Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение метаболома суспензионной культуры василистника малого (Thalictrum minus L.) - продуцента протобербериновых алкалоидов

На правах рукописи /

91

ТЕРТИЧПЛЯ ЮЛИЯ МИХАЙЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛОМА СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ВАСИЛИСТНИКА МАЛОГО (THALICTRUM MINUS L.) -ПРОДУЦЕНТА ПРОТОБЕРБЕРИНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ

14.04.02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических паук

1 7 НОЯ 2011

Москва-2011 г.

005000950

Диссертационная работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЛ АР Россельхозакадемии). Научные руководители:

Доктор фармацевтических наук Мизина Прасковья Георгиевна Кандидат биологических наук Савина Татьяна Алексеевна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук Лякина Марина Николаевна

Доктор биологических наук Краснопольская Лариса Михайловна Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российский Федерации

Защита диссертации состоится « А уе/га^^ш 1 г. в на заседании Диссертационного Совета Д 006.070.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии) (117216, г. Москва, ул. Грина,7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, д.7

Автореферат разослан: «¿Р ъ/^&^с^ЛУЬ11 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 006.070.01, доктор фармацевтических наук Громакова Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы Лекарственные препараты, получаемые из растительного сырья, занимают важное место в современной медицине. В России изучены и отнесены к лекарственным около 2500 видов высших растений. В научной медицине практически используется около 250 видов. Интерес к лекарственным растениям объясняется наличием в них биологически активных веществ, особенно алкалоидов, которые, по сравнению с синтетическими, обладают мягким воздействием на макроорганизм и в оптимальной дозе не оказывают побочных эффектов. Среди природных фармакологически активных веществ, именно алкалоиды являются основной группой, которая используется в настоящее время в качестве источников высокоэффективных лекарственных средств.

Из обширной группы растительных алкалоидов особое место занимают алкалоиды протоберберинового ряда, обладающие широким спектром фармакологического действия. Они содержатся в семействах лютиковых (Ranuncullaceae), маковых (Papaveraceae), рутовых (Rutaceae), барбарисовых (Berberidaceae) и др. Одним из наиболее применяемых из протобербериновой группы алкалоидов является берберин, так как ему присущи антибактериальное, антипротозойное и противогрибковое действия, цитостатическая активность. Берберин является антиоксидантом, спазмолитиком. Обладает выраженным желчегонным действием.

В качестве основного источника сырья для получения алкалоида берберина в России используются корни листопадного колючего кустарника барбариса - Berberís vulgaris L. семейства Berberidaceae. При заготовке исходного сырья вырубают естественные заросли барбариса, которые восстанавливаются через 10-20 лет. Причем, в промышленном производстве из 40 кг сырья (корней) получают около 200,0 г готового продукта (берберина). Потребность же в лекарственных препаратах на основе берберина, ориентировочно, составляет 300 кг в год, для этого требуется заготовить 60000 кг корней ценного кустарника, что сложно обеспечить существующей сырьевой базой, которая стремительно сокращается и находится под угрозой исчезновения.

Поэтому проблема сохранения этого ценного кустарника и поиск альтернативных, экономически оправданных источников берберина актуальна.

Одним из альтернативных и перспективных источников берберина является культура клеток василистника малого (Thalictrum minus L.) семейства лютиковых (Ranunculaceae).

Во Всероссийском Институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) в 1990 году был получен штамм Thalictrum minus L. из черешка листа растения киргизской популяции, выращенного в

ботаническом саду ВИЛАР. В результате селекции из исходного штамма культуры клеток Thalictrum minus L. сотрудниками института получен штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР с новыми ростовыми и биохимическими свойствами.

Таким образом, использование биотехнологического сырья суспензии клеток Thalictrum minus L. является современным и своевременным решением актуальной проблемы расширения сырьевой базы для получения алкалоида берберина.

Целью настоящей работы является исследование по возможности использования суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР в качестве сырьевой базы для получения препаратов на основе алкалоида берберина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

изучить морфофизиологические и биохимические свойства суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР - продуцента алкалоида берберина при выращивании в условиях глубинного культивирования;

- изучить стабильность биосинтеза алкалоида берберина суспензионной культурой клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР при субкультивировании;

- изучить фармакогностические признаки нового вида сырья суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР;

- определить влияние различных режимов сушки на химический состав биомассы культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР;

- определить оптимальные технологические условия выделения алкалоида берберина из биомассы и культуральной жидкости суспензии клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР;

- подтвердить структуру алкалоида берберина, выделенного из сухой биомассы и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР с применением методов 'Н-ЯМР-спектроскопии;

- на основании результатов исследований разработать показатели качества для включения в нормативную документацию - Технические условия на новый вид сырья «Василистника малого суспензия клеток».

Научная новизна работы

Доказана биохимическая стабильность по содержанию алкалоида берберина и определены морфофизиологические характеристики суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР.

С применением методов 'Н-ЯМР-спектроскопии доказана идентичность стандарту структуры алкалоида берберина, выделенного из сухой клеточной культуры и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены значимые диагностические признаки сырья, определены числовые показатели сухой клеточной культуры Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

Определен качественный состав и количественное содержание аминокислот и липидов в сухой биомассе клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 -05 ВИЛАР.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны:

• оптимальные режимы сушки для нового вида биотехнологического сырья - сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР;

• методики определения подлинности сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР (микроскопия, качественные реакции, ТСХ - анализ, УФ - спектроскопия);

• оптимальные условия выделения алкалоида берберина из сухой биомассы и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР-,

• технические условия ТУ 9375-174-04868244-2010 «Василистника малого суспензия клеток», штамм Тт-2 — 05 ВИЛАР;

• «Инструкция по производству суспензии клеток культуры василистника малого, выращенной в условиях глубинного культивирования» И 04868244-012-2011;

• «Инструкция по технологии выделения алкалоида берберина из суспензии клеток василистника малого штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР» И 4868244-013-2011;

• Методические рекомендации к выполнению лабораторных работ по специальности «Фармация» на тему: «Культура растительных клеток - продуцент БАВ».

Основные положения, выносимые на защиту

Результаты изучения динамики нарастания биомассы и синтеза берберина суспензионной клеточной культурой Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

Фотохимический состав суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР и показатели стабильности алкалоида берберина в процессе длительного субкультивирования.

Фармакогностические характеристики нового вида сырья - сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

Влияние температуры сушки на качество сырья и числовые показатели сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

Результаты разработки оптимальных условий выделения алкалоида берберина (субстанции) из сухой биомассы и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» (Москва, 2008 г.) и IV научно-практической конференции с международным участием «Научно-технический прогресс и оптимизация технологических процессов создания лекарственных препаратов» (Тернополь, 2011 г.).

Связь задач исследований с проблемным планом НИР Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (номер государственной регистрации 01860074455).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, заключения, выводов, библиографии, включающей 180 литературных источников, из которых 93 на иностранных языках и приложения. Работа содержит 22 таблицы и 24 рисунка.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании обзора литературных данных представлены строение, свойства и биосинтез алкалоидов протоберберинового ряда. Дана характеристика источников протобербериновых алкалоидов растительного и биотехнологического происхождения. Описаны физико-химические свойства берберина. Приведены сведения о биологической активности и применении в медицине алкалоида берберина и его производных. Рассмотрены вопросы стандартизации сырья и сохранения его качественных характеристик, методы аналитического контроля и способы выделения целевых алкалоидов из сырья.

Во второй главе «Объекты и методы исследования» приведены сведения о материалах и методах, использованных в работе.

Третья глава посвящена морфофизиологическим и биосинтетическим исследованиям суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма

Тт-2 — 05 ВИЛАР. Представлены ростовые и биосинтетические показатели суспензионной клеточной культуры в течение длительного культивирования.

Четвертая глава содержит фармакогностические исследования суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР, в которых установлены показатели, позволяющие идентифицировать данное сырье и контролировать его качество. Приведены результаты фитохимического изучения с использованием современных физико-химических методов.

В пятой главе приведены данные исследований влияния температуры сушки на технологические показатели биомассы клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

В шестой главе изложены результаты по разработке технологии выделения алкалоида берберина из сухой биомассы и культуральной жидкости суспензии клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР и идентификация данного алкалоида методом 1Н-ЯМР-спектроскопии.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили суспензионная культура клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 — 05 ВИЛАР и трава Thalictrum minus L., заготовленная по ФС 42-1638-81.

Суспензионную культуру клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР выращивали в жидкой питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга в колбах, объемом 500 мл, на подвесной качалке, совершающей круговые вращения платформы со скоростью 100 об/мин, в термостатируемом помещении при температуре 26±1 °С и отсутствии света. Объем заполнения колб питательной средой составлял 1/5 от объема колбы; соотношение инокулюма и питательной среды - 1:7. Возраст посадочной суспензии соответствовал 14 суткам. Правила асептики и приемы посадки общепринятые.

Для проведения исследований суспензионную клеточную культуру Thalictrum minus L. штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР масштабировали в лабораторно-производственных ферментаторах Brunswick (США) с механическим перемешиванием, объемом 10 л и ферментаторах аэрлифтного типа LH-4000, объемом 80 л. Клеточную массу отделяли от культуральной жидкости с применением нутч-фильтра через бязевый материал с диаметром пор 100 мкм ГОСТ 11680-46. Культуральную жидкость фильтровали дополнительно через стеклянный фильтр № 1.

Морфологическое изучение проводили методом световой микроскопии под микроскопом JIOMO Микмед-1 на 15-е и 20-е сутки роста. Определение размеров агрегатов проводили с помощью окуляр-микрометра при

увеличении в 150 раз. Для каждой фракции анализировали 20 повторностей. Степень агрегированности суспензии оценивали по отношению числа агрегатов в установленных условно фракциях к сумме агрегатов всех фракций и выражали в процентах.

Для изучения ростовых свойств суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР определяли точки регистрации нарастания биомассы в динамике роста на 5, 10, 15, 20 и 25 сутки. Накопление биомассы оценивали по массе высушенных клеток, вычисляя среднее значение из 3-х повторностей, и выражали в граммах на 1 л среды.

Исследования по определению оптимальной температуры сушки проводили в сушильных аппаратах с принудительной вентиляцией КС - 100/200 и сушилке «Лесничанка-4» при постоянной удельной нагрузке на сушильную решетку - 5 кг/м". Эксперименты проводили в 3-х кратной повторности. В качестве контроля использовали сырье, высушенное в естественных условиях при температуре 25±1 °С в течение 72 часов. Влажность сухой биомассы определяли по методике ГФ XI. Товароведческий анализ проводили в соответствии с требованиями ГФ XI и ГФ XII.

Идентификацию выделенного четвертичного алкалоида берберина, полученного из культуральной жидкости и сухой биомассы Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР, проводили с помощью 'Н-ЯМР спектров, включая метод COSY. 'Н-ЯМР спектры алкалоида берберина снимали на приборе Gemini 200 Varian (США) (рабочая частота 200 МГц) с использованием в качестве внутреннего стандарта тетраметилсилана (Merck) в смеси дейтерохлороформа и трифторуксусной кислоты. Наблюдали, полное разделение сигналов всех протонов в данной бинарной смеси.

Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья осуществляли в соответствии со статьей ГФ XI «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья». При изучении анатомического строения использовали микроскоп (АУ - 26, увеличение хЗОО, хбОО, фотонасадка МФН 12У42). Для фотосъемки применяли фотоаппарат Olympus С-180 (Япония).

Для проведения экстракции БАВ, аналитического контроля и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «х. ч.». Концентрирование извлечений и отгонку растворителей проводили с помощью ротационного испарителя ИР-1М (Россия).

Для качественной и количественной оценки полученных веществ, применяли метод хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) на пластинках «Sorbfil ПТСХ-ПА» (Россия) размером 10x10 см. Хроматографирование выполняли при температуре 25 °С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи

шприца Microliter (Германия). Для определения алкалоидов методом ТСХ использовали систему растворителей: хлороформ - спирт этиловый - 25 % раствор аммиака (40:10:1,6).

Обнаружение зон адсорбции четвертичного алкалоида изохинолинового ряда проводили по стандартному образцу берберину гидрохлориду (СО). Спектрофотометрическое определение алкалоидов в сухой биомассе и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР проводили с использованием спектрофотометра СФ - 46 (Россия).

Спектры поглощения записывали на саморегистрирующем спектрофотометре Specord-40 (Германия) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см, оптическую плотность определяли при длине волны 347 нм.

Количественное содержание алкалоида берберина в культуральной жидкости определяли экспресс-методом. Прямое спектрофотометрирование проводили при длине волны 427 нм.

Изучение аминокислотного состава сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР проводили методом ВЭЖХ с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1100 (США), с градиентным насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 мл/мин.

Для исследование липидов в сухой биомассе и траве Thalictrum minus L. применяли метод ГЖХ на приборе Carlo Erba Strumentazione, HRGC 5300 Mega Series (Италия), с пламенно ионизационным детектором с использованием программно - аппаратного комплекса для сбора и обработки хроматографических данных «Мультихром» (Россия).

Изучение качественного состава и количественного содержания жирных кислот и аминокислот в сухой биомассе и траве Thalictrum minus L. осуществляли совместно с сотрудниками ГУ НИИ Питания РАМН.

Математическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятыми методами с определением среднего арифметического, среднего квадратичного и стандартного отклонения.

Морфофизиологические и биохимические исследования суспензии клеток Thalictrum minus L, штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР

Результаты микроскопического анализа позволили установить, что суспензионная культура клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР гетерогенна по своему составу и ее морфология зависела от длительности выращивания (табл.1). На 15-е сутки культура состояла в основном из 5-ти, 10-ти, 20-ти клеточных агрегатов и агрегатов, включающих более 20 клеток, на долю которых приходилось - 22 %, 29 %, 18 % и 19 %, соответственно. На 20-е сутки картина менялась, основную часть суспензии составляли 10-ти клеточные агрегаты, на долю которых приходилось 48 %, содержание 5-ти

клеточных агрегатов оставалось практически на том же уровне - 26 %, тогда как число 20-ти клеточных агрегатов и агрегатов большего размера значительно снижалось (табл. 1).

Размеры клеток и клеточных агрегатов варьировали: для одиночных клеток - от 3,4 мкм до 10,6 мкм, для многоклеточных агрегатов - от 8 мкм до 37 мкм (табл. 2).

Таблица 1

Морфологический состав суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 — 05 ВИЛАР

Фракции

Сутки роста Одиночные клетки 2-х клеточные агрегаты 3-х клеточные агрегаты 5-ти клеточные агрегаты 10-ти клеточные агрегаты 20-ти клеточные агрегаты Агрегаты, включающие более 20 клеток

% от общего количества клеток

15 сутки 2,8 3,3 3,9 22,6 29,1 18,6 19,6

20 сутки 4,25 3,5 4,6 26,6 48,6 8,9 3,9

Таблица 2

Размеры агрегатов клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР (мкм)

Фракции

Одиночные ! клетки 2-х клеточные агрегаты 3-х клеточные агрегаты 5-ти клеточные агрегаты 10-ти клеточные агрегаты 20-ти клеточные агрегаты Агрегаты, включающие более 20 клеток

7,0±3,6 10,3±2,9 9,1±2,6 14,4±4,6 21,2±5,7 24,5±5,5 29,3±7,8

Для установления оптимального срока выращивания изучали динамику нарастания биомассы клеток и синтеза ими алкалоида берберина. Полученные результаты (рис. 1) показали, что развитие культуры происходит по классической Б-образной кривой и синтез алкалоида берберина, с максимумом на 14 - 17-е сутки, проходит параллельно нарастанию клеточной биомассы. Установлено, что клетки суспензионной

культуры экскретируют синтезируемый берберин в культуральную жидкость.

О 5 10 15 20

время культивирования (сутки)

сухая биомасса, г/л —»—общая продуктивность суспензии,%

Рис. 1. Динамика нарастания биомассы и синтеза берберина суспензионной культурой клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР при выращивании в колбах на качалке.

С целью определения биосинтетической стабильности, культивирование суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР проводили в режиме периодического выращивания в течение одного календарного года. В результате эксперимента было установлено, что при многократном культивировании сохранялась способность суспензионной культуры к биосинтезу целевого алкалоида берберина.

В процессе поддержания клеточной культуры in vitro постоянно проводили селективный отбор по основным характеристикам (рост и биосинтетическая активность). Отмечена тенденция к увеличению синтеза алкалоида берберина до 0,35 % (табл.3).

Согласно ФС 42-1638-81 «Трава василистника малого», содержание суммы протобербериновых алкалоидов в сырье должно быть не менее 0,3%. Из представленных в табл. 3 результатов видно, что суммарное содержание алкалоида берберина в сухой биомассе клеток и культуральной жидкости находится в пределах нормы, установленной для травы Thalictrum minus L.

На основании полученных данных установлен нижний предел нормирования биосинтетической активности суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР: суммарное содержание алкалоида берберина - не менее 0,3 %.

Таблица 3

Количественное содержание алкалоида берберина в суспензионной культуре клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР

Период культивирования Нарастание биомассы г/л Содержание берберина Суммарное содержание алкалоида берберина, мг % от с.м. *

г в биомассе, мг% от с.м. * в культуральн. жидкости, мг % от с.м. *

Февраль 11.02.2010 г. 17,58 ±0,43 122,10 ±0,16 274,00 ±0,15 396,10

Апрель 29.04.2010 г. 20,52 ±0,20 124,33 ±0,12 239,13 ±0,09 363,46

Август 09.08.2010 г. 18,36 ±0,25 123,05 ±0,08 188,20 ±0,13 311,25

*от сухой массы клеток

Проведенные опыты с добавками берберина бисульфата к культуре клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР подтвердили отсутствие систематической ошибки применяемого метода количественного определения алкалоида в сухой биомассе (табл. 4).

Таблица 4

Результаты опыта с фиксированными добавками берберина бисульфата к культуре клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР

Исходное содержание берберина, мг Добавлено берберина бисульфата, мг Рассчитано берберина, мг Найдено берберина, мг Относительная ошибка, %

19,8 3 22,8 21,2 -7,4

19,8 10 29,8 31,6 +6,0

19,8 15 34,8 33,8 -2,9

Таким образом, результаты исследований морфофизиологических и биохимических характеристик суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР подтвердили ее стабильность в отношении синтеза алкалоида берберина при выращивании глубинным способом. Данный факт свидетельствует о перспективности использования суспензионной культуры василистника малого в качестве исходного сырья для получения алкалоида берберина.

Фармакогностическое изучение и определение подлинности суспензионной клеточной культуры Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛ АР

Учитывая, что официнальной методики для изучения диагностических признаков анатомического строения клеток биомассы не существует, были проведены исследования по определению фармакогностических параметров и подлинности нового вида биотехнологического сырья - суспензионной клеточной культуры Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР по методике, указанной в статье ГФ XI «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья». С этой целью были приготовлены и исследованы микропрепараты из сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР. Под микроскопом были видны одиночные целые клетки, чаще группы клеток (клеточные агрегаты). Клетки с тонкими стенками имели преимущественно округлую или слегка вытянутую форму. Для подтверждения наличия алкалоидов в анализируемом сырье использовали растворы пикриновой, фосфорномолибденовой кислот и раствор Люголя. Из них в качестве оптимального выбран общеалкалоидный реактив - раствор Люголя, так как он позволяет выявить в клетках сухой биомассы наличие берберина (зернистые вкрапления оранжево-бурого цвета) и крахмала (вкрапления синего цвета) (рис. 2).

2

Рис. 2. Микроскопия сухой биомассы штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР Thalictrum minus L. (окрашен раствором Люголя, ув. хбОО): 1 - крахмальные зерна; 2 - включения, содержащие алкалоиды.

При исследовании в УФ-свете культуральной жидкости, полученной в результате отделения от биомассы клеток, наблюдали флуоресценцию желто-зеленого цвета, что свидетельствует о присутствии алкалоида берберина.

Методами ТСХ и УФ - спектроскопии, подтверждено наличие алкалоида берберина в сухой биомассе и культуральной жидкости.

Для определения подлинности полученных экстрактов из суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР были изучены спектральные характеристики испытуемых образцов и стандартного образца берберина. Установлено, что спектры берберина бисульфата (СО), экстракта из культуральной жидкости и экстракта сухой биомассы, снятые на регистрирующем спектрофотометре, имеют идентичный рисунок с максимумами поглощения 228, 264, 347, 427 нм.

При изучении 'Н-ЯМР спектров хлороформных экстрактов, без предварительной обработки, полученных из культуральной жидкости и сухой биомассы суспензии клеток Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР, были четко видны все сигналы солевой формы алкалоида берберина, однако отмечено наличие жирных кислот (табл. 5).

Таблица 5

'М-ЯМР спектры фрагментов суммы жирных кислот, обнаруженных в экстрактах культуральной жидкости и сухой биомассы Thalictrum minus L., штамм ТМ-2 - 05 ВИЛАР

Образцы (растворитель для 'Н-ЯМР спктров) Параметры 'Н-ЯМР спектров и отнесения сигналов 5 м. д

СН3 (СН2)П СН2- СНг-СОО-СН,-СН= СН7- СН2-СОО СН=

Экстракт из сухой биомассы (СБСЬ+ТФК) 0,85 м. 1,3 с. 2,3 м. 1,7 с. 2,1 м. 5,4 с.

Экстракт из культуральной жидкости (СБС13+ТФК) 0,95 м. 1,25 с. 2,4 м. 2,05 м.

В связи с этим провели исследования по выявлению качественного состава и количественного содержания данной группы веществ. Определение жирных кислот в траве и биомассе клеток Thalictrum minus L., штамм ТМ-2 - 05 ВИЛАР проводили методом ГЖХ.

В результате сопоставления пиков, было обнаружено 27 жирных кислот. В траве преобладали: масляная - 14,91 %, пальмитиновая 27,64 %, линолевая 9,89 % и а-линоленовая - 17,30 % жирные кислоты; в биомассе в общей сумме преобладали: пальмитиновая - 31,23 %, линолевая - 32,90 % и а-линоленовая - 13,41 % жирные кислоты.

В связи с тем, что биогенетическими предшественниками изохинолиновых алкалоидов являются аминокислоты, был исследован их качественный состав и определено количественное содержание методом

ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ортофталевым альдегидом в присутствии меркаптопропионовой кислоты (ОРА-реагент) (рис. 3). В сухой биомассе Thalictrum minus L., штамм ТМ-2 - 05 ВИЛАР идентифицированы 17 аминокислот, на долю незаменимых аминокислот приходилось 51,53 % (треонин, валин, метионин, лейцин, лизин, изолейцин, аргинин, фенилаланин, гистидин) от общей суммы всех аминокислот. Содержание биогенетических предшественников изохинолиновых алкалоидов фенилаланина и тирозина в изучаемом образце составляло 5,05 % от всей суммы аминокислот.

штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР.

Для определения стабильности сырья, были изучены образцы сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР, выращенных в 2008 г., находящихся на хранении в течение 28 месяцев в упаковке и условиях, предусмотренных в ТУ 9375-174-04868244-2010. Контрольные исследования по содержанию алкалоида берберина проводили каждые 6 месяцев, которые подтвердили его стабильность в течение периода хранения.

В результате проведенных исследований предложен срок годности сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР - 2 года.

Влияние температуры сушки на числовые показатели биомассы клеток Thalictrum minus L., штамм ТМ-2 - 05 ВИЛАР

Для установления влияния размеров частиц измельченной сухой биомассы клеток Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР на полноту экстрагирования берберина, определяли ее фракционный состав. Сырье предварительно измельчали в лабораторной мельнице ТУ-22-236-76 № 730 (Россия), в течение 15-20 секунд и просеивали сквозь сита с размером ячеек менее 1 мм, от 1 -2 мм, от 3 - 3,5 мм, более 3,75 мм.

При проведении аналитического контроля было установлено, что оптимальной степенью дисперсности, обеспечивающей максимальный выход

алкалоида берберина при измельчении сухой биомассы, обладали частицы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм (табл. 6).

Таблица 6

Содержание алкалоида берберина в зависимости от степени измельчения сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛЛР

Степень измельчения, мм Содержание берберина, %

менее 1 0,115±0,05

1-2 0,121±0,08

3 -3,5 0,097±0,02

более 3,75 0,086±0,012

Для изучения влияния температуры сушки на изменение количественного содержания алкалоида берберина и технологические свойства сырья - сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР, проводили эксперимент, в котором изучали три режима сушки. Схема эксперимента:

1. Естественная сушка при температуре 25±1 °С (контроль);

2. Сушка при 40 °С в сушилке «Лесничанка-4»;

3. Сушка при температуре 60 °С, в сушильном шкафу КС-100/200;

4. Сушка при температуре 80 °С, в сушильном шкафу КС-100/200.

Масса каждого образца составляла 1000,0 г, толщина слоя биомассы в кассете 1,0 - 1,5 см. Числовые показатели выбирали в соответствии с требованиями ГФ XI и ГФ XII. Определяли фракционный состав измельченной сухой биомассы, высушенной при различных температурах (табл. 7).

Таблица 7

Фракционный состав измельченной сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР, высушенной при различных __температурах_

Температурный режим Фракционный состав, % на сухую биомассу

Размер конгломератов, мм

менее 1 1-2 3-3,5 более 3,75

25 °С 51,01 ±0,46 47,21±0,47 1,59±0,36 0,19±0,08

40 °С 17,71±0,23 55,04±0,44 24,80±0,31 2,45±0,13

60 °С 18,26 ±0,18 55,98±0,42 23,10±0,18 2,66±0,22

80 °С 20,34±0,13 64,37±0,53 14,07±0,21 1,22±0,17

По результатам проведенного фракционирования определено, что основную часть сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР, высушенной при температурах 40 °С, 60 °С и 80 °С, составляли конгломераты 1-2 мм; высушенной при 25 °С - конгломераты менее 1 мм.

В изучаемом сырье, высушенном при различных температурах, были определены следующие показатели: влажность, общая зола, зола, нерастворимая в 10% HCl. Результаты приведены в табл. 8.

Таблица 8

Показатели сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР, _высушенной при различных температурах_

Температура Показатели

сушки Влажность Общая зола, Зола, нерастворимая в

биомассы после % на сухую 10% HCl, % на сухую

сушки, % массу массу

25 °С 9,42± 0,21 10,07±0,27 1,03±0,01

40 °С 6,67± 0,18 11,05±0,25 1,28 ±0,06

60 °С 6,22±0,15 10,89±0,23 1,27±0,03

80 °С 3,87±0,13 11,53±0,24 1,39 ±0,05

Аналитический контроль сухой биомассы на содержание алкалоида берберина методом ТСХ и спектрофотометрии показал, что при тепловом воздействии до 60 °С в течение 6 часов, количественное содержание алкалоида берберина в биомассе клеток оставалось на уровне контроля, высушенного при 25 °С в течение 72 часов.

На основании полученных данных разработаны нормативы на новый вид биотехнологического сырья «Василистника малого суспензия клеток»: сушка биомассы при 60 °С - 6 часов; основная масса фракционного состава на сухую биомассу — конгломераты: 1-2мм — 55,5 влажность — не более 10 °/о\ общая зола - не более 12 %.

Технология выделения алкалоида берберина из сухой биомассы н культуралышн жидкости

В связи с тем, что в суспензионной культуре клеток Thalictrum minus L., штамм ТМ-2 - 05 ВИЛАР алкалоид берберин содержится в биомассе и культуральной жидкости, разработаны две схемы технологического получения целевого алкалоида из этих фракций.

Извлечение алкалоида берберина из сухой биомассы клеток проводили по методу ФС 42-1382-87. Биомассу Thalictrum minus L., штамм ТМ-2 - 05 ВИЛАР, высушенную при 60 °С, измельчали в лабораторной мельнице в течение 15-20 секунд до размера частиц 1-2 мм. Подготовленное сырье обрабатывали 5 % спиртовым раствором уксусной кислоты, экстракцию проводили 95 % этиловым спиртом в соотношении 1 : 9 (масса сырья : объем растворителя) на водяной бане при 60 °С в течение 1 ч 30 мин с последующим подкислением концентрированной серной кислотой до рН 2-3. Полученные маточные растворы контролировали на наличие протобербериновых алкалоидов с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках

«Sorbfil ПТСХ - ПА» (Россия), размером 10x10, в системе растворителей: хлороформ - этиловый спирт - аммиак 25 % (40:10:1,6). Схема выделения алкалоида берберина из сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 BHJIAP представлена на рис. 4.

Рис. 4. Технологическая схема выделения алкалоида берберина из сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 — 05 ВИЛАР.

Способ выделения алкалоида берберина из культуральной жидкости основан на жидкофазной экстракции алкалоида берберина хлороформом в виде основания, с последующим осаждением берберина гидросульфата обработкой органической фазы разбавленной серной кислотой.

Схема выделения алкалоида берберина из культуралыюй жидкости представлена на рис. 5.

Рис. 5. Технологическая схема выделения алкалоида берберина из культуральной жидкости суспензии клеток Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР.

В результате проведенного эксперимента был получен кристаллический берберин из сухой биомассы и культуральной жидкости.

Для подтверждения подлинности полученного берберина была изучена структура данного алкалоида методом 'Н-ЯМР - спектроскопии. Данные 'Н-ЯМР спектров, приведенные в табл. 9, подтверждают строение берберина гидросульфата, дают информацию о чистоте образцов и возможной природе примеси.

Полученный образец гидросульфата берберина из культуральной жидкости не содержит примесей (рис. 6).

«" ^—i_JLJJL, ..............(О_A—

i * ¡S 4 -ft P 5 - t 6 " a • 10 .3 ppi

<20

1ПУР7Й5-13

Рис. 6. 'Н-ЯМР спектр берберина (Н Н COSY), выделенного из культуральной жидкости суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР (200 МГц, CDC13 + TFA) .

В спектре 'Н-ЯМР образца гидросульфата берберина, выделенного из сухой биомассы, содержится минорная примесь (7 — 8 %), близкая по структуре к берберину (рис. 7).

H^IJLjJ

Рис. 7. 'Н-ЯМР спектр берберина, выделенного из сухой биомассы суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР (200 МГц CD3OD).

Таким образом, подобрана оптимальная технология выделения из сухой биомассы и культуральной жидкости суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма ТМ-2 - 05 ВИЛАР алкалоида берберина, структура и чистота которого подтверждена методом 'Н-ЯМР-спектроскопии.

Таблица 9

Данные 'Н-ЯМР спектров образцов берберина гидросульфата, выделенных из культуралыюй жидкости и сухой биомассы Thalictrum minus L., штамм

ТМ-2 - 05 ВИЛАР

Образцы берберина (растворитель для 'Н-ЯМР спектров) Параметры 'Н-ЯМР спект ров и отнесения сигналов 5 м. д, J Гц

Н-1 Н-4 Н-5 Н- 6 Н- 8 bill Н-12 Н- 13 О- сн2-0 ОСН3 Иитерлре тация сигналов примесей

Очищенный образец из к. ж. (СОзОЭ) 7.65 с 6.94 с * * 9. 77 с 8.04 Д 9.5 Гц 8.14 д 9.5 Гц 8. 72 с 6.12 с 4.12 с 4.22 с

Очищенный образец из к. ж. (СОС13+ТФК) 7.40 с 6.86 с 3.26 уш. т. 4. 86 У ш. т. 9. 50 с 7.89 Д 9.5 Гц 7.95 д 9.5 Гц 8. 35 с 6.12 с 4.12 с 4.25 с

Очищенный образец из с.б. (С0300) 7.67 с 6.96 с 3.25 * 4. 90 * 9. 78 с 8.03 д 9.5 Гц 8.14 д 9.5 Гц 8. 72 с 6.12 с 4.11 с 4.21 с 9.75 с; 8.65с; 7.55 с; 7.03с; 3.98с. близкий по структуре алкалоид

* сигналы полностью или частично перекрываются сигналами растворителя к. ж. - культуральная жидкость с. б. - сухая биомасса

выводы

1. Экспериментально установлена возможность использования суспензионной культуры Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР в качестве перспективного источника сырья для промышленного производства алкалоида берберина.

2. Выявлены диагностические признаки сырья, состоящего из двух фракций: культуральной жидкости и высушенной биомассы клеток Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР.

3. Установлено, что от общей продуктивности суспензии клеток процентное содержание берберина в биомассе составляет 34 % и 66 % - в культуральной жидкости.

4. Определено, что суммарное содержание алкалоида берберина в культуральной жидкости и биомассе клеток Thalictrum minus L., штамм

Тт-2 - 05 ВИЛАР, составляет 0,3 %, что находится на уровне нормируемого показателя для лекарственного растительного сырья.

5. Определено, что суспензионная культура Thalictrum minus L., штамм Тт-2 - 05 ВИЛАР, способна, как и интактное растение, к синтезу 27 жирных кислот и 17 аминокислот.

6. Установлено, что оптимальным режимом сушки биомассы клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР является температура 60 °С в течение 6 часов.

7. Разработана рациональная технология выделения алкалоида берберина из каждой фракции (высушенной биомассы и культуральной жидкости).

8. Доказана структура и чистота полученного алкалоида берберина методом 'Н-ЯМР-спектроскопии.

9. На основании проведенных исследований разработана нормативная документация:

Технические условия ТУ 9375-174-04868244-2010 «Василистника малого суспензия клеток»;

«Инструкция по производству суспензии клеток культуры василистника малого, выращенной в условиях глубинного культивирования» И 04868244-012-2011;

«Инструкция по технологии выделения алкалоида берберина из суспензии клеток василистника малого штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР» И 4868244-013-2011.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вопросы биопродуктивности клеточной культуры Thalictrum minus / Ю. М. Тертичнан, Т. А. Савина, В. В. Вандышев, В. А. Быков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - М., 2009. - №1. -С. 11-14.

2. Разработка режима сушки нового вида фитосырья - биомассы Thalictrum minus / Ю. М. Тертичная, А. И. Ворошилов, Т. А. Савина, В. А. Быков // Материалы V Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нанобиотехнологии и инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». - М., 2009. - С. 119-121.

3. Изучение диагностических признаков суспензионных культур клеток василистника малого Talictmm minus, унгернии Виктора Ungernia victoris, женьшеня обыкновенного Panax ginseng методом микроскопии и подбор красителей / А. Н. Ходцова, Е. Ю. Бабаева, Ю. М. Тертичная, С. Н. Суслина // Материалы IX Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке».-М., 2008.-С. 213-214.

4. Протобербериновые алкалоиды в лекарственных растениях /

Ю. М. Тертичная, В. А. Быков, Т. А. Савина, II. Г. Мизина // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - М., 2011. - № 11.— С. 3-10.

5. Получение алкалоида берберина из биотехнологического сырья -суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. / Тертичная Ю. М. // Матсршш 4-i науково-практичнои конференцп з м^жнародною участие «Науково-техшчний прогрес i оптим1защя технолопчних процеав створеиня лжарскихпрепарат».-Тернотль:Укрмедкнига, 2011.-С. 51-52.

6. Качественный состав и количественное содержание аминокислот в сухой биомассе клеточной культуры Thalictrum minus / Ю. М. Тертичная,

Т. А. Савина, II. Г. Мизина, В. А. Быков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -М., 2011.-№ 11.-С. 11-14.

Подписано в печать:

07.11.2011

Заказ ЛЬ 6199 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы

Лекарственные препараты, получаемые из растительного сырья, занимают важное место в современной медицине. В России изучены и отнесены к лекарственным около 2500 видов высших растений. В научной медицине практически используется около 250 видов. Интерес к лекарственным растениям объясняется наличием в них биологически активных веществ, особенно алкалоидов, которые, по сравнению с синтетическими, обладают мягким воздействием на макроорганизм и в оптимальной дозе не оказывают побочных эффектов. Среди природных фармакологически активных веществ, именно алкалоиды являются основной группой, которая используется в настоящее время в качестве источников высокоэффективных лекарственных средств.

Из обширной группы растительных алкалоидов особое место занимают алкалоиды протоберберинового ряда, обладающие широким спектром фармакологического действия. Они содержатся в семействах лютиковых (Ranuncullaceae), маковых (Papaveraceae), рутовых (Rutaceae), барбарисовых (Berberidaceae) и др. Одним из наиболее применяемых из протобербериповой группы алкалоидов является берберин, так как ему присущи антибактериальное, антипротозойное и противогрибковое действия, цитостатическая активность. Берберин является антиоксидантом, спазмолитиком. Обладает выраженным желчегонным действием.

В качестве основного источника сырья для получения алкалоида берберина в России используются корни листопадного колючего кустарника барбариса - Berberís vulgaris L. семейства Berberidaceae. При заготовке исходного сырья вырубают естественные заросли барбариса, которые восстанавливаются через 10-20 лет. Причем, в промышленном производстве из 40 кг сырья (корней) получают около 200,0 г готового продукта (берберина). Потребность же в лекарственных препаратах на основе берберина, ориентировочно, составляет 300 кг в год, для этого требуется заготовить 60000 кг корней ценного кустарника, что сложно обеспечить существующей сырьевой базой, которая стремительно сокращается и находится под угрозой исчезновения.

Поэтому проблема сохранения этого ценного кустарника и поиск альтернативных, экономически оправданных источников берберина актуальна.

Одним из альтернативных и перспективных источников берберина является культура клеток василистника малого (Thalictrum minus L.) семейства лютиковых (Ranunculaceae).

Во Всероссийском Институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) в 1990 году был получен штамм Thalictrum minus L. из черешка листа растения киргизской популяции, выращенного в ботаническом саду ВИЛАР. В результате селекции из исходного штамма культуры клеток Thalictrum minus L. сотрудниками института получен штамм Тт-2 — 05 ВИЛАР с новыми ростовыми и биохимическими свойствами.

Таким образом, использование биотехнологического сырья суспензии клеток Thalictrum minus L. является современным и своевременным решением актуальной проблемы расширения сырьевой базы для получения алкалоида берберина.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является исследование по возможности использования суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР в качестве сырьевой базы для получения препаратов на основе алкалоида берберина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи: изучить морфофизиологические и биохимические свойства суспензионной культуры клеток Thalictrwn minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР — продуцента алкалоида берберина при выращивании в условиях глубинного культивирования; изучить стабильность биосинтеза алкалоида берберина суспензионной культурой клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР при субкультивировании;

- изучить фармакогностические признаки нового вида сырья суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР;

- определить влияние различных режимов сушки на химический состав биомассы культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР;

- определить оптимальные технологические условия выделения алкалоида берберина из биомассы и культуральной жидкости суспензии клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР;

- подтвердить структуру алкалоида берберина, выделенного из сухой биомассы и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР с применением методов 'Н-ЯМР-спектроскопии;

- на основании результатов исследований разработать показатели качества для включения в нормативную документацию — Технические условия на новый вид сырья «Василистника малого суспензия клеток».

Научная новизна работы

Доказана биохимическая стабильность по содержанию алкалоида берберина и определены морфофизиологические характеристики суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

С применением методов 'Н-ЯМР-спектроскопии доказана идентичность стандарту структуры алкалоида берберина, выделенного из сухой клеточной культуры и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены значимые диагностические признаки сырья, определены числовые показатели сухой клеточной культуры Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР.

Определен качественный состав и количественное содержание аминокислот и липидов в сухой биомассе клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны:

• оптимальные режимы сушки для нового вида биотехнологического сырья сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР;

• методики определения подлинности сухой биомассы

Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР (микроскопия, качественные реакции, ТСХ - анализ, УФ-спектроскопия);

• оптимальные условия выделения алкалоида берберина из сухой биомассы и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР;

• технические условия ТУ 9375-174-04868244-2010 «Василистника малого суспензия клеток», штамм Тт-2 — 05 ВИЛАР;

• «Инструкция по производству суспензии клеток культуры василистника малого, выращенной в условиях глубинного культивирования» И 04868244-012-2011;

• «Инструкция по технологии выделения алкалоида берберина из суспензии клеток василистника малого штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР» И 4868244-013-2011;

• Методические рекомендации к выполнению лабораторных работ студентами по специальности «Фармация» на тему: «Культура растительных клеток - продуцент БАВ».

Основные положения, выносимые на защиту

Результаты изучения динамики нарастания биомассы и синтеза берберина суспензионной клеточной культурой Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР.

Фитохимический состав суспензионной культуры клеток Thalictrum minus L. штамма Тт-2 - 05 ВИЛАР и показатели стабильности алкалоида берберина в процессе длительного субкультивирования.

Влияние температуры сушки на качество сырья и числовые показатели сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР.

Фармакогностические характеристики нового вида сырья - сухой биомассы Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР.

Результаты разработки оптимальных условий выделения алкалоида берберина (субстанции) из сухой биомассы и культуральной жидкости Thalictrum minus L. штамма Тт-2 — 05 ВИЛАР.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» (Москва, 2008 г.) и IV научно-практической конференции с международным участием «Научно-технический прогресс и оптимизация технологических процессов создания лекарственных препаратов» (Тернополь, 2011 г.).

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (номер государственной регистрации 01860074455).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 132 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, заключения, выводов, библиографии, включающей 180 литературных источников, из которых 93 на иностранных языках и приложения. Работа содержит 22 таблицы и 24 рисунка.