Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Разработка алгоритмов лечения пациентов с очаговой склеродермией на основании особенностей экспрессии генов системы АР-1

На правах рукописи

ш^

Вавилов Владимир Владимирович

РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМОВ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С ОЧАГОВОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ НА ОСНОВАНИИ ОСОБЕННОСТЕЙ ЭКСПРЕССИИ

ГЕНОВ СИСТЕМЫ АР-1

14.01.10 - Кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005557667

5 ЯНЗ 2015

Москва 2015

005557667

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава Российской Федерации.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Потекаев Николай Николаевич Официальные оппоненты:

Баткаев Эдгем Абдулахатович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической микологии и дерматовенерологии факультета повышения квалификации медицинских работников ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки Российской Федерации

Матушевская Елена Владиславовна - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры дерматовенерологии и косметологии ФГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава Российской Федерации

Защита диссертации состоится « _2015г. в « ^ » часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.040.10 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава Российской Федерации по адресу: 119991, г.Москва, ул. М.Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава Российской Федерации по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49. и на сайте организации www.mma.ru

Автореферат разослан « » /X 201 ■Ь г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук,

доцент Чебышева Светлана Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Актуальность проблемы лечения больных очаговой склеродермией (ОС), прежде всего, обусловлена распространенностью дерматоза, так как склеродермия является вторым по частоте заболеванием из группы болезней соединительной ткани, ее распространенность составляет 32-45 случаев на 100 ООО населения и за последнее десятилетие отмечается неуклонный рост заболеваемости [Takehara К. et al., 2005; Varga J., 2008; Yokoyama Y. et al., 2011]. Несмотря на достаточно большое количество исследований, этиология и патогенез ОС остаются до конца невыясненными. На сегодняшний день очаговая склеродермия рассматривается как хроническое заболевание, сопровождающееся нарушениями клеточного иммунитета, микроциркуляции и повышенным коллагенообразованием в результате сложного взаимодействия повреждения и дисфункции эндотелиальных клеток, воспаления, аутоиммунных реакций и активации фибробластов [Хамаганова И.В., 2001; Гусева Н.Г. и соавт.,2002; Довжанский С.И., 2002; Trattner A. et al., 1994; Sato S. et al., 2001; Tasker GL. et al., 2003].

Нарушения сигнального пути TGFp принято считать основными молекулярными механизмами развития фиброза при склеродермии [Cotton et al., 1998; Ihn et al., 2001; Kubo et al., 2001; Zavadi et al., 2005; Ferrari et al., 2005]. При этом транскрипционные факторы семейства АР-1 являются ключевыми сигнальными молекулами пути TGFp.

Takehara К, Sato S. Localized scleroderma is an autoimmune disorder //Rheumatology (Oxford). - 2005. - Vol. 44, N 3. - Pp. 274-279.

Varga J. Systemic sclerosis: an update // Bull NYU Hosp Jt Dis - 2008. - Vol. 66, N 3. - Pp. 198-202.

Yokoyama Y, Akimoto S, Ishikawa O. Disaccharide analysis of skin glycosaminoglycans in atrophoderma of Pasini and Pierini // Clin Exp Dermatol - 2000. - Vol. 25, N 5. - Pp. 436-40.

Хамаганова И.В., Савина М.И., Свешникова E.E. Характеристика ядерных компонентов лимфоцитов при очаговой склеродермии // Рос. журн. кожн. и вен. бол. - 2002. - № 4. - С. 42-44.

Довжанский С. И. Клиншсо-иммунологические параллели при ограниченной и системной склеродермии // Рос. журн. кожн. и вен. бол. 2002, № 4. С. 25-29.

Trattner A, David М, Sandbank М. Bullous morphea: a distinct entity?//Am J Dermatopathol - 1994. - Vol. 16, N414-417. Tasker GL. Wojnarowska F. Lichen sclerosus // Clin Exp Dermatol - 2003. - Vol. 28, N 2 - Pp. 128-133.

Cotton SA, Herrick AL, Jayson MI, Freemont AJ: TGF beta--a role in systemic sclerosis? // The Journal of pathology - 1998. - Vol. 184, N1.-Pp. 4-6.

lhn H, Yamane K, Kubo M, Tamaki K. Blockade of endogenous transforming growth factor p signaling prevents up-regulated collagen synthesis in scleroderma fibroblasts: association with increased expression of transforming growth factor p receptors // Arthritis Rheum - 2001. - Vol. 44, N 2. - Pp. 474-80.

Kubo M, Ihn H, Yamane K, Tamaki K. Up-regulated expression of transforming growth factor p receptors in dermal fibroblasts in skin sections from patients with localized scleroderma // Arthritis Rheum - 2001. - Vol. 44, N 3. - Pp. 731-734. Zavadil, J., E.P. Bottinger. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions // Oncogene - 2005. -Vol. 24 - Pp. 5764-5774. Ferrari N, Pfeffer U, Dell'Eva R, Ambrosini C, Noonan DM and Albini A The transforming growth factor-beta family members bone morphogenetic protein-2 and macrophage inhibitory cytokine-1 as mediators of the antiangiogenic activity of N-(4- hydroxyphenyl) retinamide // Clin Cancer Res - 2005 - Vol. 11, Pp. 4610-4619.

Они регулируют экспрессию гена коллагена 1 в фибробластах кожи, а также

стимулируют прогрессию клеточного цикла за счет модуляции регуляторов клеточного цикла, таких как циклин Din циклин Е [Liska et al., 1990; Slack et al., 1995; Chung et al., 1995; Shaulian et al., 2001]. Также известно, что гены АР-1 задействованы в воспалении и контроле клеточного цикла, опосредованно участвуя в процессах пролиферации, морфогенеза, апоптоза и дифференцировки клеток [Hess et al., 2004; Пирузян Е.С., 2007; Palumbo et al., 2011; Reich et al., 2009]. Однако до настоящего исследования изучение системы АР-1 как компонента регуляции синтеза коллагена на генном уровне при ОС не проводилось, хотя можно предположить их непосредственное участие в патогенезе склеродермического процесса. В связи с этим особую актуальность приобретает оценка экспрессии генов в очагах поражения при очаговой склеродермии, результатом которой может стать углубление представлений о формировании и прогрессировании ОС и расширение возможностей патогенетически обоснованного лечения.

В этом плане теоретические предпосылки для применения при ОС имеются у препарата такролимус, который является макроциклическим лакгоном [Kroft et al., 2009]. Такролимус ингибирует фосфотазу кальцинейрина, MAP киназы JNK и р38, и таким образом препятствует задержке Т-клеток в G0 фазе за счет активации ядерных транскрипционных факторов NFAT и АР-1, вызывая иммуносупрессивный эффект [Barbarino et al., 2013]. При этом в мировой литературе имеются лишь единичные сведения о применении такролимуса при лечении больных ограниченной склеродермией.

Liska DJ, Slack JL. Bomstein P. A highly conserved intronic sequence is involved in transcriptional regulation of the al(I) collagen gene // Cell Regul - 1990,-Vol. 1, N 6. - Pp. 487-498.

Slack Jt., Parker MI, Bornstein P. Transcriptional repression of the al(I) collagen gene by ras is mediated in part by an intronic API site // J Cell Biochem - 1995. - Vol. 58, N 3. - Pp. 380-392.

Chung KY, Agarwal A, Uitto J, Mauviel A. An AP-1 binding sequence is essential for regulation of the human alpha2(I) collagen (COL1A2) promoter activity by transforming growth factor-beta // The Journal of biological chemistry - 1996. - Vol. 271, N 6. - Pp. 3272-3278. Shaulian, E. and Karin, M. AP-1 in cell proliferation and survival//Oncogene -2001. - Vol. 20, N 19.-Pp. 2390-2400. Hess J., Angel P., Schorpp-Kistner M. AP-1 subunits: quarrel and har- mony among siblings // J Cell Sci - 2004. - Vol. 117, N 25. - Pp. 5965 —5973.

Пирузян Э.С., Никольская T.A., Абдеев P.M., Брускин C.A. Компоненты транскрипционного фактора АР-1 как гены-кандидаты, участвующие в развитии псориатического процесса//Молекулярная биология. - 2007. - T.41 - С. 1069-1080. Palumbo К, Zerr Р, Tomcik M, Vollath S, Dees С, Akhmctshina A, Avouac J, Yaniv M, Distler О, Schett G, Distler JH. The transcription factor JunD mediates transforming growth factor ¡beta,-induccd fibroblast activation and fibrosis in systemic sclerosis // Ann Rheum Dis -2011. - Vol. 70, N 7. - 1320-1326.

Reich, N., B. Maurer, A. Akhmetshina, P. Venalis, C. Dees, P. Zerr, K. Palumbo, J. Zwerina, T. Nevskaya, S. Gay, O. Distler, G. Schett, JH Distler The transcription factor Fra-2 regulates the production of extracellular matrix in systemic sclerosis // Arthritis Rheum - 2010. - Vol. 62, N 1 - Pp. 280-90.

Kroft EB, Groeneveld TJ, Seyger MM, de Jong EM. Efficacy of topical tacrolimus 0.1% in active plaque morphea: randomized, doubleblind, emollient-controlled pilot study//Am J Clin Dermatol - 2009. - Vol.10, N 3. - Pp.181-187.

Barbarino Julia M, Staatz Christine E, Venkataramanan Raman, Klein Teri E, Altman Russ B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways // Pharmacogenetics and genomics - 2013. - Vol. 23, N 10. - Pp. 563-585

Все вышеперечисленное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования:

Научное обоснование целесообразности применения такролимуса у пациентов с очаговой склеродермией с учетом характера экспрессии генов транскрипционных факторов системы белка активатора-1 (АР-1).

Задачи исследования:

1. Изучить изменение экспрессии генов семейств Роб, .Тип, АТР системы АР-1 в очагах поражения у пациентов с очаговой склеродермией в сравнении с интактной кожей.

2. В сравнительном аспекте изучить влияние применения мази такролимус 0.1% на степень выраженности клинических симптомов очаговой склеродермии по данным динамики индекса дерматологического статуса тЬо881.

3. Оценить влияние препарата такролимус 0,1% на качество жизни у больных очаговой склеродермией

4. Оценить терапевтическую эффективность применения препарата такролимус 0,1% у больных очаговой склеродермией.

Научная новизна

В работе впервые проведено изучение экспрессии генов системы белка активатора-1 у пациентов с очаговой склеродермией с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для оценки изменений функционирования данных генов в пределах патологических очагов с помощью того же метода исследована экспрессия генов АР-1 в клинически не измененной коже тех же больных. На основании результатов исследования доказано, что у больных очаговой склеродермией отмечается активация генов всех семейств системы АР-1 в пораженных участках, за исключением гена Р11А-1. Результаты исследования позволяют утверждать об участии генов системы АР-1 в патогенезе очаговой склеродермии, при этом максимальное увеличение экспрессии отмечается у гена фактора АТР-4 (4,7±2 раза по сравнению с непораженной кожей), что свидетельствует об участии оксидантного стресса в развитии склеродермии и обосновывает применение препаратов, влияющих на систему АР-1.

Впервые в результате количественного анализа детально изучена связь между динамикой клинического течения и клиническими формами очаговой склеродермии, а также особенностями экспрессии генов транскрипционных факторов семейств ,1ип,

Р'ой и ЛТН, в результате чего было доказано, что повышение экспрессии генов отмечается независимо от стадии патологического процесса, при этом четкой связи между максимальными показателями экспрессии генов и количеством очагов поражения не наблюдается.

Впервые на основании данных динамики индекса активности склеродермии тЬо881 и его составляющих (эритемы и степени инфильтрации очага), а также индекса качества жизни пациентов доказана высокая терапевтическая эффективность наружной терапии препаратом такролимус 0,1%, патогенетическое действие которого включает влияние на экспрессию транскрипционных факторов АР-1. Результатами исследования показано, что у большинства пациентов отмечалась достоверно значимая положительная динамика индекса активности склеродермии тЬо881, при этом полная ремиссия наблюдалась у больных с эритематозной стадией формирования бляшек. Доказано, что лечение такролимусом является более эффективным методом терапии (70,0%), по сравнению с топическими глюкокортикоидами (32,5%).

В работе доказано более выраженное, по сравнению со стандартной терапией положительное влияние терапии такролимусом на качество жизни (ДИЮК) пациентов с очаговой склеродермией.

Практическая значимость работы В работе продемонстрирована диагностическая ценность показателей экспрессии генов транскрипционных факторов семейств .Тип, Роб и АТТ для оценки активности процесса при очаговой склеродермии. Результаты исследования способствуют оптимизации терапевтических мероприятий у больных очаговой склеродермией. Предложенный новый подход к терапии данной патологии позволяет повысить эффективность лечения и улучшить комплаентность пациентов и может быть рекомендован для широкого применения в различных лечебно-профилактических учреждениях дерматологического профиля.

Установленные в работе сведения о закономерностях экспрессии генов системы АР-1 у больных с очаговой склеродермией могут быть использованы в лекционных курсах на кафедрах кожных и венерических болезней, а также в соответствующих пособиях и руководствах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных очаговой склеродермией происходит активация генов всех семейств системы АР-1 в пораженных участках по сравнению с клинически интактной кожей, за исключением гена FRA-1. Максимальное увеличение экспрессии отмечается у гена фактора ATF-4 (4,7±2 раза по сравнению с непораженной кожей), являющегося компонетом антиоксидантной системы, что свидетельствует об участии оксидантного стресса в развитии склеродермии.

2. Повышение экспрессии генов отмечается независимо от стадии патологического процесса, при этом четкой связи между максимальными показателями экспресии генов и количеством очагов поражения не наблюдается.

3. Использование препарата такролимус 0,1% у больных очаговой склеродермией вызывает высокий клинический эффект, что сопровождается регрессом клинической симптоматики и улучшением качества жизни пациентов.

Внедрение в практику результатов исследования

Полученные результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику отделений Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения Москвы и дерматологического отделения Государственного учреждения здравоохранения «Тульский областной кожно-венерологический диспансер».

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены на:

- 7 Международном форуме Дерматовенерологов и косметологов» (Москва, 2013),

- 22d EADV Congress Istanbul, Turkey (October 2013),

- XXXI Научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские чтения: иммунозависимые дерматозы» (Москва, 2014).

- 23d EADV Congress Amsterdam, Netherlands (October 2014)

Апробация работы состоялась на совместном заседании Лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИО Иммунозависимых дерматозов ПМГМУ им. И.М. Сеченова и Кафедры кожных и венерических имени В.А. Рахманова лечебного факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения РФ 27 мая 2013г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 5 - в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минообрнауки РФ.

Соответствие паспорту научной специальности.

В соответствии с формулой специальности 14.01.10 - кожные и венерические болезни (медицинские науки), охватывающей проблемы изучения этиологии, патогенеза и диагностики различных дерматозов, в диссертационном исследовании научно обоснован и разработан методический подход к лечению очаговой склеродермии.

Личный вклад автора

Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных источников литературы по теме исследования, сформулированы цель и задачи диссертационной работы. Разработан дизайн исследования и индивидуальная регистрационная карта больного в соответствие, с которой проведено клинико-анамнестическое обследование и сформирована база экспериментальных данных. Автором проведено непосредственное лечение пациентов. Проведена статистическая и описательная обработка полученных данных клинических методов обследования и специальных методов исследования. Проведен анализ результатов работы, по которым опубликованы статьи, тезисы и написана диссертация с формулировкой основных выводов, вытекающих из проделанной работы. Предложены практические рекомендации по использованию алгоритмов диагностики склеродермии и применению разработанной методики терапии.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 26 отечественных и 178 иностранных источников. Работа иллюстрирована 24 рисунками, 25 таблицами и 11 фотографиями больных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Условия, объем и методы исследований

В настоящем исследовании представлены результаты обследования и лечения пациентов с установленным диагнозом очаговая склеродермия, находившихся на амбулаторном лечении в консультативно-поликлиническом отделении московского научно-практического Центра дерматовенерологии и косметологии ДЗМ.

Под нашим наблюдением находилось 80 пациентов в возрасте от 25 до 71 года, средний возраст составил 47,7±3,4года. Среди обследованных было 51 женщин (63,75%) и 29 мужчин (36,25%).

Диагноз очаговая склеродермия в каждом конкретном случае устанавливался клинически и подтверждался путем патоморфологического изучения биоптатов кожи.

Форму заболевания определяли согласно клинической классификации ТийапеШ и Winkelmann, на основании которой было выявлено следующее распределение: из 80 больных изучаемой группы у 60 (75%) наблюдалась бляшечная форма заболевания и у 20 (25%) - генерализованная. У больных бляшечной формой очаговой склеродермии высыпания были в виде эритематозных или индурированных очагов с сиреневым венчиком роста по периферии с локализацией преимущественно в паховых областях, на коже туловища и молочных желез (п=57). При этом очаги поражения на коже живота наблюдались у 40 пациентов (50,0%), на коже поясницы и спины у 7 пациентов (8,5%), на коже молочных желез у 7 пациенток (8,5%), в паховой области и на гениталиях - у 3 пациентов (3,8%) соответственно. У 23 больных очаги располагались на коже конечностей (28,75%).

Диаметр очагов варьировал от 2 см до 40 см, занимая обширные участки тела у 3 пациентов. Количество очагов составило от 1 до 6 у пациентки с генерализованной формой заболевания, при этом во всех случаях была поражена кожа туловища, очаги на коже конечностей отмечались лишь в 3 случаях генерализованной формы склеродермии

Длительность заболевания у пациентов, включенных в исследование, на момент первоначального обращения составляла от 1 месяца до 4 лет (в среднем -1,6±0,5 года). Наиболее часто дебют заболевания у пациентов с очаговой склеродермией приходился на возраст 56 - бОлет, при этом средний возраст дебюта ОС составил 48,24 ±2,94 года.

В клиническое и лабораторно-инструментальное обследование входило изучение анамнеза жизни, заболевания, общего и локального статуса; для дифференциальной диагностики проводилось определение антинуклеарных антител методом иммуноблота в качестве скрининга возможной системности процесса, определение антител классов IgM и IgG к боррелиям В. Burgdorferi для исключения болезни Лайма.

Исследование включало два этапа. На первом этапе проводилось сравнительное изучение уровня экспрессии генов, кодирующих компоненты транскрипционного фактора API в пораженной склеродермией коже и интактных участках. Материалом для молекулярно-биологического исследования служили образцы кожи диаметром 4 мм, полученные с помощью пункционной биопсии. Биопсии из непораженных участков кожи брали на расстоянии около 3 см от пораженной кожи. Выделение РНК из биоптатов проводилось на колонках Qiagen согласно стандартному протоколу RNeasy Mini Kit® для кожи с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США). Обратная транскрипция проводилась методом ПЦР в режиме реального времени с помощью тест систем «ДНК-Синтез».

Общая характеристика метода терапии

На втором этапе проводилось исследование клинической эффективности мази такролимус 0,1% у больных очаговой склеродермией. В зависимости от проводимой терапии все пациенты были разделены на две группы, сопоставимые по основным морфо-функциональным параметрам:

- основная группа - 40 больных, получавших лечение препаратом такролимус 0,1% наружно 2 раза в день в течение 12 недель;

- контрольная группа - 40 больных, которые получали традиционное наружное лечение глюкокортикоидами III класса потенциальной активности согласно стандартам терапии очаговой склеродермии.

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом МНПЦЦК ДЗМ.

Всем больным проводили клинические методы обследования: изучение анамнеза, осмотр с оценкой дерматологического статуса с учетом индекса активности и распространенности кожного процесса mLoSSI (Modified Localized Scleroderma Severity Index), изучение качества жизни больных с использованием вопросника

ДИЮК (Дерматологический Индекс Качества Жизни).

В соответствии с динамикой индекса активности кожного процесса при ограниченной склеродермии эффективность проводимого лечения оценивалась следующим образом:

Клиническая ремиссия констатировалась при редукции индексов на 95% и более.

Значительным считалось улучшение при снижении индекса на 94% - 75%: при полном исчезновении венчика роста по периферии очагов, уменьшении их размеров, уменьшении инфильтрации.

За улучшение принималось снижение индекса на 50% - 74%: исчезновение венчика роста по периферии, частичное восстановление эластичности кожи, частичное уменьшение инфильтрации, отсутствие субъективных ощущений.

Стабилизация процесса наблюдалась при снижение индекса на 49% - 25%: побледнение венчика роста по периферии, отсутствие новых очагов поражения, снижение выраженности субъективных ощущений.

Неудовлетворительным считался результат при динамике менее 24%.

Критериями включения в исследование стали: больные с установленным диагнозом очаговая склеродермия; возраст больных 18-65 лет; получение информированного согласия.

Критериями невключения были злокачественные новообразования и предраковые заболевания кожи в анамнезе и на момент осмотра, болезнь Лайма, системная склеродермия, противопоказания к назначению такролимуса.

Критериями исключения больных из исследования стали: появление нежелательных явлений, связанных с терапией, несоблюдение режима терапии.

Статистическая обработка результатов исследования.

Для обсчета результатов использовались данные реакции ПЦР в реальном времени со следующими параметрами: эффективность праймеров в реакции ПЦР в реальном времени не менее 95%; коэффициент корреляции не менее 0,99; наклон кривой (slope) -3,4±0,2. Обработку результатов полимеразной цепной реакции проводили методом 2"ллст, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена в пораженном образце по сравнению с непораженным. AACt рассчитывалось как AACt = ACt (пораженной кожи) - ACt (непораженной кожи) и

каждое значение ACt = Ct (исследуемый ген) - Ct (GAPDH). Эксперименты проводили в трехкратной повторности для каждого образца.

Оценка снижения индекса активности очаговой склеродермии mLoSSI, а также отдельно изменений индексов эритемы и толщины очага на момент посещения для 4 разных временных отметок (первичный визит, повторные посещения через 4 недели, 8 недель и 12 недель) проводилась с помощью непараметрического метода Фридмана и двухфакторного дисперсионного анализа (two-way ANOVA). Статистический анализ данных осуществлялся с помощью программ SPSS v.21 и Prism 6 Graphpad. Метод Фридмана применялся в связи с небольшим количеством испытуемых, а также, поскольку нельзя было подтвердить допущение о нормальности распределения. Достоверными считались различия при р<0.05. При общей достоверности результатов проводились апостериорные сравнения с помощью критерия Вилкоксона. Для данного исследования критический уровень а составил 0,0125. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1 этап исследования Определение уровня экспрессии генов семейств Juri, Fra, Fos uATF в резкиме реального времени Было проведено исследование 20 образцов кожи, полученных из склеродермических очагов путем пункционной биопсии. В качестве контроля использовались образцы кожи тех же пациентов, взятые на расстоянии 3 см от очага поражения в пределах непораженной ткани. Большой интерес представляло сравнение уровней экспрессии генов в пораженной части кожи больных склеродермией по отношению к визуально непораженной части кожи. Такое сравнение, принятое и в ряде зарубежных лабораторий, позволяет максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту эксперимента.

Был произведен анализ экспрессии следующих генов, кодирующих транскрипционный фактор АР-1: C-JUN, JUNB, JUND, C-FOS, FOSB, FRA-1, FRA-2, а также ATF-1, ATF-3 и ATF-4. Для анализа экспрессии данных генов

определялись уровни мРНК соответствующих транскрипционных факторов в биоптатах кожи у пациентов с ОС.

Полученные с помощью метода ПЦР в реальном времени результаты свидетельствуют об увеличении экспрессии практически всех генов АР-1 системы в пораженной склеродермией коже, за исключением гена РЯЛ-1 (табл.1).

Таблица 1

Особенности экспрессии генов АР-1 в очагах поражения у больных очаговой склеродермией

Ген с-Лип с-Ров К<)5-1! П»А-1 П{А-2 ллч-в ЛЖ-Б АТГ-1 АТГ-3 АТК-4

Изменение т т т 1 т Т Т Т Т т

экспрессии

Средние 3.6 3.9 3.5 4,16 3.4 4,0 4.3 3,19 3.9 4.6

значения ±1.76 ±2.65 ±1.7 ±2,7 ±1.86 ±2.04 ±2.3 ±1.4 ±2.17 ±3,0

При индивидуальном анализе не было выявлено достоверной зависимости между клинической тяжестью процесса и уровнем экспрессии генов.

Исходя из анализа литературных данных и полученных результатов собственных исследований, гены с измененной экспрессией в склеродермических очагах можно классифицировать на категории, каждую из которых можно использовать в качестве терапевтической мишени в лечении заболевания (табл.2).

Таблица 2

Факторы АР-1 как вероятные компоненты патогенеза и терапевтические мишени при очаговой склеродеримии

прямое | гиперпродукции коллагена срыв обратной регуляции коллагенно-образования косвенные показатели/ регуляторы ТСГр пути антиоксидант-ная система

Гены с-)Ш, с-Р08, ЛЛМЭ, ГКА-2 П1А-1 АТБ-З, ДЛ\Г-В, РОЭ-В ЛГ1-4

Транскрипционные факторы .ГипО, РКА2, 1ип-С и с-Роб (в форме димера) и соответствующие им гены можно отнести к напрямую активирующим гиперпродукцию коллагена. Селективные ингибиторы данных транскрипционных факторов и соответствующих генов являются перспективными лекарственными препаратами при очаговой склеродермии.

В тоже время у большинства пациентов отчетливо наблюдалось стойкое снижение экспрессии гена Р11А-1, в норме отрицательно регулирующего синтез коллагена. При этом максимальное уменьшение экспрессии гена отмечалась у пациентки с генерализованой формой очаговой склеродермии и обширными эритематозными очагами на стадии индурации. В связи с этим можно выделить еще одно патогенетическое звено - срыв обратной регуляции коллагенообразования. Протективный эффект РЯА-1 может быть также связан с ролью данного транскрипционного фактора в регуляции провоспалительных механизмов и трансдифференциацировки эндотелиальных клеток и фибробластов. Активация сигнального пути Р11А-1 является перспективной таргетной терапией для очаговой склеродермии и других фиброзирующих заболеваний.

Факторы АТР-З и ДЛЧ-В не влияют непосредственно на синтез коллагена, однако их функция важна в патогенезе очаговой склеродермии с точки зрения регуляции сигнального пути Тврр. Совместно эти факторы составляют репрессивный комплекс, взаимодействующий с участками генов, связывающих АР-1 комплекс, и в первую очередь с геном ингибитора дифференцировки 2, антагониста функций Тврр. Кроме того, как отмечалось выше ШЫ-В - важный биомаркер фиброза, за счет участия в регуляции ремоделирования матрикса и формирования межклеточных взаимодействий.

Таким образом, воздействие на данный фактор также является одним из возможных подходов к комплексному лечению очаговой склеродермии. За счет положительной обратной стимуляции экспрессии гена Тврр напрямую и через систему интегринов данный АТР-З становится важной терапевтической целью для таргетного ингибирования, поскольку ингибирование данного фактора может прерывать путь Тврр до активации АР-1 зависимых процессов, в первую очередь это касается гиперпродукции коллагена.

Среди всех генов системы АР-1 у гена АТР-4 отмечалось наибольшее увеличение экспрессии. При измерении уровня экспрессии гена АТР4 в пораженной

склеродермией коже относительно визуально непораженной кожи было показано повышение в интервале от 1,14 раз до 10 раз. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена оказалось повышенным в 4,58±3 раза. Данное изменение свидетельствует о высокой активности антиоксидантной системы, поскольку транскрипционный фактор А1Т-4 является индуктором глутатиона и синтезируется в клетках в условиях оксидантного стресса. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высоком напряжении антиоксидантной системы и, вероятно, важной роли оксидантного стресса в патогенезе склеродермии. Антиоксиданты остаются малоизученной категорией лекарственных препаратов, но тем не менее спектр заболеваний, при кототрых данная группа препаратов может быть эффективной постоянно расширяется. Одной из таких нозологий может стать очаговая склеродермия.

2 этап исследования Оценка клинической эффективности наружной терапии препаратом такролимус 0,1% у пациентов с очаговой склеродермией Клиническая оценка эффективности терапии мазью такролимус 0,1% осуществлялась с помощью индекса активности очаговой склеродермии, измерявшегося до начала терапии, в процессе и по ее завершении. Все пациенты завершили полный курс лечения и не пропустили ни одного контрольного визита. До лечения индекс качества жизни у больных, находившихся под наблюдением, составил в среднем по группам 19,2±1,24 балла (р<0,01).

На фоне применения препарата такролимус в основной группе отмечалась более выраженная положительная динамика в отношении клинических проявлений очаговой склеродермии. У пациентов основной группы регресс клинической симптоматики в среднем составлял для эритемы 86,2% и для индурации - 71,2%, что достоверно лучше, чем в контрольной группе - 38,2% и 34,9% соответственно.

Таким образом, наиболее выраженное снижение общего показателя индекса тяжести патологического процесса отмечалось в группе, применявшей такролимус, при этом суммарный индекс снизился на 75,2%, в то время, как в группе контроля редукция составила 37,2% (табл.3, рис.1).

Таблица 3

Динамика индекса активности и распространенности процесса шЬо881 при ограниченной склеродермии после различных методов лечения

Признак 1 группа (основная) 2 группа (контрольная)

до лечения после лечения до лечения после лечения

Эритема 4,975±0,518 1,975 ±0,572 Р1* 5,025±0,38 4,058±0,394 Р2**

Инфильтрация 3,975±0,241 1,225±0,232 Р1* 4,275±0,344 3,525±0,336 Р2*

Суммарный индекс 12,187± 1,151 3,425±0,664 Р1** 13,552±0,693 7,555±0,923 Р2*

Примечание: Р1 -сравнение с показателями до лечения, Р2 - сравнение с основной группой; *- р<0,05; ** - р<0,01.

о стандартная терапия о такролимус

О -

Первый визит 4 неделя 8 неделя 12 неделя

Визиты

Рис. 1. Динамика изменения индекса активности очаговой склеродермии под влиянием проводимых методов лечения в двух группах с измерениями показателей на 0, 4, 8 и 12 неделях соответственно.

При индивидуальном анализе изменений индекса активности тЬо881 под воздействием наружного препарата такролимус 0,1% применялся статистический

метод Фридмана для исследований с серией измерений во времени. Результаты метода Фридмана продемонстрировали статистически достоверное снижение активности склеродермического процесса на фоне лечения х2=49,299, р<0,001.

Апостериорный анализ с помощью метода Вилкоксона с критическим уровнем значимости 0,0125 показал, что статистически достоверное снижение индекса mLoSSI наблюдалось в каждый временной промежуток между повторными визитами пациентов (табл.4).

Таблица 4

Изменение средних значений индекса mLoSSI на момент каждого визита в течение 12 недель лечения такролимусом 0,1%

Показатель Визит 1 Визит 2 (4 недели) Визит 2 (8 недель) Визит 3 (12 недель)

1 (основная) группа

Среднее значение mLoSSI 12,1 7,875 5,200 3,425±0,664

Стандартное отклонение 1,151 1,12 0,86 0,92

Статистическая значимость <0,001 <0,001 0,001

2 (контрольная группа)

Среднее значение mLoSSI 13,55 11,451 8,264 7,555

Стандартное отклонение 0,693 0,88 0.74 0,92

Статистическая значимость <0,001 <0,001 0,001

У 65,0% больных основной группы отмечалось снижение индекса тЬоБЗ! более, чем на 75,0%. Наилучший эффект отмечался у пациентов с бляшками в эритематозной стадии с регрессом индекса активности до 0, в то же время наименьший эффект отмечался у пациентов с генерализованной формой очаговой склеродермии, при этом только у одной пациентки с генерализованными очагами поражения показатель активности процесса сохранялся неизмененным при каждом

контрольном визите, в связи с чем она была переведена на терапию циклоспорином А.

В течение первого месяца достоверное снижение активности процесса (р<0,001) отмечалось только в основной группе, так у 34 (85%) пациентов суммарный индекс тЬо881 снизился более, чем на 25%. В дальнейшем положительная динамика отмечалась у 36 (90%) пациентов. Ни у одного пациента не наблюдалось усиление активности процесса в течение всего курса терапии. Полной ремиссии с тЬо881=0 удалось достичь у 3 (7,5%) пациентов. Лучше терапии поддавались больные с единичными очагами на стадии эритемы. Отсутствие или незначительное снижение индекса активности наблюдалось у пациентов с генерализованной формой очаговой склеродермии.

В контрольной группе лишь на 3 визите у большинства пациентов (75%) отмечалось достоверное улучшение индекса тЬо881, однако его значения были еще высокие.

Таким образом, в основной группе после терапии такролимусом клиническое выздоровление отмечалось у 6 (15,0%), значительное улучшение - у 20 (50,0%), улучшение у 2 (5,0%), стабилизация процесса у 8 пациентов (20,0%), и у 4 больных (10,0%) отсутствовал эффект от лечения. Таким образом, терапевтический эффект наблюдался у 70,0% больных.

клиническое выздоровлене значительное улучшение улучшение

стабилизация процесса терапевтический эффект без эффекта

Рис. 2. Терапевтическая эффективность применения такролимуса у больных очаговой склеродермией.

80,0 % 60,0 %

1 группа 2 группа

В группе контроля отмечался терапевтический эффект лишь в 32,5% случаев, при этом снижение клинического выздоровления не отмечалось ни в одном случае. Из 40 испытуемых только у 6 (15,0%) больных удалось достигнуть значительного улучшения, у 14 (35,0%) отмечалось улучшение, стабилизация состояния - у 10 (25,0%) пациентов. У 10 (25,0%) больных отсутствовал эффект от проводимой терапии (рис.2).

Принимая во внимание данные литературы о том, что очаговая склеродермия, особенно при длительном прогредиентном и рецидивирующем течении, существенно ухудшает качество жизни больных, для оценки физического, психоэмоционального состояния пациентов, а также комфортности проводимого лечения, нами использовался индекс качества жизни - ДИКЖ.

До лечения индекс качества жизни у больных, находившихся под наблюдением, составил в среднем по группам 19,2±1,24 балла (р<0,01). У пациентов с ограниченным формами и единичными бляшками индекс был в среднем на 18% ниже, чем у больных с распространенной формой заболевания (р<0,01).

20

15

ю

5

о -

до лечения 4 неделя 8 неделя 12 неделя

о ДИКЖ о т^ЭЭ!

Рис. 3. Динамика снижения субъективных и объективных симптомов у больных ограниченной склеродермией на фоне наружной терапии такролимусом.

Параметры индекса качества жизни в большей степени были достоверно хуже при прогрессирующем течении очаговой склеродермии, нежели чем у больных со стабилизацией процесс без активного роста бляшек по периферии: индекс ДИКЖ был выше в среднем на 23,5% (р<0,01). Наиболее высокие показатели снижения

19

качества жизни наблюдались у больных с зудом и при локализации патологического процесса на косметически значимых участках тела.

В основной группе больных была выявлена высокая прямая корреляционная связь (г=0,99) при р=0,0072 индекса ДИКЖ и индекса активности склеродермического процесса тЬо881. В процессе лечения на фоне улучшения клинической картины заболевания, пропорционально улучшались и показатели качества жизни (рис.3).

Таким образом, на основании оценки эффективности и комфортности проводимой терапии самими больными, наружное применение такролимуса является наиболее эффективным, что подтверждается снижением индекса ДИКЖ на 56,5%, в то время, как группе стандартной терапии он снизился на- 22,0% соответственно.

Общая оценка регресса клинической симптоматики и динамики изменения индексов активности процесса и качества жизни позволила достоверно установить более высокую эффективность наружного применения препарата такролимус 0,1%.

Выводы

1. Установлено, что у больных очаговой склеродермией отмечается достоверное изменение экспрессии генов системы АР-1 (С-ЛЛМ, ДЖВ, ЛЛ^ГО, С-БОЗ, Р08В, Р11А-1, РЯА-2, а также АТР-1, А1Т-3 и А1Т-4) в очагах поражения в сравнении с интактной кожей. Выявлено усиление экспрессии генов всех семейств системы АР-1 за исключением Р11А-1 в склеродермических бляшках. При этом максимальное увеличение экспрессии отмечалось у гена фактора АТР-4 (4,7±2 раза по сравнению с непораженной кожей), являющегося компонетом антиоксидантной системы, что свидетельствует об участии оксидантного стресса в развитии склеродермии.

2. У пациентов с очаговой склеродермией отсутствует корреляция между выраженностью клинической симптоматики и увеличением экспрессии генов-индукторов гиперпродукции коллагена с-ЛЖ, с-РОБ, ЛМ-Б, Р11А-2

3. Наружное применение мази такролимус 0,1% у пациентов с очаговой склеродермией способствует выраженному регрессу клинических симптомов заболевания, что подтверждается статистически достоверной в соответствии с критерием Фридмана, положительной динамикой индекса шЬо881 - 74,5%, при

этом полная ремиссия наблюдается у больных с эритематозной стадией формирования бляшек

4. Применение такролимуса 0,1% обладает более высокой терапевтической эффективностью (67,5%) по сравнению с применением топических кортикостероидов (46,7%), что сопровождается улучшением качества жизни пациентов по данным индекса ДИКЖ 56,5% и 22,0% соответственно.

Практические рекомендации

1 .В рамках первичного обследования рекомендуется проводить иммуноблотинг для обнаружения ядерных антител как критерия системности процесса. На стадиях пятна для исключения болезни Лайма рекомендована постановка ИФА и вестерн-блотта.

2.Наружная терапия препаратом такролимус 0,1% показана для лечения пациентов с очаговой склеродермией вне зависимости от стадии патологического процесса, при ограниченных поражениях - в виде монотерапии. Лечение рекомендуется проводить 2 раза в день в течение 12 недель.

3.Противопоказаниями для применения предложенного метода наружной терапии очаговой склеродермии являются общие противопоказания и индивидуальная непереносимость препарата такролимус 0,1%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вавилов В.В., Патогенез склеродермии: современные представления / Н.Н. Потекаев, В.В. Вавилов // Клиническая дерматология и венерология. - 2012. - № 5.-С. 8-15.

2. Вавилов В.В. Фиброзирующие заболевания кожи: особенности клинической картины / Н.Н. Потекаев, В.В. Вавилов // Клиническая дерматология и венерология. - 2013 - № 2. - С. 4-10.

3. Вавилов В.В. Экспрессия генов АР-1 транскрипционного комплекса в очагах поражения у больных очаговой склеродермией / Н.Н. Потекаев, В.В. Вавилов, В.В. Соболев, А.Г. Соболева, А.Д. Золотаренко, И.М. Корсунская, С.А. Брускин // Клиническая дерматология и венерология. - 2013. - № 2. - С.69-74.

4. Вавилов В. В. Оценка эффективности топической терапии Такролимусом при очаговой склеродермии у взрослых с помощью индекса mLoSSI / Н. Н. Потекаев, В.В. Вавилов // Клиническая дерматология и венерология. - 2013. - № 6. - С. 46-51.

5. Вавилов В.В. Экспрессия генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 в очагах поражения у больных очаговой склеродермией / Потекаев Н. Н., Вавилов В.В., Соболев В.В., Соболева А.Г., Золотаренко А.Д., Корсунская И.М, Брускин С.А. // Клиническая дерматология и венерология. - 2013. - № 6. - С. 13-17

6. Vavilov V. АР-1 transcription factor genes expression in morphea skin lesions / V. Vavilov, N. Potekaev, V. Sobolev // CD with abstracts of 22d Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology. Istanbul, Turkey 2-6.10.13

7. Вавилов В.В. Экспрессия генов системы АР-1 в очагах поражения больных с очаговой склеродермией / Н.Н. Потекаев, В.В. Вавилов, В.В. Соболев, И.М. Корсунская, С.А. Брускин. - Москва: Материалы 7 Международного форума Дерматовенерологов и косметологов, 2013г. - С.12

8. Вавилов В.В. Оценка эффективности наружного применения такролимуса 0,1% у пациентов с очаговой склеродермии с помощью индекса активности mLoSSA / В.В. Вавилов, Н.Н. Потекаев // Тезисы XXXI научно-практической конференции Рахмановские чтения. Дерматология в России. - 2014. - № 3 - С. 59.

9. Vavilov V. Novel therapeutic targets in morphea based on AP-1 genes expression profiling / V. Vavilov, N. Potekaev // CD with abstracts of 23d Congress of the European Academy of Dermatology and Venereology. Amsterdam, Netherlands 08-12.10.14

Подписано в печать 24.11.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 80 Экз. Заказ № 6142-11-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39