Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка флуориметрических методик оценки качества кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в лекарственных средствах

На правах

Таубэ Александра Альбертовна

Разработка флуориметрических методик оценки качества кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в лекарственных

средствах

005012017

14.04.02-Фармацевгическая химия, фармакогнозия.

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

12 мд? гт

Москва 2012

005012017

Диссертационная работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Саканян Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна

доктор фармацевтических наук Зилфикаров Ифрат Назимович

Ведущая организация: Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской Академии Наук.

Защита диссертации состоите^ & ¿V- /Ад 14:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений ГНУ ВИЛАР РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЛАР РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан'1/^" 1012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.006.070.01, "

доктор фармацевтических наук ' ' Громакова Алла Ивановна

П 2

Общая характеристика работы

Актуальность темы

В современном мире проблема качества лекарственных средств является важнейшим фактором повышения уровня жизни, экономической, социальной и экологической безопасности.

Критерии качества лекарственных средств, установленные Всемирной организацией здравоохранения включают в числе обязательных элементов соответствие требованиям спецификаций качества, устанавливающим тщательно отобранные нормы, методы испытаний и др. Как правило, спецификации качества содержатся в таких нормативных документах, как общие фармакопейные статьи (ОФС), фармакопейные статьи (ФС), фармакопейные статьи предприятия (ФСП), а также ГОСТы, ОСТы, ТУ и др.

Это предусматривает, гармонизацию требований, предъявляемых различными производителями одних и тех же лекарственных средств к их качеству и методикам определения этого качества.

Анализ нормативных документов зарубежных стран и отечественных производителей свидетельствует о том, что во всем мире прослеживается четкая тенденция к внедрению в практику фармацевтического анализа современных инструментальных методов, обеспечивающих специфичность аналитических методик. Это и обуславливает тот факт, что в последние годы при оценке качества лекарственных средств широкое распространение получили различные методы физико-химического анализа, такие как спектрофотометрия, хроматография, ЯМР-спектроскопия, флуориметрия, капиллярный электрофорез и другие.

Это актуально и в случае анализа витаминсодержащих лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД).

В настоящее время витаминсодержащие лекарственные препараты и биологически активные добавки занимают лидирующие позиции в перечне лечебно-профилактических средств, повседневно используемых населением разных стран мира. Только на территории РФ зарегистрировано порядка 3000 лекарственных средств и БАД, содержащих витамины и витаминоподобные субстанции, употребляемые в лечебных и профилактических целях.

Это является основанием к совершенствованию методик контроля качества витаминов, поскольку в нормативной документации на одну и ту же субстанцию и лекарственные препараты на ее основе довольно часто приводятся совершенно разные методики качественного и количественного анализа. В частности, до сих пор в большинстве случаев для количественного определения кислоты аскорбиновой (КА) применяются традиционные титриметрические методы. Несмотря на неоспоримые достоинства титриметрии, этот метод имеет ряд ограничений, к числу которых следует отнести: невозможность получения достоверного результата в присутствии других компонентов, входящих в состав лекарственного средства; высокая лабильность и способность к окислению.

Вместе с тем, активное участие этого витамина в обменных процессах человеческого организма и обеспечивает довольно широкую область его применения в виде различных лекарственных средств, в том числе как в индивидуальном виде, так и в составе комплексных препаратов.

Другим витамином, принимающим не менее активное, чем кислота аскорбиновая, участие в ферментативных реакциях человеческого организма в качестве кофермента является кислота фолиевая (КФ). Кислота фолиевая применяется и в качестве индивидуального лекарственного средства (таблетки) и входит в состав железосодержащих лекарственных средств и поливитаминных препаратов. Методики анализа кислоты фолиевой также требуют совершенствования.

Применительно к анализу витаминов такой метод анализа как флуоресцентный метод характеризуется высокой специфичностью, позволяющей осуществлять оценку качества определяемого вещества в присутствии других компонентов и чувствительностью, близкой, в некоторых случаях, к чувствительности радиохимических методов. Все это дает возможность для использования метода флуориметрии при проведении качественного и количественного анализа не только субстанций и монопрепаратов, но и комплексных витаминосодержащих лекарственных средств, лекарственного растительного сырья, растительных лекарственных средств и препаратов.

В связи с этим разработка флуориметрических методик анализа кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой представляет собой актуальную задачу, решение которой будет способствовать повышению уровня современного фармацевтического анализа в области оценки качества витаминов.

Цель работы - разработка методик флуоресцентного качественного и количественного анализа кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в витаминосодержащих лекарственных средствах и препаратах, в том числе растительного происхождения. Задачи исследования:

1. Изучить целесообразность использования метода флуориметрии для определения подлинности кислоты аскорбиновой и разработать соответствующую методику.

2. Подобрать оптимальные условия для проведения качественного и количественного анализа кислоты аскорбиновой флуориметрическим методом в лекарственных средствах и провести валидационные испытания этой методики.

3. Разработать флуориметрическую методику определения подлинности и количественного содержания кислоты аскорбиновой в лекарственных средствах, в том числе растительного происхождения.

4. Разработать оптимальные условия качественного и количественного флуориметрического анализа кислоты фолиевой в лекарственных средствах и осуществить валидационную оценку предложенной методики.

5. Разработать флуориметрическую методику определения подлинности и количественного содержания кислоты фолиевой в лекарственных средствах, в том числе растительного происхождения.

6. Составить методические указания для оценки качества кислоты аскорбиновой и фолиевой в лекарственных средствах, в лекарственном растительном сырье, лекарственных средствах растительного происхождения.

Научная новизна.

Впервые предложено использовать флуориметрический метод анализа, как для качественной, так и для количественной оценки таких широко используемых в медицинской практике витаминов, как кислота аскорбиновая и

кислота фолиевая, реализуя принцип сквозной стандартизации «Субстанция-лекарственное средство».

Для проведения флуориметрического качественного и количественного анализа КА предложено осуществить оценку интенсивности флуоресценции продукта конденсации КДА с о-фенилендиамином (ОФДА). При этом для проведения реакции окисления КА в КДА следует в качестве катализатора этой реакции использовать ионы меди. Впервые экспериментально определены условия проведения реакции окисления КА в КДА и ее последующей конденсации с ОФДА, включая концентрацию реагентов, рН среды, время проведения реакции, температуру. Экспериментально установлено, что для качественного и количественного анализа КА, проводимого флуориметрическим методом следует использовать длину волны возбуждения 340 нм и длину волны регистрации 425 нм. Определен оптимальный состав раствора сравнения, включающий, в частности, натрия эдетат, в качестве реагента, позволяющего предотвратить реакцию окисления КА.

Впервые проведена оценка пригодности разработанной методики по валидационным показателям в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2002.

Впервые разработана и апробирована методика флуориметрического анализа КФ, исключающая ее предварительное окисление. Подобраны оптимальные условия определения: время, рН среды, длины волн. Экспериментально установлено, что для качественного и количественного анализа КФ флуориметрическим методом следует использовать длину волны возбуждения 275 нм и длину волны регистрации 335 нм. Впервые проведена оценка пригодности разработанной методики по валидационным показателям в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2002.

Практическая значимость и внедрение результатов исследований.

Разработаны флуориметрические методики определения кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой по показателям «Подлинность», «Количественное определение» в лекарственных средствах, в лекарственном растительном сырье и различных лекарственных препаратах.

Суть методик отражена в виде «Методических указаний по определению

кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в субстанциях и лекарственных

6

формах», которые прошли апробацию в лабораториях СПб ГУЗ «СЗЦККЛС» и ООО «ВИС». Методические указания предназначены для применения в практической деятельности лабораторий по контролю качества лекарственных средств и БАД.

Связь задач исследования с проблемным планом НИР.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по "Плану Фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 гг.", заданию 04.13. Разработать научные основы лекарственного растениеводства, создать высокоэффективные профилактические и лечебные средства, разработать методы контроля качества и безопасности лекарственных препаратов из растительного сырья с использованием молекулярных тест-систем.

Апробация работы.

Основные результаты исследований доложены на юбилейной конференции «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств ГОУ ВПО СПХФА (Санкт-Петербург, 2005), региональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 40-летию фармацевтического факультета ГОУ ВПО КГМУ (Курск, 2006), научно-практической конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2007), региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007).

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по разработке методики качественного и количественного анализа кислоты аскорбиновой в субстанциях с использованием флуориметрии.

2. Результаты исследований по разработке методики флуориметрического определения подлинности и количественного содержания кислоты

аскорбиновой в лекарственном растительном сырье и в лекарственных препаратах.

3. Результаты исследований по разработке методики качественного и количественного анализа кислоты фолиевой в субстанциях с использованием флуориметрии.

4. Результаты исследований по разработке методики флуориметрического определения подлинности и количественного содержания кислоты фолиевой в лекарственном растительном сырье и в лекарственных препаратах.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе одна работа в научных изданиях, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации:

Содержание работы изложено на 174 страницах машинописного листа, включает 75 таблиц, 26 рисунков и состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации (Глава 1) и 3 глав экспериментальных исследований, заключения, общих выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 173 источника, их них 137 - зарубежных авторов. Диссертация содержит 11 приложений.

Основное содержание работы

Во введении отражены актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, определена цель и сформулированы задачи исследования.

Обзор литературы (Глава 1). Обобщены сведения о роли, значении и области применении витаминов, в особенности кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой, в медицинской практике. Особое внимание при этом уделено методам качественного и количественного анализа субстанций кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой. Приведены сведения об особенностях используемых методов качественного и количественного анализа, показаны их достоинства и недостатки. Даны теоретические основы флуориметрического метода анализа и изложены современные подходы к валидации аналитических методов.

Материалы и методы исследования (Глава 2). Приведена характеристика объектов, материалов и методов исследования, а также используемого оборудования. Представлены методики химического и физико-химического

анализа, а также дана валидационная характеристика испытаний.

8

Объектами исследований для разработки методик качественного и количественного анализа служили стандартные образцы кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой (фолиевая кислота кат. № 47620 >97,0%, Sigma 2004; аскорбиновая кислота кат. № 95209 > 99,5%, Sigma 2004), субстанции аскорбиновой и фолиевой кислот производства Китай, Россия, Франция, Индия, а также лекарственные препараты и лекарственное растительное сырье, в состав которых входят кислота аскорбиновая и кислота фолиевая.

Апробацию разработанных методик проводили на субстанциях, лекарственном растительном сырье и модельных смесях различного состава, содержащих анализируемые витамины, а также ЛП промышленного производства и аптечного изготовления.

Титриметрическое определение проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд. (вып. 2, с. 55), а также утверждённых НД на ЛС и ЛП.

Для проведения спектрофотометрического анализа использовали следующее оборудование:

• Спектрофотометр «СФ-2000»;

• Спектрофотометр PharmaSpec UV-1700.

Для проведения хроматографического анализа использовали следующее оборудование: жидкостной хроматограф Shimadzu LC-10AVP (Япония), со спектрофотометрическим детектором, колонка: Luna С18 150*4,6*5, скорость потока подвижной фазы: 0,8 мл/мин; подвижная фаза: фосфатный буферный раствор - ацетонитрил (90:10).

Для проведения флуориметрического анализа использовали следующее оборудование:

• Флуориметр «Флуорат 02-2М», (НПО «Люмекс», Россия). Условия проведения: режим - флуоресценция; чувствительность - средняя, низкая.

• Спектрофлуориметр «Панорама 124», (НПО «Люмекс», Россия). Условия проведения: чувствительность - низкая, задержка строба - 1,00мкс, длительность строба 4,90мкс.

Все используемые реактивы и титрованные растворы готовили в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XII изд.

Разработка флуориметрической методики качественного и количественною анализа кислоты аскорбиновой в лекарственных средствах (Глава 3).

Первым этапом исследования явилось изучение возможности применения флуориметрического анализа в оценке качества КА. Предварительно был снят спектр флуоресценции КА (рис.1), изучение которого свидетельствует о том, что КА не обладает нативной флуоресценцией. Известно, что КА легко окисляется до кислоты дегидроаскорбиновой. Основным условием протекания этого процесса являются наличие определенных окислителей и создание соответствующего рН среды. Спектр флуоресценции КДА (рис. 1.), показал, что его интенсивность находится на уровне фоновых значений.

0,16 0,14

&

* 0.12

5_ 0,10 л

| 0,08 | ода

I 0,04

= ода ода

/ / "К, % \ \ дк -«-КДА ——продм риакщи КДА с ОФДА

У / / \ ч "V Ч

___ ; / /

350 370 390

410 430 450 дш-на волны, нм

470 490

Рис. 1. Спектры флуоресценции растворов кислоты аскорбиновой (АК), кислоты дегидроаскорбиновой (КДА) и фонового раствора (0,05 мг/мл) при длине волны возбуждения 340 нм.

Для выполнения исследования была проведена оценка возможности

использования известной реакции конденсации кислоты дегидроаскорбиновой

с ОФДА (рис. 2.).

35 мин. темное место

N42

СН2ОН

3-(1,2-дигидроксиэтил)фуро-[3,4-Ь]хиноксалин-1 (ЗН)-он

Рис. 2. Схема взаимодействия КДА с ОФДА Согласно данным литературы, реакция протекает в темноте в течение 35 минут с образованием хиноксалинового производного - 3-(1,2-дигидроксиэтил)фуро[3,4-Ь]-хиноксалин-1(ЗН)-он.

На рис. 3. показано, что спектр флуоресценции продукта конденсации КДА с ОФДА имеет характерный максимум при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм. Таким образом, появление интенсивного излучения полученного хиноксалинового производного может быть положено в основу флуориметрической методики качественного и количественного анализа кислоты аскорбиновой в ЛС, ЛП и лекарственном растительном сырье.

длина волны, нм

Рис. 3. Спектр флуоресценции продукта конденсации кислоты дегидроаскорбиновой с ОФДА при длине волны 340 нм.

Для разработки методики был проведен комплекс исследований по изучению оптимальных параметров анализа: концентрации реагентов, выбор катализатора, окислителя, стабилизатора, растворителя, условий проведения определения - температуры, времени, рН среды. Для перевода кислоты

аскорбиновой в кислоту дегидроаскорбиновую в качестве возможного окислителя были исследованы ионы некоторых металлов: меди (И), ртути (II), железа (III) (табл. 1.). Установлено, что раствор ртути нитрата неселективно окисляет кислоту аскорбиновую до кислоты дегидроаскорбиновой, калия гексацианоферрат (III) мешает дальнейшему проведению реакции конденсации, взаимодействуя с ОФДА, поэтому в качестве окислительного реагента был выбран раствор меди ацетата, который селективно окисляет АК только до КДА и не мешает дальнейшему проведению анализа.

Таблица 1. Влияние ионов металлов на степень окисления кислоты __аскорбиновой (0,05 мг/мл)_

Время окисления, мин Содержание кислоты аскорбиновой в % к первоначальному содержанию после окисления ионами металлов

Си(СН3СОО)2 K3Fe(CN)6 Hg(N03)2

1 96,4 97,0 0

15 23,45 35,75 0

20 10,6 10,35 0

25 0 0 0

Результаты определения оптимального значения рН среды даны в табл. 2.

Таблица 2. Содержание кислоты аскорбиновой в растворе после добавления ионов меди при различных знамениях рН среды

Время рН среды после добавления раствора ионов меди, мин Содержание кислоты аскорбиновой к первоначальному содержанию, % при разных значениях рН среды

3,69 4,77 6,19

20 53,81 10,60 11,43

25 39,78 0 0

60 0,95 0 0

90 0 0 0

Было установлено, что при значениях pH раствора в диапазоне 4,77+6,19

полное окисление происходит в течение 25 минут. Поэтому, раствор ионов меди следует готовить в буферном растворе с рН=4-К5,5.

Далее исследовалось влияние концентрации ионов меди на полноту окисления раствора кислоты аскорбиновой. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Эффект концентрации попов меди на окисление _раствора кислоты аскорбиновой (0,05 мг/мл)_

Концентрация ионов меди, мкг/мл Содержание в растворе кислоты аскорбиновой, к первоначальному содержанию, %

1 10,3

5 0

10 0

15 0

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее оптимальной

концентрацией ионов меди в растворе является 5 мкг/мл, так как уже при этой концентрации наблюдается необходимый результат, т. е. 100-процентное окисление КА.

Было изучено влияние времени и температуры на процесс окисления кислоты аскорбиновой. Результаты, приведенные в табл. 4., свидетельствуют о том, что этот параметр не оказывает существенного влияния на время окисления кислоты аскорбиновой.

Таблица 4. Влияние факторов времени и температуры на окисление __кислоты аскорбиновой ионами меди_

Время, мин Содержание кислоты аскорбиновой после добавления ионов меди % к первоначальному содержанию; при температуре, °С

18-25°С 45-55°С 88-98°С

15 23,45 27,43 31,98

20 10,6 10,08 14,5

25 0 0 0

Следовательно, процесс окисления КА следует проводить при комнатной

температуре в течение 25 мин.

Далее проводилась реакция конденсации кислоты дегидроаскорбиновой с раствором ОФДА. Для подбора оптимальной концентрации раствора ОФДА реакция конденсации проводилась в различных соотношениях кислоты дегидроаскорбиновой и . ОФДА: 1:1; 1:1,1 1:1,2; 1:2; 1:3. Определение концентрации ОФДА проводили методом спектрофотометрии до и после проведения реакции.

Измеряли интенсивность излучения полученных растворов после прохождения реакции конденсации, исходя из которой, рассчитывали концентрацию кислоты аскорбиновой в растворе (табл. 5.).

Таблица 5. Влияние концентрации раствора ОФДА на интенсивность ___излучения (концентрация КДА 0,05 иг/мл!_

№ Соотношение КА: ОФДА интенсивность обнаруженная

п/п (Концентрация ОФДА, Моль/л) флуоресценции, концентрация,

усл. ед. мг/мл

1 1:1 (2,5*10'4) 1,630 0,0503

2 1:1,1 (2,7*10"4) 1,578 0,0486

3 1:1,2 (3,0*10"4) 1,618 0,0500

4 1:2 (5,0* 10"4) 1,589 0,0489

5 1:3 (7,5* 10"4) 1,607 0,0496

Полученные результаты показывают, что концентрация ОФДА не оказывает влияния на прохождение реакции конденсации и избыток ОФДА не мешает проведению анализа.

Оптимальное соотношение КА и ОФДА составляло 1:1,2. Избыток ОФДА обеспечивает получение достоверных результатов анализа при высоких концентрациях КА.

В качестве стабилизатора кислоты аскорбиновой был выбран натрия эдетат. В табл. 6. представлены результаты оценки влияния времени и концентрации раствора натрия эдетата на стабильность КА в растворе.

Таблица 6. Влияние времени и концентрации раствора натрия _эдетата на стабильность КА в растворе_

ЭДТА, Содержание КА (% 1 после добавления натрия эдетата

Моль

Время, 0,00005 0,0001 0,00025 0,0005 0,931

мин

0 99,8 99,8 99,8 99,8 99,8

30 1,99 4,32 99,32 99,73 99,63

60 1,66 3,32 98,01 99,76 99,72

90 0 1,66 98,32 99,76 99,72

120 0 0 98,01 99,76 99,80

180 0 0 98,21 99,80 99,73

240 0 0 78,18 99,78 99,81

При добавлении натрия эдетата в концентрации 0,0005 М и выше

наблюдался высокий стабилизирующий эффект, сохраняющийся как минимум в течение 4 ч. Таким образом, установлено, что для приготовления контрольного раствора необходимо добавление в него раствора натрия эдетата одновременно с раствором, содержащим ионы меди, после чего значение интенсивности флуоресценции остается на уровне фонового.

Таким образом, при определении подлинности КА следует регистрировать пик флуоресценции продукта конденсации КДА с ОФДА при длине волны возбуждения 340 им и длине волны испускания 425 нм.

Следующим этапом явилась разработка методики количественного определения КА в ЛП, представленных в различных лекарственных формах: витаминных порошках, витаминных глазных каплях, таблетках, инъекционных растворах, лекарственном растительном сырье, а также ее валидационная оценка.

В основу количественного определения КА положена флуориметрическая методика, для проведения которой используют ту же пробоподготовку, что и для методики качественного анализа, но при этом измеряют величину флуоресценции при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм. С целью выявления линейной зависимости была построена графическая зависимость интенсивности флуоресценции хиноксалинового производного КА от первоначальной концентрации КА в растворе (рис. 4.). Метрологические характеристики разработанной методики и методики, приводимой в НД (тетраметрической) приведены в табл. 7.

Концентрация кислоты аскорбиновой, мг/мл

Рис. 4. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации кислоты аскорбиновой в растворе.

Таблица 7. Данные для сравнительной метрологической оценки двух

методик количественного анализа субстанции кислоты аскорбиновой

Титриметрическая методика Флуориметрическая методика

Содержание Метрологические Содержание Метрологические

кислоты характеристики кислоты характеристики

аскорбиновой, % аскорбиновой, %

99,80 хср=99,29±1,023 99,89 хср=99,29±0,932

98,80 í=5; S2=0,158417; 100,3 Г=5; Б2=0,7564;

99,75 S=0,3980; 98,83 8=0,8698;

99,10 Р=95% 98,03 Р=95%

99,10 t(P,f)=2,57 98,69 t (Р,0=2,57

99,20 Еср=1,03% 99,79 Еср=0,97%

Валидацию разработанной методики осуществляли по показателям: линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации определяемого вещества в растворе, аналитический диапазон концентраций, специфичность и точность (правильность и прецизионность) в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Специфичность методики определялась методом добавок (табл. 8.). Полученные результаты свидетельствуют о воспроизводимости и специфичности предлагаемой методики.

Таблица 8. Определение содержания кислоты аскорбиновой в растворе _методом добавок_

Содержание Введено Найдено Абсолютная Относительная

кислоты кислоты всего, ошибка, мг ошибка, %

аскорбиновой в растворе, мг/мл аскорбиновой, мг/мл мг/мл

0,0501 0,0121 0,05920 -0,0030 ±4,82%

0,0508 0,0243 0,07390 -0,0012 ±1,60%

0,0512 0,0373 0,08970 +0,0012 ±1,30%

0,0498 0,0501 0,10035 -0,00045 ±0,45%

Валидационные характеристики разработанной методики даны в табл. 9.

Таблица 9. Валидационные характеристики флуориметрнческой методики _количественного анализа кислоты аскорбиновой_

Показатель Значение

Линейность у=25,87569х+0,323059

Аналитический диапазон 0,008-0,09мг/мл

Специфичность коэффициент корреляции 0,99906

Правильность критерий Стьюдента 0,23-1,48

Точность Е < 2%

Таблица 10. Метрологические характеристики количественного анализа кислоты аскорбиновой методом флуоримстрии в некоторых _лекарственных препаратах, содержащих КА__

{ Хсо I Б2 Б | Р | Т(Р,Л Ахсп | Е, %

Таблетки кислоты аскорбиновой 0,025г

5 0,0251 г | 1,03*10-" 0,00008 | 0,95 | 2,57 0,00022 | 0,91

Таблетки кислоты аскорбиновой с глюкозой, 0,1

5 0,0884 г | 6,588* 10"6 0,00257 | 0,95 | 2,57 0,00178 | 1,92

Компливит

8 49,50 мг | 0,6356 0,7972 | 0,95 | 2,36 0,6270 | 1,27

Раствор кислоты аскорбиновой 5% для инъекций

5 0,0501 гИ 7,23*10"7 0,00085 | 0,95 | 2,57 0,00060 | 1,19

Витаминный порошок №3 «Антигриппин»

5 0,286 г \ 1,37*10'6 0,0012 | 0,95 | 2,57 0,003 | 1,05

Плоды шиповника

5 0,399 Т 1,2* Ю-4 0,0109 1 0,95 1 2,57 0,0115 | 2,87

Витаминные глазные капли

5 0,050 г | 1,10*10"6 0,00105 | 0,95 | 2,57 0,00085 | 1,71

Апробацию методики проводили на лекарственных препаратах

заводского производства и мелкосерийного изготовления (внутриаптечная заготовка и фасовка) содержащих КА, а также на лекарственном растительном сырье «Плоды шиповника». Результаты анализа статистической обработки данных количественного анализа ЛП, содержащих КА, подтверждают правильность выбранной методики (табл. 10.).

Разработка флуорнметрической методики качественного и количественного анализа кислоты фолиевой в лекарственных средствах (Глава 4).

Для разработки методик проведен комплекс исследований по изучению оптимальных условий определения подлинности кислоты фолиевой и ее количественного содержания без использования окисляющих реагентов: концентрации анализируемого витамина, условия проведения определения -температуры, времени, рН среды, длин волн.

Для выбора оптимальной длины волны возбуждения проводили измерения интенсивности флуоресценции раствора кислоты фолиевой (5 мг/мл) в двумерном режиме (рис. 5.). Анализ в двумерном режиме, когда одновременно меняется длина волна возбуждения и длина волны регистрации, позволяет выявить все пики флуоресценции и оценить их пригодность для фармацевтического анализа.

Рис. 5. Двумерное изображение максимумов флуоресценции кислоты фолиевой (5 мкг/мл) в буферном растворе при pH 9,2. Параметры измерения: чувствительность - низкая, задержка строба - 1,00мкс, длительность строба

4,90мкс.

На основании полученного спектра были выявлены следующие максимумы флуоресценции: при длинах волн волны возбуждения 225 и 275 нм и длине волны регистрации 335 нм (рис. 6,7.).

Ех = 225.0 пш

1.21.0-

0.2 0.0

Ех = 275.0 пт

,2 1.о 4

Рис. 6. Спектр регистрации флуоресценции раствора кислоты фолиевой (5 мкг/мл) в буферном растворе при длине волны возбуждения 225 нм

Рис. 7. Спектр регистрации флуоресценции раствора кислоты фолиевой (5 мкг/мл) в буферном растворе при длине волны возбуждения 275 нм

Нами были проведены серии экспериментов, связанные с изучением влияния рН среды на интенсивность флуоресценции КФ. Резкое усиление флуоресценции наблюдается после растворения кислоты фолиевой в растворе со значением рН среды 8^-10 (боратный буфер) на свету в аэробных условиях (рис. 8). Следующим этапом явилось исследование фонового излучения анализируемого раствора. С этой целью контрольный раствор готовили

следующим образом: в анализируемый раствор добавляли 0,1М раствор натрия гидроксида для получения раствора с рН 11-42. При этом интенсивность излучения снижалась до фонового значения (рис.9,10.). I

Рис. 8. Зависимость интенсивности флуоресценции раствора кислоты фолиевой (5 мкг/мл) от рН среды.

Таким образом, для определения подлинности субстанции КФ, может быть предложена флуориметрическая методика, основанная на регистрации двух пиков - при длине волны возбуждения 225 и 275 нм и длине волны регистрации 335 нм. Методика в последующем может быть реализована, в том числе и в комплексных лекарственных средствах и лекарственном растительном сырье, содержащих КФ.

✓Чг-

Рис. 9. Спектр регистрации флуоресценции кислоты фолиевой (5 мкг/мл) после добавления 0,Ш раствора натрия гидроксида при длине волны возбуждения 225нм.

Рис. 10. Спектр регистрации флуоресценции кислоты фолиевой (5 мкг/мл) после добавления 0,1М раствора натрия гидроксида при длине волны возбуждения 275 нм.

Для разработки флуориметрической методики количественного определения КФ в субстанциях использовали методику подтверждения подлинности. Измеряли величину флуоресценции при длине волны возбуждения 275 нм и длине волны регистрации 335 нм. Для расчета

количественного содержания был использован метод калибровочного графика. С целью выявления линейной зависимости строили графическую зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации КФ в растворе (рис. 11.).

1.4 1.2

I 1

|

I 0,8

с; ■&

| 0,6

0,2 о

0 5 10 1 5 20 25 30 35

Концентрация кислоты фолиевой, мкг/мл

Рис. 11. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации кислоты фолиевой в растворе.

Результаты статистической обработки результатов анализов разработанным методом и методом сравнения (ВЭЖХ) приведены в табл. 11.

Таблица 11. Данные для сравнительной метрологической оценки двух

методов количественного анализа субстанции кислоты фолиевой

Метод ВЭЖХ Флуориметрический метод

Содержание Метрологические Содержание Метрологи чес кие

кислоты характеристики кислоты характеристики

фолиевой, % фолиевой, %

97,49 хср=97,43±0,91 1=5; 97,71 хср=97,60±0,98

97,42 82=0,0530; 97,23 £=5; Б2=0,150

97,40 8=0,728; 98,04 8=0,387;

97,38 Р=95% 98,15 Р=95%

97,49 1 (Р, 0=2,57 97,27 1 (Р,1)=2,57

97,39 Еср=0,93% 97,86 Еср=1,00%

Валидацию разработанной методики осуществляли по тем же параметрам, что и методики, предложенной для анализа КА.

Для оценки специфичности методики было проведено определение содержания КФ методом добавок (табл. 12.).

Таблица 12. Определение концентрации кислоты фолиевой в

растворе методом добавок

№ Содержание Добавлено Найдено Абсолютная Относитель

п/п кислоты кислоты всего КФ, ошибка, мкг ная ошибка,

фолиевой в фолиевой, мкг %

растворе, мкг

мкг

1 5,113 1,278 6,522 +0,131 ±2,05

2 5,113 2,556 7,548 -0,121 ±1,58

3 5,113 3,835 9,088 +0,140 ±1,56

4 5,113 5,113 10,116 -0,110 ±1,08

Полученные результаты свидетельствуют о воспроизводимости и

специфичности предлагаемой методики.

Валидационные характеристики метода представлены в табл. 13.

Таблица 13. Валидационные характеристики флуоримстрнческой _методики количественного анализа кислоты фолиевой_

Показатель Значение

Линейность у=0,034838х+0,144556

Аналитический диапазон 0,5-8,0мкг/мл

Специфичность коэффициент корреляции 0,994276

Правильность критерий Стьюдента 0,13-1,02

Точность Е < 2%

Метрологические характеристики полученных результатов анализа свидетельствуют о возможности использования метода флуориметрии для оценки качества лекарственных препаратов, содержащих КФ.

Далее проводили апробацию методики на лекарственном растительном сырье и лекарственных препаратах, содержащих кислоту фолиевую. Результаты анализа, представленные в табл. 14., также подтвердили целесообразность применения разработанной флуориметрической методики для качественного и количественного анализа КФ в лекарственных препаратах. Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемая нами флуориметрическая методика определения КФ в лекарственных препаратах по точности сопоставима с методиками, регламентируемыми нормативной документацией

Таблица 14. Метрологические данные количественного анализа кислоты фолиевой методом флуориметрии в некоторых лекарственных ___препаратах___

f ХСр ^ ! .. 8 | Р 1 Т(Р,0 1 Ах™ 8,%

Таблетки кислоты фолиевой 0,001 г

5 1,0490 мг 1,467*10"6 0,00121 0,95 2,57 0,00126 0,12

Таблетки «Компливит»

5 97,99 мкг 6,61 2,57 0,95 2,57 3,83 1,91

Витаминные порошки (внутриаптчное изготовление)

5 0,0096 г 1,76*10"7 0,00042 0,95 2,57 0,0005 1,65

Листья крапивы

5 0,180 4*10"5 0,0063 0,95 2,57 0,066 3,68

Витаминные порошки (внутриаптечное изготовление)

5 0,0187 г 2,0*10"8 0,000128 0,95 2,57 0,000329 1,76

Таким образом, использование разработанных нами флуориметрических методик качественного и количественного определения каслоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в исследованных лекарственных средствах дает воспроизводимые и сопоставимые результаты, что позволяет сделать заключение о целесообразности внедрения и применения их в фармацевтическом анализе.

Общие выводы

1. Проведен сравнительный анализ методов, рекомендуемых отечественной и зарубежной нормативной документации для определения содержания кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой и определена необходимость разработки флуориметрических методик.

2. Разработана флуориметрическая методика определения подлинности кислоты аскорбиновой, основанная на ее окислении до кислоты дегидроаскорбиновой с последующей конденсацией с о-фенилендиамином. Установлено, что для ее проведения необходимо использовать в качестве окислителя меди ацетат, в качестве стабилизатора контрольного раствора -натрия эдетат, рН раствора должно находиться в пределах от 4 до 5. Измерять величину интенсивности излучения следует регистрировать при длине

возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм.

22

3. Для проведения количественного определения кислоты аскорбиновой следует использовать ту же пробоподготовку, что и для определения подлинности. Измерять величину интенсивности излучения следует при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм.

4. Проведена валидационная оценка разработанных флуориметрических методик количественного определения кислоты аскорбиновой но показателям: линейность, аналитический диапазон, специфичность, правильность (точность и прецизионность), которая показала ее пригодность для использования в фармацевтическом анализе.

5. Разработана флуориметрическая методика определения подлинности кислоты фолиевой. Определены оптимальные условия для ее проведения. Установлено, что необходимо использовать боратный буферный раствор с рН 9,2. Пик флуоресценции регистрируют при длине возбуждения 275 нм и длине волны регистрации 335 нм.

6. При проведении количественного определения кислоты фолиевой следует использовать ту же пробоподготовку, что и для определения подлинности. Измерять величину интенсивности излучения следует при длине волны возбуждения 275 нм и длине волны регистрации 335 нм.

7. Проведена валидационная оценка разработанных флуориметрических методик количественного определения кислоты фолиевой по показателям: линейность, аналитический диапазон, специфичность, правильность (точность и прецизионность).

8. Разработаны методические указания для оценки качества кислоты аскорбиновой и кислоты фолиевой в лекарственном растительном сырье и лекарственных препаратах промышленного производства и аптечного изготовления.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Таубэ, A.A. Флуориметрия в оценке качества лекарственных и лечебно-профилактических средств, содержащих аскорбиновую кислоту / A.A. Таубэ, Е.И. Саканян // Подготовка кадров для фармацевтической промышленности. Сборник научных трудов юбилейной конференции посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств.- Санкт-Петербург,- СПб.: Изд-во СПХФА, 2005.- С. 146-148.

2. Таубэ, A.A. Контроль качества фолиевой кислоты в готовых лекарственных формах флуориметрическим методом/ A.A. Таубэ, Е.И. Саканян // Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики: материалы региональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию фарм. фак-та КГМУ. - Курск, 2006.-С.248-250.

3. Таубэ, A.A. Флуориметрическая методика определения кислоты аскорбиновой с использованием в качестве окислителя раствора меди (И) ацетата/ A.A. Таубэ, Е.И. Саканян, Е.В. Галушина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. -Пятигорск, 2007,- Вып.62.-С.412-414.

4. Таубэ, A.A. Валидационная оценка флуориметрической методики количественного определения кислоты аскорбиновой в лекарственных препаратах/ A.A. Таубэ // Объединенный мед. журнал.- 2007,- № 2.- С. 43-47.

5. Таубэ, A.A. Флуориметрия в оценке качества витаминсодержащих лекарственных средств и БАД к пище/ A.A. Таубэ // Молодые ученые-практическому здравоохранению: тез. докл. региональной научн. конф. студ. и асп. г. Санкт-Петербург, 18-19 апреля 2007 года.-СПб.- 2007.-С.38-39.

6. Таубэ, A.A. Оценка содержания кислоты аскорбиновой в лекарственных препаратах флуориметрическим методом/ A.A. Таубэ, Е.И. Саканян, Е. В. Галушина // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии,- Москва.-2007.- № 4,- С.42-45.

7. Таубэ, A.A. Флуориметрическая методика оценки количественного содрежания кислоты фолиевой в составе препарата «Компливит» / A.A. Таубэ, Е.И. Саканян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2008,- Вып.63.-С.342-343.

Подписано в печать «10» февраля 2012 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 223

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.