 в липосомах в мг проводят по формуле: А" х гп_

.А. с '

где: А] -оптическая плотность испытуемого раствора;

А0 - оптическая плотность стандартного раствора PCO; 14

m - навеска PCO OR-2011, мг. Результаты определения содержание OR-2011 в ЛЛЛФ представлены в таблице 4.

Таблица 4

Определение содержания OR-2011 в липосомальпых формах

№ Оптическая Оптическая Содержания

образ плотность плотность OR-2011

ца исследуемо образца в липосомальной Метрологические

го раствора стандартног форме (мг) характеристики

(Ai) о раствора (X)

(Ао)

1 0,622 0,625 39,70 Х= 39,91

Sx= 0,135

2 0,586 0,621 39,90

Sx-= 0,055

3 0,596 0,623 40,00 Дх-= 0,142

4 0,621 0,624 40,07 £ = 0,3 %

5 0,622 0,622 40,00

6 0,624 0,625 39,80

среднее содержание OR-2011 в ЛЛЛФ составляет 39,91 ± 0,15 мг и ошибка среднего результата количественного определения OR-2011 в липосомах не превышает 0,3%. Методика спектрофотометрического определения проста в исполнении, требует незначительного количества анализируемого вещества, отличается достаточно большой точностью и чувствительностью, относительная ошибка не превышает ± 2 %.

Определение эффективности включения ОК-2011

Для определения эффективности включения OR-2011 на хроматографическую колонку С 10/20, заполненную сефадексом 0-50 и предварительно уравновешенную 0,15 М раствором натрия хлорида (при

скорости 0,5 мл/мин), наносят 1 мл липосомальной дисперсии с СЖ-2011 и элюируют 0,9 % раствором натрия хлорида. На выходе из колонки получают две фракции:

I фракция — очищенный липосомальный 011-2011. Объем первой фракции - 7 мл.

II фракция - не включившийся в липосомы 011-2011. Объем вторая фракции - 8 мл.

Результаты определения эффективности включения 011-2011 в пяти сериях представлены в таб.5

Таблица 5

Определение эффективности включения (Ш-2011 в ЛЛЛФ

№ образца Оптическая плотность испытуемог о раствора Оптическая плотность исходного раствора Эффективность включения в липосомы (мг)

1 0,589 0,624 43,10

2 0,585 0,622 42,05

3 0,590 0,625 43,15

4 0,587 0,624 42,12

5 0,599 0,620 43,02

Как видно из таблицы 5, результаты определения 011-2011 в различных сериях ЛЛЛФ показывают близкие значения по включению 011-2011 в липосомы.

Применение метода тонкослойной хроматографии для качественного апалпза ЛЛЛФ ОЫ-2011

Качественный анализ липосомального 011-2011 методом (ТСХ) проводили с использованием следующих систем растворителей; н-бутанол -уксусная кислота - вода (12:3:5) , хлороформ - спирт метиловый - вода -

аммиак водный (45:27:2,8:2,8), спирт изопропиловый - ацетон -эфир - вода (35 : 35 : 10 : 20). Условия хроматографирования были подобраны так, чтобы на хроматограмме была видна лекарственная форма, которую хотели определить. Для каждого компонента были выбраны свои храматографические условия. Так, OR-2011 определяют в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода (12:3:5) на линию старта хроматографической пластинки Сорбфил или аналогичного качества размером 10x15 см наносят 5 мкл (50 мкг) испытуемого раствора, 5 мкл (50 мкг) 1 % раствора рабочего стандартного образца (PCO) OR-2011 -(стандартный образец вещества свидетеля, СОВС-1) , (рис.4) в качестве проявителя используют нингидрин. Лецитин определяли в системе хлороформ - спирт метиловый - вода - аммиак водный (45:27:2,8:2,8) на линию старта хроматографической пластинки Сорбфил или аналогичного качества размером 10x15 см наносят 5 мкл (14 мкг) испытуемого раствора и 5 мкл (14 мкг) 0,28 % раствора лецитина (СОВС-2), (рис. 5) в качестве проявителя использовали йод .Холестерин определяют в системе хлороформ - спирт метиловый - аммиак водный (88:1:1) На линию старта хроматографической пластинки Сорбфил или аналогичного качества размером 15x10 см наносят 20 мкл (120 мкг) испытуемого раствора и 20 мкл (120 мкг) 0,6 % раствора холестерина (СОВС-3), (рис.6) в качестве проявителя используют йод. Сахарозу определяют в системе спирт изопропиловый — ацетон -эфир - вода (35 : 35 : 10 : 20) На линию старта хроматографической пластинки Сорбфил или аналогичного качества размером 10x15 см наносят 5 мкл (16 мкг) испытуемого раствора и 5 мкл (16 мкг) 0,32 % раствора сахарозы (СОВС-4) ,(рис .7) в качестве проявителя используют а -нафтол и серную кислоту концентрированную.

Рис.4 ТСХ (Ж-2011 на пластинке «вогЬйЬ> в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода (12:3:5)

1- Субстанция СЖ-2011(СОВС1)

2-ЛЛЛФ

Холестерин

Рис.6 ТСХ Холестерин на пластинке

«8огЬй1» в системе

хлороформ - спирт метиловый аммиак водный концентрирован (88:1:1)

1-ЛЛЛФ

2-СОВС-З

Рис.5 ТСХ лецитин на пластинке «вогЬШ» в системе хлороформ - спирт метиловый - вода -аммиак водный

концентрирован (45:27:2,8:2,8)

1-ЛЛЛФ

2-СОВС2

Сахароза

Рис.7 ТСХ Сахароза на пластинке «вогЬШ» в систем

спирт изоиропиловый - ацетон эфир - вода (35 : 35 : 10 : 20)

1-ЛЛЛФ

2-СОВС-4

В таблице №6 показаны Их и смесь растворителей, которые используют при анализе 011-2011, лецитина, сахарозы и холестерина.

Образцы Система растворителей Rf

OR-2011 бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (12:3:5) 0,41 ±0,02

Лецитин хлороформ - спирт метиловый - вода - аммиак водный (45:27:2,8:2,8) 0,60±0,02

Сахароза спирт изопропиловый - ацетон - эфир - вода (35 : 35 : 10 : 20) 0,64±0,02

Холестерин хлороформ - спирт метиловый - аммиак водный (88:1:1) 0,59±0,02

Изучение цитотоксического действия ЛЛЛФ OR-2011 в опытах in vitro

Цитотоксическую активность ЛЛЛФ OR-2011 изучали в опытах in vitro на клеточных линиях меланомы кожи человека: Mel Ibr и Mel Kor. На рис.8 представлены результаты цитотоксического действия субстанции OR-2011 и ЛЛЛФ OR-2011 на клетки линии Mel Ibr после инкубации в течение 24 ч. ИК50 (концентрация, вызывающая ингибирование пролиферации клеток на 50%) для ЛЛЛФ OR-2011 была достигнута в концентрации 0,1 мг/мл, а для субстанции 0,2 мг/мл. Пустые липосомы эффекта не оказывают.

Mel Ibr, 24 ч

о -I-.-,-.-1-1-.—-

0,015 0,031 0,062 0,125 0,25 0,5 1 Концентрация, мг/мл

Рис. 8. Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 и пустых липосом на клетках Mel Ibr, время инкубации 24 ч.

120 5100 80 60 40 20

Mel Ibr, 48 ч

—Пустые

ЛИПОСОМЫ -as- Субстанция OR-2011

2011

0,0150,031 0,0620,125 0,25 0,5 Концентрация, мг/мл

Рис.9. Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 и пустых липосом на клеток Mel Ibr, время инкубации 48 ч.

На рис.9 представлены результаты цитотоксического действия субстанции OR-2011 и ЛЛЛФ OR-2011 на клетки линии Mel Ibr после инкубации в течение 48 ч. ИК50 для ЛЛЛФ OR-2011 было достигнуто при концентрации 0,1 мг/мл, а для субстанции 0,2 мг/мл. Пустые липосомы эффекта не оказывали. После инкубации клеток в течение 72 ч (рис 10) обнаружено, что ИК50 для ЛЛЛФ OR-2011 составило 0,08 мг/мл, а для субстанции - 0,2 мг/мл. Пустые липосомы не оказывают никакого эффекта.

Mel Ibr, 72 ч

0,031 0,062 0,125 0,25 0.5 Концентрация, мг/мл

- Пустые липосомы

Субстанция OR-2011

-ЛЛЛФ OR-2011

Рис. 10. Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 и пустых липосом на клетках Mei Ibr, время инкубации 72 ч.

Аналогичные результаты получили при использовании в качестве клеток-мишеней клеточной линии меланомы Mel Kor. При инкубации в течение 24 ч. ИК50 для ЛЛЛФ OR-2011 было 0,125 мг/мл, а для субстанции препарата 0,2 мг/мл . Пустые липосомы не оказывали такого эффекта, (рис. 11)

Mel Kor, 24 ч

120 100 80 60 40 20 0

--- —

S ч

ж

\

ТЙГ j i-т

0,015 0,031 0,062 0,125 0,25 0,5 Концентрация, мг/мл

- Пустые липосомы Субстанция OR-2011 -ЛЛЛФ-СЖ-2011

Рис.11. Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 и пустых липосом на клетки Mel Kor, время инкубации 24ч.

При инкубации с клетками Mel Kor в течение 48 ч ЛЛЛФ OR-2011 ИК50 составило 0,08 мг/мл, а для субстанции 0,150 мг/мл. Пустые липосомы не проявляли эффекта, (рис. 12)

Mel Kor, 4-8 ч

120 100 SO

so

АО 20 О

- Пустые липосомы

Субстанция OR-2011

-ЛЛЛФ OR-201 1

0.015 0.031 0.062 0,125 0.25 0,5 Концентрация, мг/мл

Рис.12 Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 и пустых липосом на клетки Mel Kor, время инкубации 48 ч.

После инкубации клеток Mel Kor в течение 72 ч ИК50 составило 0,02 мг/мл для ЛЛЛФ OR-2011 и для субстанция около 0,03 мг/мл а для пустых липосом не проявлялся эффект (рис.13)

Mel Kor, 72 ч

120 100 80 60 40 20 О

» Пустые ™посомы

Субстанция OR-2011

-А-ЛЛЛФОЯ-2011

0,015 0,031 0,062 0,125 0,25 0,5 Концентрация, мг/мл

Рис. 13 Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 на клетки Mel Kor в опытах in vitro, время инкубации 72 ч

Противоопухолевая активность ЛЛЛФ (Ж-2011

Противоопухолевую активность ЛЛЛФ (Ж-2011 изучали на мышах ВБР1 (С57В1/6 х БВА/2) с подкожно растущей опухолью эпидермоидной карциномой легкого Льюиса. Данные исследования представлены в ытаблице 7 и на рис.14.

Таблица 7

Влияние OR-2011 на рост подкожно привитой карциномы лёгкого Льюис /LLC/ у мышей

BDF1 (С57В1/6 х DBA/2).

Воздействие Торможение роста опухоли, % спж, дни УП Ж, %

8 с. 12 с. 16 с. 23 с. 30 с. 40 с.

Контроль 651,0 * ±308,4 2447,2 ±1096,9 3733,4 ±1190,4 7782,2 ±1795,9 15152,8 ±2077,5 18263,3 ±3419,0 39,6±2,8

(9/9) ГО/91 (9/9) Ю/91 (9/9) ГО/9) (9/9) ГО/97 (9/9) Г0/91 (4/4) [0/91

OR-2011 субстанция 150 мг/кг xlp. в/в. (2с.) 100 (0/7) [0/7] 81 (7/7) [0/7] 67 (7/7) [0/7] 46 (7/7) [0/7] 36 (7/7) I0/7J 2 (7/7) [0/7] 42,6±3,5 8

OR-2011 субстанция 200 мг/кг xlp. в/в. (2с.) 100 (0/7) [0/7] 99 (2/7) [0/7] 96 (6/7) [0/71 65 (7/7) [0/7] 76 (7/7) [0/7] 53 (7/7) [0/7] 49,9±7,3 26

OR-2011 субстанция 300 мг/кг xlp. в/в. (2с.) 100 (0/6) [1/7] 100 (0/3) [4/7] 99,8 (1/3) [4/7] 95 (2/2) [5/7] 84 (2/2) [5/7] 63 (2/2) [5/7] 23,4±14,7 -41 **

OR-2011 ЛЛЛФ 200 мг/кг xlp. в/в. (2с.) 100 (0/6) [0/6] 99,9 (4/6) [0/6] 99 (3/6) [0/6] 88 (6/6) [0/6] 74 (б/б) [0/6] 39 (6/6) [0/6] 45,7±3,9 15

OR-2011 ЛЛЛФ 300 мг/кг xlp. в/в. (2с.) 95 (2/4) ГЗ/71 100 (0/3) И/71 100 (0/1) Í6/71 100 (0/1) [6/71 99,9 (1/1) [6/71 99,9 (1/1) [6/71 15,6±12,9 -61 **

Примечания: * - В графах указано:Торможение роста опухоли в % (в группе Контроль -указаны средние объёмы опухолей (в ммЗ) на данные сутки опыта); в ( ) - количество мышей с опухолью / количество мышей в группе на данные сутки опыта; в [ ] -суммарное количество мышей павших от токсичности к данным суткам опыта / исходное количество мышей в группе.

* * - знак « - » обозначает, что в данных группах из-за высокой гибели мышей-опухоленосителей от токсического действия 011-2011 указан % уменьшения (а не увеличения) продолжительности жизни леченных животных по сравнению с контрольной (не леченной) группой.

При однократном введении препарат (Ж-2011 как в виде субстанции (в дозах 150-200 мг/кг), так и в виде ЛЛЛФ (в дозе 200 мг/кг) значительно (на

53-100% и 74-100% , соответственно) и продолжительно (до 30-40 суток) ингибировал рост подкожных опухолевых узлов. Кроме того препарат как в виде субстанций, так и в виде ЛЛЛФ значительно удлинял латентный период развития карциномы легкого Льюиса у мышей ЕЮБ1.

п 2SOOO -£ £ 20000 - ч с ^ 15000 - В © - юооо - W £ С «ООО -« Б т

А

К и С. w S lO 12 16 23 27 ЗО 40 сутки поел» траноплянтяции ь; —•»«— QR-2011 субстанция 200 мг/кг; —»*— ЛЛЛФ OR.2Q1 1 200 мг/мг

Рис.14. Влияние OR-2011 на рост подкожно привитой карциномы лёгкого Льюис /LLC/у мышей BDF1 (C57BI/6 х DBA/2) Таким образом, в проведенном исследовании не было выявлено

существенных различий в противоопухолевом действии OR-2011 как в виде

субстанции, так и в виде разработанной лекарственной формы ЛЛЛФ.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате технологических исследований установлен оптимальный состав лиофилизированной липосомальной лекарственной формы OR-2011. Для обеспечения сохранения качества липосомальной дисперсии в процессе лиофилизации подобран эффективный криопротектор — сахароза.

2. Разработана технология получения лиофилизированной липосомальной дисперсии OR-2011 с диаметром частиц 122±10 нм.

3. Разработан метод тонкослойной хроматографии ЛЛЛФ OR-2011 для качественного определения OR-2011 и ингредиентов (лецитин, холестрин, сахароза) в лиофилизированной липосомальной лекарственной форме.

4. Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения активного компонента ЛЛЛФ(Ж-2011 в 95% спирте при длине волны 229 ± 2 нм.

5. В проект ФСП «OR-2Q11 липосомальный лиофилизат для приготовления

раствора для инъекций 40 мг» внесены показатели качества, предложенные для стандартизации препарата.

6. Установлено, что ЛЛЛФ OR-2011 проявляет цитотоксическое эффект на клетки меланомы кожи человека mel Kor и mel Ibr in vitro по сравнению с субстанцией препарата.

7. Показано, что противоопухолевое действие ЛЛЛФ OR-2011на мышей с карциномой легкого Льюис in vivo статистически значимо не отличалось от эффекта субстанции препарата.

Список работе, опубликованных по теме диссертация

1. Сравнение цитотоксического действия лекарственных форм противоопухолевых препаратов из класса нитрозомочевины / Н.В.Грищенко/ Б. Альбассит [и др.] // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. -Т.13, № 1. - С.49-52.

2. Разработка лиофилизированной лекарственной формы нового производного нитрозомочевины OR-2011 / А.Ю. Барышников/ Б. Альбассит [и др.] // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т 13, № 2. -С. 77-84.

3. Разработка липосомальной лекарственной формы нового соединения соединения из класса нитрозоалкилмочевины / Б. Альбассит [и др.] // Материалы Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием (23-25 мая 2013, Минск). Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 5.

4. Противоопухолевая активность нового соединения из класса нитрозоалкилмочевин М.А.Барышникова / Б. Альбассит [и др.] // Материалы Белорусско-Российской научно-практической конференции с международным участием (23-25 мая 2013,Минск) Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12 , № 2. - С .8.

5. Липосомальный противоопухолевый препарат OR-2011 из класса нитрозомочевины для лечения меланомы / Б. Альбассит [и др.] // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с между народным участием (20-21 марта 2014, Москва). Российский биотерапевтический журнал.-2014,-Т.13, № 1.-С. 59.

Подписано в печать гэ. 12.14 Формат 60x84/16. Бумага офисная «ЗуегоСору». Тираж 100 экз. Заказ № 699 Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Бпохина» 115478, г. Москва, Каширское ш:, 24