Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Амплификация онкогена ERBB-2 и делеции локусов 17 хромосомы в опухолях различных локализаций

-6 ¡и 9 г

Министерство здравоохранения РФ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ им. проф. Н. Н. ПЕТРОВА

На правах рукописи УДК 616-018-006: 576.858.6

ИМЯНИТОВ Евгений Наумович

АМПЛИФИКАЦИЯ ОНКОГЕНА ЕЯВВ-2 И ДЕЛЕЦИИ ЛОКУСОВ 17 ХРОМОСОМЫ В ОПУХОЛЯХ РАЗЛИЧНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ

Специальность — 14.00.14 — онкология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте онкологии им. проф. Н. Н. Петро-

иа Минздрава РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук П. Г. Князев; чл.-корр. АМН РФ, проф. К. П. Хансон

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Л. М. Берштейн; доктор биологических наук, профессор Ф. Л. Киселев

Ведущее научное учреждение: Институт проблем онкологии им. Р. Е. Кавецкого АН Украины.

Защита диссертации состоится « . . . ».......... 1992 г.

в «... » часов на заседании специализированного совета НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова (189646, Санкт-Петербург, Пе-сочный-2, Ленинградская ул., 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « . . . »......... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е. В. Демин

Актуальность работы.

-Прогресс в изучении молекулярных повреждений, обнаруженных раковых клеток (особенно в протоонкогенах и супрессорных ==~~~TSBadl), позволил значительно приблизиться к пониманию механизмов возникновения злокачественных новообразований у человека (Сейц И.Ф., Князев П. Г., 1986; Киселев Ф. Л и др., 1990; Weinberg R., 1989).

Одной из "горячих" точек генома опухолевых клеток являются гены 17 хромосомы. Известно, что на длинном плече 17 хромосомы расположены онкогены ERBA-1 и ERBB-2 (HER-2) (Spurr N. К.Е. et al., 1984; Coussens L. et al., 1985; Yamamoto T. et al., 1986). Особое внимание ученых привлекает последний из них, поскольку он нередко амплифицируется в неоплазмах различных локализаций (Zhou D. et al. , 1987; Tal M. et al. , 1988; Slairon D. J. et al. , 1989).

Вопрос об активации протоонкогена ERBB-2 в опухолях молочной железы изучен в наибольшей степени. Рядом авторов показано, что экстракопии онкогена ERBB-2 наблюдаются примерно в 20Z - 25% карцином этого органа, причем вероятность рецидива у таких пациенток значительно выше, а продолжительность жизни -короче (Slamon D. J. et al., 1987,1989; Gullick W. , 1990; Paterson M.C. et al., 1991). Нэвообраэования иных локализаций изучены меньше, однако имеются отдел} ные сообщения о прогностической значимости статуса онкогена ERBB-2 для рака легкого (РЛ) и рака яичника fPffl (Slairon D. J. et al., 1989; Berchuk А. et al. , 1990; Kern J. A. et al., 1990). В то же время, в ряде работ отрицается какая-либо связь активации протоонкогена ERBB-2 с клинико-патологическими параметрами рака молочной железы (ГМЖ) (Ali I.U. étal., 198Яа,б; Zhou D. et al., 1989; Kurv F. et al. , 1990).

В последнее время было установлено, что для генов 17 хромосомы характерны не только амплификации, но и делении их аллелей ("погори гетерозиготности", ИГ) (Vogeistem В. et al. , 1988, 1989; Bon esen A.-L. et al. , 1990). Молекулярно-генети-ческое выявление участков хромосом, нередко делецирущихся в неоплазмах, позволяет установить наиболее вероятные локусы расположения генов, осуществляющих негативный контроль клеточной пролиферации I "антионкогрнов"). Для короткого плеча 17 хромосомы, которое особенно част ) утрачивается в опухолях,

- г -

"кандидат в антионкогены" уже известен - это тен р53 (Miller С. et al., 1986). Значение потерь противоположного плеча этой жэ хрошоомы для процессов злокачественной трансформации пока неясно.

Несмотря на большое число работ, посвященных причастности молекулярно-генетических аномалий 17 хромосомы к возникновению опухолей у человека, многие вопросы относительно их частоты и специфичности остаются неясными. Частота амплификации и суперэкспрессии онкогена ERBB-2 в РМЖ, по данным некоторых публикаций, колеблется в 4 раза. В разных популяциях больных РМЖ получены абсолютно противоречивые результаты о взаимосвязи активации этого онкогена с клинико-патологическими параметрами карцином (Slamon D. J. et al. , 1988; Ali I.U. et al., 1988). Новообразования иных локализаций изучены еще меньше. К началу проведения данного исследования отсутствовали сведения о комбинациях амплификации онкогена ERBB-2 и делеций участков 17 хромосомы, а также их ассоциации с повреждениями других онкогенов и антионкогенов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение частоты и степени амплификации онкогена ERBB-2, а также делеций некоторых локусов 17-й хромосомы. В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Выявить частоту структурных поврелщений онкогена ERBB-2 в неоплазмах молочной железы, яичника, толстой кишки, легкого и щитовидной железы у человека;

2. Провести анализ ассоциации амплификации и сулерэкспрес-сии онкогена ERBB-2 с клинико-патоморфологическими параметрами карцином молочной железы (размером опухоли, наличием метастазов в лимфатические узлы, стадией заболевания, роэраетом и нопаузальным статусом пациенток, уровнем стероидных рецепторов) и с прогнозом течения заболевания;

3. Уточнить опухолевые локализации, для которых наиболее характерны делеции определенных локусов 17р и 17q;

4. Провести скрининг аномалий антионкогенов р53 и RB-1 в карциномах молочной железы, яичников, легкого, толстой кишки и щитовидной железы;

Б. Изучить комбинаторику повреждений генов 17 хромосомы,

- 3 -

онкогенов HRAS-1, C-MYC, ERBB-1, антионкогенов p53 и • RB-1, а также оценить возможную ассоциацию этих нарушений с клини-ко-патоморфологическими параметрами изучаемых малигнизаций.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В ходе выполнения диссертационного исследования впервые получены следующие данные:

- показана статистически достоверная взаимосвязь между делениями короткого плечаЧ7 хромосомы (зонд YNZ-22) и отсутствием метастазов в лимфоузлы при раке молочной железы, что может указывать на наличие в данном локусе генов, причастных к процессу метастазирования первичной опухоли;

- продемонстрированы амплификации онкогена ERBB-1 в опухолях толстой кишки и яичника;

- установлены случаи повышенной экспрессии супрессорного гена RB-1 в некоторых карциномах молочной железы;

- выявлена строгая ассоциация между амплификацией онкогенов ERBB-2, ERBB-1, С-МУС и делецией 17р (возможно, антионкогена р53) в опухолях у человека.

Кроме того, получен ряд новых данных:

- на большом количестве клинического материала (316 образцов ДНК) изучена частота амплификации онкогена ERBB-2 в опухолях наиболее распространенных локали?.дций;

- высокая частота (25t) амплификации и суперэкспрессии онкогена ERBB-2 выявлена лишь в карциномах молочной железы; показано отсутствие строгой корреляции между амплификацией данного гена и клинике-патоморфологическими параметрами карцином;

- установлено, что амплификация онкогена ERBB-2 может служить самостоятельным и независимым маркером повышенного риска рецидива (Р<0,00005) в изученной выборке больных раком молочной железы;

- в группе больных раком яичников из северо-западных реги-i'H'jt Гиеи.ш дмп.гифилйцпл онкогена ERES-2 встречаете/! ?алчите льно реже (1 из 36 случаев), чем в США и Западной Европе. Это делает неприемлимым применение данного теста в качестве мрогн^стическуо маркера для опухолей данной локализации-.

- нокагано, что крупные аномалии антионкогенов р5о и КБ-1 отсутствуют в опухолях эпителиального происхождения, однако

делеции RB-1 часто встречаются в саркомах мягких тканей. Осуществлен поиск точковых мутаций в 175 кодоне супрессорного гена р53, который не выявил высокой частоты подобного нарушения в карциномах молочной желеаы, яичника, толстой кишки и щитовидной железы;

- установлена высокая частота делений локусов 17р и 17q в злокачественных опухолях толстой кишки, молочной железы. яичников, легкого, и низкая - в новообразованиях щитовидной «влевы.

Диссертационная работа имеет научно-теоретический характер. Ее практическая значимость заключается в следуюцгм.

Данные о частоте амплификации онкогена ERB8-2 позволили сделать заключение о тон, что для PME целесообразна разработка экспресс-методов определения статуса этого гена с целью уточнения прогноза заболевания, а также новых подходов к иммунотерапии опухолей, направленных на специфическое связывание ре-цепторного белка pl85ERBB-2. Выявление делеций различных локусов 17 хромосомы может оказаться полезным для поиска новых супрессорных генов, расположенных в участках 17р я 17q.

Апробация работы. Основные положения диссертанта бита представлены на советско-французском симпозиуме "Вирусология я молекулярная онкология" (Рига, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск. 1990), советско-финском симпозиуме "Molecular mechanisns of malignant growth" (Таяреге, 1991), школе FEES "Oncogenes and cell growth" (Киев, 1901), a также на совместном заседании лабораторий биохимии, оигоимху-нологик, химических канцерогенных агентов, эндокринологии и предклинических испытаний НИИ онкологии им. проф. R К Петрова Минздрава СССР.

Структура и объем диссертации. Диссертация из лож на иа 175 страницах машинописного текста и состоит *з введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 7 рисунками. Библиографический указатель включает 337 публикаций на русском и английском языках.

- Б -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве материала исследования использовались хирургически удаленные участки тканей опухолей. Кроме того, в ряде случаев изучались метастазы карцином. Для контроля использовали макроскопически неизмененные ткани но краю резекции того же органа, а также периферическую кровь от этих ле больных. Всего материал для исследования получен от 316 пациентов, в том числе: 142 образца рака молочной железы; 62 - рака толстой кишки; 38 - рака легкого; 36 - рака яичника; 29 - рака щитовидной железы; 6 - сарком и 3 - меланомы.

Выделение ДНК и РНК проводили на основе метода, описанного T. Maniatis et al. (1982). Впоследствии применяли более простой метод очистки нуклеиновых кислот, не уступающий, на наш взгляд, по качеству "классическому" (фенольно-хлороформному). После лизиса к препаратам добавляли NaCl до концентрации 3,5 M и равный объем хлороформа, встряхивали в течение 30 минут и центрифугировали. Затем к супернатанту добавляли 2 обк?ма этанола, после чего нити ДНК "выкручивали" из раствора при помогай быстрого вращения стекляной палочки. После выкручивания ДНК к раствору добавляли еще 1/2 от первоначального объема этанола и оставляли на ночь при -20'С. РНК осаждали центрифугированием и очишали от примесей хромосомальной ДЬЛ по методите, предложенной M. Zasloff et al. , 1978.

10 мкг ДНК обрабатывали соответствующей эндонуклеазой рестрикции ("Фермент", Вильнюс), затем фрагменты ДНК электрофоре-тичееки разделяли в 1% геле агарозы ("Pharmacia", Швеция) и переносили на нейлоновые мембраны ( "Hybond-N", "Aniersham", Великобритания) (Е. Southern et al. , 1975).

В работе использовались следующие зонды: 0,7 т. п. н. БатН I - F-4-RI фрагмент онкогена ERBB-? (плазмида регЬВ-2, "Amejfikim", Великобритания;; полная копия онкогена и-МУО, размером 5 т. п. н. (плазмида рКН-47 предоставлена D. Stehelin, Франция); полная копия онкогена HRAS-1 (плазмида pHRAS-Th-3 были получена в нашей лаборатории); полная копия онкогена-ERBB-1 (плазмида CVN/HER-1 предоставлена Л. Ullrich, Германия); 4,5 г. п. н. Eco R1 фрагмент онкогена JUN (плазмида pEHJ

- б -

предоставлена М. Schwab, Германия); полная копия супрессорного гена р53 (плаэмида р53 предоставлена М. Oren, Израиль); 3,8 т. п.н. фрагмент супрессорного гена RB-1 (плаэмида pRbl предоставлена М. Schwab, Германия); анонимные маркеры*) на короткое и длинное плечи 17 хромосомы YNZ-22 и ТНН-59 (одноименные плазмиды предоставлены R. White, США). Для контроля эквивалентности количества нуклеиновых кислот фильтры с ДНК перегибри-дизовывали с 1,6 т. п. н. Hindi II-EcoRI фрагментом онкогена RAF-1 ("Amersham", Великобритания), а фильтры с РНК - с 2 т. п. н. фрагментом гена коллагенааы (плаэмида pCllase/PX-7 предоставлена Р. Herrlich, Institute of Genetics and Toxicology, Karlsrue, Germany).

Мэчение ДНК -зондов осуществляли при помощи ник-трансляции или в реакции со "статистической затравкой", используя коммерческие наборы "Amefsham" (Великобритания) или НПО "Фермент" (Литва).

Гибридизацию проводили в течение ночи при 42'С в буфере, содержащем 50Z формамида, 5-х SSC (1-х SSC - цитратно-солевой буфер, содержащий 0,15 М NaCl и 0,15 Ы цитрат натрия (pH 7,0)), 100 мкг/мл дрожжевой тРНК, 0,051 фикола, 0.05Z поливи-нилпиралидона, 0,051 бычьего сывороточного альбумина, 0,1Z SDS. йшьтры отмывали трижды по 15 минут в 1-х SSC, 0,1* SOS при 42'С, затем ещэ столько же по 15 минут в 0,1-х SSC, 0,12 SDS при той же температуре, и, наконец, 1 раз в течение 5 минут в 0,1-х SSC, 0,1t SDS при 65'С (Т. Maniatis et al., 1982). Авторадиографию осуществляли при -70'С. При визуальном и ден-ситометрическом анализе автографов за амплификацию принимали не менее, чем 3-кратное усиление сигнала, за делеци» - 2-кратное и более ослабление интенсивности фрагмента

Экспрессию онкогенов исследовали методом дот-блот-гибриди-зации цитоплазматич?сксй РНК с г*?':?нным зондом. 20 мкг РНК с двумя 4-кратными разведениями, денатурированной в течение 15

*) - Анонимные зонды - это клонированные последовательности отдельных участков хромосом, представленные множественным)! аллелями в геноме человека, и расположенные в пределах еще не-кдентифицирэзанных генетических элементов.

минут при 65'С в 10-х SSC, 2,2 М формальдегиде, наносили при помощи вакуумного насоса на нитроцелшлозные фильтры ("Hybond-C", "Amersham", Великобритания). Для контроля примесей ДНК в препарате параллельно использовали РНК-азную обработку каждого образца (В. Whyte et al., 1982). Гибридизацию проводили в условиях, описанных выше. За суперэкспрессию принимали не менее чем 5-кратное увеличение сигнала

Для поиска точковых мутаций в гене р53 проводили полиме-разную цепную реакцию, позволяющую амплифицировать специфические последовательности гена. В работе использовались предложенные нами пары праймеров: для выявления нуклеотидных замен в 143 кодоне rei:a р53: 5'-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3' и 3' -QCA6GCQCGGTACCGGTAB-5'; в 175 кодоне этого же гена: б'-CAGCTGTGGGTTGATTCCACAC-3' и 3' - ACTCGCGACGAGTCTATCQCTA-5'. Реакцию проводили в буфере следующего состава: 67 мМ трис-НС1 (рН 8.8); 170 мкг/мл БСА; 16,6 мМ ацетат аммония; 6,7 мМ хлорид магния; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 6,7 мМ ЭДТА; 1 мМ каждого дезоксирибонуклеотида. В реакционную смесь (25 мкл) добавляли 0,1 мкг каждого праймера и 0,1 мкг исследуемой ДНК После этого проводили денатурацию геномной ДНК (2 минуты при 100'С) и добавляли к пробе 1 ед. полимеразы из Termus termophilis. 35 циклов амплификации осуществляли пр ! следующих условиях: 1,5 минуты - 55'С (отжиг); 1,5 минуты - '/¿'С (синтез); 1,5 минуты - 94'С (денатурация). ПЦР завершали удлиненной фазой синтеза (5 минут). Затем аликвоту препарата гидролизовали эндонуклеа-зой рестрикции Cfol (37'С, 24 часа), добавляя 1 ед, фермента непосредственно в амплификационный буфер. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществлялось в 12Х полмакриламид-ном геле (соотношение акриламид/бисакриламид = 30/1).

Статистическую обработку результатов проводили по методу хи-квадрат

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Активация онкогена ERBB-2 в опухолях у человека.

Анализ числа копий онкогена ERBB-2 в наиболее распространенна карциномах у человека показал, что лишь в РМЖ наблюда-

- 3 -

ется относительно высокая частота амплификации онкогена ERBB-2. Экстракопии этого онкогена были обнаружена в 36 ( 257.) из 142 j .УК. В 17 опухолях наблюдалось 3-5 экстракопий этого гена; в 13 - 6-15; в б - >15 копий. Выявленная нами частота амплификации онкогена ERBB-2 (25%) согласуется с большинством зарубежных публикаций (Borg A. et al., 1990; Borresen A.-L. et al. , 1990; Guerin M. et al. , 1988; Gullick W. J. , 1990; Slamon D.J. et. al., 1987, 1988, 1989). В то же время, по данным ряда авторов встречаемость экстракопий данного гена значительно ниже, что, если не принимать во внимание техническую сторону эксперимента, может отражать этиологические и генетические особенности течения РМЖ в различных популяциях (All I. et al., 1988; Zhou D.-J. et al., 1989). Так или иначе, наши результаты показывают, что частота активации онкогена ERBB-2 является достаточной для клинического использования сведений о его статусе с целью уточнения прогноза течения РМЯ (см. ниже).

Для 42 опухолей было проведено параллельное изучение экспрессии онкогена ERBB-2. В 3 случаях отмечена 5-10 -кратное повышение его транскрипционной активности; в 6 - 11-50 -кратное; в одном - более, чем 50 -кратное. Амплификация и суперэкспрессия строго коррелировали между собой, причем высокая степень амплификации (>5 копий) сопровождалась усилением его экспрессии в 10-50 раз. Лишь в одном случае отмечалась суперэкспрессия онкогена ERBB-2 в отсутствие его экстракопий. Следует заметить, что в этой опухоли, экспрессируицей примерно 100 -кратный избыток ERBB-2 -специфической РНК, отмечалась также единственная в данной группе перестройка гена р53, расположенного на той яг хромосоме, что и ERBB-2 (Miller С. et al. , 1986). Нами также выявлен 1 случай амплификации онкогена ERBB-2 (3-5 копий на гаплоидный геном), не сопровождавшийся увеличением его транскрипционной активности. Строгая корреляция медду амплификацией и суперэкспрессией позволяет в практических целях ограничить изучение статуса онкогена ERBB-2 геномным уровнем, т. е. анализом его амплификации. Выявление экстракопий гена технически значительно провд?, чем детекция его экспрессии, особенно если использовать технику дифференциальное! полимеразной цепной реакции (Fry? R. A. et al., 1Р89).

Рассмотрим подробнее возможные ассоциации между наличием экстракопий онкогена ERBB-2 и клиническими параметрами РМЖ.

Как видно из табл. 1; у больных РМЖ не выявлено строгой корреляции между амплификацией онкогена ERBB-2 и вовлечением лимфатических узлов, размером опухоли, стадией заболевания, содержанием стероидных рецепторов, возрастом и менопаузальным статусом пациенток.

Для изучения прогностической значимости амплификации ERBB-2 мы отобрали больных с послеоперационным периодом, превышающим 40 месяцев. Этим требованиям отвечали 32 пациентки, у которых послеоперационный период варьировал от 44 до 82 месяцев (табл. 2). IÍ3 них, как показано в табл. 2, у 25 женщин в первичной опухоли была обнаружена единичная копия онкогена ERBB-2; при этом рецидив выявлен лить у двух из них (T2N3MD и T3N3M0). В то же время из 7 больных с амплификацией данного онкогена 6 подверглись рецидиву РМЖ, в том числе все без исключения случаи с амплификацией >5 копий (4 пациентки) (табл. 2). Примечательно, что в трех случаях рецидива клиническая картина заболевания была относительно благополучной (T1N0MD, T2N0MD и T2N1MD).

Существенно, что в данной группе больных лишь статус онкогена ERBB-2 оказался надежным прогностическим маркером (Р<0,00005), в то время как наличие рецидива не коррелировало достоверно с вовлечением лимфатических узлов и размером первичной опухоли. К сожалению, содержание гормональных рецепторов было известно лишь в 14 случаях, что не позволило сравнить его прогностическую значимость с ролью активации гена ERBB-2.

Вероятно, данные ó прогностической ценности амплификации онкогена ERBB-2 представляют наибольший интерес (табл. 2). С практической точки зрения, наши результаты позволяют считать 5-кратное и более увеличение числа копий онкогена ERBB-2 беэо-шиОичпым маркером плохого прогноза РМЖ. Разумеется, численность выборки больных явно недостаточна для получения окончательных выводов.

D. Slamon et al. (1989) и X. Zhaug et. al. (1989) установили относительно высокую частоту (20-25%) амплификации онкогена ERBB-2 в раках яичника, которые, как известно, имеют сходный с

Таблиц л 1. Амплификация онкогена ЕКВВ-2 и клинические параметры рака молочной железы

ОНКОГЕН Е1*ВВ-2

КЛИНИЧЕСКИЕ ------------------------------------------------------------------КОРРЕЛЯЦИЯ

ПАРАМЕТРЫ ГПЖ ЕДИНИЧНАЯ КОПИЯ АМПЛИФИКАЦИЯ

ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ

Воплгчены »11 15

Не вовлечены 52 12

Нет данные 13 9

ЛИМФАТИЧЕСКИЕ иЭЛЫ (для РМЖ размером 2-5 см)

Вовлечены Не вовлечены 18 34 9 5 Р < 0,1

РАЗМЕР ОПУХОЛИ

< 2 см 2-5 см > 5 см Нет данных 22 52 19 13 8 14 5 ■ 9 -

СТАДИЯ

I и II III и IV Нет данных 66 27 13 16 11 9 -

ВОЗРАСТ БОЛЬНЫХ

< 00 лет > 50 лет Нет данных 42 51 13 9 18 9 -

М£Н0ПАУЗАЛЬНЫЙ СТАТУС БОЛЬНЫХ

До менопаузы Менопауза После менопаузы Нет данных 23 26 42 13 3 9 15 9 Р < 0,2

ГОРМОНАЛЬНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ

ЕР ♦ ЕР - 18 19 6 10 -

РП ♦ РП - 22 15 10 6 -

Нет данных 69 20

Примечания! ЕР - эстрогеновые рецепторы? РК - прог*стероновые рецеп торы.

Т а б л и ц а 2. Прогностическая значимость амплификации снкогена ЕКБВ-2 при раке молочной железы

ОНКОГЕН ЕЙВВ-2

РЕЦИДИВ ЕДИНИЧНАЯ АМПЛИТИКАЦИП

РМЖ

копия

Нет рецидива 23 1

Есть рецидив 2 6

Примечания: Средний послеоперационный период - 59 месяцев* Достоверность выявленной корреляции — Р<0,00005. Все Л случая с более чем 5-кратной лмплификацией подверглись рецидиву.

РМЖ патогенез. Более того, 0. 31атоп а1. (1989) обнаружили взаимосвязь амплификации онкогена ЕЛ?ВВ-2 о ухудшением прогноза для жизни у больных раком яичника.

В нашем исследовании амплификация онкогена Е1?ВВ-2 была показана лишь в 1 из 36 РЯ, причем ее степень не превышала 3-кратную. Полученные данные согласуются с результами В. УаЫатте еЬ а1. (1990), которые не выявили экстракопии прото-онкогена ЕРВВ-2 в 20 случаях РЯ Расхождения наших данных с сообщениями 0. 31ашоп е1 а1. (1989) и X. 1Ъаиг еЬ а1. (1989) могут быть обусловлены различиями в генетическом фоне или этиологических факторах, ассоциированных с развитием РЯ, между Россией и США, а также западно-европейскими странами.

Увеличение количества копий данного гена установлено также в 4 из 62 раков толстой кишки (РТК) и в 1 из 29 раков щитовидной железы (РЩК). Не найдено изменений онкогена ЕГ?ВВ-2 в 38 РЛ, 6 саркомах и 3 меланомах.

Щзимечательно, что ни в одном образце ДНК амплификация онкогена Е&ВВ-2 не сопровождалась аналогичным событием в отношении гена р53, что позволяет исключить мультипликацию всей 17-й хромосомы.

2. Амплификация онкогенов ERBB-1 и С-МУС в опухолях различных локализаций.

Онкоген ERBB-1 имеет высокую степень гомологии с геном ERBB-2 и может амплифицироваться в ряде опухолей человека (Coussens L. et al., 1985; Lu S. H et al., 1988; Yoshida K. et al., 1У89), поэтому мы сочли целесообразным провести параллельное изучение повреждений данного онкогена Однако, амплификации данного гена обнаружены лишь в 2 из 56 РТК (3-5 копий и >15 копий) и в 1 из 26 РЯ (3-5 копий). Не выявлено изменения копийности онкогена ERBB-1 в 65 РМЖ, 30 РЛ и 22 РЩЖ.

Увеличение числа копий онкогена С-МУС, для которого особенно характерен подобный способ активации, обнаружено лишь в 1 из 23 РЛ и в 2 из 60 РМЖ. Амплификации указанного гена отсутствовали в 40 РТК, 22 РЯ и 27 РЩЖ.

2. Повреждения антионкогенов в карциномах у человека.

2.1. Анализ структуры антионкогенов р53 и RB-1 в опухолях у человека.

Одним из наиболее изученных антионкогенов является р53, расположенный на коротком плече 17 хромосомы (Miller С. et al. , 1986). р53-специфический зонд использовался нами для контроля увеличения плоидности 17-й хромосомы при выявлении амплификации гена ERBB-2. Таким образом, мы получили информацию относительно данного гена для всех образцов, изученных на предмет статуса онкогена ERBB-2. Ген р53 не проявляет аплель-ного полиморфизма при гидролизе по HindIII и BamHI, поэтому достоверно выявить его делеции не представлялось возможным. Лишь в одном образце отмечалось нарушение р53 - при обработке ДНК из РМЖ 210 ферментом BamHI, помимо нормального 12 т. п. н. Фрагмента, обнаруживался дополнительный ? т. п. н. сигнал. Примечательно, что именно у этой больной показана чрезвычайно высокая степень суперэкспрессии онкогена ERBB-2, расположенного на противоположном плече 17 хромосомы.

Стратегия поиска точковых мутаций в гене р53 была аналогичной работе S. Baker et al.. (1989), продемонстрировавших » нуклеотидные замены в 143 кодоне (GTG на GCG) или в 175 кодоне (CGC на САС) данного гена в 2 РТК с делецией 17р, т.е. того

локуса, где расположен ген р53. Таким образом, в этой публикации впервые было выявлено наличие точковых мутаций в антионкогене р53 в опухолях человека. В этой связи нами была предпринята попытка выяснить, насколько характерны такие события для новообразований различных локализаций.

При поиске нуклеотидной замены Т на Ц в 143 кодоне ми амп-лнфицировали фрагмент гена р53 размером 111 п. Н. (табл. 3). Как видно из табл. 3, рестрикционное расщепление фрагмента размером 111 п. н. при анализе ДНК из 45 РТК и 51 РМЖ обнаружило одинаковую картину гидролиза рестриктазой Cfol: на электро-фореграммах наблюдались 2 фрагмента протяженностью 100 и 11 п. н. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии подобного нарушения в 143 кодоне гена р53 в изученных нами образцах ДНК карцином человека

Мутации в 175 кодоне гена р53 выявлялись посредством гидролиза той же рестриктазой ПЦР-продукта размером 129 п. н. (табл. 3). При специфическом расщеплении амплификата рестриктазой Cfol в норме образуются фрагменты длиной 16, 18, 46 и 51 п. н. Однако, в 1 из 53 РМЖ, 1 из 35 РТК и 1 из 19 РЯ было обнаружено исчезновение фрагмента наибольшего размера, сопровождавшееся появлением иного, размером 69 п. н. Это позволяет предполагать потерю сайта рестрикции Cfol, вызванную мутацией в 175 кодоне упомянутого супрессорного гена Частота мутаций в 175 кодоне гена р53 в нашей работе ниже, чем указывают А. а Levine et al., (1991). Расхождения могут быть вызваны тем, что многие из работ, обобщенных этими авторами, проведены на клеточных линиях, а не на первичных опухолях.

Делеции гена RB-1 выявлены в 2 из 4 сарком мягких тканей. Нами не установлено крупных повреждений данного гена ни в одной из изученных неоплазм эпителиального происхождения (68 РМЖ, 25 РЯ. 41 ПК, 25 РВИ. 24 РЛ).

2.2. Потери гетерозиготности 17 хромосомы в неоплазмах у человека

Для поиска ПГ короткого плеча 17-й хромосомы (17р) нчми ^ применился анонимный зонд YNZ-P2. Пг>луч°ццые hpj'M результаты обобщены в табл. 4. Как видно из табл. 4, ро псех типах опухо

Таблица 3. Вывлвние точковых мутаций в гене р53 с ломаные гидролизе продукта полимеразмой цепной реакции реетриктазой Cfol

N иссле- Размер ожи- Размер

ДУ5МОГО кодом* <■ скобках - N зкзона)

143 CU)

даемог-о мого

♦рагмента вез рестрикции (в скобках' — N первого и последнего нук-леотида)

»parмантов после гидролиза растр иктазой ■ норме

Способ

выявления

мутации

Ожидаемый размер Фраi— ментов после гидролиза рестриктазэй при мутации

Вид

опухоли

Число Число

исследовании х

образцов

выявленных мутаций

J

Оь.

Г

111 <924-1024)

100+11

Появление сайта рестрикции Cfol при замене Т на Ц

54+46+11

РТК РМХ

45 31

175 <V>

129 46+31+13+16 Иечезна-

<978- венме

-1106) сайта

рестрикции Cfol

46+69+16

РТК РМХ РЯ Р«Х

35 S3 19 25

Примечания! 8 работе использовались предложенные нами пары пралмеров: для анализа мутаций в 143 кодоне гена рЗЗ - З'-ТАЦТЦЦЦЦТГиЦЦТЦЛАЦААГА-З' и 3'—ГЦАГТЦГЦГГТАЦЦГГТАГ-3* I В 175 кодоне - З'-ЦАГЦТГТГГГТТГАТТЦЦАЦАЦ-З' ; и З'-ДЦТЦГЦГАЦГДГТЦТАТЦГЦТА-З*. При подборе праймеров мы руководствовались : муклеатидной последовательностью гена р53, опубликованной в рсботе L. Buchman •t al. <1988).

Т а 6 л и ц л 4. Потери гетераэиготмости участков кромасинь. 17р и 17q в злпчачрстврин«>! опу>:оп«>; у человека

Число изу- Число инФорматив- Число боль-Локализация Проба чеиных мых (гетерозигот- ных с пот»--

вольиым иых) вольных ре«* гетеро-

зиготное™

молочная УМг-22 ( 17р> 44 39/60 <65Х) 18/39 <46Х>

железа

ТНН-5Ч <17ч) 44 34 /60 (57*) 10/34 С29Х)

толстая УN1-22 <17р) 40 26/40 <65%) 15/26 <58* )

киши 4

ТНН-59 <17Ч> 40 16/40 <4СХ) 4/16 <25Х)

Уиг-22 <17р> 23 16/23 <70«) 6/16 (30Х>

легкие

ТНН-59 С 17ч) 23 11/23 (43*) 2/11 С1ЭХ)

У N2-22 С 17р> 24 13/24 (54Х) 7/13 <54Х>

яичник 9/21

ТНН-59 С17Ч> 26 21/26 (81Х) <43Х)

китовидная УЫ2-22 <17р) 23 15/23 <65Х) 0 СОХ)

железа

ТНН-59 <17Я> 21 17/27 (ЬЗХ) 2/17 (12Х>

лей, кроме РЩЖ, наблюдался достаточно высокий процент образцов с ПГ.

Потери гетерозиготности длинного плеча 17-й хромосомы выявлялись при помощи анонимного зонДа ТНН-59. Как указано в табл. 4, наиболее высокая частота потерь 17ч отмечалась в РЯ и РЛ (примерно в половине информативных случаев); в РМЖ и РТК это событие встречалось несколько реке (в 1/4 образцов); наименьший процент делеций 17ч продемонстрирован в РЩЖ.

а Комплексная характеристика повреждений онкогенов ЕВВВ-1, ЕЙВВ-г, С-МГС. НШ5-1. антионкогенов ЯВ-1, р53 и делеций 17-й хромосомы в опухолях у человека

60 образцов ДНК из РМЖ были изучены по всем перечисленным выше характеристикам (амплификация онкогенов Ш?Г?-2, ОТВ-1. С-МУС; статус антионкогенов р53, ЙВ-1; ИГ хромосомы 17р и

Таблиц а5. Корреляция между делециями короткого плена 17-й хромосомы (17р) и некоторыми параметрами карцином молочно^ железы

YN2-22 (17р)* Корреляция

Всего ----------------------

норма делеция

Лимфатические узлы вовлечены не вовлечены 17 19 13(76») 6(32*) 4(24%) 13(68») Р < 0, 02

ERBB-2 одна копия аг (плиФикацин 29 10 18(62») 3(30») 11(33») 7(70») Р < 0, О

ТНН-59 <17q)» норма делеция 18 6 13(72%) 1(17») 5(28») 5(33») Р < 0, 1

$ - талька информативные <гетерозиготные) случаи учтены.

17q).

Как видно из табл. 5, амплификация онкогена ERB6-2 почти всегда (7 из 10 информативных случаев) сопровождалась делецией 17р. Лишь в 3 образцах увеличение копий ERBB-2 не сочеталось с потерей гетерозиготности по YNZ-22. По-видимому, низкая степень достоверности обнаруженной ассоциации (Р<0,2) объясняется недостаточной численностью информативной выборки больных. Вероятно, сочетание этих событий представляет особый интерес, поскольку активация онкогена ERBB-2 вместе с инактивацией антионкогена (возможно, р53) могут на молекулярном уровне отражать классические двустадийные модели канцерогенеза.

В 5 из 6 информативных случаев РМЖ утрата гетерозиготности по ТНН-59 (17q) сопровождалась аналогичным событием на 17р, однако малое число образцов, гетерозиготных по обоим маркерам, не позволило подтвердить достоверность корреляции (табл. б). Скорее всего, одновременная делеция этих маркеров отражает анеуплоидию 17 хромосомы, хотя подтвердить это предположение может лишь цито-генетический анализ. Ответ на этот вопрос поз- . волит уточнить, имеют ли делении длинного плеча 17 хромосомы самостоятельное значение.

Анализ взаимосвязи указанных молекулярно-генетических повреждений с клинико-патологическими параметрами РМЖ - рнявил очень неожиданные закономерности (таСл. 5). Корреляция, обнаруженная нами, показала, что де лоция короткого плеча 17 хромосомы строго ассоциируется с отсутствием метастазов в лимфатические узлы (Р < 0,02). При этом состояние первичной опухоли (рагмер и степень прорастания в окоужагшие ткани) оказались примерно одинаковыми в группах РМЖ с делециями и нормой по ¥N2-22. Эти факты позво.дяют, разумеется, с очень большими оговорками, предположить наличме >;а коротком пле«е 17-й хромосомы последовательностей, вовлеченных в процесс мотастазировалия РМЖ, которые в процессе инициации и/или прогрессии опухоли утрачиваются одновременно с де.гецией антионкогека.

40 образцов ДНК из РТК Зыля изучены по всем перечисленным выше характеристикам. Кроме того, в 14 случаях прозодилось параллельное изучение клеточных линий, полученных из опухолей тех же больных.

Наиболее важным итогом настоящей работы в отношении РТК представляется заклячечие о том, что, вопреки распространенным представлениям, потери гетерозиготности короткого плеча хромосомы 17 по крайней мере не всегда сопровождаются утратой супрессорного гена р53. Действительно, отождествление делеций ло-куса ¥N2-22 с "потерей" аллелей антионксге.ча р53 стало уже традиционным (Уо?е1гге1п В. еЬ а1., 1988; Геагоп ЕН. e^ а1. , 1987; Бакег 5. еЬ а1. , 1939; Уаг1еу Х М. а1., 1991). Однако, наши результаты ставят под сомнение правомерность такой интерпретации. Действительно, можно допустить, что в ряде случаев делеция гена рБЗ, который не проявляет аллель:югс полиморфизма по использовавшейся нами рестриктазе ШгкШ!, маскируется примесями нормальных тканей или дупликацией оставшегося (возможно, мутированного) аллеля. Однако, вызывает настороженность отсутствие изменений гибридизациониого сигнала р53 в ГТК с низким содержанием неизмененных клеток и в клеточных линиях, несущих делэцию 17р, и. особенно в новообразованиях с делениями однего и? аллел»й УМ7.-22 в гоуоэыоте. Вэпро-'у о соответст вии данных, полученных при покпми анонимного зоила У?(7.-??. статусу геяа р53 в дальнейшем необходимо >л°л?Г)'Ь -амое прис

тальное внимание, тем более, что на примере опухолей молочной железы уже продемонстрировано несовпадение делеций аллелей YNZ-22 и гена р53 (Coles С. et al. , 1990).

Комплексный анализ 22 РЯ и 23 PJ1 не выявил каких-либо ассоциаций между различными молекулярно-генетическими повреждениями, а также клиническими параметрами карцином. И, наконец, в РЩЖ частота упомянутых выше аномалий была настолько низка, что не позволила провести полноценную статистическую обработку данных.

4. Изучение ассоциации между амплификацией онкогенов (ERBB-2, ERBB-1. С-МУС) и потерями гетерозиготности участков хромосомы 17р.

В настоящэй работе, как упоминалось выше, была обнаружена ассоциация между амплификацией онкогена ERBB-2 и делецией хромосомы 17р в опухолях молочной железы. Однако эта взаимосвязь не была статистически достоверной, возможно, из-за недостаточной численности проанализированной выборки больных.

В этой связи нами была произведена суммарная статистическая обработка данных по амплификации онкогенов (ERBB-2, ERBB-1, C-MYC) для всех опухолевых образцов ДНК, которые оказались информативными по зонду YNZ-22 (хромосома 17р) (табл. 6). В конечном итоге, при формальной трактовке полученных результатов, нам представляется возможным сделать следующее заключение: амплификация онкогена (ERBB-2, ERBB-1, С-МУС) почти всегда сопровождается делецией хромосомы 17р (антионкогена?).

В свете наших данных подобная гипотеза имеет свои "сильные" и "слабые" стороны, которые подробно рассматриваются в диссертационной работе.

Следует заметить, что в настоящий момент не существует исчерпывающих аргументов, препятствующих объединению в одну группу опухолей различных локализаций, а также суммарной оценке всех выявленных амплификаций. Тем не менее, даме при изолированном учете упомянутых параметров (амплификация онкогенов и делеция хромосомы 17р) только для РМК или только для онкогена ERBB-2 (табл. 6) корреляция остается яа грани достоверности (Р < 0,1 и Р < 0,05 соответственно), хотя вероятность ошибки при

этом несколько увеличивается (по-видимому, за счет снижения общего числа информативных случаев).

Таблица 6. Ассоциация между амплификацией онкогенов Е1?ВВ-2, Е13ВВ-1, С-МУС и потерей гетерозиготности хромосомы 17р в опухолях различных локализаций.

Тип опухоли Гетеразиготность Нет ампли- Есть ампли- Корре-по зонду УЫ2-22 Фчкации Фикация ляция

(хромосома 17р)

рак молочной сохранена 18 3*

железы Р < 0,1

утрачена 10 8«*

рак яичника сохранена 6 0 не

досто-

утрачена 3 1*** верна

рак толстой сохранена 11 0 ' не

кийки досто-

утрачена 13 2**9* верна

рак легкого сохранена 10 0 не

досто-

утрачена . 6 0 верна

рак китовид- сохранена 15 0 не

ной железы досто-

----------- утрачена 0 0 верна

Все опухоли сохранена 60 3

Р < 0,01

54 11

Примечания! Только имфог>натианыв (гетерозиготные) по зонду >Ш1~Т2 олучаи учтены. * - амплификация омкоген* ЕРВВ-2| •• — 1 овразеи с анплиФикациеА онкогена С-НУС, остальные - ЕЯВВ-2| - амплифи-

кация онкогена Е1*ВВ-2| *«»» - 1 овпазяч о а«-1лиФмкацм»я щгпгри»

ЕРВВ-1, 1 - Еяев-г.

шюды

1) Амплификация онкогена ERBB-2 (3-кратная и более) встречается часто в карциномах молочной железы (в 36 из 142 случаев) и редко - в неоплазмах яичника 1.1 из , толстой кишки (4 из 62), легкого (О из 38) и щитовидной железы (1 из 29) у человека.

2) Увеличение числа копий и суперэкспрессия онкогена ERBB-2 строго коррелируют между собой (Р < 0,0001), что позволяет ограничить клиническое тестирование активации этого гена выявлением его амплификации.

3) Амплификация онкогена EREB-2 статистически достоверно ассоциирует (Р < 0,00005) с повышенным риском рецидива рака молочной железы (PMS). Так, прогрессирование опухолевого процесса наблюдалось у 6 из 7 больных РМЖ с амплификацией данного гена, однако только у 2 из 25 без таковой. Следовательно, тест на копийность данного онкогена может быть рекомендован для внедрения в клиническую практику.

4) Статус онкогена ERBB-2 является независимым прогностическим параметром, поскольку присутствие экстракопий данного онкогена не сочетается достоверно с наличием метастазов в лимфатические узлы, размером опухоли, содержанием стероидных рецепторов и возрастом пациенток.

5) Частота амплификации онкогена ERBB-2 в исследованных нами опухолях яичника, в отличие от результатов зарубежных авторов, была низкой. Это свидетельствует о нецелесообразности клинического внедрения данного теста.

6) В опухолях эпителиального происхождения не установлено высокой частоты повреждений структуры супресеорннх генов RB-1 и р53, выявляемых методом Саузерн-блот. В то же время, делеции антионкогена RB-1 выявлены в 2 из 4 сарком мягких тканей. Точ-ковые мутации в 175-ом кодоне гена р53 встречаются в злокачественных новообразованиях молочной иелезы (1 из 53 случаев), толстой кишки (1 из 35), яичника (1 из 19), хотя и достаточно редко.

7) Потери гртерозиготности короткого плеча 17-й хромосомы

(17р) (эонд УНг-22) часто наблюдаются в карциномах молочной железы (18 из 39 информативных случаев), толстой кишки <15 из 26). яичника (7 из 13), ре» - в опухолях легкого (6 из 16). и не обнаружены в 15 злокачественных новообразованиях щитовидной железы. Вопреки сложившимся представлениям, суп рессорный ген р53 может оставаться невовлеченным при данном типе делении, по крайней мере, в неоплазмах толстой киши.

8) Утраты гетерознготности длинного плеча 17-й хромосош (17ч) (ТНВ-59) выявлены в 9 из 21 образцов рака яичника; в остальных типах неоплазм частота этого события несколько реже: в опухолях молочной железы - 10 иэ 34 информативных случаев, толстой юшки - 4 из 16, легкого - 2 из 11, деовндной жлеэы - 2 из 17. Самостоятельная роль делений хромосош 17ч не вызывает сошения лишь для опухолей яичника; в других типах новообразований. особенно в раках молочной железы, это событие часто сочетается с делецней локусов противоположного плеча 17-й хромосомы.

9) Амплификация онкогена 13X8-2 в образцах рака молочной железы в большинстве случаев сочеталась с делецней хромэсомы 17р (7 иэ 10 информативных больных с амплификацией, но лишь И иэ 29 без таковой имели утрату 17р), однако, выявленная взаимосвязь не быв достоверной (Р < 0,2). Увеличение числа копий онкогенов ЕРШ-2. ЕИЗВ-1, С-КУС в других типах опухолей носили единичный характер; тем не менее, результаты суммарной статистической обработка всех полученных данных свидетельствуют, «по активация упомянутых онкогенов часто сочетается (Р < 0,01) с утратой последовательностей 17р.

10) Потеря гетерозиготности хромосомы 17р в опухолях молочной железы достоверно коррелировала с отсутствием метастазов в лимфатические узлы (Р < 0.02). Этот факт позволяет с определенной осторожностью предположить, что параллельно с делецней антионкогеиа, расположенного на хромосоме 17р. происходит утрата генов, инактивация которых вадерятяет процесс м^тястя-вирования опухоли.

- Zc -

■к * *

Выражал сердечную признательность руководителям диссертационной работы д. м. н. Петру Григорьевичу Князеву и чл. -корр. АМН РФ, проф. Кайдо Пауловичу Хансону за постоянное внимание к работе и ценные советы при обсуждении результатов, а также проф. Евгению Иосифовичу Шварцу (Ленинградский Педиатрический институт) - за предоставленную возможность проведения полиме-разной цепной реакции. Приношу глубокую благодарность сотрудникам НИИ онкологии им. Н. Е Петрова Минздрава РФ проф. Бохману Я Е , проф. Вагнеру Р. И., проф. Мельникову Р. А., проф. Семит-лазову В. Ф., д. м. н. Валдиной Е. А., д. м. н. Винокурову Е Л., д. м. н. Лемехову Е Г., к. м. н. Гафтону Г. И., K.U.H. Ивановой О. А., к. м. н. Юрковой Л. Е., Нургазиеву К Ш., Мусаеву Е Т. ва предоставление опухолевого материала, Пиха А. Е - за предоставление данных о содержании стероидных рецепторов в карциномах молочной железы. Выражаю также глубокую благодарность моим друзьям и коллегам О. И. Чернице, С. А. Соколову, С. Е Румянцевой, Т. А. Дорофеевой, Л. Е Рикуновой, С. И. Вишняковой, А. И. Кузьмину, К. Е Титову, А. А. Лыщэву, к. б. н. И. Ф. Никифоровой, к. б. н. О. М. Серовой, к. б. я. Г. Ф. Плужниковой за помощь в работе. Приношу глубокую благодарность проф. К1 А. Берлину и О. Е Плуталову (Институт биоорганической химии АН РФ, Москва) за предоставление праймеров и О. К Кабоеву (Ленинградский институт ядерной физики) - га предоставление Tet-полимеразы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Имянитов Е.Н., Черница 0. И. Структурно-функциональное состояние онкогенов ERBB-2, HRAS-1, С-МУС, антионкогенов р53, RB1 и делеции хромосомы 17 в опухолях молочной железы // Эксперт онколол.-1991.-13.-Н'б.-С, 44-45.

2. Имянитов Е. Е Князев П. Г. Активация онкогена ERBB-2 и прогноз течения рака молочной яелезы у человека // Вопр. он-кол. -1991. -37. -N' 5. -С. 627-534.

3. Имянитов Е. Н., Черница О. И., Серова О. it , Юркова Л. Е., Винокуров Е Л., Князев П. Г. Низкая частота амплификации онко-

гена ЕИЗВ-2 (НЕЯ-2/ИЕи) в опухолях яичника // Эксперим. ои-КОЛ. -1992. -14. -И' 1. -С. 43-45.

Тип-