Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Распределение НLА-антигенов класса I у больных гепатитом В с подтвержденным генотипом HBV

На правах рукописи

р Г Б © Д

Потекаева Светлана Александровна. 2 9 Я Н В 2004

Распределение НЬА-антигенов класса I у больных гепатптом В с подтвержденным генотипом НВУ.

14.00.10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ.

диссертации на соискании ученой степени кандидата медицинских наук.

Москза - 2003.

Работа выполнена в Московской медицинской академии им И.М. Сеченова.

Доктор медицинских наук, профессор

Кандидат медицинских наук, доцент

Научные руководители:

Елена Васильевна Волчкова.

Татьяна Николаевна Лопаткина.

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Галина Михайловна Кожевникова.

Николай Дмитриевич Никифоров.

Ведущее учреждение:

Российская медицинская академия постдипломного образования (РМАПО).

//

2004 г. в часов

Защита диссертации состоится «_0_> на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.05 Московской медицинской академ И.М. Сеченова по адресу: 119992, Москва, Б. Пироговская ул., д.2,стр.3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаминтальной библиотеке ММА им И.М. Сс по адресу: Москва, Нахимовский пр-т, д.49. Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Доктор медицинских наук,

профессор Е.В. Волчкова. Д Г^

V

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Одной из актуальных проблем современной медицины являются вирусные поражения печени различной этиологии, что объясняется возрастающим количеством ежегодно регистрируемых случаев заболевания, трудно прогнозируемым характером их течения и относительно частым формированием хронических форм (Майер К.-П. 1999, Шерлок Ш., Дж. Дули 1999, Серов В.В., Апросина З.Г. 2002).

Вирусному гепатиту В принадлежит одно из первых мест в общей структуре инфекционных заболеваний в связи с его повсеместным распространением. В общем ряду причин смерти хронический гепатит В занимает 9 место. В общей структуре вирусных гепатитов на долю гепатита В приходится от 10 до 30%, причем значительно увеличилось количество так называемых «носителей» HesAg. В связи с этим данное заболевание должно рассматриваться как одно из важнейших хронических вирусных поражений человека (Майер К.-П. 1999, Онищенко Г.Г. 2002, Шерлок Ш., Дж. Дули 1999).

В соответствии с современными представлениями в патогенезе хронического гепатита В имеют место факторы, которым отводится ведущая роль в персистенции вирусной инфекции и развитии хронического поражения печени. С одной стороны, это факторы, связанные с иммунной системой хозяина, а с другой - с генетическими особенностями вируса (Чуланов В.П., Волчкова Е.В., Пак С.Г. 2000, Апросина З.Г., Лопаткина Т.Н. 1986, СюткинВ.Е., Лопаткина Т.Н. 2000).

В качестве перспективных генетических маркеров предрасположенности ко многим заболеваниям и вариантам их течения в последние годы зарекомендовали себя антигены системы HLA, наиболее изученной в настоящее время генетической системы человека, обладающей чрезвычайным полиморфизмом. Однако, в основном исследовалась связь HLA-аллелей с иммунным ответом на HBsAg при вакцинации здоровых людей или у больных острым вирусным гепатитом (Kruskall M.S., Alper С.А. с соавт., 1992, Stachowski J., Kramer J., F st G, 1995, Nouri-Aria K.T., 1983).

Прогрессирование хронического гепатита В зависит от состояния иммунной системы и продолжающейся репликации вируса в печени. Вирус не оказывает прямого цитопатического действия и лизис инфицированных гепатоцитов осуществляется цитотоксическими клетками при клеточном иммунном ответе хозяина с участием молекул класса I главного комплекса гистосовместимости человека, в результате чего в течении и развитии болезни имеют место аутоиммунные механизмы с образованием

антител против собственных гепатоцитов (Ройт А. 2000, Chu С.М. et al. 1987, 1993, Dudley F.J. et al. 1972, Подымова С.Д. 1980).

Полиморфизм системы HLA, свойственный конкретной популяции, является предметом пристального внимания иммуногенетиков, т.к. служит отправным моментом в ряде исследований при изучении проблем «HLA и заболевания» (Ахмедова Х.Ю. 1990, Петров Р.В. 1987, Яздовский В.В с соавт. 1998, Vladitiu А.О., Rose N.R. 1974).

На основе анализа гомологии нуклеотидных последовательностей генома вируса гепатита В в настоящее время идентифицировано 7 генотипов HBV (A-G) и установлена ассоциация между мутациями и исходом HBV инфекции в зависимости от генотипа вируса (Lindh M. et all. 1997, Norder H. et all. 1994, Sanchez L.V. et all. 1999, Stuyver L. et all. 2000, Bahn A. et all. 1995, Bloom H.E. 1995, Laskus T. et all. 1995, Lee Y.I. et all 1996, Lindh M. et all. 1996, Naoumov N.V. et all. 1992, Sato S. et all. 1995, Zoulim F. et all. 1996).

Работ, посвященных комплексному исследованию распределения антигенов класса I системы HLA у больных хроническим гепатитом В и выявлению относительного риска развития хронического гепатита у носителей определенных HLA-антигенов на фоне персистенции различных генотипов вируса гепатита В в доступной нам литературе мы не встретили, как и генотипирования HBV у больных острым вирусным гепатитом в популяции средней полосы России.

Цель настоящего исследования:

Изучение особенностей распределения HLA антигенов класса I у больных с различным исходом гепатита В с подтвержденным генотипом HBV в сопоставлении с результатами генотипирования у больных острым вирусным гепатитом В в популяции средней полосы России.

Задачи исследования:

1. Изучить распределение антигенов системы гистосовместимости класса I у больных хроническим вирусным гепатитом В и циррозом печени в популяции средней полосы России.

2. Исследовать распределение HLA-A, -В антигенов при хроническом течении вирусного гепатита В с учетом активности процесса.

3. Исследовать серологические маркеры в сыворотке крови при остром и хроническом гепатите В в сопоставлении с вирусемией.

4. Идентифицировать генотипы HBV у больных с острым гепатитом В.

5. Идентифицировать генотипы HBV при хроническом гепатите В в изучаемой

группе больных.

Научная новизна.

Проведенное генотипирование больных хроническим гепатитом В по системе НЬА в популяции средней полосы России позволило установить ведущую роль среди этих больных генотипа НЬА-В27.

Впервые установлена ассоциативная связь между НЬА-В27 и высокой предрасположенностью ХГВ после инфицирования НВУ.

Выявлено, что аутоиммунные нарушения при ХГВ и/или цирроз печени в группе больных ХГВ с генотипом В27 встречаются достоверно чаще, чем среди пациентов с другими типами НЬА.

Впервые показано, что риск развития цирроза печени у носителей НЬА-В27 выше, чем при отсутствии данного антигена системы гистосовместимости. Относительный риск равен 26,3.

Полученные данные позволяют считать, что НЬА-В17 является маркером низкой степени активности ХГВ.

Впервые проведено генотипипирование НВУ больных гепатитом В в популяции средней полосы России и выявлено преимущественное распространение генотипа О, который ассоциируется с низкой вероятностью формирования хронических форм.

Практическая значимость.

Выявленная ассоциативная связь системы гистосовместимости I класса с генотипом НВУ у больных вирусным гепатитом В позволяет рекомендовать исследование НЬА класса I для прогнозирования течения и исхода данного заболевания.

Положения, выносимые на защиту.

1. Результаты комплексного изучения распределения антигенов системы гистосовместимости класса I у больных хроническим вирусным гепатитом В и циррозом печени выявили высокий риск развития хронического процесса у носителей НЬА-В27.

2. У больных хроническим гепатитом В с наличием в НЬА-фенотипе антигена В27 в популяции средней полосы России вероятность развития цирроза печени в 26,3 раза выше, чем при других разновидностях системы НЬА I класса.

3. Наличие в генотипе человека НЬА-В27 при инфицировании вирусом гепатита В сочетается с субклиническим течением ОВГ.

4. Инфицированность в популяции средней полосы России обусловлена генотипом D HBV и формирование ХГВ, по-видимому, не зависит от генотипа вируса, а определяется особенностями системы гистосовместимости I класса.

Внедрение полученных результатов в практику.

Результаты настоящего исследования внедрены в практику работы Клинической инфекционной больницы №2 г. Москвы и клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ММА им. И.М. Сеченова и используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, а также на кафедре нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции КИБ №2 18 декабря 2001г, на 5-ом Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии, и иммунофармакологии» 12-14 ноября 2002 г., на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 20-24 января 2004 г. Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова 26 июня 2003 года

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения с обсуждением полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами, 7 диаграммами, 6 рисунками, 1 схемой, снабжена 2 выписками из историй болезни. Библиографический указатель содержит 167 источников литературы (54 отечественных и 113 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

С целью выполнения поставленных задач было обследовано 130 пациентов с HBV-инфекцией: 100 пациентов с острым вирусным гепатитом В (88 мужчин и 12 женщин) в возрасте от 15 до 70 лет, находившиеся на лечении в инфекционной клинической больнице № 2 в марте-мае 1999 года и 30 пациентов (14 мужчин и 16

женщин) с хроническим гепатитом В и циррозом печени вирусной этиологии в возрасте от 16 до 68 лет с морфологически подтвержденным диагнозом и наличием НВУ ДНК в сыворотке, которые наблюдались в гепатологическом отделении Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний имени Е.М. Тареева за период 1998-2000 гг. (таблица №1).

Таблица!.

Возрастной и половой состав больных с вирусным гепатитом В.

Возраст (в годах) Количество больных ОВГВ Количество больных ХГВ

М Ж Всего % М Ж Всего %

15-20 40 2 42 42 3 3 6 20

21-30 35 7 42 42 2 2 4 13,3

31-40 11 1 12 12 4 - 4 13,3

41-50 1 2 3 3 3 2 5 16,7

51-60 - - - - - 7 7 23,3

Старше 60 1 - 1 1 2 2 4 13,3

Всего 88 12 100 100 14 16 30 100

HLA фенотип устанавливали в стандартном микролимфотоксическом тесте. В работе использованы HLA-типирующие сыворотки НИИ гематологии и переливания крови Минздрава РФ (Санкт-Петербург), коммерческие сыворотки фирм «Behring» и «Pel-Freez», а также сыворотки из коллекции XI Международного рабочего совещания по гистосовместимости. С помощью этих наборов типирующих реагентов выявлялись HLA-антигены локусов А, В. Контрольную группу составили 150 здоровых доноров крови русской национальности. Достоверность различия частот HLA-антигенов определяли с помощью точного теста Фишера для четырехпольных таблиц (Браунли К. А. 1997).

На основании методики, предложенной Lamm L.U. (1979г) выделяют два вида связи HLA и заболевания: генетическая детерминированность и генетическая ассоциация. О генетической детерминированности можно говорить в том случае, когда «патологический ген» имеет истинное сцепление с HLA комплексом. Гены HLA, ассоциированные с заболеваниями можно рассматривать как гены восприимчивости к заболеваниям либо как маркеры локусов, сцепленных с истинными генами определяющих предрасположенность к заболеваниям. Наличие HLA-ассоциаций характеризуют величиной относительного риска (ОР). ОР - величина, показывающая во сколько раз больше риск развития заболевания при наличии в HLA-фенотипе определенного антигена, чем при его отсутствии (Добротина H.A. с соавт. 1990, Рашидова P.A. с соавт. 1989, Шабалин В.И. 1988, Lamm L.U. 1979).

OP = a!d b'c

где a- частота носителей антигенов среди больных, Ь- частота носителей с отсутствием антигенов среди больных, с- частота носителей антигенов в контрольной группе, d- частота носителей с отсутствием антигенов в контрольной группе. Данная формула использовалась для определения относительного риска (ОР).

Методом ПЦР исследовали сыворотку на наличие ДНК вируса гепатита В с использованием тест систем семейства «АмплиСенс» производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ (Москва). Определение генотипов вируса гепатита В проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

Результаты клинических и лабораторных исследований были внесены в карты индивидуального обследования. Статистическую обработку клинических и лабораторных данных выполняли в соответствии с правилами вариационной статистики (Мерков A.M., Поляков Л.Е.,1974) и вычислением для полученных параметров средней арифметической (М), средней ошибки средней арифметической (m), стандартным отклонением (<т). Оценку достоверности различий количественных показателей проводили путём сопоставления средних значений по t- критерию Стьюдента. Значение фактора достоверности оценивали по таблице вероятности. Для статистической обработки небольших групп наблюдений и оценки качественных различий использованы непараметрические методы анализа: критерий U- Вилкоксона - Манна -Уитни.

Часть статистической обработки полученных данных выполняли на компьютере IBM PC с использованием универсального математического пакета "EXCEL 7", программы "Biostat. exe" (Printer of biostatistics, 4th Edition, S.A. Glantz, McGraw-Hill), a также программы SPSS 10.0. Достоверность частот HLA-антигенов определяли с помощью точного теста Фишера для четырехпольных таблиц (Браунли К. А., 1977).

Результаты исследований и их обсуждение. При анализе полученных результатов нами было установлено, что у 100 обследованных больных с ОВГ 68% внутривенно употребляли наркотические вещества. Большинство из обследованных пациентов были в возрасте от 15 до 30 лет (88%). Преобладали лица мужского пола - 88% (таблица №1).

Острый период у 88% больных ОГВ сопровождался желтушным синдромом, при этом дополнительно наблюдались: гепатомегалия у 48%; гепатоспленомегалия у 13%; гепатомегалия и диспепсический синдром у 12%; гепатоспленомегалия и

диспепсический синдром у 13%; астеновегетативным синдромом у 13%; гепатоспленомегалия и артралгии у 1 %.

У 12% больных в остром периоде не наблюдалось желтушного синдрома, однако, у этих пациентов отмечались выраженные астеновегетативный и диспепсический синдромы, что и послужило поводом для поступления в стационар.

С момента возникновения желтухи у пациентов исчезала лихорадка, экзантема, проявления гриппоподобного синдрома, а также уменьшались проявления астеновегетативного, диспепсического и артралгического синдромов.

При анализе биохимических показателей выявлено, что у 6% уровень AJ1T составлял до 5N (N - норма), у 6% от 8 до 12N, у 16% от 14 до 24N, у 33% от 26 до 50N, у 25% от 50,5 до 89N. У 8% уровень ACT составлял до 4N, у 14% от 5 до 12N, у 13% от 13 до 24N, у 42% от 26 до 50N, у 8% 58N. У одного пациента уровень ACT составлял 173N. Уровень ГГТ у 15% был в пределах нормы, у 24% уровень ГГТ был до 2N, у 34% до 4N и у 8% до 6,7 N, у одного пациента уровень ГГТ составлял 15N. Уровень щелочной фосфотазы был повышен у всех обследованных больных от 3 до 8,6N. Уровень общего билирубина у 12% был в пределах нормы, у 36% повышался до 5N, у 34% до 10N, у 14% до 14,5N, у 4% до 22,5N. Полученные данные по биохимическим нарушениям отражены в диаграммах № 1 и №2.

АЛТ

ACT

■ до 5N

□ 5-12N

□ 13-24N

□ 26-50N

□ 50.5-89N

Диаграмма 1. Распределение пациентов с ОВГВ в сопоставлении с уровнем цитолитнческих ферментов при поступлении в стационар.

■ И

Идо 5Ы Идо 10Ы □ до 15Ы Шдо 23 N

Диаграмма 2. Распределение уровня билирубина у больных ОВГВ.

Все обследованные больные перенесли ОВГВ среднетяжелого течения по клинико-биохимическим критериям на основании приказа № 408 МЗ РФ от 12.07.1989г.

ДНК НВУ обнаружена в 100% случаев. При генотипировании вируса гепатита В установлено, что в 99% случаев заражение произошло Б-генотипом НВУ.

При сопоставлении спектра серологических маркеров НВУ-инфекции у больных острым вирусным гепатитом В и наличия вирусемии выявлено, что ДНК НВУ присутствовала в 100%, тогда как HBsAg - в 97%, аНВс^М - в 73%, НВсАЬ сум - в 90%, НВеАЬ - в 57% случаев (таблица №2).

Таблица 2.

Спектр серологических маркеров у больных ОВГВ.

Кол-во больных Серологические маркеры

НВвАв аНВс^М аНВс сум НВеАЬ НВУ ОЫА

1 - + - - +

1 - + - + +

2 + - - + +

3 + + - - +

1 + + - + +

17 + + + - +

49 + + + + +

19 + - + - +

4 + - + + +

2 + - - - +

1 - + + - +

100 97 73 90 57 100

Примечания: обследование проведено до 20 дня желтухи, за исключением 3 больных

(HBsAg-пoзитивныx).

% 40

БЛ общ.

Только у 49% (49 чел.) присутствовали НВзАд, аНВс^М, НВсАЬ сум и НВеАЬ. У 19% отсутствовали аНВс^М и НВеАЬ; у 17% не определялся НВеАЬ; у 4% -аНВс^М; у 3% - аНВс^М, НВеАЬ; у 2% - аНВс^М, НВсАЬ сум; у 2% - аНВс^М, НВсАЬ сум, НВеАЬ; у 1% - НВвА^ НВеАЬ; у 1% - НВсАЬ сум; у 1% - НВэА& НВсАЬ сум; у 1% - НВвА^ НВсАЬ сум, НВеАЬ.

У 3 больных (3%) не выявлен HBsAg в сыворотке крови, но при этом определялись аНВс^М, а также ДНК НВУ, что свидетельствует о наличии так называемого НВзА§-негативного ОВГВ.

У 23% пациентов аНВс^М в сыворотке крови не определялся, но несмотря на отсутствие маркера, традиционно свидетельствующего об «остроте» инфекционного процесса выявлен высокий уровень ферментемии, билирубинемии и репликация НВУ.

Таким образом, обследованная группа больных ОВГВ была разнородна по серологическому профилю, в частности, были пациенты с HBsAg-нeгaтивным ОВГВ и выявлена значительная группа больных с отсутствием аНВс^М (27%). В условиях отсутствия маркеров других вирусных гепатитов для этой группы больных, представляется важным исследование ДНК НВУ для подтверждения наличия вирусемии.

Дополнительно у больных ХГВ для верификации диагноза помимо серологического и лабораторного обследования, выполнена пункционная биопсия печени у 24 из 30 пациентов (80%), длительность заболевания к моменту обследования в среднем составила 11,4 лет, хотя у 4 пациентов давность заболевания не была установлена (таблица №3).

Таблица 3.

Длительность заболевания у пациентов ХГВ и циррозом печени к

моменту обследования.

Длительность заболевания Количество больных

неизвестна 4 чел.

До 1 года 6 чел.

От 1 года до 5 лет 9 чел.

От 5 до 10 лет 3 чел.

От 10 до 15 лет 3 чел.

От 15 до 20 лет 2 чел.

33 года 2 чел.

45 лет 1 чел.

80% больных отрицали перенесенный острый вирусный гепатит. При ретроспективном анализе факторов риска в этой группе больных получены следующие данные: донорство - 4 человека, посещение стоматолога - 3 человека, оперативные вмешательства - 6 человек, гемотрансфузии - 4 человека, татуировка в детстве - I человек, медработники - 2 человека, частое посещение гинеколога по поводу лечения бесплодия - 1 человек, контакт с мужем, перенесшим ОВГВ - 1 человек. 4 пациента имели более одного фактора риска. У 7 пациентов факторы риска не были выявлены.

У половины обследованных (14 человек - 46,7%) имели место системные проявления, которые были представлены следующим образом: генерализованный васкулит, гломерулонефрит, аутоиммунные нарушения, узелковый периартериит, суставной синдром, синдром Шегрена, тубулоинтерстициальный нефрит, фиброзирующий альвеолит, синдром Гийена-Барре, ^А нефропатия, доброкачественная моноклональная иммуноглобулинопатия, что обусловлено формированием иммунных комплексов с НВУ в эндотелии сосудов различных органов (таблица №4).

Таблица 4.

Распределение системных проявлений у больных ХГВ.

Внепеченочные проявления Количество больных

Абс. число %

Суставной синдром 4 28,6

Узелковый периартериит 3 21,4

Синдром Шегрена 3 21,4

Гломерулонефрит 2 14,3

Генерализованный васкулит 1 7,1

^А нефропатия 1 7,1

Доброкачественная моноклональная иммуноглобулинопатия 1 7,1

Тубулоинтерстициальный нефрит 1 7,1

Фиброзирующий альвеолит 1 7,1

Синдром Гийена-Барре 1 7,1

Антафосфолипидный синдром 1 7,1

Нейропатия 1 7,1

Миалгии 1 7,1

Поражение кожи 1 7,1

Тиреоидит 1 7,1

*-у ряда больных сочетание двух и более системных поражений.

При анализе клинической картины заболевания установлено, что у 23% пациентов периодически наблюдались такие проявления как экзантема, лихорадка, миалгии, артралгии, нейропатия, «сухой» синдром и у 40% их сочетания, у 23% пациентов имели место печеночные проявления: желтуха, гепатомегалия, кожный зуд; спленомегалия, асцит и энцефалопатия, как проявления цирроза печени, у 7% проявляется только общеклиническими симптомами (слабостью, анорексией, психоэмоциональной лабильностью, недомоганием) и у 7% больных заболевание протекает бессимптомно.

На момент обследования у 20% пациентов с хроническим гепатитом В не было каких либо клинических проявлений заболевания. У остальных больных (80%) клиническая картина заболевания была представлена следующим образом: общеклиническими проявлениями (только слабостью у 10%, слабостью в сочетании с другими симптомами у 46,7%); печеночными проявлениями, представленными желтухой (10%), кожным зудом (3,3%), гепатомегалией (36,7%), спленомегалией (10%), при циррозе печени асцитом (10%) и энцефалопатией (6,7%); внепеченочными проявлениями: экзантемой (3,3%), лихорадкой (10%), миалгиями (13,3%), нейропатией (23,3%), артралгиями (23,3%), «сухим» синдромом (6,7%). Преобладающими признаками являлись слабость, гепатомегалия, нейропатия, артралгии, миалгии и лихорадка (диаграмма №4).

■ печеночные проявления В внепеченочные проявления Ш смешанные проявления

О бессимптомное течение

□ общеклинические проявления

Диаграмма 4. Клиническая картина у больных ХГВ на момент

обследования.

Активность процесса в печеночной ткани подтверждена результатами лабораторных и морфологических исследований. У всех больных в стадии обострения

33%

выявлено повышение уровня цитолитических, холестатичееких ферментов, билирубина, гипергаммаглобулинемия, снижение альбуминов сыворотки крови. Эти нарушения сохранялись и в стадии клинической ремиссии. Уровень антител к ДНК как нативной, так и денатурированной был стойко повышен независимо от стадии процесса у 40% пациентов (у 10% пациентов с ХГВ низкой степени активности, у 3,3% - с ХГВ умеренной степени активности, у 3,3% - с циррозом печени, у 6,7% - с ХГВ низкой степени активности с системными проявлениями, у 10% - с ХГВ умеренной степени активности с системными проявлениями, у 3,3% - с ХГВ высокой степени активности с системными проявлениями и у 3,3%- с циррозом печени с системными проявлениями). Криоглобулины не обнаруживались в стадии клинической ремиссии и появлялись в стадии обострения в 16,7% случаев (у 3,3% больных ХГВ умеренной степени активности, у 6,7% - ХГВ низкой степени активности с системными проявлениями, у 3,3% - ХГВ умеренной степени активности с системными проявлениями и у 3,3% -циррозом печени). При анализе уровня иммуноглобулинов и комплемента как в стадии клинической ремиссии, так и в стадии обострения различий не установлено (таблицы №№ 5,6).

Таблица 5.

Динамика лабораторных показателей у больных ХГВ в стадии обострения и ремиссии.

показатели ХГВ в ст. обострения ХГВ в ст. ремиссии

п средние значения крайние значения п средние значения крайние значения

АЛТ 16 460,2±150.7 13-2200 23 73,4+17.36* 8,6-360,1

АСТ 16 459,6±178,5 32-1395 23 62,4±13.4* 21-316,6

ЩФ 14 245,1±56 96-659 22 147,8±19,6 42-337

ГГТ 15 136,1 ±40.1 10-650 23 50,7±22.5 10,9-537

БЛ 13 13,9±8.7 0,6-114,4 21 1,1+0.14 0,5-3,4

ХЭ 11 5765±923 1712-9957 19 8847±701* 2025-14087

альбумины 10 47,1±5.4 3-62,2 14 53±2,9 31,7-66,3

Гамма-глобулины 12 18,5±3.5 2-35,3 15 21,6±2,8 2,9-45,6

Примечания:

п- количество наблюдений *- достоверность между группами (р<0.05)

13

Таблица 6.

Динамика иммунологических показателей у больных ХГВ в стадии

обострения и ремиссии.

показатели ХГВ в ст. ремиссии ХГВ в ст. обострения

п средние значения крайние значения п средние значения крайние значения

1йА 12 372±54 20-780 21 374±47 125-890

1йМ 12 223±55 100-650 21 157±17 73-410

1йО 12 1974±188 1300-3180 21 2143±519 650-12200

Со 10 28,5±2.2 13-37 17 29,1 ±2 0-34,5

аДНК натив. 9 1,3±0.1 0,3-1,8 14 1,5±0.2 0,9-2,9

аДНК денат. 9 1,4±0.2 0,24-2,1 14 1,4±0.1 1,1-2,4

Была исследована степень вирусемии у пациентов с ХГВ, которая представлена следующим образом: высокая - 30% (9 чел), умеренная -16,7% (5 чел), низкая -26,7% (8 чел), отсутствует - 26,7% (8 чел) (таблица №7).

Таблица 7.

Соотношение степени вирусемии и морфологической картины у больных

ХГВ.

Лбе. % Вирусемия Титр НВУ Гистологическая картина

число боль- ДНК

боль ных

ных

4 13,3 Высокая 5+(1:10000) ХГВ низкой степени активности

2 6,8 Высокая 5+(1:10000) ХГВ умеренной степени активности

1 1,3 Высокая 5+(1:10000) ХГВ высокой степени активности

1 1,3 Высокая 5+(1:10000) Цирроз печени

1 1,3 Высокая 4+(1:1000) Цирроз печени

3 10 Умеренная 3+(1:100) ХГВ низкой степени активности

2 6,8 Умеренная 3+(1:100) ХГВ умеренной степени активности

2 6,8 Низкая 2+(1:10) ХГВ низкой степени активности

1 3,3 Низкая 2+(1:10) Цирроз печени

2 6,8 Низкая 1+(1:1) ХГВ низкой степени активности

1 3,3 Низкая 1+0:1) ХГВ умеренной степени активности

2 6,8 Низкая 1+(1:1) Цирроз печени

3 10 Отсутствует - ХГВ низкой степени активности

2 6,8 Отсутствует ХГВ умеренной степени активности

1 3,3 Отсутствует ХГВ высокой степени активности

2 6,8 Отсутствует Цирроз печени

30 100

Приведенные данные в таблице №7 свидетельствуют, что при ХГВ низкой степени активности высокая степень вирусемии наблюдалась у 4 пациентов, умеренная

у 3, низкая - у 4 и отсутствует у 3 пациентов. При ХГВ умеренной степени активности высокая степень вирусемии наблюдалась у 2 больных, умеренная - у 2, низкая - у 1 и отсутствует у 2 больных. Вирусемия при ХГВ высокой степени активности представлена следующим образом: высокая у 1 и отсутствует у 1 пациента. Вирусемия наблюдалась у 5 пациентов с циррозом печени: высокий уровень вирусемии у 2, низкий у 3 и не определяется у 2 пациентов с циррозом печени, т.е. представленные данные свидетельствуют об отсутствии корреляции между уровнем вирусемии и степенью активности процесса, что соответствует ранее проведенным исследованиям.

Следовательно, наши данные согласуются с представлениями, что уровень вирусемии не соответствует степени патологического процесса в печени: при ХГВ низкой степени активности вирусемия наблюдалась у 11 из 14 пациентов, ХГВ высокой степени активности представлена и высоким уровнем вирусемии, и отсутствием ДНК НВУ в сыворотке крови. Таким образом, степень вирусемии не является показателем активности процесса в ткани печени, что также корреспондирует с литературными источниками (Серов В.В., Апросина З.Г. 2002 г).

В нашей работе впервые показана роль НЬА-В27 в течении хронического вирусного гепатита В в популяции средней полосы России. НЬА-типирование, проведенное у пациентов с хроническим гепатитом В выявило высокую частоту встречаемости аллеля В27 (23,3% против 7,3%, р<0.05). НЬА-В27 свидетельствует о высоком риске формирования ХГВ, т.е. выявлена ассоциативная связь между НЬА-В27 и предрасположенностью к развитию хронического поражения печени. Относительный: риск развития болезни у лиц, имеющих в генотипе В27 в 3,85 раза выше, чем при его отсутствии (таблица №8).

Таблица 8.

Встречаемость локуса В-27 у больных ХГВ в сопоставлении с встречаемостью в популяции.

Частота антигена НЬА-В27 (%) Р

Больные ХГВ (п=30) Контрольная группа (п=150)

23,3 7,3 3,85 0,0151

Примечания:

ЯК-относительный риск.

Р-досговерность (двусторонний тест Фишера).

Частота встречаемости НЬА фенотипа у больных ХГВ в сопоставлении с активностью процесса в печени представлены в таблице №9.

Таблица 9.

НЬА-фенотипы больных хроническим гепатитом В с разной

степенью активности процесса в печени.

Активность процесса в печени и число номера НЬА-А НЬА-В

больных больных

ХГВ низкой степени активности 1 1 - 45 17

(п=7) 2 2 24 44 17

3 1 3 44 55

4 11 24 51 15

5 2 11 13 35

6 2 - 13 17

7 1 3 7 52

ХГВ умеренной степени активности 8 24 28 52 58

(п=2) 9 1 3 44 35

ХГВ высокой степени активности (п=1) 10 1 2 49 55

ХГВ низкой степени активности с И 3 11 14 62

формированием цирроза (п=2) 12 2 - 13 27

ХГВ умеренной степени активности с 13 3 25 35 -

формированием цирроза (п=1)

Цирроз печени 14 3 - 27 35

(п=3) 15 2 24 27 44

16 2 24 7 27

ХГВ низкой степени активности с 17 26 - 44 64

системными проявлениями 18 23 34 44 -

(п=6) 19 2 - 51 8

20 24 - 7 14

21 24 - 14 38

22 1 25 8 18

ХГВ умеренной степени активности с 23 2 - 62 27

системными проявлениями 24 2 - 13 27

(п=4) 25 1 2 18 60

26 2 3 14 15

ХГВ высокой степени активности с 27 2 29 13 -

системными проявлениями (п=1)

Цирроз печени с системными 28 11 26 35 52

проявлениями 29 25 - 51 15

(п=3) 30 1 24 18 27

Из таблицы №10 видно, что у больных с циррозом печени НЬА-антиген В27 встречается достоверно чаще, чем у больных ХГВ без цирроза печени (71,4% против 9,5%, р=0,0027). Риск развития цирроза печени в исходе ХГВ рассчитанный с помощью четырехпольных таблиц в 26,3 раза больше при наличии в НЬА-фенотипе антигена В27, чем при его отсутствии.

16

ТаблицаЮ.

Связь НЬА-В27 с развитием цирроза печени у больных хроническим гепатитом В (четырехпольная таблица).

Больные ХГВ Количество больных с HLA-фенотипом

В27+ В27-

с циррозом печени (п=7) 5 2

без цирроза печени (п=23) 2 21

Примечания:

р=0,0027 - достоверность (двусторонний тест Фишера). RR - относительный риск=26,3

При обсуждении роли иммунной системы в реагировании на появление вируса в организме принято считать, что тяжелая форма ОВГ свидетельствует о более состоятельной иммунной системе и не сопровождается хронизацией процесса (Rowell D.L., Jensen D.M. 1999). Обращает на себя внимание тот факт, что у пациентов, имеющих HLA-B27, нет указаний в анамнезе на перенесенный ОГВ, т.е. в данной группе больных отмечалось субклиническое течение острого вирусного гепатита В.

В доступной нам зарубежной и отечественной литературе мы не нашли упоминаний об ассоциативной связи HLA-B27 и течении ХГВ. Группой американских исследователей (Alper С.А. 1989, Kruskall M.S. et all. 1992) выявлено, что дефект функции клеток-супрессоров наследуется с гаплотипом HLA-B8, DR3 и это является первичным моментом, а не обусловлено повреждением клеток печени. При генотипировании лиц, с различным иммунным ответом на вакцинацию против вирусного гепатита В установлено, что при отсутствии иммунного ответа был обнаружен рост случаев индивидуумов - гомозигот по HLA, белки, которых ассоциированы в значительной степени с гаплотипом [HLA-B8, SCOl, DR3]. По данным немецких исследователей (Stachowski J., Kramer J. et all. 1995) носители HLA-Al, HLA-D27 наблюдались более часто в группе с высоким ответом на вакцинацию против вирусного гепатита В. По данным некоторых авторов в европейской популяции России высока частота регистрации HLA-A1 у больных легким течением острого вирусного гепатита (ОВГ) независимо от этиологии. Тяжелое течение ОВГ достоверно чаще регистрировалось у больных с наличием в фенотипе HLA-A2 и В5, а также В8. Антигены HLA-A2 и В5 вообще не регистрировались у больных с легким течением HBsAg-негативного гепатита В и по мере нарастания тяжести состояния частота встречаемости их возрастала. При затяжном гепатите В HBsAg-позитивном и HBsAg-

негативном достоверно часто регистрировался антиген HLA-B18 (24,77% и 29,62% соответственно, что выше, чем в контрольной группе). Однако, частота встречаемости HLA-B18 была повышенной и у людей с благоприятным завершением HBV-инфекции и у пациентов со сформировавшимся хроническим гепатитом В. HLA-B18, по-видимому, нельзя отнести к маркерам HBV-инфекции. Но есть сообщения, что хронические гепатиты низкой, умеренной и высокой степени активности ассоциировались с В18. В отличие от хронического гепатита низкой степени активности у больных с хроническим гепатитом умеренной и высокой степени активности выявлена высокая частота В5. Возможно, эта специфичность маркирует указанный клинико-морфологический вариант хронического гепатита. В группе больных ВГВ HBsAg-позитивных высока частота антигена HLA-B35, что отличало антигенный профиль HLA от такового в группе больных HBsAg-негативным ВГВ. (Голосова Т.Н. с соавт. 1982, Журкин А.Т. 1988, Петрунин Ю.Пю 1988, Тульченецкая Т.А. 1982, 1984, 1985, Шимолин с соавт. 1989).

Журкин А.Т. изучал распространение системы HLA (локусы А, В, С, DR) у больных с различными формами хронического вирусного гепатита в европейской популяции России. При всех формах хронического гепатита низкой степени активности преобладали антигены 4 определенных локусов А10, В16, В35, CW2, CW4, DR3 (Журкин А.Т. 1988). По данным Рашидовой P.A. в среднеазиатской популяции распределение антигенов HLA по тяжести течения острого вирусного гепатита В показал, что у больных со средней тяжестью достоверно регистрировалась повышенная частота встречаемости HLA-A10, «относительный риск» (Р) которых составил 3,0. У больных с тяжелым течением выявлена повышенная частота антигенов HLA-A3 с Р -5,1 и HLA-B7 с Р - 4,8 (Рашидова P.A. 1989). При анализе результатов генотипирования HLA нами не было выявлено статистически значимых ассоциаций течения ХГВ с иным, кроме HLA В27 фенотипом системы гистосовместимости.

В нашей работе при сопоставлении активности печеночного процесса у лиц с различным HLA генотипом установлено, что в группе обследованных больных аллель В17 встречается только при ХГВ низкой степени активности, т.е. полученные нами данные свидетельствуют, что HLA-B17 с большой долей вероятности является маркером низкой степени активности ХГВ (таблица №10).

Исследования, проведенные Mayerat С. (1999г), показали, что генотип А HBV ассоциирован с высоким темпом хронизации инфекции.

При генотипировании НВУ при хроническом гепатите В нами установлено, что преимущественно преобладал О генотип НВУ - 81,9%, встречались также С генотип -4,5% и А генотип - 13,6%. (диаграмма 4).

4,5 13,6

Ю

81,9

Диаграмма 4. Распределение генотипов НВУ у больных ХГВ.

Приводим данные по сочетанию серологических маркеров и степени вирусемии у больных ХГВ (таблица 11).

Из таблицы №11 следует, что серологический профиль у больных ХГВ представлен разнообразно: НВэАя - 79,3%, НВэАЬ - 30%, HBeAg - 30%, НВеАЬ - 93%, аНВс^М - 48,3%, НВс сум - 82,8% (диаграмма №5).

ИА-генотип ■ »генотип □ С-генотип

ИНВэАд ЕЭНВэАЬ □ НВеАд ШНВеАЬ ■ аНВс1дМ ВаНВссум

Диаграмма 5. Серологический профиль у больных ХГВ.

Таблица 11.

Серологические показатели и степень вирусемии у больных ХГВ (п=30).

№ пациентов НВБАВ НВбАЬ HBeAg НВеАЬ НВс^М НВс сум ДНК НВУ

1 + - + + - + 5+

2 + - - + + 5+

3 + - - + + + 5+

4 + - - + - + 5+

5 + + - + 5+

6 + - - + + + 5+

7 + - - + - + 5+

8 + - + + 4- + 5+

9 + - + + + 4+

10 - + - + + + 3+

11 + + - 3+

12 + - + + ■Н + 3+

13 + - - + - + 3+

14 + - + + + + 3+

15 + - - + - + 2+

16 + + - + + + 2+

17 + - - + ■н + 2+

1В + - - + - + 1+

19 + + + 1+

20 + - - + + + 1+

21 + - - + + + 1+

22 + - - + + + 1+

23 + + -

24 + + -

25 - + + - -

26 + - - + + - -

27 + - - + - + -

28 - - + + + -

29 + + - + - - -

30* +

* у пациентки К. декомпенсированный цирроз печени,

Выявлено, что маркеры, свидетельствующие об активной репликации вируса (HBeAg и аНВс^М) не всегда соответствуют уровню вирусемии в сыворотке крови больного: при высоком уровне вирусемии HBeAg встречается в 33,3% случаев, аНВс^М - в 44,4%, при умеренном уровне вирусемии оба маркера встречались в 60%, при низком уровне вирусемии HBeAg не встречается, аНВс1цМ встречается в 62,5% случаев.

Следовательно, серологические маркеры при ХГВ не всегда отражают репликативную активность вируса гепатита В в сыворотке крови.

При анализе течения патологического процесса у лиц, инфицированных различными генотипами НВУ заболевание у 3 пациентов инфицированных вирусом НВУ А генотипа протекало без системных проявлений, длительность наблюдения к моменту обследования составила от 1 года до 10 лет. Активность процесса представлена следующим образом: а) ХГВ низкой степени активности у 1 больного, б) ХГВ умеренной степени активности у 1 больного, в) декомпенсированный цирроз печени с синдромом портальной гипертензии, печеночно-клеточной недостаточностью у 1 больного, который сформировался к 4 году наблюдения.

При инфицировании С генотипом 1 пациента ХГВ низкой степени активности сформировался через 4 года после перенесенного ОВГВ.

У 26 пациентов инфицированных НВУ О-генотипа клинико-морфологические проявления ХГВ были разнообразны, в т.ч. цирроз печени наблюдался у 5 человек, что составило 55,6% от всех больных с ЦП из них у 2 пациентов ЦП с системными проявлениями (22%).

При сопоставлении частоты встречаемости В27 у пациентов с различными генотипами НВУ полученные результаты свидетельствуют, что данный локус преимущественно встречается у пациентов с Б-генотипом НВУ - у 71,4% (5 человек).

Проведенное исследования позволяют предположить, что в популяции средней полосы России ведущую роль в хронизации процесса при НВУ инфекции занимает генетическая предрасположенность (ассоциация), обусловленная особенностями системы гистосовместимости НЬА класса I (А, В) о чем косвенно свидетельствует подавляющее распространение Б генотипа НВУ инфекции во всех обследованных группах без связи с хронизацией процесса.

Выводы:

1. Результаты исследования распределения антигенов системы НЬА класса I у больных хроническим гепатитом В указывают на то, что у носителей НЬА-В27 высок риск развития хронического гепатита В в популяции средней полосы России, что свидетельствует о наличии ассоциативной связи между генетическими факторами человека и НВУ. Относительный риск равнен 3,85.

2. Установлено, что у больных хроническим гепатитом В с наличием в НЬА-фенотипе антигена В27 в популяции средней полосы России вероятность развития цирроза печени в 26,3 раза выше, чем при других разновидностях системы НЬА I класса.

3. Наличие в генотипе человека НЬА-В27 при инфицировании вирусом гепатита В сочетается с субклиническим течением острого вирусного гепатита В.

4. Анализ распределения антигенов системы НЬА показал, что аллель В17 ассоциируется с низкой степенью активности ХГВ в популяции средней полосы России.

5. Инфицированность в популяции средней полосы России обусловлена генотипом Б НВУ. Формирование ХГВ, по-видимому, не зависит от генотипа вируса, а определяется особенностями системы гистосовместимости I класса.

6. Серологические исследования выявили, что при ОВГВ ДНК НВУ присутствовала в 100%, тогда как HBsAg - в 97%, аНВс^М - в 73%, НВсАЬ сум - в 90%, НВеАЬ - в 57%, поэтому для окончательной верификации диагноза необходимо использовать метод ПЦР.

7. При хроническом гепатите В выявляемость ДНК НВУ методом ПЦР составила 90% вне зависимости от активности процесса, что подтверждает необходимость одновременного проведения как серологического, так и вирусологического исследования.

Практические рекомендации.

Рекомендовано проведение генотипирования по системе НЬА пациентов с хроническим гепатитом В, а также определение генотипа НВУ с целью прогнозирования его течения и исхода. При обследовании пациентов с вирусным гепатитом В наряду с иммунологическими исследованиями необходимо использовать метод ПЦР установления генотипа и степени активности НВУ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Потекаева С.А., Яздовский В.В., Лопаткина Т.Н., Алленов М.Н., Иванова И.В., Волчкова Е.В. «HLA-генетический профиль у больных хроническим гепатитом В, отобранных методом случайной выборки.» // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-28 марта 2002, т. III, с. 55-56, 2002 г.

2. Потекаева С.А., Яздовский В.В., Лопаткина Т.Н., Алленов М.Н., Волчкова Е.В. «Изучение HLA-генетического профиля у больных хроническим гепатитом В». // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье в XXI веке», Тула, 2000, с. 110.

3. Потекаева С.А., Яздовский В.В., Волчкова Е.В., Лопаткина Т.Н., Чуланов В.П., Воронин A.B. «Особенности распределения HLA-антигенов у больных хроническим гепатитом В». // 5 Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». Москва 2002г. Сборник трудов, т.2, с. 196.

4. Потекаева С.А., Волчкова Е.В., Лопаткина Т.Н., Яздовский В.В., Чуланов В.П., Пак С.Г. «Особенности системы HLA класса I у больных хроническим гепатитом В в сопоставлении с генотипом вируса гепатита В». // «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии». Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова (22-23 мая 2003 г.), Москва 2003, с. 146.

5. Потекаева С.А., Волчкова Е.В., Лопаткина Т.Н., Яздовский В.В., Чуланов В.П., Пак С.Г. «Распределение HLA-антигенов класса I у больных гепатитом В с подтвержденным генотипом HBV». // Журнал «Эпидемиология и инфекционные болезни»

6. Потекаева С. А., Волчкова Е.В., Лопаткина Т.Н., Яздовский В.В., Чуланов В.П. «Антигены HLA класса I у больных хроническим гепатитом В с подтвержденным HBV генотипом». // VI Российский съезд врачей-инфекционистов. 29-31 октября 2003, Санкт-Петербург.,с. 310.

Список сокращений.

AJIT - аланиновая трансаминаза.

ACT - аспарагиновая трансаминаза.

ЩФ - щелочная фосфатаза.

ГГТ - гамма-глутамилтранфераза.

БЛ - билирубин.

ХЭ - холинэстераза.

ХГВ - хронический гепатит В.

Ig - иммуноглобулин.

Со - комплемент.

ТЗ - трийодтиронин.

Т4 - тироксин.

ТТГ - тиреотропный гормон.

АТТГ- антитела к тиреоглобулину.

ОВГВ - острый вирусный гепатит В.

Ir-гены - гены иммунного ответа.

HLA - человеческие лейкоцитарные антигены.

Т-КР - клонотипический антигенный рецептор Т-лимфоцита.

МНС - главный комплекс гистосовместимости.

HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В.

HBeAg - антиген инфекционное™.

HBcAg - ядерный антиген вируса гепатита В.

HBsAb - антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В.

НВеАЬ - антитела к антигену HBeAg вируса гепатита В.

НВсАЬ - антитела к ядерному антигену вируса гепатита В.

CD8 - Т-супрессоры.

CD4 - Т-хелперы.

ПЦР - полимеразная цепная реакция. ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота. HBV - вирус гепатита В. ИНФ - интерферон. ЦП - цирроз печени.