Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Распространенность иммунопатологических синдромов и характеристика иммунной системы у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации

На правах рукописи

ГРИШИНА ЛЮБОВЬ ВИКТОРОВНА

Распространенность иммунопатологических синдромов и характеристика иммунной системы у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации.

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск-2004

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук СВ. Сенников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член.корр.РАМН В.И. Киселев доктор медицинских наук, профессор B.C. Ширинский

Ведущая организация:

ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН

Защита состоится <<_>>_2004 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 001.001.01 ГУ НИИ клинической

иммунологии СО РАМН по адресу:

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Ядерная бомбардировка Хиросимы и Нагасаки, испытания ядерного оружия на полигонах, аварии на-атомных электростанциях, а также растущее применение ионизирующего излучения (ИИ) в терапии различных заболеваний в середине XX века, привело к необходимости исследований последствий радиационного воздействия на человеческий организм [Coulter M.P., 1952; Payne S., 1952; Stewart C.B, 1953; Sauer L., 1955; StoloffI.L., 1959; Macomber W.B., 1957]. Однако и в настоящее время научные дискуссии о механизмах воздействия ионизирующего излучения и его отдаленных последствиях на живой организм не завершены, и многие вопросы требуют дальнейшего изучения. Исследования в области данной проблемы по-прежнему остаются актуальными как из-за постоянного имеющегося риска радиоактивного заражения окружающей среды, так и из-за риска потерь здоровья лиц, уже подвергшихся радиационному воздействию.

Хотя результаты воздействия малых доз радиации на животных и на человека описываются в литературе, но многие данные противоречивы [Ярилин А. А., 1985; Гозенбук В.Л., 1988; May R.D., 1983; Hayase H., 2002; Seki Y., 1995; Stewart С, 1988]. Исследования, выполненные на экспериментальных животных и в культурах клеток с использованием малых доз радиационного воздействия, показывают высокую радиочувствительность как иммунокомпетентных клеток [Seki Y., 1995; Ярилин А. А., 1985; Kataoka Y. and Sado Т., 1975; Dainiak N., 2002], так и ряда иммунологических механизмов. [Житкевич Т.И., 1996; Shankar.B., 1999; Беляков И.М., 1992; Шарецкий А.Н., 2000], их важную роль в развитии патологических состояний, формирующихся после радиационного воздействия [Shankar В., 1999; Dainiak N.. 2002; Fedorocko P., 2002; Hayase H., 2002; Sakaguchi N., 1994]. В то же время, проблема воздействия ионизирующего излучения на иммунную систему человека, в особенности в малых дозах и в отдаленные сроки, остается малоизученной.

В ряде исследований описываются последствия воздействия малых доз радиации на иммунную систему жителей Алтайского края и Казахстана [Шойхет Я.Н., 2002], жителей Южного Урала [Орадовская И.В., 2000], ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в 1986 - 87 г.г. и пострадавших в результате этой аварии [Chernyshov V., 1997; Беляков И.М., 1993; Киселева Е.П., 2000;; Титова Л.Д., 1998;], жителей Хиросимы и Нагасаки, переживших взрыв атомной бомбы [Kusunoki Y, 1998, 2001]. К сожалению, результаты исследования данных групп населения противоречивы и не являются полными. В частности, остаются открытыми вопросы по изменению субпопуляционной структуры иммунокомпетентных клеток, их функциональной активности, изменениям в регуляторном звене иммунной системы, не ясны механизмы возникновения иммунопатологических синдромов у лиц, подвергнувшихся радиационному воздействию, и у их потомков. В связи с этим, представляется актуальным изучение отдаленных эффектов радиационного воздействия в системы у лиц, подвергшихся такому возде

ктвиБиВЛКОтаХАшко». С этой

СП г л.. 09 ¿M ПЧСЬ

целью нами были обследованы жители Алтайского края, пострадавшие в результате ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне. Факт радиационного воздействия на население Алтайского края подтверждается данными радиационной разведки, анализом распространения воздушных масс из эпицентра взрыва, выпадений Р-активности и аномальных повышений радиационного фона. Изучение последствий этих испытаний и решение вопроса о социальной и медицинской защите населения началось в 1990 г., более чем через 40 лет после первого испытания. В настоящее время радиоактивное загрязнение природной среды от испытаний в Алтайском крае снизилось до допустимого фонового уровня [Сухорукое Ф.В., 1996; Щербов Б.Л., 2000]. Ранее, другими исследователями уже была установлена взаимосвязь между относительно высоким уровнем показателей заболеваемости и смертности у населения Алтайского края и ядерными испытаниями, проведенными на Семипалатинском полигоне в 1949-1962 гг. [ШойхетЯ.Н., 1999], дозозависимые изменения иммуногенетической структуры (в том числе — предрасполагающие к развитию вторичных иммунодефицитов) [Коненков В.И., 1995; Шойхет Я.Н., Козлов В.А., Коненков В.И., 2002] и изменения в'уровне экспрессии генов иммунорегуляторных цитокинов, что свидетельствует о дизрегуляторных процессах в иммунной системе [Козлов В.А., 1995]. Представлялось актуальным и значимым продолжить изучение состояния иммунной системы у данной группы населения, в связи с чем были поставлены следующие цель и задачи.

Цель работы - изучить частоту встречаемости иммунопатологических синдромов, количественные и функциональные параметры иммунной системы у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации и у их потомков.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространенность иммунопатологических синдромов у лиц, подвергшихся радиационному воздействию и у их потомков.

2. Изучить субпопуляционную структуру иммунокомпетентных клеток периферической крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию.

3. Изучить пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию, а также их способность к продукции цитокинов in vitro.

4. Изучить уровень цитокинов Txl и Тх2 типов (ИЛ-2, ИФН-у, ИЛ-4,-10), а также провоспалительных цитокинов (ИЛ-ф, ИЛ-6, ФНО-а) в сыворотке крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию и их потомков.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризовано состояние иммунной системы, включая субпопуляционную структуру ИКК, их пролиферативную активность, способность к продукции цитокинов, содержание цитокинов в сыворотке крови и частоту встречаемости иммунопатологических синдромов в популяции лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах, а также у их потомков.

Установлено увеличение частоты встречаемости ряда иммунопатологических синдромов: инфекционного (синдром, вторичного иммунодефицита)," аллергического, аутоиммунного, гематологического и

онкологического у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона и у и\ потомков.

Отмечены изменения в функциональной активности иммунокомпетентных клеток лиц, подвергшихся воздействию малых доз радиации. В частности повышение пролиферативной активности и способности к продукции ФНО-а МНК ПК в ответ на митоген и в то же время снижение продукции ИЛ-4 и ИЛ-2 в ответ на стимул. Кроме того, у этих лиц выявлены изменения в субпопуляционной структуре иммунокомпетентных клеток.

Впервые определен широкий спектр цитокинов в сыворотке крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию и их потомков. Установлено достоверное увеличение уровня сывороточных провоспалительных цитокинов -ИЛ-1Р, -6, ФНО-а и цитокинов Тх1 и Тх2 типов - ИЛ-2, -4, 10, ИФН-у.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты вносят новый вклад в область изучения воздействия малых доз ионизирующего излучения в отдаленные сроки на иммунную систему человека. В частности, установлена активация системы цитокинов, что сопровождается изменением количественных и функциональных показателей иммунной системы и увеличением частоты встречаемости иммунопатологических синдромов.

Проведенные исследования неоспоримо доказывают настоятельную потребность в организации региональной иммунологической службы для проведения широких иммунореабилитационных мероприятий среди населения Алтайского края не только для лиц, непосредственно подвергшихся радиационному воздействию, но и для их потомков.

Основные положения, выносимые на защиту.

Воздействие ИИ в малых дозах на организм человека приводит в отдаленные сроки к изменению как количественных, так и функциональных параметров иммунной системы, что лежит в основе увеличения частоты встречаемости иммунопатологических синдромов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2000); 2) семинарах группы молекулярной иммунологии лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1999-2000); 3) конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет.» (Санкт-Петербург, 2002); семинаре научного отдела ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура работы. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 94 страницах машинописного текста, включающего И рисунков и 7 таблиц. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 196 литературных источников, в том числе 118 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Характеристика обследованных. Обследовались лица, проживающие в населенных пунктах Угловского района Алтайского края и подвергшиеся

радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона. Приводимые эффективные дозы были реконструированы с

использованием архивных данных и моделей расчета доз внешнего и внутреннего облучения населения [ШойхетЯ.Н., 1999; ШойхетЯ.Н., 1997]. Обследованы жители населенных пунктов: с. Топольное с эффективной эквивалентной дозой (ЭЭД) радиационного воздействия 157,1 сЗв, условно обозначенное нами как 1-я зона; с. Беленькое и с. Наумовка - ЭЭД 121,6 и 122,8 сЗв соответственно, принятые за 2-ю зону; с. Лаптев Лог с ЭЭД радиационного воздействия 63,3 сЗв, принятое за 3-ю зону. В ходе работы обследованы облученные лица в количестве 132 человека (41 мужчина и 91 женщина), принятые за первое поколение, для которых установлена ЭЭД и их потомки, соответственно 121 человек (42 мужчины и 79 женщин) второго и 75 человек (33 мужчины и 42 женщины) третьего поколения. Возраст лиц 1-го поколения варьировал от 49 до 80 лет, 2-го - от 13 до 48 лет, 3-го - от 7 до 27 лет.

Оценка-. распространенности основных. иммунопатологических синдромов. Была использована разработанная в ГУ НИИКИ СО РАМН автоматизированная система оценки индивидуального риска иммунопатологических состояний - «АСИРИС» [Гельфгат Е.Л., 1990]. Эта система позволяет путем обработки на персональном компьютере результатов анкетирования определить для каждого индивида обследуемой группы количественную меру выраженности того или иного иммунопатологического синдрома. Для популяции «АСИРИС» дает возможность оценить распространенность и профиль иммунопатологических синдромов. Система «АСИРИС» позволяет выявить 5 основных типов иммунопатологических синдромов. Инфекционный синдром включает множественные, рецидивирующие или хронические инфекционно-воспалительные заболевания разной локализации; аллергический синдром - аллергические заболевания и аллергические реакции; аутоиммунный синдром - аутоиммунные заболевания, системные аутоиммунные реакции, реактивные артриты. Гематологический синдром объединяет лимфопролиферативные заболевания, анемический и геморрагический синдромы, лимфоаденопатию. Онкологический синдром включает злокачественные и доброкачественные новообразования разной локализации.

Выделение МНК из периферической крови человека. Для исследований использовали гепаринизированную венозную кровь. МНК выделяли стандартно, путем центрифугирования венозной крови в градиенте плотности фиколл-верографина (р= 1,082 г/л) (фиколл (Pharmacia Fine Chemicl, Sweden), верографин (Шеринг АО, Германия)). 5 мл крови наслаивались на 3 мл раствора фиколл-верографина и центрифугировались при 3000 об/мин в течение 20 мин [Boyum A., 1968]. МНК ПК, собранные из интерфазы, отмывали средой RPMI-1640 (Вектор, Россия) с 1% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) 3 раза путем ресуспендирования и последующего центрифугирования при 1000 оборотов/мин в течение 10 минут.

Культивирование МНК ПК in vitro. Культивирование МНК ПК проводили в 24-луночных плоскодонных планшетах (Linbro, США). В каждую лунку помещался 1 мл полной культуральной среды (RPMI-1640 с добавлением 10% ЭТС, гентамицина 80 мкг/мл, 2мМ L-глутамина, 5x10"5 меркаптоэтанола),

содержащий I миллион клеток. Для стимуляции МНК ПК использовали Конконлвалин Л (Кон Л) к концентрации 10 мкг/мл. Время культивирования - 48 часов во влажной атмосфере при температуре 37° С и при концентрации СО25%. Перед сбором кондиционной среды клетки осаждали центрифугированием в планшетах при 1000 оборотов/мин в течение 10 мин. Собранные пробы хранились при - 20° С до определения в них содержания цитокинов.

Определение количественного содержания- цитокинов

электрохемплюминесцентным (ЭХЛ) методом проводилось на приборе ORIGEN ANALYZER (IGEN Inc., США). Подготовку реактивов и определение каждого цитокина проводили, как описано ранее [Blackburn GF et al. 1991, Yang H. et al 1994, Крысов СВ. и др. 2000]. В качестве специфических антител против рекомбинантных человеческих IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-ct, IFN-y, IL-ip были использованы поликлональные и моноклональные антитела (R&D System, Великобритания). В работе использованы антитела, неспособные перекрестно связывать другие цитокины. Для построения калибровочных кривых были использованы рекомбинантные цитокины: человеческие рекомбинантные цитокины TNF-a, ИЛ-1В, IL-2, IL-4, IL-6, (R&D System, Великобритания), IFN-y (Thomae-Biberach/Riss, Германия), IL-10 (PeproTech Inc., Rocky Hill, Нидерланды). Стрептавидиновые бусы - фирма IGEN Inc., США.

Оценка пролиферативной активности,клеток. Клетки культивировали в объеме 150ul в круглодонных 96-луночных планшетах ("Медполимер", Санкт-Петербург) в конечной концентрации 0,1х10б клеток/лунку (МНК ПК). Для стимуляции пролиферативного ответа МНК использовали Конканавалин А (Кон А, 10 мкг/мл). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа по включению Н3-тимидина в нуклеопротеидные фракции клеток. Н3-тимидин вносили по 1 мкКи на лунку за 6 часов до конца культивирования, клетки осаждали на фильтры (Flow, UK) с помощью прибора Cell Harvester (Flow Labs, США). Подсчёт радиоактивности экспериментального материала производили в жидкостном сцинтиляционном счётчике SL-30 (Intertechnic Франция). Результаты представили в виде среднего счёта (импульс / мин) из трёх идентичных культур.

Определение субпопуляцнонной структуры- иммунокомпетентных клеток. Показатели субпопуляционной структуры иммунокомпетентных клеток периферической крови были методом проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur, Beckton Dickinson, США) на базе лаборатории клинической иммунологии ГУ НИИКИ СО РАМН. Для обработки результатов использовали программу CellQuest (Beckton Dickinson, США), используя параметры прямого (FSC), бокового (SSC) светорассеяния и канала флюоресценции 3 (FL-3). Данные методы выполняли в соответствии с описаниями, представленными в руководствах "Лимфоциты: Методы"(1990), "Monoclonal antibodies source book" и инструкциями производителей антител. Использовались моноклональные антитела IC0-90 - CD3, ICO-116 - CD 16, меченные флюоресцеином изотиоцианатом и ICO-86 - CD4, IC0-180 - CD20, ICO-31 - CD8), меченные фикоэритрином (МедБиоСпектр, Москва).

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка

результатов производилась при помощи программы Statistica 5Ю. }[ия статической проверки гипотез о достоверности различии между группами данных использовались непараметрическне критерии Мани-Уитни, Колмогорова-Смирнова, Уилкоксона, критерий таблицы 2X2, так как исслсдусмыс выборки не подчинялись нормальному распределению. Данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней (М±т) и в виде медианы (Me) и размаха квартилей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Распространенность и структура иммунопатологических синдромов. В результате проведенных исследований по системе «ЛСИРИС» установлено, что различные формы иммунопатологических синдромов выявлены у 87 % обследованных, что достоверно выше в сопоставлении с контрольной группой, включающей население Сибири различных регионов (74 %) (рис. 1). Частота выявляемости определенных и вероятных иммунопатологических синдромов (38 %) у жителей Угловского района также оказалась достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,001). В дальнейшем анализировалась, частота встречаемости только определенных и вероятных иммунопатологических синдромов, для которых можно говорить об уже сформированной иммунопатологии. Данные по частоте встречаемости донозологических и малых форм иммунопатологических синдромов не приводятся.

I „4-------1 - --,---------- |

I Ал И11С а1«4<ф|*1Я1р»|тьИПС р|фс:к1см**фмт НПО дчмо км »ви* И [1С ' | □подвергши«» ».1 ияиию малахдо! радиации_□ контроль |

Рнс.1. Общая характеристика распространенности ИПС у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации и у их потомков. *** • имеется достоверное отличие с контрольной группой при р<0,001, ** - при- р<0,01.

Анализ структуры иммунопатологических синдромов у жителей Угловского района выявил достоверное повышение частоты встречаемости всех форм ИПС в сравнении с контролем, причем наибольшие значения определялись для аутоиммунного (18,5 %) и инфекционного (16,2 %) синдромов (рис. 2). Такие же изменения в частоте встречаемости иммунопатологических синдромов наблюдалась и среди жителей населенных пунктов Угловского района с различной ЭЭД радиационного воздействия (данные не приводятся).

Известно, что общее ухудшение здоровья населения, подвергшегося радиационному воздействию, наблюдается не только у облученных, но и в последующих поколениях [Шойхет Я.Н, 2000]. Поэтому мы оценивали распространенность ИПС у жителей Угловского района, непосредственно подвергшихся радиоактивному облучению в результате деятельности Семипалатинского Полигона (1-е поколение, облученные), и у их потомков (2-е

Рис. 2. Структура ИПС у лиц, подвергшихся влиянию' малых доз радиации и у их потомков. *** - имеется достоверное отличие с контрольной группой при р<0,001, * - р<0,05.

и 3-е поколение) (Рис. 3). Анализ распространенности типовых иммунопатологических синдромов в трех поколениях выявил в общем сходную картину - увеличение частоты встречаемости инфекционного, аллергического и аутоиммунного синдромов в сравнении с жителями Сибири и, соответственно, уменьшение групп людей без ИПС. I'

Рис. 3. Структура ИПС у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации и у их потомков (Угловский район Алтайского-края) в сравнении с контрольной группой (жители Сибирского региона) в отдельных поколениях: А - первое поколение (облученные); В - второе; С - третье. *** - имеется достоверное отличие с контрольной группой при р<0,001, ** - р<0,01, * - р<0,05.

В литературе имеются сведения о последствиях воздействия радиации в отдаленные сроки на различные группы - ликвидаторов последствий Чернобыльской аварии [Звагуле Е.Я., 2002], детей, проживающих на загрязненных территориях вокруг Чернобыля [Chemyshov V., 1997], жителей Среднего Урала [Орадовская И.В., 2000], японское население, пережившее атомную бомбардировку [Kusunoki 1998, 2001]. Эти данные

свидетельствуют, что и при других типах и формах радиационного воздействия также наблюдается рост частоты иммунопатологических состояний Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что радиационное воздействие в малых дозах в отдаленные сроки приводит к увеличению распространенности различных ИПС как у лиц непосредственно подвергшихся ИИ, так и у их потомков в двух последующих

поколениях В основе роста иммунопатологии у данном категории лиц Moiyi лежать изменения 6 различных звеньях иммунной системы, в связи с чем, следующим этаном нашей работы явилось изучение основных количественных и функциональных показателей иммунной системы.

Субпопулиционная структура иммунокомпетентных клеток. Анализ субпопуляционной структуры иммунокомпетентных клеток периферической крови в обследованных группах выявил рост содержания клеток с фенотипом CD3+ с увеличением дозы радиационного воздействия. У жителей 1-й и 2-й зон (населенные пункты с наибольшей ЭЭД) эти различия достигают достоверных значений в сравнении со значениями показателя у лиц, проживающих в 3-й зоне (наименьшее значение ЭЭД) (рис. 4) Статистически значимых изменений в содержании субпопуляции Т-хелперов (CD4+) во всех трех исследуемых зонах не обнаружено.

Рис. 4. Субномулнцнонная структура иммунокомпетентных клеток периферической крови лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации) (М±т). <-> - статистически достоверное различие между группами при: * -р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

Содержание клеток, экспрессирующих CD8, снижено у жителей 1-й зоны в сравнении с содержанием этих клеток у жителей 2-й зоны. Различий в содержании CD8+ клеток у лиц, проживающих в 3-й зоне, не выявлено.

Содержание CD16+ клеток периферической крови у обследованных лиц возрастает с увеличением дозы радиационного воздействия. У жителей 1-й зоны эти различия достигают достоверных значений в сравнении с другими обследуемыми группами. Повышение содержания СД16-позитивных клеток у жителей 1-й зоны интересно сопоставить с данными по частоте встречаемости онкологического синдрома, которая ниже у жителей этого населенного пункта, чем у жителей деревень с меньшей ЭЭД. Если рассматривать динамику смертности от злокачественных новообразований у жителей, подвергшихся радиационному воздействию, то в последнее десятилетие этот показатель у жителей 1-й зоны значительно снизился и приближается к значению показателя в популяции. Вероятно, это связано с тем, что онкопатология у жителей с.Топольное, с максимальной ЭЭД, реализовалась в первую очередь и в настоящее время (обследование проводилось в 1999 г.) в живых остались жители с повышенной активностью NK-клеток, у которых противоопухолевый

иммунитет функционирует более эффектипно.

Изучение содержания CD20+ клеток в периферической крови у обследуемых лиц из разных зон выявило, что с ростом ЭЭД происходит снижение этого показателя, причем у жителей проживающих в 1-й зоне (наибольшее значение ЭЭД) этот показатель достоверно снижается в сравнении с группой лиц из 2-й и 3-й зон.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об изменениях субпопуляционной структуры иммунокомпетентных клеток в отдаленные сроки у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации. Причем изменения в содержании основных субпопуляций- иммунокомпетентных клеток ПК у обследованных групп существенно различаются. Наиболее значимые изменения выявлены в содержании CD3+ и CD 16+ клеток, количество которых возрастает с увеличением дозы радиационного воздействия, и CD20+ клеток, для которых прослеживается тенденция к снижению. Полученные различия в субпопуляционной структуре ИКК могут зависеть от таких факторов, как доза радиационного облучения, продолжительность воздействия и некоторых других. Выявленные изменения могут быть следствием нарушения баланса цитокинов Тх1/Тх2 типов и лежать в основе формирования иммунопатологических состояний.

Пролиферативная активность и? способность к продукции иммунорегуляторных цитокинов. МНК ПК, В нашей работе функциональные свойства лимфоцитов оценивались по пролиферативной активности МНК ПК и способности к продукции иммунорегуляторных цитокинов in vitro у лиц, непосредственно

подвергшихся радиационному воздействию. Как следует из рисунка 5,

25000 20000 15000 10000 5000 О

[спонтанная Остимугнрованная

Рис. 5. Спонтанная и митогенин-дуцированная пролиферативная активность МНК ПК у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации (M±m). w - статистически < достоверное различие между группами при: * - р<0,05; *** -р<0,001.

пролиферативная активность МНК ПК в ответ на митоген (КонА) повышается с возрастанием дозы радиационного воздействия, причем различия показателя достоверны между всеми зонами. Высшие значения КонА-индуцированной пролиферативной активности зарегистрированы у жителей 1- зоны (максимальная ЭЭД). Следует отметить, что контрольную группу для обследуемого контингента облученных лиц, возраст которых составляет свыше 49 лет подобрать практически невозможно, но если показатели

пролпфсрапшноП акишносш МНК ПК у обследуемых срамить с фугшоП условно злоровых доноров (средний возраст 25-30 лет), они оказываются достоверно выше. В литературных источниках отмечается влияние ионизирующего излучения на нролиферативпую активность лимфошпов. Так, Кизипок! с коллегами на популяции выживших после атомной бомбардировки Хиросимы н Нагасаки показано, что с увеличением полученной радиационной дозы способность клеток к пролиферативному ответу в ответ на КонА снижается [КиБипок!, 2001]. Другими авторами при малых дозах облучения мышеи (0,95 мГр/ч в течение 1-12 недель) отмечается повышение пролиферативного ответа на ЛПС [НЫй У., 2002].

При изучении продукции ФНО-а МНК ПК у жителей всех обследованных населенных пунктов наблюдается повышенная продукция цитокина в ответ на митоген (рис 6). Необходимо подчеркнуть, что в обследуемой группе наблюдалась значительная КонА-индуцированнная продукция этого провоспалительного цитокина, в несколько десятков раз превосходящая показатель в группе условно здоровых (рис. 6). Такое значительное увеличение продукции ФНО-сс может

Рис 6. Спонтанная и митогенстимулированн ая- продукция ФНО-а МНК ПК лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации, in vitro (M±m). U -статистически достоверное различие между группами при: * - р<0,05; ** - р<0,01.

приводить к хронизации различных воспалительных процессов у лиц, непосредственно подвергшихся радиационному воздействию. Полученные нами результаты о повышенной продукции МНК ПК согласуются с данными,

полученными ранее при обследовании этой же группы людей, у которых зарегистрировано повышение экспрессии генов провоспалительных цитокинов ИЛ-1-р и ИЛ-6 и, в том числе, ФНО-й в МНК ПК и рост частоты встречаемости инфекционно-воспалительных процессов [Козлов В.А., 1995].

При оценке продукции цитокинов Тх1 и Тх2 типов в культуре МНК ПК наблюдается иная картина. Так, продукция ИЛ-4 МНК ПК в ответ на митоген незначительно повышается у жителей 1-ой зоны (различия недостоверны) и даже снижается у лиц из 3-й зоны (рис. 7). Продукция ИЛ-2 также не увеличивается в ответ на стимуляцию клеток КонА (рис. 8). Таким образом, в наших исследованиях показано, что мононуклеарные клетки исследуемых лиц не отвечают на стимуляцию митогеном продукцией цитокинов Тх1 и Тх2 типа, необходимых для формирования полноценного гуморального и клеточного иммунного ответа.

Рис. 7. Спонтанная и митогенсти-мулированная продукция ИЛ-4 МНК ПК лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации, in vitro (M±m).

Рис. 8. Спонтанная и итогенсти-мулированная продукция ИЛ-2 лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации, в культуре МНК ПК in vitro (M±m).

Из литературных данных известно, что после радиационного воздействия продукция изучаемых нами цитокинов лимфоцитами значительно меняется [Baker W.H., 1995; Chang СМ., 1995; Chang СМ., 1997; Finkelstein JN., 1994; Limanni A., 1995]. Тем не менее, данные об отдаленных последствиях радиационного воздействия в малых дозах на продукцию цитокинов у человека в литературе практически отсутствуют. В частности, следует отметить, что у лиц, подвергшихся воздействию малых доз радиации при ликвидации последствий аварии ЧАЭС [Калинина Н.М., 1998], и у лиц, получивших облучение в высокой дозе в результате атомной бомбардировки в Японии [Kusunoki Y., 2001], выявлено снижение митоген-индуцированной продукции ИЛ-2.

Таким образом, нами выявлены изменения функциональных свойств иммунокомпетентных клеток периферической крови у обследованных. У лиц, подвергшихся радиационному воздействию, наблюдается повышенная пролиферативная активность мононуклеарных клеток и продукция в

ответ на митоген, в то же время продукция цитокинов Txl и Тх2 типа (ИЛ-2 и ИЛ-4) практически не меняется или даже снижается после активирующего стимула. Эти изменения функциональных свойств иммунокомпетентных клеток могут приводить к выраженной воспалительной реакции за счет повышенной продукции на антигенные стимулы и к формированию неполноценного

гуморального и клеточного иммунного ответа, так как стимуляции продукция цитокинов Txl и 2 типа этими клетками в ответ на митоген не регистрируется.

Выявленные изменения в продукции цитокинов Txl и 2 типа (ИЛ-2 и ИЛ-4) и провоспалительного (ФНО-а) МНК ПК свидетельствуют о нарушениях в регуляторном звене иммунной системы и могут лежать в основе изменения субпопуляционной структуры ИКК ПК, и в конечном итоге, в увеличении частоты встречаемости иммунопатологических синдромов у жителей Алтайского

края, подиерииичся радиационном) воздействию. На следующем этапе работы мы более подробно изучили сывороточный профиль провоспалител1.1и.[\ цитокинов (ИЛ-1 р, ИЛ-6, ФНО-а) и цитокинов Тх1 и 2 типов (ИЛ-2, ИФН- у, ИЛ-4, ИЛ-10) у лиц, пострадавших от радиационного воздействия в малых

Содержание в сыворотке ировоспалительных цитокинов. Наиболее выраженные изменения были обнаружены для провоспалительных цитокинов шыр, ИЛ-6 и ФНО-а (таблица 1). Таблица№. 1. Содержание ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а в сыворотке крови у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации. Различие с условно здоровыми донорами статистически достоверно при уровне значимости: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001. { - различие между группами при-

1оны п ИЛ-6, пг/мл ИЛ-1 Р, пг/мл ФНО-а, пг/мл

Ме Размах квартилей Ме Размах квартилей Ме Размах квартилей

1 97 10,5* 109,1 1612,4*** 19337,1 39,15* 474,6

2 62 8,4* 118,4 1042,7*** 4290,6 534,7***-! 8520,5

3 83 1,5*/ 159,7 1201,2*** 19842,4 2353,1*** J 11867,4

1-3 242 7,7* 127,7 1323,7*** 13554,4 134,5*** 4584,8

норма 44 5,7 59,6 7,6 20,7 11,5 38,5

Значительное увеличение концентрации сывороточного ИЛ-1В у жителей всех населенных пунктов и во всех поколениях полностью согласуется с данными о повышении уровня экспрессии мРНК ИЛ- 1р в нестимулированных МНК ПК, полученными ранее на этой же выборке обследованных [Козлов В.А., 1995].

Содержание других провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ФНО-а также было повышено в сыворотке крови у всех обследованных групп. При этом, у людей, подвергшихся большему радиационному воздействию (1-я зона), концентрация ФНО-а в сыворотке крови была меньшей (медиана 39,2 пг/мл). И наоборот, в группе, подвергшейся меньшему радиационному воздействию (3-я зона), концентрация была наибольшей (медиана

2353,1). Эта закономерность прослеживалась в каждом отдельно взятом поколении. Снижение сывороточных концентраций у жителей 1-ой

зоны совпадает с данными по спонтанной продукции ФНО-а МНК в культуре (рис.6), которая и жителей 1-ой зоны была минимальной. Концентрация ФНО-а у третьего поколения была выше (медиана 1086,5 пг/мл), чем у первого и второго поколений (280,5 и 390,1 пг/мл соответственно). Сывороточный уровень ИЛ-6 во всех населенных пунктах превышал нормальные показатели, но незначительно. Эти показатели также согласуются с полученными ранее результатами о повышенной экспрессии генов ФНО-а и ИЛ-6 в мононуклеарных клетках периферической крови у лиц из тех же населенных пунктов [Козлов В.А., 1995].

Таким образом, у большинства жителей Угловского района, подвергшегося радиационному воздействию, концентрация и

ФНО-а в сыворотке крови значительно повышена относительно этих значений

н контрольной ipynnc. Уровень, превышающий нормальные показатели ИЛ-Iß (90 иг/мл) имели 81,4% обследованных; ИЛ-6 - 47,3%, ФИО-а (30,6) - 79,3% . Эти результаты согласуются с данными оценки состояния здоровья населения с помощью автоматизированной системы «Асирис», по результатам которой у 87% обследованных выявлены различные иммунопатологические синдромы. Можно заключить, что повышенная экспрессия и продукция провоспалительных цитокинов вносит несомненный вклад в развитие хронических и рецидивирующих воспалительных заболеваний, повышенная частота которых наблюдается у жителей Алтайского края, пострадавших от радиационного воздействия.

Из литературных данных известно, что после радиационного воздействия экспрессия генов и продукция провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-ip, ИЛ-6 и ФНО-а, значительно меняется [ Baker W.H., 1992; Chang СМ., 1995; 1997; Finkelstein JN., 1994; Limanni A., 1995] В работе Белякова И.М. с коллегами установлено, что содержание ИЛ-10 в сыворотке крови у ликвидаторов через 5 лет после Чернобыльской аварии достоверно повышается до 2351+ 1946 пг/мл по сравнению с контрольной группой здоровых доноров, у которых этот показатель был равен 90,0+23,6 пг/мл, причем в группе ликвидаторов (суммарная доза внешнего облучения 0,1-0,5 Гр) концентрация ИЛ-ф в сыворотке была выше (36,49+2352), чем у больных с последствиями острой лучевой болезни (суммарная доза внешнего облучения 4-9 гр), и составляла 1356+432 [Беляков И.М., 1993]. В популяции людей, переживших атомную бомбардировку Хиросимы и Нагасаки, установлено дозозависимое повышение ИЛ-6 в плазме крови в отдаленные сроки после радиационного воздействия [Hayashi Т., 2003].

С другой стороны, хорошо известен факт, что как ИЛ-1р\ так и ФНО-а, обладают сильнейшим радиопротективным действием-[Рогачева С.А., • 1997, 1998; Рождественский Л.М., 1998; Легеза В.И.Т 1999; Urbaschek R., 1987; Karkanitsa L.V., 1997; R. Neta R., 1990, 1994; Shen R.N., 1991]. В свете этих данных повышение уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови жителей Алтайского края, подвергшихся длительному радиационному воздействию в малых дозах, может иметь адаптационное значение при повышении радиационного фона.

В ряде работ показано, что повышение экспрессии генов и продукции цитокинов иммунокмпетентными клетками человека и, в частности ИЛ-ip, ИЛ-6 и ФНО-а, может быть обусловлено аллельным полиморфизмом генов [Bidwell J., 1999; Koss К., 2000; Warzocha К., 1998; Djouadi К., 2001; Wilkinson R., 1999; Wilson A., 1997; Patino-Garcya A., 1999; Fishman D., 1998; Linker-Israeli M., 1999]. Можно предположить, что механизмом формирования повышенной продукции ИЛ-ip, ИЛ-6 и ФНО-а в популяции, подвергшейся длительному радиационному воздействию, может являться увеличение частоты встречаемости аллельных вариантов генов е гиперпродукцией цитокинов. Это может быть эффективным механизмом, направленным на защиту кроветворной системы от

мсГимюнрнянюю воздействия повышенною радиационного фона 1акжс имеются данные о том, «но ршличные аплельнме варианты icna ФНО-а строю ассоциированы с генами главного комплекса гнстосовместнмости, причем аллсльные варианты, обуславливающие высокую экспрессию ФНО-а строго ассоциированы с HLA Al, В8, DR3, а низкую экспрессию - с DR2 [Wilson А., 1993, 1997; Jacob С., 1990, Bendtzen К., 1988; Abraham L., 1993]. В работе, выполненной академиком РАМН Коненковым В.И. с коллегами [Коненков В.И, 1995], показано, что у жителей Угловского района, подвергшихся

радиационному воздействию выявлено увеличение частоты встречаемости этих антигенов: для А1 установлено увеличение с 20% в контроле до 34% у облученных, для В8 показано увеличение с 14% в контроле до 34% у облученных, для DR3 изменений не выявлено, а для DR2 зарегистрировано снижение с 38% в контроле до 34 у облученных. У этой же группы обследуемых ранее была зарегистрировано значительное увеличение экспрессии гена ФНО-а, как на уровне мРНК [Козлов В.А., 1995], так и на-уровне самого медиатора в наших исследованиях. Способность иммунокомпетентных клеток жителей Угловского района к повышенной продукции ФНО-а подтверждается и нашими данными о достоверно повышенной КонА-индуцированной продукции этого медиатора МНК ПК. Таким образом, наше предположение, что повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов, и в частности ФНО-а, может быть связана с изменением частоты встречаемости разных аллельных вариантов генов цитокинов, косвенно подтверждается этими данными.

Вероятно, лица обладающие повышенной продукцией провоспалительных цитокинов, имеют преимущество перед лицами с низкой продукцией в выживании при повышении радиационного фона, что подтверждается радиопротективным действием этих медиаторов при облучении [Рогачева, 1997, 1998; Рождественский Л.М., 1998; Легеза В.И., 1999; Urbaschek R., 1987; Karkanitsa L.V., 1997; Neta R., 1990; 1994; Shen R.N., 1991).

В целом, можно заключить, что регистрируемое у жителей Угловского района повышение экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов с одной стороны может иметь адаптационное защитное значение для популяции, а с другой стороны приводить к росту хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, частота встречаемости которых повышена у жителей этого района Алтайского края.

Содержание в сыворотке Тх1/Тх2 цитокинов. Другой группой важных медиаторов, которые были изучены и от которых в значительной степени зависит развитие иммунной реакции преимущественно по клеточному или гуморальному типу, являются цитокины, продуцируемые Т-хелперными клетками. IL-2, IFN-y в основном продуцируются Т-хелперами 1 типа и регулируют реакции клеточного иммунитета, в том числе реакцию гиперчувствительности замедленного типа. IL-4, IL-10, в основном, продуцируются Т-хелперами 2 типа и регулируют реакции гуморального иммунитета, в том числе пролиферацию и дифференцировку В-клеток и продукцию иммуноглобулинов [Mosmann R.T., 1996]. В норме

существует определенный баланс в продукции этих цитокннов, обеспечивающий функционирование различных звеньев иммунной системы. Изменение в профиле продуцируемых цитокинов свидетельствует об активации иммунной системы и при устойчивых изменениях может указывать на формирование иммунопатологических состояний.

Таблица №. 2. Содержание, иитокинов Тх1/Тх2 типов в сыворотке крови у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации. Различие с условно здоровыми донорами статистически достоверно при уровне значимости: * - р<0,05; ** - р<0,01;

*** -р<0. 001' { - различие мАждУ ГрУППЯМИ ПР Ш р<0 05 и НИЖе. . , _

Зоны (П) Тх1 Тх2

ИЛ-2 ИФН-Y ИЛ-4' ил-м

Me (размах квартилей)* Me (размах квартилей) Ме (размах квартилей)< Me (размах квартилей) -

(97) Г/ 113*** (133) Л32,2*** (474,6) 38,2** (496,8) Г 134*** (48)

2(62) < 1.171,5*** (28) , 1' 40,3** (494) 5,3* (489,9) .186,5*** (201)

3(83) t 224*** (41) 0 (686,7) 65,3** (537,8) к 254*** (42)

1-3 (242) 177,5"* (113) 20,1*** (280,9) 42,6** (500,2) 174,5*** (120)

Норма 5,803(19,4) 0(19) 6,7(37,5) 143 (58,7)

Концентрация ИЛ-2 в сыворотке крови обследованных жителей Угловского района, подвергшихся радиационному воздействию, а также у их потомков достоверно выше в сравнении с показателями контрольной группы (Таблица 2). У жителей отдельных населенных пунктов изменения содержания ИЛ-2 в сыворотке имеют сходный характер, причем статистически в сравнении с нормой достигают показатели содержания ИЛ-2 отдельно по поколениям, а также у населения деревень в целом. Анализ содержания ИФН-у (Таблица 2) в сыворотке крови жителей Алтайского края выявил изменения, сходные с таковыми для ИЛ-2, то есть достоверное увеличение сывороточной концентрации как у всей группы обследованных, так и отдельно по трем поколениям при р<0,001.

Изучение содержания ИЛ-4 (Таблица 2) в сыворотке крови жителей Угловского района Алтайского края обнаружило увеличение концентрации цитокина у всей группы обследованных и при анализе по поколениям. При исследовании содержания ИЛ-4 в сыворотке крови лиц, проживающих в отдельных населенных пунктах, в 1-й и 3-й зонах выявлено достоверное увеличение показателя во всех анализируемых поколениях. Во 2-й зоне изучаемый показатель был достоверно повышен только в третьем поколении (данные не приводятся).

Содержание ИЛ-10 в сыворотке крови жителей' Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию, а также у их потомков, достоверно выше в сравнении с нормативными значениями, что аналогично характеру изменений, выявленных для других изученных цитокинов (Таблица 2). Анализ концентрации цитокина в сыворотке крови отдельно по населенным пунктам выявил статистически значимое увеличение содержания ИЛ-10 во всех исследуемых группах.

Таким образом, в сыворотке крови лиц, подвергшихся радиационному воздействию, выявлено повышение содержания как цитокинов,

продуцирующихся Тх-1 (ИЛ-2 и И11Ф-у). так и нптокинов, иролуцируюшнчся Гх-2 (ИЛ-4, ИЛ-10) типов, что свидетельствует об активации иммунной системы. Это повышение не столь выражено, как для провоспалительных цитокинов и в определенной степени может быть следствием повышения нровосналигельных цитокинов, высокий уровень которых приводит к изменению баланса цитокинов и установление его на другом, более высоком

уровне. С другой стороны, повышенный уровень цитокинов Txl и 2 типа в сыворотке крови жителей Угловского района сопровождается ростом частоты встречаемости таких иммунопатологических синдромов как инфекционный, аллергический, аутоиммунный, гематологический, онкологический, в формировании которых участвуют как механизмы клеточного, так и гуморального иммунитета, которые как раз и регулируются изученными нами цитокинами. Повышение частоты иммунозависимых заболеваний у лиц, подвергшихся радиационному воздействию, в патогенезе которых участвуют цитокины Т-хелперов 1-го и 2-го типов, вероятно, является .следствием повышения уровня экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов и нарушения баланса цитокинов Txl и 2 типа. Известно, что развитие аллергических заболеваний определяют преимущественно цитокины Т-хелперов второго типа, а в формировании аутоиммунных и инфекционных заболеваний участвуют как цитокины Тх-1, так и Тх-2. Так как эти изменения регистрируются в трех поколениях, то, вероятно, это связано с изменением генофонда исследуемой популяции. В частности, с увеличением частоты аллельных вариантов генов, ответственных за повышенную продукцию цитокинов. В пользу предположения об изменении генофонда популяции говорят данные иммуногенетических исследований, выполненных под руководством академика РАМН В.И.Коненковым на этом же контингенте жителей Угловского 'района. В этих исследованиях установлены факты выраженных изменений в HLA в трех поколениях среди населения тех регионов Алтая, которые располагаются на следе ядерного взрыва 1949 года. В качестве контроля использовалось население района Алтайского края, не затронутого радиоактивным облаком. Авторами регистрировалось значительное снижение, вплоть до полной элиминации из популяции некоторых HLA-генов. Данные изменения могут быть связаны с выбыванием из популяции индивидов с определенным генотипом, возможно, за счет избирательной смертности.

Таким образом, у жителей Угловского района Алтайского края наблюдаются в отдаленные сроки после воздействия в малых дозах радиации изменения как количественных, так и функциональных параметров иммунной системы, что безусловно лежит в основе регистрируемого роста частоты встречаемости иммунопатологических синдромов.

Выводы

1. У лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах в результате деятельности Семипалатинского полигона, а также у их потомков в двух последующих поколениях наблюдается увеличение частоты встречаемости инфекционного, аллергического и аутоиммунного синдромов, что свидетельствует о нарушениях в иммунной системе.

2. Выявлены изменения в субпопуляционной структуре ИКК у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации, причем характер этих изменений зависит от дозы радиационного воздействия: с увеличением дозы - возрастает количество СДЗ+ и СД 16+ клеток и уменьшается число СД20 + клеток.

3. У лиц подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах наблюдается повышенная пролиферативная активность мононуклеарных клеток периферической крови в ответ на митоген и способность к продукции ФНО-а, в то же время повышения продукции ИЛ-4 и ИЛ-2 мононуклеарными клетками в ответ на митоген не наблюдается, что говорит об нарушениях функциональной активности этих клеток, в частности в продукции цитокинов, необходимых для формирования полноценного гуморального и клеточного иммунного ответа или воспалительной реакции.

4. В сыворотке лиц, подвергшихся радиационному воздействию и у их потомков регистрируются значительное повышение концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-Р, ИЛ-6 и ФНО-а), а также увеличение в уровне цитокинов Txl и 2 типа (ИЛ-2, ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-10), что приводит к нарушению баланса цитокинов и увеличению риска развития инфекционно-воспалительных процессов и различных иммунопатологических состояний у обследуемых групп населения.

5. В отдаленные сроки после воздействия в малых дозах радиации на организм человека наблюдаются изменения как количественных, так и функциональных параметров иммунной системы, что лежит в основе регистрируемого увеличения частоты встречаемости иммунопатологических синдромов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сенникова Ю.А., Гришина Л.В., Еремина Л.В., Крысов СВ., Сенников СВ., Козлов В.А. Профиль провоспалительных цитокинов у лиц, подвергшихся радиационному воздействию // Russian J of Immunology. Тез. докл. 2-го съезда иммунологов. - 1999. - V. 4, Supp. L. - р.338.

2. Гришина Л.В., Сенникова Ю.А., Киселев СВ., Гельфгат Е.Л., Крысов СВ., Соловьева Н.Ю., Сенников СВ., Козлов В.А. Содержание основных иммунорегуляторных цитокинов в сыворотке крови и некоторые показатели иммунного статуса у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона // Материалы 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН. Новосибирск, 2000. - С 27.

3. Гришина Л.В., Сенникова Ю.А., Гельфгат Е.Л., Киселев СВ., Соловьева Н.Ю., Сенников СВ. Распространенность иммунопатологических синдромов и некоторые показатели иммунитета у жителей Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона // Аллергология и иммунология. Тез. докл. III съезда иммунологов и аллергологов СНГ. - 2000. - T.I. - №2. - С. 193.

4. Сенникова Ю.А., Гришина Л.В., Гельфгат Е.Л., Соловьева Н.Ю., Киселев СВ., Крысов СВ., Сенников СВ., Козлов В.А. Структура иммунопатологических синдромов и некоторые показатели иммунной системы у жителей Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности

Семипалатинскою полиюна. // 'Jkojioi ичсская Лнтроиоло! ия, Кжеюлник.

5. Grishina L.V., Sennikova Y.A., Kisselev S.V., Gelfgat E.L., Krysov S.V.,. Soloveva N.Y, Sennikov S.V., Kozlov V.A.. Serum level of the main immunoregulation cytokines and some immunological status parameters in the population exposed to radiation influence resulted from the nuclear test action at the Semipalatinsk test site // J. Leukoc. Biol. Suppl. - 2001. - S.262. - p.78.

6. Гришина Л.В., Сенникова Ю.А., Сенников СВ., Козлов В А. Содержание основных иммунорегуляторных цитокинов'в сыворотке крови у жителей Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского ядерного полигона и у их потомков // Аллергология и иммунология. Тез. докл. IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ. - 200 L - Т.2. - №2. - С. 171.

7. Сенникова Ю.А., Гришина Л.В., Соловьева Н.Ю., Крысов СВ., Сенников СВ., Козлов В.А. Цитокины Тх первого и второго типов у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского ядерного полигона // Экологическая антропология, Ежегодник. - 2002. - С.

' 195-198.

8. Гришина Л.В , Сенникова Ю.А., Сенников СВ., Козлов В. А.. Продукция ИЛ-2 и ИЛ-4 in vitro иммунокомпетентными клетками периферической крови жителей Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона // Цитокины и воспаление. Тез. докл. конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет». -2002. - Т. 1.- №2. -С.87.

9. Гришина Л.В., Сенникова Ю.А., Крысов СВ.. Соловьева Н.Ю., Сенников СВ., Козлов В.А. Цитокины, продуцируемые Т-хелперами 1-го и 2-го типов у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона // Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. - Новосибирск. - 2003. - С. 42-45.

10. Sennikov S.V., Krysov S.V., Injelevskaya T.V., Silkov A.N., Grishina L.V., Quantitative analysis of human immunoregulatory cytokines by electrochem method//J. Immun. Methods. - 2003. - V. 275, №1-2 - pp. 81 - 88.

11. Гришина Л.В., Сенникова Ю.А. Соловьева Н.Ю., Крысов СВ., Сенников С В., Козлов В. А. Цитокины Т-хелперов первого и второго типов в сыворотке жителей Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона // Медицинская иммунология. Тез. докл. Конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге».- 2003.-Т.5.- №3-4.-С 461.

12. Козлов В.А. Сенникова Ю.А., Крысов СВ., Гришина Л.В., Соловьева Н.Ю., Сенников СВ. Цитокины Т-хелперов первого и второго типов и некоторые показатели иммунного статуса у жителей Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона // Евразийский медицинский журнал. - 2003. - № 1. - С. 81-88.

13. Хабаров А.С, Дергачев B.C., Шойхет Я.Н., Гришина Л.В., Сенникова Ю.А., В.А. Козлов В.А., Сенников СВ. Иммунорегуляторные цитокины у потомков второго поколения лиц, подвергшихся радиационному воздействию в

результате деятельности Семипалатинского полигона, страдающих иммуноиндикаторными болезнями ЛОР-органов // Бюллетень СО РАМН. -2003.-№3(109).-С. 97-101.

Заказ № 386. Тираж 100 экз. Печ. л. 1,0. Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Типография ЗАО «ТамКон».

<- 66 3 1

ф Актуальность проблемы.

Двадцатый век принес человечеству открытие ядерной реакции. Однако вне зависимости от того, использовался ли атом в «мирных» или «немирных» целях, он таил в себе угрозу здоровью человека. Ядерная бомбардировка Хиросимы и Нагасаки, испытания ядерного оружия на полигонах, аварии на атомных электростанциях, а также растущее применение ионизирующего излучения (ИИ) в терапии различных заболеваний в середине XX века привело к необходимости исследований последствий радиационного воздействия на человеческий организм [104, 146, 163, 170, 178, 180]. Однако и в настоящее время научные дискуссии о механизмах воздействия ионизирующего излучения и его отдаленных последствий на живой организм не завершены, и многие вопросы требуют дальнейшего изучения. Исследования в области данной проблемы по-ф прежнему остаются актуальными как из-за постоянного имеющегося риска радиоактивного заражения окружающей среды, так и из-за риска потерь здоровья лиц, уже подвергшихся радиационному воздействию.

Хотя результаты воздействия малых доз радиации на животных и на человека, в частности, описываются в литературе, но многие данные противоречивы [12, 73, 121, 150, 172, 179]. Исследования, выполненные на экспериментальных животных и культурах клеток с использованием малых ж доз радиационного воздействия, показывают высокую радиочувствительность как иммунокомпетентных клеток [73, 105, 137, 172], так и ряда иммунологических механизмов [5, 17, 61, 173] их важную роль в развитии патологических состояний, формирующихся после радиационного воздействия [105, 107, 121, 169, 173]. В то же время, проблема воздействия ^ ионизирующего излучения на иммунную систему человека, в особенности в малых дозах и в отдаленные сроки, остается малоизученной.

В ряде исследований описываются последствия воздействия малых доз радиации на иммунную систему жителей Алтайского края и Казахстана [64], жителей Южного Урала [40], ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в 1986 - 87 г.г. и пострадавших в результате этой аварии [5, 23, 56, 100], жителей Хиросимы и Нагасаки, переживших взрыв атомной бомбы [139, 140, 141]. К сожалению, исследование данных групп населения противоречивы и не являются полными. В частности, остаются открытыми вопросы по изменению субпопуляционной структуры иммунокомпетентных клеток, их функциональной активности, изменениям в регуляторном звене иммунной системы, не ясны механизмы возникновения иммунопатологических синдромов у лиц, подвергнувшихся радиационному воздействию, и у их потомков. В связи с этим, представляется актуальным изучение отдаленных эффектов радиационного воздействия в малых дозах на состояние иммунной системы у лиц, подвергшихся такому воздействию и их потомков. С этой целью нами были обследованы жители Алтайского края, пострадавшие в результате ядерных испытаний на Семипалатинском полигоне. Факт радиационного воздействия на население Алтайского края подтверждается данными радиационной разведки, анализом распространения воздушных масс из эпицентра взрыва, выпадений р-активности и аномальных повышений радиационного фона. Изучение последствий этих испытаний и решение вопроса о социальной и медицинской защите населения началось в 1990 г., более чем через 40 лет после первого испытания. В настоящее время радиоактивное загрязнение природной среды от испытаний в Алтайском крае снизилось до допустимого фонового уровня [55, 68]. Ранее, другими исследователями уже была установлена взаимосвязь между относительно высоким уровнем показателей заболеваемости и смертности у населения Алтайского края и ядерными испытаниями, проведенными на Семипалатинском полигоне в 1949-1962 гг. [65], дозозависимые изменения иммуногенетической структуры (в том числе - предрасполагающие к развитию вторичных иммунодефицитов) [27, 62] и изменения в уровне экспрессии генов иммунорегуляторных цитокинов, что свидетельствует о дизрегуляторных процессах в иммунной системе [25]. Представлялось актуальным и значимым продолжить изучение состояния иммунной системы у данной группы населения, в связи с чем были поставлены следующие цель и задачи.

Цель работы.

Изучить частоту встречаемости иммунопатологических синдромов, количественные и функциональные параметры иммунной системы у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации и у их потомков.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространенность иммунопатологических синдромов у лиц, подвергшихся радиационному воздействию и у их потомков.

2.Изучить субпопуляционную структуру иммунекомпетентных клеток периферической крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию.

3.Изучить пролиферативную активность мононуклеарных клеток периферической крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию, а также их способность к продукции цитокинов in vitro.

4.Изучить уровень цитокинов Тх1 и Тх2 типов (ИЛ-2, ИФН-у, ИЛ-4,-10), а также провоспалительных цитокинов (ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО-а) в сыворотке крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию и у их потомков.

Научная новизна работы.

Впервые охарактеризовано состояние иммунной системы, включая субпопуляционную структуру ИКК, их пролиферативную активность, способность к продукции цитокинов, содержание цитокинов в сыворотке крови и частота встречаемости иммунопатологических синдромов в популяции лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах, а также у их потомков.

Установлено увеличение частоты встречаемости ряда иммунопатологических синдромов: инфекционного (синдром вторичного иммунодефицита), аллергического, аутоиммунного, гематологического и онкологического у лиц, подвергшихся радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона и их потомков.

Отмечено изменения в функциональной активности иммунокомпетентных клеток лиц, подвергшихся воздействию малых доз радиации, в частности; повышение пролиферативной активности и способности к продукции ФНО-а МНК ПК в ответ на митоген и в то же время снижение продукции ИЛ-4 и ИЛ-2 в ответ на стимул. Кроме того, у этих лиц выявлены изменения в субпопуляционной структуре иммунокомпетентных клеток.

Впервые определен широкий спектр цитокинов в сыворотке крови у лиц, подвергшихся радиационному воздействию и их потомков. Установлено достоверное увеличение уровня сывороточных провоспалительных цитокинов - ИЛ-1(3, -6, ФНО-а и цитокинов Тх1 и Тх2 типов - ИЛ-2, -4, 10, ИФН-у.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные результаты вносят новый вклад в область изучения воздействия малых доз ионизирующего излучения в отдаленные сроки на иммунную систему человека. В частности, установлена активация системы цитокинов, что сопровождается изменением количественных и функциональных показателей иммунной системы и увеличением частоты встречаемости иммунопатологических синдромов.

Проведенные исследования неоспоримо доказывают настоятельную потребность в организации региональной иммунологической службы для проведения широких иммунореабилитационных мероприятий среди населения Алтайского края не только для лиц, непосредственно подвергшихся радиационному воздействию, но и для их потомков.

Основные положения, выносимые на защиту.

Воздействие ИИ в малых дозах на организм человека приводит в отдаленные сроки к изменению как количественных, так и функциональных параметров иммунной системы, что лежит в основе увеличения частоты встречаемости иммунопатологических синдромов.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2000); 2) семинарах группы молекулярной иммунологии лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1999-2000); 3) конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет.» (Санкт-Петербург, 2002); семинаре научного отдела ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Самостоятельность выполненной работы.

Результаты представленные в данной работе получены и обработаны лично автором. Автор выражает признательность: С.В. Крысову, Н.Ю. Соловьевой, Ю.А. Сенниковой, С.В. Киселеву за помощь в проведении экспедиционных работ; E.J1. Гельфгату за предоставление автоматизированной системы оценки индивидуального риска иммунопатологических состояний - «АСИРИС» и помощь в обработке результатов анкетирования.

Большую признательность автор выражает научному руководителю работы д.м.н. С.В. Сенникову и к.м.н. Ю.А. Сенниковой за подробное обсуждение полученных результатов, а также сотрудникам института клинической иммунологии за помощь и благожелательное отношение в ходе выполнения работы.

Выводы

1. У лиц, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах в результате деятельности Семипалатинского полигона, а также у их потомков в двух последующих поколениях наблюдается увеличение частоты встречаемости инфекционного, аллергического и аутоиммунного синдромов, что свидетельствует о нарушениях в иммунной системе.

2. Выявлены изменения в субпопуляционной структуре ИКК у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации, причем характер этих изменений зависит от дозы радиационного воздействия: с увеличением дозы - возрастает количество CD3+ и CD 16+ клеток и уменьшается число CD20 + клеток.

3. У лиц подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах наблюдается повышенная пролиферативная активность мононуклеарных клеток периферической крови в ответ на митоген и способность к продукции ФНО-а, в то же время повышения продукции ИЛ-4 и ИЛ-2 мононуклеарными клетками в ответ на митоген не наблюдается, что говорит об нарушениях функциональной активности этих клеток, в частности в продукции цитокинов, необходимых для формирования полноценного гуморального и клеточного иммунного ответа или воспалительной реакции.

4. В сыворотке лиц, подвергшихся радиационному воздействию и у их потомков регистрируются значительное повышение концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 р, ИЛ-6 и ФНО-а), а также увеличение в уровне цитокинов Тх1 и 2 типа (ИЛ-2, ИФН-у, ИЛ-4, ИЛ-10), что приводит к нарушению баланса цитокинов и увеличению риска развития инфекционно-воспалительных процессов и различных иммунопатологических состояний у обследуемых групп населения.

5. В отдаленные сроки после воздействия в малых дозах радиации на организм человека наблюдаются изменения как количественных, так и функциональных параметров иммунной системы, что лежит в основе регистрируемого увеличения частоты встречаемости иммунопатологических синдромов.

Заключение

В нашей работе впервые было исследовано состояние иммунной системы жителей Алтайского края, пострадавших от радиационного воздействия в результате деятельности Семипалатинского полигона.

Установлено увеличение частоты встречаемости иммунопатологических синдромов среди населения Угловского района Алтайского края, которое подверглось наибольшему радиационному воздействию в результате деятельности Семипалатинского полигона над спонтанным уровнем этих синдромов, регистрируемым у жителей Сибири. Анализ распространенности типовых иммунопатологических синдромов в трех поколениях у лиц, проживающих в различных населенных пунктах Угловского района, выявил в общем сходную картину - это увеличение процента лиц с различными формами ИПС в сравнении с теми же возрастными группами жителей Сибири. В то же время, для каждой обследованной группы выявлен ряд специфических черт. Частота встречаемости отдельных форм ИПС меняется у представителей разных поколений и у жителей населенных пунктов с различной ЭЭД радиационного воздействия.

В целом, на основании полученных нами данных можно заключить, что у лиц, непосредственно попавших под след ядерного взрыва августа 1949 года, и у их потомков наблюдается повышение частоты инфекционного, аутоиммунного, аллергического, гематологического и онкологического синдромов в сравнении с населением различных регионов Сибири. Этот факт может свидетельствовать о наличии дефектов в иммунной системе у обследуемой группы, в частности, нарушениях как клеточного, так и гуморального звеньев. Результаты наших следующих исследований подтверждают это.

Нами установлены изменения в субпопуляционной структуре иммунокомпетентных клеток у лиц, подвергшихся влиянию малых доз радиации, причем характер этих изменений зависит от дозы радиационного воздействия: с увеличением дозы - возрастает количество СДЗ+ и СД 16+ клеток и уменьшается число СД20 + клеток.

Функциональные параметры иммунокомпетентных клеток также изменены. У лиц, подвергшихся радиационному воздействию, наблюдается повышенная пролиферативная активность мононуклеарных клеток и продукция ФНО-а в ответ на митоген, в то же время продукция цитокинов Тх1 и Тх2 типа (ИЛ-2 и ИЛ-4) практически не меняется или даже снижается после активирующего стимула. Эти изменения функциональных свойств иммунокомпететных клеток могут приводить к выраженной воспалительной реакции за счет повышенной продукции ФНО-а на антигенные стимулы и к формированию неполноценного гуморального и клеточного иммунного ответа, так как стимуляции продукция цитокинов Тх1 и 2 типа этими клетками в ответ на митоген не регистрируется.

Выявленные изменения в продукции цитокинов Тх1 и 2 типа (ИЛ-2 и ИЛ-4) и провоспалительного - (ФНО-а) МНК ПК свидетельствуют о нарушениях в регуляторном звене иммунной системы и могут лежать в основе изменения субпопуляционной структуры ИКК ПК, и в конечном итоге, в увеличении частоты встречаемости иммунопатологических синдромов у жителей Алтайского края, подвергшихся радиационному воздействию.

При изучении сывороточного профиля цитокинов у жителей Алтайского края установлено увеличение концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1(3, ИЛ-6 и ФНО-а, что вносит несомненный вклад в патогенез длительных и плохо поддающихся лечению хронических воспалительных заболеваний.

Значительное повышение КонА-индуцированной продукции ФНО-а МНК ПК у лиц, непосредственно пострадавших от радиационного воздействия, и повышенный уровень провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6 ФНО-а) что у лиц, пострадавших от радиационного воздействия, и их потомков в значительной степени определяет рост инфекционно-воспалительных процессов, регистрируемых у обследуемых групп населения.

Кроме того, в сыворотке крови лиц, подвергшихся радиационному воздействию, выявлено повышение содержания как цитокинов, продуцирующихся Тх-1 (ИЛ-2 и ИНФ-у), так и цитокинов, продуцирующихся Тх-2 (ИЛ-4, ИЛ-10). Повышение уровня сывороточных цитокинов Тх 1 и 2 типов не столь значительное, как для провоспалительных цитокинов, и, вероятно, является следствием их повышения. В результате баланс цитокинов Тх1 и 2 типа устанавливается на более высоком уровне, при котором возрастает вероятность нарушения регуляции реакций как гуморального, так и клеточного иммунитета.

Исходя из вышеперечисленных фактов, можно заключить, что у лиц, подвергшихся воздействию малых дох радиации в отдаленные сроки, наблюдаются изменения в иммунной системе, затрагивающие как функциональные, так и количественные параметры различных звеньев иммунной системы, что приводит к росту частоты встречаемости иммунопатологических синдромов у данной группы населения. Описанные нарушения фиксируются не только у лиц, непосредственно попавших под радиационное воздействие, но и у их потомков.