Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Флуоресцентный анализ лекарственных гетерофункциональных соединений в многокомпонентных формах, биоматериалах и воздухе рабочей зоны по продуктам деструктивных реакций

МИШСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

БАРАНОВ ВАСИЛИЙ ПАВЛОВИЧ

ФЛ70РЕСЦЕНТШЙ АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ГШРОФУНКЦИОНАЛЬШХ СОЕДИНЕНИЙ В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ <10 ШХ, ШОМШИТАЛАХ И ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЭОШ ГО ПРОДУКТАМ ДЕСТРУКТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

15.00^02 - фармавдвтичаская хптя и Фаршкагкозкя

АвтораФврат диссертации на соискание ученой степени кандидата фарщдавтичвскпх наук

!.!0СКВА - 1994

и-'

\.

Работа шиши на в Московской Ыыдцкцникой Аиадишм им. И.М.Сеченова

Научный руноводитоль: - доктор химических наук, профессор Ершов Ю.А.

Официальные оппошнш:

- доктор фармацевтических наук, про] оссор Бирдянд A.C.

- доктор фармацезтаческих наук , профессор Решетник В.Ю.

Ведущая организация : Центр химии локарствешпис средств - Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт

Защита диссертации состоится " "----- 1994 г

в _ часов на заседании специализированного Совета

Д.074.05.06 при Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (I2I0I9,Москва,Суворовский бульвар,13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Академии (Москва,Зубовская пл.,1)

Автореферат разослан " " - 1994 г.

Ученый секретарь специализированного Совета Д.074.05.06 , кандидат фар-мацеьлческих наук , доиент

Садчикова Н.П,

ОНЦАЯ ХАРАКТЕ РЛ (ПИК А РАБОТЫ

Актуальность теш. Современные методы анализа лекарственных средств (ЛС) основаны на исгользовшшп высокочувствительных методов,обладающих большой сэлективностыо.В то же время эти избирательные и экспрессные метода должны быть доступны любой лаборатории,просты в выполнении и надежны в результатах.Всем этим требованиям отвечает метод флуориметрии,позволяющий быстро и точно проводить определение уровня препаратов в с&южидкос-тяж организма,особенно при изучении ¿недоступности и фармакоки-юики лекарственных веществ (ЛВ),а таю® необходим для контроля качества лекарственных препаратов сложного состава или с невысокими (например,гомеопатическими) концэнтравдями ингреда-ентов.Фдуориметрия успешно может исгользоваться для анализа загрязнений внешней средн.

Поэтому работа ,направленные на гоиск новых способов флу-ориметрического анализа ЛС, необходим* и интересны ещё и потому, что механизм* реакций образования флуорофоров,продукта этих ре-акпдй на всегда изучены.Одна из наиболее актуальных проблем -.экологическая чистота фармпроизводства.Не секрет,что это одно из наиболее вредных в экологическом отношении химических отраслей промышленности. И здесь,как нигде, должен быть жестким контроль чистота атмосферы,особенно воздуха рабочей зоны.Для этого соответствующие гигиенические слуяСЬ,отделы и лаборатории должны быть вооружены экспрессными,чувствительными методикам! ана-лиза.Флуориметрия,обладающая этиш положительными качествам, должна занять достойное место в арсенале химика-гигиениста.

Цель*и задачи исследования. Целью настоящей работа яаляется разработка новых методик флуоресцзнтного количественного определения лекарственных веществ разных груш в многокомпонентшх смесях,биологических объектах и во внешней среде.

Для достижения поставленной цэли необходим) било решить слэдувдие задачи:

I.Осуществить гоиск и отбор реакций с ниютинашдом,димедролом и промедолом .заканчивающиеся образованием флуоресцентных продуктов.

2.Изучить состав и спектральные характеристики (Спектры,квантовые выходы флуоресцэнвди,сдвиг Стокса) продуктов этих реакций.

3.Разработать оптимальные условия проведения флуоресцентных реакщй с исследуемыми ЛВ.

4.Использовать оптимальные методики флуориитрии ЛВ для исследования стабильности новой многокомпонентной лекарственно-витаминной смеси противошокового действия в течение долгосрочного хранения.

5.Разработать флуориметрические методики анализа в биомэтериале для препаратов .представляпцих токсикологическую и социальную опасность (промедол,димедрол).

б.Определить уровни ЛВ в рабочие моменты технологического производства, используя метод флуоркметрии.

Научная новизна. Для производных ни кэ тиковой кислоты (никоти-намид),бензгидрола (димедрол) и пиперидина (лромедол) впервые созданы чувствительные .безопасные и селективные способы флуо-риметрического анализа,измерены квантовые шхода флуоресданцаи продуктов реакций,лежащих в основа этих способов,с использованием оригинальной,простой,доступной модифицированной модели измерения и расчета.

С помощью флуориматрии и тонкослойной хроматографии (ТСХ) подтверждена устойчивость перечисленных ЛВ в одном составе (противошоковом раствора на основе полиглюкина) при хранении этой лекфорш (JES) в течение 3-х лет.Это позволило предложить для кнфузгонного лечения и профилактики шока в условиях массовой травматизавди медслужбам граждансюй обороны и скорой гомэщи адекватную пропись новой JES,готовилась которая ранее только экс-те морально.

По результатам флуориметрии димедрола в биотканях разработана экспериментальная модель определения степени всасываемости препаратов через слизистую носа.

Материалы исследований защищеш охранными документами. Публикации ; По материалам исследований опубликовано 10 работ: 4 изобретения,2 статьи,2 тезисов докладов,I депонированная рукопись и получена I приоритетная справка от ВНШГПЭ па пропись противошокового раствора.

Практическая значимость таботы. Предложенные методики флуори-метрического анализа нлиотинамнда,димедрола и промедола рекомендованы для контроля качества Л3> в условиях аптек,контрольно-аналитических лабораторий,центральных заводских лабораторий фармацевтических заводов (КАЛ ОблАШ" г Литы).

Способы анализа димедрола и промедола в биотканях прошли испытания в Областном бюро судмедэкспертизы (г.Чита).

Флуориметрическое определение тиамина и пиридоксина в био-яидкостях использовались в лаборатории промышленной токсикологии НЖДС (г.Купавна) при разработке' и уточнении 1ЩК этих веществ в атгосфере.

В реальных условиях производства апробирована методика флуориметрического анализа тиамина в воздухе рабочих пометений

- 4 -

комбината "Белвитамины'Чг.Белгород).

Способ анализа димедрола в биологических объектах применялся в эксперименте на кафедре ЛОР-болезней (Курский мединститут,г.Курск) при разработке модели оценки степении всасываемости ЛВ через клеточные и тканевые барьеры.

Способ флуориметрического анализа никотинамида внедрен в учебный процесс кафедр бионесрганической и биологической химии Читинского мединститута (г.Чита).

Апробация работа. Результаты исследований доложены на конференциях СНО и молодых ученых ММА в 1992 и 1993 гг.(г.Владимир,г.Суздаль) и на межкафедральной конференции кафедр неорганической, аналитической и фармацевтической химии фарьфа куль те та МГЛА в 1993 г.

Положения . выдвигаемые на защиту. На защиту вынося тся:

- разработка адекватных методик и оптимизация условий проведения флуоресцентного анализа нию тинами да .димедрола и промедо-ла;

- установление состава и спектральных характещстик продуктов деградации ЛВ,обладающих флуоресценцией;

- пропись самостоятельной ЛФ (противошоковый раствор). Структура и объем работы: Диссертавдя изложена на 159 страницах машинописного текста,содержит 23 рисунка и 35 таблиц.Диссертация состоит из введения , 5 глав,выводов и списка литературы,который включает 223 источника.

Во введении обоснована актуальность работ,сформулированы цель и задачи исследования.1 глава (обзор литературы) посвящена методам анализа гетерофункционалышх соединений.Особое внимание уделено определению органических веществ с использованием люминесценции.

Во 2-й глава представлены материалы и метода исследования,описаны методики измерения интенсивности флуоросшнвди ЛВ,расчетов спектральных характеристик,поиска лгадшесшнтных реакций с ЛВ и. методики определения оптимальных условий проведения этих реакций.

В 3-й главе представлены результата анализа промедола,ни-котинамада,димедрола 'и других витаминов в простых и сложных Ш>, проведано обоснование оригинальной прописи и доказана целесообразность сочетания в ней указаных ЛВ с полиглюкином.

В главах 4 и 5 приведены результата флуориметрического определения уровня ЛВ в воздухе рабочей зоны фармпрэдпрзятий и в биологических объектах.

СОДЕГЕАНИЕ РАГОШ Материалы и методы исследования

Обьекш исследования. В качество анализируемых веществ были топэльзовани ЛВ гетерофункционального строения (соединения разных химических групп:производные пиридина,бензгидрола.шшари-дийа и таазола)»широко распострананшэ в клинической практике, нмевдие достаточную историю использования .анализируемые разнообразными методами,часто включаемые в много-компонентные лекарственные композиции (например,поливитамины),не обладающие флуоресценцией в неизмененном виде (исходном со стоянии). Выбраны для изучения ЛВ,отвечающие всем этим требованиям: димед-юл,промедол,ниютинашд,ш!ридоксшг,даэтиламид никотиповой кис-ютн и таадан , в различные ЛФ (субстанции,таблетки,иньении-|нные растворы,драяе.ипфузпонный раствор).

Биологическими объектами исследования бшш кровь,моча, ¡елудочлое содержимое и слизистая носа экспериментальных жи-

вотных и тругов ладей,получавших препарат парентерально,пзро-рально и ингаляционш.

В качества основного и главного метода анализа является флуориметрия.Для корелляции результатов флуориметрии использовали неюдное титрование по Госфармакопее , а также используемую в практике фарманализа тонкослойную хроматографию. Реагента и при бот. Для проведения реакций исюльзовались реагент: формальдегид в юнцэнтрировакной серной кислоте (анализ гшомедола),хлоралгидрат с раствором гидроксида натрия (никоти-намид), уксусный ангидрид и серная кислота (димедрол),перманга-нат калия+пероксид водорода+соляная кислота+раствор аммиака (Вд), гексацианоферрат(3)калия с раствором гидроксида натрия (В^), раствор тетрароданокобальтоата аммония в серной кислоте (даэтил-амид ниютиновой кислош).

. Для разделения ингредиентов противошоковой смеси использовалось тонкослойное хроматоградирование на "Силуфоле" в 2-х различных системах растворителей для каждого ЛВ(Таблица 4).

Для экстракции .растворения и хроматографирования продуктов флуоресцентных реакшй с ЛВ использовались растворители:изопро-панол,этанол или димегалТормамид (димедрол),изоамиловый спирт (В^.нлнотинамид).дистиллированная вода(проыедол,В£,ништинамид), бензол,диоксан (ТСХ димедрола).пиридин,н-пропанол,мочевина 20£, ыуравьиная кислота (ТСХ В^ и никотинамида),метанол,хлороформ (ТСХ диэтиламида никотиновой кислоты) .ледяная С^СООН,ацетон (ТСХ В0 и никотинамида).Все реагенты и растворители соответствовали классу"хч*1,"чда";,чя или стандартам Госфармаюэпеи.

Для обнаружения пятен ЛВ при ТСХ смеси исгоьзовали 1£ (В^), реактив Драгевдорфа (димедрол,диэтиламид НК).сульфат меди 10% (никоаинамид),УФ-св8Т (В^ )

Интенсивность флуоресцэнвди растворов измеряли на отечественных флуориметрах ЭФ-ЗМА(КШИ, 1&1А), "Кван т-5 " (КГГ.Я),ФМЦ-2(т. Купавна),ФАС-1(г.Чита) с наборам стеклянных светофильтрах.

Спектры флуоресцвнщи продуктов реакций снимали на спектро-флуориметрах МШ?-2А"Хитачи"(ЧГМИ.ВНИВИ г.Москва), "Перкин-Елмер" (ГИШдаЕТ,г.Москва).

Спектры поглощения продуктов реакций снимали на пишущем спектрофотометре "Спекорд-УВ"(Германия) в УФ-даапазонэ (200-400 нм).

Для идентификации продуктов реакщи с димедролом и никотина ми дом снимали С^ЯГЛР-спектры на "Спектрум"(ИРЕА) и "Брукер" (НИИГНИ,г.Москва),используя стандарты - Д20«аЦбтон»'И''С(тетра-метилсилан).

Визуально регистрировали флуоресценцию с помощью излучателя УФ-света марки Л-60 со светофильтрами УФС-3.Пробы прогревали и высушивали на бане ТБ-110 с терморегулятором«Измерение рН среда растворов при определении оптимальных условий реакций проводили на потенциометре ЗВ-74 или ЛПУ01.Оптимальный режим работа приборов корректировали по трем буферным растворам срН в •разных участках шкалы.Оптическую плотность (экстинвдю) растворов для расчета коэффициентов молярной экстинции при вычислении квантового выхода флуоресценции,для установления зависимости выхода продуктов реакции с димедролом от концентрации серной кислоты и для экстракционно-фотометрического анализа диэтиламида НК измеряли на фотоэлектроколориметре КЗД-2. Расчета и измерение квантового выхода Флуоресценции продуктов реакций с ЛВ. Использовалась модифицированная методика Паркера, заюпочаидаяся в измерении интенсивности флуоресценции измеряемого растворал стандарта (раствор вещества с известным квантовым выходом),сравнении этих величин в соотношении с коэффициентами

..... 8 -

в соотношении с коэффициентами молярной экстинвди £ этих вещэста по уравнению

где у - квантовые выходы флуоресценции,I - интенсивности флуоресценции,отн.ед.; Т - титр измеряемых растворов,мкг/мл; М -молярные массы веществ,г/моль.

В ксчестве стандарта использовался раствор хинкна-сульфа-та в 0,5 моль/л серной кислоте,}«антовый выход которого известен (0,55),

Особенностью модифицированной методики измерения и расчета квантового выхода является простота и доступность вследствие исключения при вычислениях коэффициентов спектральной чувствительности и перепоглощения света . Это достигается измерением интенсивности флуоресценции сверхразбавленных растворов флуоро-форов , когда процессы реабсорбции излучения исключены.Особенностью методики является использование коэффициента молярной экст инции,измеренного на длине волны возбуждения флуоресценции и замена значений площади шд спектрами флуоресценции на соотношение величин интенсивностай флуоресцэнвди в опыте и стандарте.

Методика проведения анализа ЛВ в воздухе рабочей зоны Фармптю-изводств. Флуоримеория использовалась дог определения'уровня загрязнения воздуха производственных помещений пылью исследуе-шх веществ.Проводился отбор проб воздуха электроаспиратором с юнцэнтрапией пыли на фильтры АФА-8,объемная скорость (расход воздуха) составляла 100 л/мин.Вследствие шсокой чувствительности флуоршетрм сокращалось время накопления аналитически значимых количеств ЛВ-, и общее время'проведения анализа не превышало 15-30 минут,включая время отбора проб воздуха.

ст

Способ оценки степени всасываемости JIB через тканевые барьещ. Моделирование осуществлялось на кроликах,которым димедрол вводился в верхнечелюстную пазуху или внутримышечно.Затем производился флуориметртчэский анализ препарата вкрови. и в слизистой носа при разных состояниях слизистой (здоровая,воспаленная при инфицировании).По соотношений концэнтращй ЛВ в биоматериалах оценивалась скорость проникровения через клеточные и тканеше барьера в норме и при патологии.

ЭКСПЕШМЕНТАЛЬПАЯ ЧАСТЬ

I.Реакции деградации ЛВ с получением Флуоресщрулдих продуктов. Найде'ны флуоресцентные реакции с промедолом,никотпнашдом и димедролом .Для идентификации ниговшашда исгользовался хлоралгидрат в щелочной среде при нагревании ш схеме па)"(РисД) с

образованием формиата и нииэтината в реакционной смеси.Продукты

тч

реакции с киготинамидом реконструированы по результатам С ШР--спектроснопии (Рис.2а).Наблюдается трансверсия сигнала С-К= = 130,0 МД) амидной" группы в сигнал С-0(£ =166,85 МД) карбоксильной группы никотина та.

При продолжении известных реакций ^ормальдегада в концентрированной серной кислоте с промедолом и с серной кислотой (в присутствии уксусного ангидрида) с димедролом обнаружена .флуоресценция при продолжении путем растворения полученных окрашенных' продуктов в избытке воды (промедол,Рис.1б) и этанола или диметилфоршмида (димедрол,Рис. 1в).Продукта последнего этапа реакции с димедролом <4*ли восстановлены с помощью С^ЯМР-спектров (Рис.26) по исчезновению.сигналов ароматического (дифенильного) Фрагмента молекулы вследствие швода его в осадок в кислоте.При добавлении в реакционную смесь с димедролом уксусного ангидрида обнаружено значительное повышение шхода флуоро*оров-дмТошлт>-ного продукта - при растворении юс в изопропаноле.

ч

о

II

•Сч

^ [0] (с Г)

№0Н

\

0Ч1а

шюганамид

ни ко та на т

С( с - с(он)3 МЛВН „ м сн |+н„¡1

а)

хлоралгидрат

хлороформ

0

Ч-\

о-

промедол | СИ,

+ сн2о

рп формальна да гад

Н^04 о

* я-Ч^

хиноидшЯ конденсат

б)

а

г

димедрол

а

НС

ГУ

НС-0-(СН^-ЙН3\

.2+

50,

Н+

н+ и

\==/оксониевая соль

А

Ч<

О

ИЭС-С^ укс.анг

в)

+но-(снд,

' А

сна сНз

пмфл

-. уфлуоресцвнция

Рис.1.Схемы флуоресцентных реакций с ЛВ : а) с никотина-мидом б)с промедолом (проект) в)с димедролом

-II -

Дет флуоресцентного анализа пиридоксина использована известная реаквдя окислентмактонизапия Хафф-Пердцвейга по схе-

о-с.— О

ме

CHjOH

но

сн.

ридоксин

лактон-4-пиридокси-ловая кислота

При анализе тиамина исгользовалась известная флуоресцентная

реакция получения его окисленной формы - тиохрома (Ванг-Харрис),

экстрагйруешго в изоамиловый спирт в щелочной среде.

. ' Методики анализа ЛВ госноЕаннне на данных превращениях,

составлялись госяе оптимизации условий проведения реакций.

о

Pi-Cs

ми.

vs

о

лее

«Г

1S»

sr MD

17S ф Î6S Ï5 155 JSD ¡Ц5 S itt iij ¡25

СИ/

с,

'»,6

сн

CHjO

S.MO

M )зо 126 no <oo sa ■ m ro ta ¡o

TMC

cHjO cy m)t

Л) Ci « 30 20 10

S MO

Ркс.2.С^ЯМР-спектр; никотинамида (1а) и продуктов реакции с ним (2а):"ВШЕР? »,^=0,01 т/т в Д20, стандарт - ацетон.С^ШР-спектхн димедрола (16) в ' этаноле л продуктов его гидролиза в кислоте (26)

- 12 -

2'.Оптимальные условия проведения Флуррвсшнтных реакций с ЛВ И' спектральные характеристики продуктов. Определены (Таблица I):

- оптимальные концентрации реагентов;

- нижний предел обнаружения реакций (споообов анализа);

- линейные диапазоны зависишсти интенсивности флуоресценции от концентрации (титра) ЛВ ;

- температурные режимы реакций с никотинамидом и пиридоксином;

- рН среда реакционной смеси (рНц^=8,5 ♦ 9,0);

- перекрестное мешающее влияние другах ЛВ на проведение анализа;

- оптимальные соотношения объемов "растворитель:проба" при растворении флуоресцирующих продуктов (промедол,димедрол);

- спектральные параметры флуоресцентных продуктов - максимумы поглощения и флуоресцэнции продуктов,квантовый выход флуоресценции, сто ксов сдвиг;

- цодобраш оптимальные растворите ли-экстре генш ЛВ из пройЬ биома те риала или ЛФ и условия экстракции;

При сравнении спектров поглощения неизмененных ЛВ и продуктов реаквди практически не отмечено значительных изменений основных полос спектров,что свидетельствует о сохранности сопряженных систем фрагментов молекул в процессе реакщй.Гиперхромиза-ция основных полос спектров поглощения в результате реакций подтверждает со1дзащание безызлучательшх процессов в молекулах продуктов.

Э.Определение ЛВ в лэкйошэх. Разработанные методики флуоиимет-рического анализа использовались в контроле уровня ЛВ в односложных ЛФ:тайлетках,инъекционных растворах (Таблица 2) в сравнении с методами неводного титрования по Госфармакопее для димедрола,промедола и никотинамида.Отклонения содержания ЛВ в этих ЛФ при анализе обоими методами соответствовали допустимым по ПОТ.

Таблица I.

Оптимальные условия проведения реакшй с ЛВ и спектральные характеристики продуктов.

Оптимизируешй параметр

Димедрол

Способ I Способ 2

Промедол Ник-д Вд

Нижний предел • обнаружения, 2,0 мкг/мл

Линейный диа-пазон"1 _Н-Т", 2.2-(дкг/мл отн -700

Концентрации НеЗД реагентов нэнц.

0,05

0,08

0,7 0,5 0,02

0,05- 0.08- 0.7- 0,5- 0,02-70,7 -80,0 -50,0 До,0 -16,0

укс.анг: форшль- хлорзл-К.'п04гекеч-: Н^эси = дегад 1% гидрат 0,51 циаьо-=3:7 ' в Но30/ :№аОН= НЖ феррат к ¿1:1(5^ ¿Л калия р-ры) ист ' 9,01%,

5 М

Тешерастрные режиш о бра бот- -ки проб

Макстдум шгло- 376 щения, ш

Максимум флуор- л?о ресцэнвии, ш •

Стоксов сдвиг,нм 46

376

422 46

2-5 глин 20°С

398

Ю1Щ.Ь0Н

ш4он

5„мин Ю.мин -Ю0°С Ю0°С

368 351 378

434. 36

456 88

390

39

430 52

Квантовый выход флуоресц.

0,0022 ' (¿5,0004)

0,099 0,035 0,179 (¿0,018)(±0,006)(0,03)

Основные шло- 220- 220-сы спектров -233 -233 поглощения,нм

260-270

250, 2901 -325

235, 263

Анализу да мешают

промедол, тиа -мик.пиридоксин таопентал,ват.С 1шш тинашд

кордиамин

димед- димедрол,Вг рол,Вд кодеин,ди-корди- проме=- проме-медрол,С амин, дол.РР дол,РР димедр.корди- корди-промед.амин амин

Соотношения

обьешв "раст ________

воритель:проба" =1:9

НЗД :эта- изопро--..нол Ш.Ш) панол:

эба=

проба:

изоами-

ловый

спирт:

Экс трагант гексан_гексан хлороформ нзоамшг.ДЛФА Изоамил.

- 14 -

Флуориметричэский анализ иромэдола и никотинамида проверялся на моделях (искусственных смесях соответствующих реальным ЛФ) • "таблетки" и "инъекционный раствор"(Таблица 3).Наблйдаеше небольшое снижение уровней обоих ЛБ в модельном образце "таблетки" объясняется незначительной адсорбцией препаратов на твердых натлнителях и вспомогательных веществах,но учет этих потерь технически невозможен.

Таким образом,сопоставле.ше результатов анализа разными

методами в реальных ЛФ и искусственных смесях показало,что по

/

величине погеешкости анализа,достоверности,точности и воспроизводи шст и флуориметрические методики не уступают общепринятым нормативным и вполне шгут использоваться для контроля качества ЛС как метод выбора.

Проводилось флуориметрическое определение никотина ми да в сложных ЛФ драже поливитаминов "Пентовит"и "Декамевит".Найден-ные уровни никотинамида в поливитаминах (X = 0,0186 мкг/мл± +0,0013 ,А= ± 6,9%) для "Пентовита" и (X = 0,0495 + 0,0035 мкг/мл,А= + 7,0$) для "Декомевита"-свидетельствуют о возюж-ности исшльзовать новый способ для контроля качества сложных ЛФ - без ш делания чистого вещества и без предвар!тельной очистки проск.

4.Определение компонентов противошоковой смеси. Для лечения и профилактики травматического, шока предлагается шфузионно-ла-; ' карственный ко милекс,воздейчтвукщий на все основные патогенетические звенья шоковой болезни : болевая импульсация,гипоксия, гипотония,спазм периферических сосудов,выброс биогенных аминов, падение сердечной деятельности и нарушение всех видов обмена веществ и функции эндокринной системы.Все ингредиента должны: - не иметь противоречивого фармакологического действия;- иметь большую терапевтическую широту и многолетнюю апро-

Таблица 2.

Результата сравнительного анализа ЛФ (п = 10) флуориметрией и неводным титрованием по П>Х

лв Метрологич. Таблетки Инъекционный р-р величиш Флуоримет. Неводн. Флуоргает.Неводн.

Димедрол Содержание 0 05 г 1% - I 0 ПО ПРОПИСИ и,и° Г l/¡> - J-,U X + S 0,0465 ? 0,0483? 0,0913 + 0,0993 + мкг/мл| ТО,00084,+0,0004, +0,002, +0»0066, + ДД 93,0+1,8 96,5+0,8 ?2,2 99,3+0,7

Никотнна-мпд Содержание . n пТг _ т<? --Т о по прописи . u'Uiö г 1/0 .

X Sé" , 0,0139+ 0,0144+ 0,0106+ 0,0093+ мкг/шг, ТО,0003, То,0003 +0,0005, ТО,0002, +2,0 +4,56 +4,2 ? 2,12

Промедол Содержание- 0 025 г 2% - I 0 по прописи u»u<í0 г 1 +6 , 0,023+ 0,024+ 0,0192+ 0,0199+ 1лкг/ш, +0,0015, TO.00II, +0,0085, +0,011. + L ,% +6,4 +4,63 +4,7 + 5,3

Таблица 3.

\модэльные "Таблетки" "Раствор "1

^смеси ЛВ состав 4í'W/m состав ríí'T)/m

Промедол . : _ -1 тальк-0,01 стеаринов. к-та-0,025 крахмал-0,3 промедолО ,025 0.023? . +0,0013 i5|46) • вода для иньекций-- 1.0 промедол 0,02 0.020? +¿.0004

Нико тинамид тальк 0,006 • стеариновая к-та 0,025 крахшл0,02 ник-д 0,015 0.0137 + +0.00II ± 2,0) вода для иньекпий -1,0 ни го тинами д 0,01 0.0099+ +6,0002 tiM

бацига в клинической практике;

- не тлеть побочных токсических и аллертаческих эффектов;

- иметь широкий "терапевтический коридор" доз;

- прицельно воздействовать на свое патогенетическое звано шока;

-быть совместишм с другими комгошнтами смеси;

- обладать стабильностью при хранении;

- быть доступными и широко распостраненными в аптечной сети;

- иметь отечественное производство.

Всем этим требованиям отвечают ингредиента противошокового раствора "на основе полиглюкина,содержащего промедол,димедрол,кордиамин,витамины В]-,В£,РР в терапевтических дозах (Таблица 4). Хранение стерильного раствора проводилось в обычных условиях: в стеклянных флаконах емкостью 250 мл (марка стекла НС-1)',под пробкой с обкаткой алшиниевой фольгой при комнатной температуре, в темноте.

Флуориметричэски проводилось определение уровня каждого компонента смеси через 3 года хранения (Таблица 4).Дополнительно проводили ТСХ разделение компонентов смеси в 2-х различных системах раствэ]жтелей на каждое ЛВ (Таблица 4) .Для анализа ди-этиламида никотиновой кислота (кордиамина) исгользовался менее чувствительный экстракционш-фотометрический метод с тетраро-данокобальтоатом аммония в кислой среде,когда в водно-хлорофор-мно-эганольнуго смесь экстрагировался синий комплекс ЛВ,фтомет-рировался на 670 нм 0Е8),всвязи с наиболышй его концентращей в смеси (2500 мкг/мл); Флуориметрически и фотометрически выявлена почти полная сохранность компонентов смеси (90-100$ от исходного) через 3 года хранения без нарушения химической структуры, что подтвердилось совпадением значений при ТСХ исследовании в опыто и стандарте и отсутствием доголнительных фрагментарных пятон дериват-ов , образующихся в процессе хранения.

Таким образом сохранность ингредиентов смоси обеспечивает клинический эффект смеси после долгосрочного хранения и позволяет исгользовать её в виде самостоятельной лэкфорш. 5.Определение тиамина бромида в возлтхе рабочей зони . В реальных условиях производства в цехе тиамина комбината "Белвитами-ш" (г.Белгород) производился отйор проб воздуха электроаспиратором нафильтры АФА-8 с объемной скоростью 100 л/мин в течение 10 мин в помещениях сушки технического тиамина и'фасовки фармакопейного препарата на шеоте 1,5 м (уровень дахатель-шх органов аппаратчика) от пола.С фильтра пыль витамина бромида смывалась водой,в смыве производилось флуориметр1ческов определение концентрации витамина в воздухе с использованием граду-нровочных стандартных растю ров. IIa Сдано Bj в воздухе при сушке 1,73 мг/м3 ' и при фасовке порошка 5,02 мгД/3,что расценивается как превышение ОБУВ (определяемого безопасного уровня вещества) в воздухе,равного 1,0 мг/м3 (по данным НШ гигиены труда и профзаболеваний ,г.Москва)".

6.Определение ЛВ в биоматераалах. Разрабртанные методики флуо-римет;Еического анализа использовались для определения уровней ЛВ в различных биообъектах.

Промедол и димедрол (Способ I) определяли в искусственных смесях с кровью и мочой по 5,0 и 500,0 мкг/мл (X + S = 41,2 + + 0,95 мкг/мл в моче и I =35,8 + 3,76 мкг/мл промедола в крови , X + £ = 426,6 + 12,5 мкг/шгь в даче и X + 8 =430,7 + 11,0 мкг/мл в крови димедрола).Снижение уровня ЛВ в крови объясняется частичной адсорбцией препаратов на клетках,связыванием с балками сыворотки и ферментной деградацией (бяотрансформацией) мо-лекул^

1

00

Таблица 4.

результата флуориметртчесюго (фотометрического и хромато-графического анализа компонентов противошокового раствора через 3 года хранения (п=10, -Ъ= 2,26)

Ингредиент ^ з^Г! Ш%)

Значения

смеси

полигл. /мл " уяа&ык$ т ' опыт

стандарт

+ 5, п = 4 ,р<С0,01 при хроматографиров.

Цромедол °»С1 0,01

Димедрол

Никотина-мвд °»01

Пиридокси-на гидрохл.

Диэтиламид никот.к-ты

Тиамина

бромид °'06

50,0 50,0

50,0 250,0 2500,0 300,0

47,5 + 2,16 ( + 4,6)

48,7 + 1,86 34 ( + 3,8) • 63

46,5 + 4,31 75

(97,0 + 9,3) 30

230,8 ±1,8

(95,9 + 0,8) 61

2517,9 + 172,3 • 80

( + 6,7) 8

245.0 + 8,22 64

(98,0 + 3,35) 12

31 62 75 33

61

82 6

67 14

+ 1,5 ±0,5

+ 0,1

±1,0

±0,1

±1,0

+ 0,7

±1,5 ±1.0

Примечания: Для хроматографического определения В^ исгользовалась методика двойного разделения по Нюрнбергу,

Для анализа даэтьламида НК использовалась экстракционная фотометрия (Фармация, 1978,'Л ,с.89).

- 19 -

Флуориметрически'(Способ I) определялся димедрол при исследовании 2-х случаев судебно-у~\ячбской экспертизы по поводу непреднамеренного отравления грудных детей 6-ти и-5-ти суток от роду .ошибочно получивших перорально го 2,0 мл 1С$ растсора препарата,всвязи с чем наступила смерть через 3 и 6 часов после приема. Экспертизе были представлены" кровь,моча и желудочное содер-яиюе трупов с целью установления количества токсиканта в биода-териале.Вио найдено 0,0028 и 0,0042 мг/ыл ЛВ в крови, 0,0100 и О,0072 мг/т в моче и 0,0057 мг/мл в желудочном содеряииэм,что СУло расценено как шсоютоксичные юнцэнтрапии, вероятно приведено к смерти.

' Способ 2 (с предварительной обработкой уксусным ангидридом npoöj) флуориметрического анализа димедрола использовался для оценки всасываемости ЛВ из слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи кролигов.Ещго получено,что при введении полимерных (голь-этилэнглиюль ПЗГ.кербоксиметилцеллшоза КЩ) растворов препарата в пазуху носа концентрация его в крови не превышали терапевтическую длительное Epetfo - оюло 7 часов.

В серии исследования проинипаемости слизистой в корме и при

/

воспалении (I мл суточной культуры стафиллококка на агаре с Т= и I млрд микробных тел) после внутришшечного введения водного раствора димедрола 1,0-12 содержание его в нормальной слизистой оболочке пазух колебалось от 7,0 до 19,16 мкг/мл(г).В случае воспаления (3-й сутки после инфицирования) содержание препарата в слизистой составляло всего 2,67 - 5,63 мкг/г,то есть в 3 раза шяе,чем в здоровой серии кроликов.Эти результат подтвердила, что при воспалении поступление димедрола из, крови 'ерез лейкоцитарный барьер в слизистую резко снижается из-за изменения микроциркуляиии тканей.Это подтвердилось обратным экспериментом.

когда в пазуху разного состояния, вводали димедрол,причем,при введении препарата в воспаленную пазуху уровень димедрола в крови бел в 2 раза ниже,чем при введении в здоровую.

Флуориметрический способ с уточненными характерютиками флуоресценции и- условиями проведения реакций окисления "тиамин--тиохром" применекдля определения уровня свободного тиамина в крови 10 добровольцев женского шла 18-22 лет,здоровых,по случайной шборке.Определено ( X = 0,85 мкг/мя, + 0,34 мкг/мл) заниженное содержание витамина по сравнению со средними данными по человеческой популявди,что соответствует каршю общего авитаминоза - гиповитаминоза ив значительной степени (сезонность)*

Тиамин определялся (Таблица 5) в 1ф0ни и моче крю,подвергшихся острой 4-х часовой ингаляционной затравке шлью-того же витамина с целью определения степени токсичного препарата (уточнение ЦЦГС в воздухе).Уровень тиамина сопоставлялся с другими йюхимическимЕ показателями.По мере увеличения ингаляционной дозы достоверно повышался уровень хлоридов в моче и кальция в крови,аскорбиновой кислоты и холестерина в надпочечниках и сыворотке крош.а также активность лактат^-дегидрогеназы и ойцего фосфора шворотки (Сектор промышленной токсикологии НИИДС,Купавна)..

Тиамин в "сыворотке крови крыс после 18-ти суточного кормления фолиевой кислотой то Лиму на 3-й день госхэ выхода из эксперимента имел тенденцию к повышению на 20$ : 7. = 3,69 мкг/мл 6- ± 1,66 мкг/мл в контроле (п = 7) и X + <Г"= 4,45 + 1,57 мкгДа! в опыта (п = 10,1= 2,23).Нарушений в обмене витаминов при фоническом поступлении фолиевой кислотн ш обнаружено.

Ппрпдоксин определяли флусрс-лтричвск! б г.рот-:,: ьрнс-самцов получавших однократно шгаглц::о;;!:..' точогага 4 часов --иль того яе па тягана В$ на 3-1» день ¡.-..с*, зотракки с цэль>' о; •!щрв ток-

- 21- •

снческого действия пйридоксина при ингаляционном воздействии для расчета и уточнения 1Щ его в воздухе (Таблица 5).Отмечено сгосзение_ уровня Bg во 2-й и 3-й группах животных,то есть при получении самых больших ингаляционных доз.Это объясняется угнетением собственных синтетических механизмов обмена витамина при массивном поступлении его извне "(компенсация) и чрезмерной антитоксической защитной системой связывания и трансформации токсиканта,когда госле прекращения его поступления в организм сохраняется инерционно низкий уровень свободного пиридоксина.Эти процессы сопровождаются достоверным сшгаэниэм ионов натрия в крови по всем группам животных,пошшэнием активностей аланинтрансами-тзЫ,триглииэридов,глутамилтрансферазы (2 н 3 группы) и бутират-дэгадрогеназы (3 группа).

Таблица 5.

Результаты фДуориметрического анализа витаминов группы В в крови и моче крыс после острой 4-х часовой ингаляционной затравки пылью IB

Группы Концентрации животных, витаминов в IB количество воздутса , животных мг/м .

Концентрация X + б", _мкг/мл _

кровь

моча

контроль (интактн.) п = 8

1-я,п = 8

2-я,п = 8

3-я,п = 8

О

3,6 26,0 78,0

1,65 + 0,08 1,09/+ 0,1

1,35 + 0,13 1,07 + 0,1 1,82 + 0,11 1,15 + 0,13 1,88 + 0,07 1,07+0,15

контроль ' (интактн.) п = 7

1-я,п = 7

1-я,п = 6

3-я,п = 8

О

2,6 9,1 20.0

300,3 + 46,4

304,3 + 38,4 192,5 + 24,2 195,5 + 24,1

Полученные результата токсикологического исследования витаминов свидетельствуют о малотокспчности их при ингаляционном поступлении в организм даже в.болыпих концентрацияхГ

- 22 -

Подвода итог сказанному ,молено утверждать , что флуориметри-ческий анализ ЛВ велвдетше высокой чувствительности и специфичности позволил успешно решать задачи в токсикохимических , биохимических и судебно-химических исследованиях Которые,по-ви-дашму ,и явятся основными точками приложения и использования флуориметрии, помимо гигиенического анализа».

Наличие традиционных методов определения ЛВ не исключает поиск новых способов анализа,так как имеющиеся недостатки почти каждого метода несколько ограничивают их использование¿Примене-ние для анализа излучательной способности некоторых ЛВ в УФ-света открывает новые области исследований,имеет определенные преимущества перед обычными методами^'

ощие швода

1.Найдены деструктивные реаквди с ЛВ,продукта которых обладают флуоресценцией,в частности,установлено:

а) продукты деградации,димедрола в серной кислоте пред-отавляют собой, дифенильные производные,которые при растворениии в органических растворителях (спирт,даметилформамид) приобретают излучательные свойства;

б)использовакие ш!кроколичеств уксусного ангидрида значительно повышает шход.флуоресцентных продуктов димедрола в ре- ' акции с серной кислотой^

в)основными продуктами- реакции ниютинамида с хлоралгидратом в щелочной среде являются шшэтинат и формиат натрия.

2.Созданы новые высокочувствительные и селективные количественные способ анализа димедрола.промедола и никотинашда на основе флуоресцентных реаквдй посла уточнения оптимальных условий

гас проведения.'

3.Разработана простая методика измерения и расчета квантового шхода флуоресценции продуктов реакшй с ЛВ .исключающая исправления спектров поглощения п флуо'ресцэнвдл и введение дополнительных спектральных коэффициентов.

4.Способы флуориметрического анализа исшльзованы для контроля качества многокомпонентных и простых лввформ шкптинашда.промэ-дола и димедрола.

6.Флуориметрически и хроматографически доказана стабильность многокомпонентной лекарственно-витаминной композиции противошокового дейстшя при 3-х летнем хранении в одном составе с ноли-глюкином.

бИсгользование нового флуориметрического способа анализа димед*-рола в биоМатериале позволило разработать экспериментальную модель оценки степени всасываемости ЛВ в кровь через тканевые барьеры.

7.Модифицироваяная методика флуориметрического контроля уровня тиамина в воздухе рабочей зоны-успешно применена в условиях реального производства.

8.Использование модифицированных флуориметрических методик ана-

I

лиза елташнов Вд и В^в баоматериалах подтвердило малотоксич-пость их при ингаляционном воздейстши на животных.

Основные розультаты исследований опубликованы в следующих работах:

Х.К флуориматрческому определению тиашна хлорида и пиридокси-га гидрохлорида в многокомпонентной лекарственной-смеси.//Деп"."' ВИНИТИ Я5207-80.-Чита,1980.(с соавт.Хабаров А;А.,Рожинский М.М.) 2?Способ количественного определения 1,2,5-триметил-4-пропионил-

-океи-4-фенилпилеридана гидрохлорида.//Авт.свидетельство на изобретение Ж34467 (Бюллетень №20)¿1981.(с соавт. Хабаров A.A.,F0-жинский М.М.).

3.Способ количественного определения никотинашда./Двт.св. на изобретение №834468(Воллетень fê20),I98i;(c соавт. Хабаров A.A.).

4.Способ определения димедрола в биологических объектах.//Авторское св. на изобретение J5 93CŒ23 (Бюллетень Ж9),19В2.(с соавт. Хабаров A.Ai)

5.Определению промедола в лекарственных формах флуоресцентным мо то дом. //Фармация. -I983.-К4.-С. 62-64. ( с соавт. Хабаров A.A.).

6.Противошоковый раствор./ЛГриоритетная справка ВНИИГПЭ по заявке на изобретение' й 3608681/13(992305) ,1984. (с соавт. Рояинский М.М.,Хабаров A.A.).

7.Способ определения всасываемости лекарственного вещэства'./Двт. св. на изобретение № 1553895,1990.(с соавт. Пискунов C.S. и др.).

8.Проникновение димедрола в слизистую оболочку верхнечелюстной пазухи в норме и в условиях бактериального воспадения.(Экспериментальное исследование).//Йурнал ушных,носовых и горловых болез-ней.-Киев:Здоров»я,1990,- JC6.— С.43-45. (с соавт. Ельков И.В., Ховрина М.П,).

9.Основы флуоресцентного анализа производного бензгидрола.//Материалы конференции CHD им. И.И.Пирогова ММА "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины." г.Владимир,I992.-C.II. ( с соавт. Загоскина О.В.).

10.Измерение квантового шхода флуореспэнции окисленной форм витамина Bj.//Материалы 90-й конференции СШ ММА "Клинические и экспериментальные.исследования в медицина",г.Суздаль,1993,--С.45.(с соавт.Загоскина О.В.).

УЧАСТОК МНОИИТЕЛЬНОЯ TE"H!1I<Ü 30HL! Ai-ÎH СССГ> ПОДП.. К ПЕЧАТИ 2-94 Л^-- ЗАКАЗ 47 ТИРА:: ÎÛÔ 2(3.