Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Раннее эмбриональное развитие и дифференцировкавомероназальнои системы человека

Но правах рукописи

Гулимова Виктория Игоревна

"Раннее эмбриональное развитие и дифференцировка вомероназальной системы человека"

14.00.23-гистология, цитология и эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в НИИ морфологии человека РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Савельев C.B.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Юрина H.A. доктор медицинских наук Зворыкин В.П.

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, РАН.

Защита состоится

30 ноября 1995 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.001.04.01 НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул. Цюрупы, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

НИИ морфологии человека РАМН.

«—■

Автореферат разослан ~2Л/

Ученый секретарь диссертационного совета (7 канд. биол. наук Емельяненко И.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Исследование раннего формообразования и развития вомероназального или якобсонова органа (ВО) человека является аюуальным, поскольку данная тема до сих пор практически не разрабатывалась в отечественной морфологии и мало исследована в мире вцелом (Gower, Ruparelia, 1993). ВО был впервые описан в 1703 году, но более чем за 100 лет о нем не было получено сколь-нибудь существенной информации вплоть до 1811 г., когда его переоткрыл Якобсон (Jacobson, 1811), давший ему свое имя. Еще 70 лет понадобилось на то, чтобы исследования, начатые на животных, привели к описанию ВО у эмбрионов человека и взрослых людей (Келликер, 1882).

Обобщая результаты исследований ВО за многие годы, можно утверждать, что система ВО, возникшая у древних амфибий, не только сохранилась, но и продолжает функционировать у современного Homo sapiens. Однако, на сегодняшний день мы не имеем ответов на большинство принципиальных вопросов, связанных с фило- и онтогенезом системы ВО даже у животных. В особенности мало разработаны проблемы развития, строения и функционирования ВО у человека.

Известно, что ВО и связанные с ним органы хорошо развиты и активно функционируют в большинстве групп наземных позвоночных. Функции системы ВО весьма разнообразны: это водное обоняние (амфибии, рептилии), выслеживание добычи и определение вкуса пищи (рептилии и отдельные группы млекопитающих), рефляция полового цикла, общественного и сексуального поведения (высшие млекопитающие) (Harrison, 1987). С другой стороны, есть современные данные о почти 100% встречаемости ВО и его функциональной активности у взрослых людей (Garsia-Velasco, Mondragon, 1991; Monti-Bloch, Grosser, 1991; Moran et al., 1991). Высказывалось предположение о возможности использования системы ВО эмбрионами и плодами (Клосовский и др., 1969). Таким образом, мы располагаем \ информацией о том, что система ВО у человека существует.

Однако, имеются лишь очень разрозненные и противоречивые данные о ее формировании, функциях, влиянии на организм человека, возможных отклонениях в развитии и их связи с другими аномалиями.

Такая ситуация сложилась, в основном, под влиянием двух факторов. Во-первых, вследствие широко распространенного представления о том, что система ВО человека является рудиментарной и после 5-го месяца внутриутробного развития подвергается дегенерации (Титова, 1956; Hart, 1987). Во-вторых, по причине труднодоступности соответствующего плодного и эмбрионального материала. Внимательное изучение работ, написанных по материалам клинических наблюдений, показывает, что даже специалисты-отоларингологи, как правило, не уделяют должного внимания системе ВО. В то же время, существуют обширные литературные данные, указывающие на связь между состоянием периферических отделов обонятельного анализатора, функциями половых органов, сердечно-сосудистой системы и эмоциональной сферой (Рунге, 1888; Карпов, 1928; Еланцев, 1935; Султанова, Агеева, 1973; Nomura, Matsuura, 1972). Недостаток знаний о развитии системы ВО приводит к тому, что нередко оказывается невозможным установить причины аномалий, выявленных у взрослых людей.

Следовательно, особенно актуальным представляется изучение закладки и формирования системы ВО в раннем эмбриогенезе человека. Проведение такого исследования на уникальном эмбриональном и плодном материале с изготовлением серийных срезов предоставляет возможность не только восполнить существующие пробелы в эмбриологии и функциональной морфологии системы ВО, но и проследить ее состояние при ряде патологий развития.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель работы состояла в выяснении способа закладки, развития и дифференцировки системы ВО у человека от раннего эмбрионального до середины плодного периода как в норме, так и при ряде аномалий внутриутробного развития. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- с помощью пластических и графических реконструкций, изготовленных по сериям гистологических срезов, проанализировать закладку и первичную дифференцировку сиситемы ВО человека в процессе нормального и патологического развития;

- используя анатомические методы макропрепаровки с последующей зарисовкой материала, а также специальные микроскопические приемы, исследовать спорный вопрос о существовании мышечного аппарата ВО;

- изучить при помощи трансмиссионной электронной микроскопии ВО плодов человека разного пола для решения вопроса о наличии в нем рецепторных элементов, исследования ультраструктуры вомероназального эпителия и выявления возможных различий между полами;

- с помощью антител к эпитопу Р-5 хордина, широко распространенному в нервной системе позвоночных, охарактеризовать различные элементы системы ВО, в особенности - клетки, мигрирующие из вомероназального эпителия и образующие предполагаемый ганглий этого органа;

- проверить возможность специфического связывания рецепторных элементов ВО с молекулами гормонов, помеченными флуоресцентным маркером (ТИНС) на нативных срезах с целью выяснения функциональных возможностей системы ВО у плодов человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Диссертация является законченной научно-исследовательской работой, содержащей новое решение актуальной научной задачи, состоящей в комплексном анализе основных морфологических процессов раннего эмбрионального формообразования системы ВО человека, её развития у плодов и предполагаемых функциональных возможностей в плодном периоде. Проведенное исследование позволило впервые:

- предложить детальное описание закладки и нерва ВО в раннем эмбриогенезе человека;

- установить, что у плодов человека обоих полов в возрасте 18-22 нед. сохраняется ВО с хорошо развитым нервом, связанным с передним мозгом;

- выявить рецептороподобные клетки в вомероназальном эпителии плодов мужского и женского пола;

- обнаружить отсутствие индукционного влияния хряща носовой перегородки на закладку и формирование нервного аппарата ВО на ранних стадиях;

- выявить иммуногистохимически наличие эпитопа Р-5 хордина в вомероназальном нерве и клетках предполагаемого вомероназального ганглия;

- обнаружить специфическое связывание между меченым прогестероном и клетками эпителия ВО на нативных срезах;

- показать наличие капиллярной сети вокруг ВО и проникновение капилляров в вомероназальный эпителий при отсутствии мышечного аппарата ВО у плодов человека в возрасте 22 нед.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. 1. Проведенная работа является частью комплексного исследования Научного Совета по морфологии человека (07), проблемной комиссии 'Морфогенез клеток, тканей и организма* 07.02 (Ы Гос. регистрации 8106232110.ИЮН.). 2. Полученные данные дают объективное представление о формировании системы ВО на ранних этапах онтогенеза человека. 3. Проведенные исследования позволяют предположить функциональную активность системы ВО в пренатальном периоде. 4. Материалы диссертации используются в учебном процессе Омским медицинским институтом (каф. гистологии, цитологии и эмбриологии), и Московским Гуманитарным Университетом им. Е.Р.Дашковой.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены и обсуждены на секциях МОИП (1994 г.), третьих научных чтениях имени академика АМН Саркисова С.А. и симпозиуме "Современные представления о структурно-функциональной организации мозга (Москва, 1995)*.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них одна в центральном журнале. Одна работа принята к печати в центральном журнале для опубликования в 1996 го/ху•

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Изложена на 178 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 48 рисунков. Список литературы содержит 124 источника, из них 27 на русском языке. - j,

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 34 эмбрионах и плодах человека, полученных в результате абортов при сроках беременности от 5 2/3 до 22 нед. после оплодотворения как в норме, так и при ряде аномалий эмбрионального развития (анэнцефалия, развитие в маточной трубе, гипотрофия). Материал по эмбриональному и плодному развитию человека был собран в клиниках г.Москвы за период с 1990 по 1995 г. после абортов, проводимых в связи с прерыванием беременности. Собирали эмбрионов и плодов от здоровых женщин в возрасте от 17 до 36 лет.

Для определения возраста эмбрионов параллельно использовали несколько методов: подсчет количества сомитов (Muller, O'Rahilly, 1986), определение числа спинальных ганглиев и динамики появления склеротомов, анализ состояния внутренних органов (O'Rahilly, Muller, 1981; O'Rahilly, Muller, 1986). В качестве основного параметра, адекватного как для эмбрионов, так и для плодов человека, была выбрана темя-копчиковая длина (ТКД), измеренная обычным способом (Фалин, 1976). Использовались также данные анамнеза матери.

Забор материала для гистологической обработки осуществлялся в течение часа после аборта или искусственных родов. В качестве фиксатора использовали кислый 10% формалин. Эмбрионов фиксировали целиком. Плодный материал подвергали препаровке.

Для изучения в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ), иммуногистохимических исследований и выявления гормонов использовали материал, полученный не позднее, чем через 3040 мин. после искусственных родов. В первом случае фиксацию отпрепарированного вместе с ВО фрагмента эпителия носовой

перегородки проводили в 2.5 % глутаровом альдегиде на 0.1 молярном фосфатном буфере (рН 7.2) по (Уикли, 1975). Для иммуногистохимических исследований использовали материал, обработанный тремя различными способами: фиксированный в кислом 10% форомалине, фиксированный 2% параформе на 0.1 молярном фосфатном буфере (рн 7.4) с добавлением глутарового альдегида до концентрации 0.25% и нефиксированный материал. Для выявления гормонов выделяли переднюю часть носовой перегородки. Использовался нефиксированный материал, сохранявшийся во время транспортировки (не более 1.5 часа) в фосфатном буфере на физиологическом растворе (рН 7.4) при температуре +5С.

Материал, предназначенный для гистологических исследований, обезвоживали и заливали в смесь парафин-воск. На ротационном микротоме изготавливали фронтальные серии срезов толщиной 10-15 мкм, которые затем окрашивали гематоксилин-эозином, по Маллори, методом Ниссля или импрегнировали серебром. Часть материала до заливки была окрашена в куске борным кармином. Надо отметить, что в каждом случае наклеивали, подвергали гистологической обработке и исследовали все срезы из данной серии.

Материал для ТЭМ был обезвожен по стандартной методике (Гайер, 1974), отконтрастирован 1% уранилацетатом и залит в эпон-аралдит. Затем на ультратоме фирмы 1.КВ делали полутонкие срезы толщиной 1 мкм, которые окрашивали метиленовым синим. Срезы исследовали в световом микроскопе для обнаружения ВО. С разных уровней цефалической части ВО получали ультратонкие срезы толщиной 600-900 ангстрем. Их окрашивали в растворе Рейнольдса (Уикли, 1975) и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе .ШМ-ЮО-СХ-П (Япония, ^Е01_") при увеличении 5-20 тыс. (ускоряющее напряжение - 80 кВ).

Гистологические серии срезов использовались для изготовления пластических и графических реконструкций. Для этого срезы прорисовывали с помощью микропроектора с увеличением 59-166х и переносили на кальку со сдвигом (графические реконструкции). Пластические реконструкции изготавливали из смеси воск-парафин. Проекции переносили на пластины с

толщиной, пропорциональной увеличению и толщине среза, из которых монтировали увеличенную трехмерную реконструкцию. Пластические и графические реконструкции использовали для измерения структур системы ВО на разных стадиях эмбрионального развития.

Плодный материал после специальной препаровки использовали также для измерений и макроскопических зарисовок с увеличением 40х, окрашивания Суданом черным Б в куске или просветления в неокрашенном виде для анализа в поляризованном свете.

Эпителий ВО плодов в возрасте 20-22 нед. был исследован с помощью моноклональных антител Ат5 к эпитопу Р5 хордина осетровых рыб. Этот эпитоп является маркером центральной и периферической нервной системы позвоночных (Preobrazhensky, Rodionova, Barabanov, 1989). Антительную реакцию проводили по методике (Polak, Van Noorden, 1986; Polak, Van Noorden, 1987). Моноклональные антитела к эпитопу Р5 хордина использовали в концентрации 2 мкг/мл. Контрольную реакцию проводили с моноклональными антителами Ат1 к эпитопу Р1 хордина, не реагирующими с антигенами нервной системы позвоночных. Второй этап реакции включал в себя обработку срезов коньюгатом козьих антител к IgG мышей с пероксидазой хрена (разведение 1:500). Визуализация иммунсгистохимической реакции проводилась раствором DAB (3,3'-диаминобензидин, Sigma).

Перегородки носа плодов мужского пола в возрасте 22 нед. были использованы для выявления рецепторов к гормонам в обонятельном и вомероназальном эпителии. Использовали криостатные срезы толщиной 15 мкм с нефиксированного материала. Гормоны (тестостерон, прогестерон и окситоцин) конъюгировали с флуоресцентным маркером. В качестве маркера был выбран TRITC (Tetramethylrhodamine isofhiocyanate), который, благодаря своей способности излучать в красной части спектра при возбуждении ультрафиолетовыми лучами, может быть легко локализован на фоне желто-зеленой автоф;;уоресценции среза. Срезы инкубировали с раствором меченого гормона во влажной камере в течение 40 мин. при комнатной температуре. Конечная концентрация меченого гормона в растворе составляла для

тестостерона, прогестерона и окситоцина 0.05%, 0.25 % и 50 мкЕД/мл соответственно. Срезы из контрольной серии предварительно инкубировали с растворами немеченых гормонов. После обработки срезы заключали в 50% водный глицерин и фотографировали в люминесцентном микроскопе *Люмам-ИЗ*.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Вомероназальная система представляет собой комплекс органов, образующих второй обонятельный анализатор. Она является автономной и объединяет вомероназальный орган, его собственный нерв (НВО), терминальный нерв, железы, капиллярную сеть и собственное представительство в переднем мозге -добавочную обонятельную луковицу.

Исследование в общей сложности 34 нормальных эмбрионов и плодов человека показало присутствие во всех случаях парной закладки, или сформированного ВО.

Из литературы известно, что система ВО человека закладывается в раннем эмбриогенезе (ст. 16, 37 д.) и полностью дифференцируется к 5-му месяцу пренатального развития (Гитова, 1956; Калина, 1960; Pearson, 1941, Bossy, 1980; Boehm, Gasser, 1993). Показано, что закладка ВО возникает из эпителия передней трети основания носовой перегородки, однако, детали этого процесса оставались невыясненными (O'Rahilly, 1.967).

В настоящей работе сделана попытка подробно проанализировать именно ранний период возникновения системы ВО в развитии человека. Установленные нами сроки появления первых признаков закладки ВО соответствуют литературным данным: это 5 2/3 нед. развития, середина 16 ст. (эмбрион 10 мм ТКД). Изготовление пластических и графических реконструкций по сериям срезов с ряда эмбрионов (10,11,13, 14.5,16 и 18 мм ТКД) позволило установить основные этапы формирования кармана ВО. Выявлено, что в формировании ВО принимают участие две структуры: вомероназальная бороздка и плакода - утолщение эпителия перегородки, расположенное дорзальнее бороздки относительно перегородки носа. По нашим данным, эмбриональный морфогенез ВО осуществляется в два этапа. На

первом этапе эпителиальные клетки из плакоды и бороздки мигрируют в мезенхиму с образованием клеточного тяжа, основание которого соединяется с эпителием перегородки в зоне бороздки и плакоды. Второй этап включает в себя формирование полости ВО путем инвагинации пласта в этой области и шизоцельного расхождения клеток тяжа.

В результате описанных процессов у эмбриона 18 мм ТКД (6 4/5 нед., 19 ст.) мы видим уже сформированный ВО. НВО в этом возрасте имеет три основных ветви, начинается формирование обонятельных луковиц в виде парных выпячиваний переднего мозга. Однако, миграция клеток из вомероназального эпителия на этой стадии не заканчивается. Наиболее активной зоной выхода клеток из эпителиального пласта в мезенхиму у эмбрионов 18-25 мм ТКД остается цефалическая часть ВО. Y эмбриона 28 мм ТКД (8 нед., ст. 23) отмечена миграция клеток и в дорзальной части органа, а у плода 40 мм ТКД (10 нед.) она происходит со всех сторон кармана ВО, приводя к образованию гангпиеподобных структур. Именно у двух последних эмбрионов были выявлены признаки обратного развития ВО: отсутствие связи полости ВО с полостью носового мешка у эмбриона 28 мм ТКД и исчезновение самой полости ВО, а также связи вомероназального эпителия с носовым у 40 мм эмбриона.

У 12 нед. плода (63 мм..ТКД), а также у всех более старших плодов до 22 нед включительно, мы обнаружили ВО нормального строения. При этом миграция клеток из эпителия ВО продолжается. Как и на самых ранних стадиях, она наиболее интенсивна в цефалической части ВО. Из литературы известно что, миграция клеток из ВО имеет огромное значение. Она важна не только для образования шванновских оболочек ветвей нерва (Pearson, 1942). Показано, что именно клетки, мигрировавшие из закладки ВО, служат материалом для формирования терминального ганглия (Larsell, 1950). Частично они перемещаются по направлению к головному мозгу, а затем и в сам мозг. Проникая в развивающуюся обонятельную луковицу, эти клетки изолируют локальные группы синоптических окончаний, играя, таким образом, важную роль в формировании клубочкового слоя (Schwanzel-Fukuda, Pfaff, 1991). Клетки другой группы попсдают в гипоталамус,

септум и ряд других областей, где они окончательно дифференцируются, приобретая способность к синтезу LHRH (Valverde et al., 1992).

Таким образом, миграция клеток из закладки ВО на ранних этапах развития у животных достаточно хорошо исследована. Тем не менее, в литературе отсутствуют подробные описания этих процессов у человека.

В данной работе обычными гистологическими методами удалось установить, что клетки, мигрирующие как из вомероназальной бороздки, так и из зоны плакоды ВО, уже у эмбрионе? 11 мм ТКД вступаю! в контакт со стенкой переднего мозга.

Основное внимании нами было уделено миграции клеток, продолжающейся из вомероназального эпителия после завершения формирования органа. В литературе описано продолжение миграции клеток из ВО, однако, ее значение до сих пор неизвестно (Pearson, 1941; Boehm, Gasser, 1993). Вопрос о миграции тесно связан с проблемой существования вомероназального ганглия, которая широко обсуждается в литературе, но до сих пор не имеет окончательного решения (Humphrey, 1940; Bossy, 1980; Harrison, 1987; O'Rahilly, Muller, 1988; Muller, O'Rahilly, 1990).

По нашим данным, клетки продолжают мигрировать из ВО после смещения терминального ганглия к обонятельной луковице. Следовательно, описываемые нами ганглиеподобные структуры не могут относиться к терминальному ганглию. Клетки ганглиеподобных структур реагировали с антителами Mat At5 к эпитопу Р-5 хордина, являющемуся маркером для нервной системы. Анализ гистологического строения этих структур и то, что через них проходит, по меньшей мере, часть ветвей НВО, позволяет нам считать, что они действительно представляют собой вомероназальный ганглий.

В литературе мы находим описания ряда аномалий, связанных с системой ВО ( Levin, 1925; Gabriele, 1967; Jordán, 1973; Ruano-Gil et al., 1980; Schwantzel-Fukuda et al., 1989; ). Однако, они относятся к плодному периоду, или выявлены у взрослых. Нами описано состояние системы ВО у ранних эмбрионов при ряде характерных аномалий. Показано отсутствие закладок как

основной, так и добавочной обонятельной системы у эмбриона с анэнцефалией. При гипотрофии обнаружены носовые карманы, развитые несколько сильнее, чем в норме. Отмечена вомероназальная бороздка. Плакода выражена слабо и только с одной стороны носовой перегородки. На эмбрионе 10 мм ТКД, имеющем незамкнутую нервную трубку вследствие развития в маточной трубе, продемонстрирована задержка развития обонятельной системы. Выявлены обонятельные плакоды, характерные в норме для эмбрионов 5-7 мм ТКД- Закладка ВО не найдена.

Исследование аномального эмбриона 19 мм ТКД, развивавшегося в маточной трубе, позволило установить, что отсутствие закладки хряща носовой перегородки не оказывает влияния на формообразование системы ВО. Однако, результатом механического воздействия на эмбриона стало увеличение размеров ВО и НВО по сравнению с нормой.

Для эмбрионов и плодов человека в литературе описаны являения асимметрии и индивидуальной изменчивости в системе ВО (Jordan, 1973; Ortmann, 1989). В нашей работе для ранних возрастов асимметрия закладки ВО была выявлена только у аномального эмбриона 10 мм ТКД. В норме мы не обнаружили признаков изменчивости до 8 недель эмбрионального развития (эмбрион 28 мм ТКД, ст. 23). Эти результаты согласуются с большинством известных работ (Humphrey, 1940; Bossy, 1980), но противоречат данным Шахова (Шахов, 1975), полагающего что в норме ВО полностью сформирован у эмбрионов 10 мм ТКД и в этом возрасте уже проявляет заметную индивидуальную изменчивость.

По нашим данным, критическим периодом в развитии ВО человека является промежуток от 8 до 12 недели развития. В это время обнаружено исчезновение связи между полостью ВО и носовыми карманами (эмбрион 28 мм ТКД), полная утрата соединения между эпителиальными стенками ВО и эпителия носового мешка, а также отсутствие полости ВО (эмбрион 40 мм ТКД). В обоих описанных случаях изменения были отмечены по обеим сторонам от перегородки, т.е. асимметрии мы не наблюдали.

Важно подчеркнуть, что у всех изученных нами плодов в более

позднем возрасте от 12 до 22 нед. сформированный ВО присутствовал по обеим сторонам перегородки, имел полость, связанную с полостью носа, богатую иннервацию и хорошее кровоснабжение. В этом возрасте уже выражены признаки индивидуальной изменчивости. Различалось число ветвей НВО (4-5) и их расположение. Выявлены различия по форме и расположению ВО. Тем не менее, ни у одного исследованного плода старше 12 недель мы не обнаружили дегенеративных изменений, отмеченных у эмбриона 28 мм и плода 40 мм ТКД. Эти результаты говорят о том, что, несмотря на вариабельность, проявляющуюся в развитии ВО человека, систему ВО нельзя назвать дегенерирующей (Ciges ef al., 1977; Garsia-Velasco, Mondragon, 1991). Скорее всего, мы имеем дело с крайне специализированным образованием, которое, как правило, сохраняется в процессе развития.

Проблема индивидуальной изменчивости тесно связана с явлением полового диморфизма в системе ВО. Половой диморфизм строения как самого ВО, так и других структур вомероназального комплекса, неоднократно описывался в литердтуре для разных видов животных (Segovia, Guillamon, 1993). Важно подчеркнуть, что во многих случаях он затрагивает проекции НВО в головном мозге (Claro et al., 1992). У человека эта тема практически не исследована до сих пор. Только в работах последних лет указывается на существование функционального полового диморфизма в системе ВО у взрослых людей (Monti-Bloch, Grosser, 1991; Monti-Bloch et al., 1994). Между тем, известно, что стимулы, воспринимаемые посредством ВО, могут влиять на секрецию LHRH и гонадотропина, активизировать структуры амигдалярного комплекса и гипоталамуса (Scalia, Winans, 1975; Larrivasahd et al., 1993; Segovia, Guillamon, 1993). С другой стороны, существуют бесспорные различия между мужским и женским сексуальным' поведением. Зная это, естественно предположить, что должны отличаться и структуры, определяющие это поведение.

Мы сравнивали форму ВО у плодов мужского и женского пола в возрасте 15-22 нед, поскольку плоды этого возраста имелись в наибольшем количестве и пол их был точно известен.

Показано, что ВО у плодов мужского пола имеет, как правило, колбовидную форму, тогда как для девочек наиболее характерен ВО в виде узкой трубки или закругленного кармана. Как женский ВО, так и вытянутая дистальная часть мужского ВО могут образовывать короткие ответвления, полость которых связана с основной полостью ВО. При этом мужской ВО, в среднем, в 1.5 раза длиннее женского.

Кроме того, отмечено, что кровоснабжение ВО лучше развито у мальчиков. У них обнаружены отдельные капилляры, проникающие под базальную мембрану и даже вглубь эпителиального пласта. У девочек капиллярная сеть, развита хуже, а проникновения капилляров в вомероназальный эпителий, обнаружить не удалось. Зато у плодов женского пола в полость ВО открывается значительно больше протоков желез, чем у мальчиков.

Другое отличие состоит в том, что миграция клеток из вомероназального эпителия и ганглиеподобные структуры вблизи ВО у плодов мужского пола значительно более выражены.

При исследовании вомероназального эпителия в трансмиссионном электронном микроскопе нами выделены четыре группы предполагаемых рецепторных клеток у плодов мужского пола, тогда как у девочек найдено только две. Таким образом, есть основания полагать, что у человека ВО проявляет половой диморфизм не только на анатомическом, но и на цитологическом уровне.

Нельзя исключить возможность того, что тонкие различия между полами, а также особенности, отличающие систему ВО человека от основного обонятельного анализатора, могут быть выявлены только иммуногистохимическими методами или с помощью электронной микроскопии. В последние годы был сделан огромный шаг вперед в области иммуногистохимии ВО у животных (Imamura et al., 1985; Osada et a!., 1994; Meredith, Fernandezfewell, 1994). Однако, известны лишь отдельные сообщения об изучении системы ВО человека с помощью антительных реакций (Boehm, Gasser, 1993; Johnson et al., 1994).

В данной работе ВО плодов человека был исследован на наличие эпитопа Р-5 хордина осетровых рыб, который известен

как маркер для центральной и периферической нервной системы позвоночных {Preobrazhensky et al., 1989). Позитивная реакция в вомероназальном эпителии отсутствовала, но мы обнаружили ее в клетках, мигрировавших из ВО, а также в волокнах обонятельного и вомероназального нервов. Эти данные подтверждают сделанное нами ранее предположение о том, что структуры, образованные мигрировавшими клетками, представляют собой вомероназальный ганглий.

Одной из малоисследованных областей, связанных с системой ВО человека, является ультраструктура вомероназального эпителия (Винников, Титова, 1957; Бронштейн, 1977). Не решенным окончательно на сегодняшний день остается вопрос о наличии в ВО человека рецепторных элементов (Jordan, 1973; Moran et al., 1991). Неясно, сколько типов таких рецепторов существует.

В данной работе методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) изучен ВО плодов человека обоего пола в возрасте 18-22 нед. У всех исследованных плодов в ВО присутствуют клетки, по своему строению соответствующие рецепторным элементам. Эти клетки были обнаружены как в медиальной, так и в латеральной части ВО, что согласуется с результатами (Humphrey, 1940; Nakashima et al., 1985), хотя и противоречит другим сообщениям (Титова, 1956).

Данное исследование позволило выделить четыре группы предполагаемых рецепторов у плодов мужского пола и две у женских плодов. Разделение на группы производили в результате анализа различий в строении апикальной поверхности клетки и ее ультрасгруктурных особенностей. Рецептороподобные элементы ВО у мальчиков включают в себя: 1 - клетки с электронно-плотной цитоплазмой, узкой апикальной частью, длинными микровиллами и без центриолей в периферическом отростке; 2 - электронно-плотные клетки с широкой апикальной частью, короткими микровиллами и центриолями; 3 - клетки с электронно-светлой цитоплазмой, "древовидными' выростами и центриолями в периферическом отростке; 4 - электронно-светлые клетки с длинными микровиллами и без центриолей. У девочек выявлены две основные группы рецептороподобных элементов, соответствующие группам 1 и 4 мужского ВО. Кроме того,

показано, что в эпителии ВО плодов обоего пола присутствуют как жгутиковые, так и микровиллярные опорные элементы, причем большая их часть несет жгутики с небольшим количеством коротких микровилл по периферии клеточной поверхности.

Таким образом, как результаты собственных исследований, так и литературные данные последних лет, говорят о наличии рецептороподобных элементов в эпителии ВО. В свете этого большое значение приобретает вопрос о том, имеет ли ВО функциональное значение для человека, каково оно и в каком возрасте может проявляться. С одной стороны, электрофизиологическими методами установлена активность вомероназального эпителия взрослых людей в ответ нет специфические стимулы (Monti-Bloch et al., 1994). С другой стороны, известно, что после полового созревания в организме человека синтезируются и выводятся во внешнюю среду со слюной, мочой и апокринным потом соединения, по своим характеристикам соответствующие феромонам (Gower, Ruparelia, 1993; Cohn, 1994).

Следовательно, есть основания полагать, что ВО человека может функционировать. Исходя из этого, мы исследовали вомероназальный эпителий плодов с целью выявления его способности специфически связываться с гормонами как стероидной, так и белковой природы, помеченными флуоресцентным маркером (TRITC). Исследовали сродство вомероназального эпителия к прогестерону, тестостерону и окситоцину. Обнаружено, что в ВО присутствуют зоны связывания с меченым прогестероном. В клетках ганглиеподобных структур четких зон связывания с конъюгатом. выявлено не было. Специфического связывания с двумя другими исследованными гормонами мы не обнаружили ни в вомероназальном эпителии, ни в мигрировавших из него клетках. Полученный результат свидетельствует о наличии в эпителии ВО рецепторов к прогестерону и возможном их использовании в перинатальном периоде для анализа плодной жидкости.

Предположения о возможности плодного обоняния у человека и животных высказывались с тех пор, как было установлено, что возможна рецепция не только газообразных веществ, но и соединений, растворенных в жидкости (Bradley, Mistretta, 1975;

Meredith,! 991). В качестве предполагаемых одорантов, содержащихся в плодной жидкости называли лимонную, молочную и мочевую кислоты, жирные кислоты и аминокислоты.

Несмотря на это, на животных многими авторами получены данные, свидетельствующие о невозможности функционирования системы ВО в пренатальном периоде ( Taniguchi et al., 1982; Garrosa et al., 1992; Coppola et al., 1993). Показано, что у мышей и крыс проток, связывающий полость ВО с носовыми мешками, открывается лишь при рождении, а для окончательного созревания системы ВО необходимо, по данным разных авторов, от нескольких дней до трех недель.

Однако, у человека картина складывается совершенно иная. Дифференцировка рецепторных элементов ВО, как и в обонятельном эпителии, происходит очень рано,(5-6 нед) (Титова, 1956; Калина, 1960; Humphrey, 1940; Bossy, 1980; Boehm, Gasser, 1993), а у эмбрионов 11-14 мм ТКД (середина 6-й недели) начинает устанавливаться связь между обонятельным и вомероназальным нервами и передним мозгом (Pearson, 1942). В этот период ноздри эмбриона еще не закрыты эпителиальными пробками и единственным препятствием для обонятельной рецепции остается неразвитость как основной, так и добавочной обонятельных луковиц. Полностью система ВО и ее центральное представительство оказываются сформированными к 18.5 нед. внутриутробного развития (Humphrey, 1940). С этим событием практически совпадает по времени другое - исчезновение эпителиальных пробок, закрывающих вход в ноздри эмбрионов и плодов до 4.5 мес (Петрова, 1977).

Таким образом, начиная с пятого месяца жизни плода сформированы все структуры, необходимые для рецепции плодной жидкости и открыт доступ к ним. Особо надо подчеркнуть, что при исследовании плодов в возрасте 15-22 нед. мы ни в одном случае не выявили недоразвития протока ВО, связывающего орган с полостью носа. Следовательно, возражения против плодной рецепции, актуальные для грызунов, для человека не имеют оснований.

Заслуживают внимания и другие факты, свидетельствующие в пользу способности ВО человека к плодной рецепции. Из

литературы известно, что рецепторная активность тесно коррелирует с секреторной функцией различных желез носовой полости и степенью их развития (Бронштейн, 1966), В ряде работ в качестве одного из основных отличий обонятельного и вомероназального эпителия называется отсутствие в последнем боуменовых желез (Moulfon, Beidler, 1967; Siges et al., 1977). Нам удалось показать наличие у плодов человека обоего пола трубчатых желез, протоки которых открываются в изобилии в вомероназальную бороздку и желобок, но в несколько меньшем количестве они впадают и в сам карман ВО. Таким образом, ВО у плодов человека обильно снабжается секретом желез, необходимым для рецепторной деятельности.

Вопрос о сократимости ВО у плодов человека остается открытым, поскольку нам не удалось выявить вокруг органа гладкомышечных волокон, описанных для некоторых животных (Hamlin, 1930; Mendoza, 1993). Тем не менее, отмечена хорошо развитая система кровоснабжения. Капилляры образуют частую сеть вокруг ВО, которая лучше выражена у плодов мужского пола. У мальчиков, кроме того, мы наблюдали проникновение отдельных капилляров под базальную мембрану в эпителиальный слой ВО.

Эти результаты имеют особое значение, поскольку для животных известно, что кавернозные тела вокруг ВО вместе с капиллярами, проникающими в вомероназальный эпителий, могут способствовать сокращению-расслаблению ВО, которое регулируется с помощью тройничного нерва или в зависимости от концентрации в крови адреналина (Meredith, 1994).

На грызунах, у которых ВО во взрослом состоянии обладает точно установленной сократимостью, было показано, что сократительная активность стимулируется инъекциями эпинефрина (Coppola, Millar, 1994). Авторы отмечают, что эпинефрин не оказывает стимулирующего воздействия на ВО эмбрионов и плодов. В соответствии с нашими данными, можно предположить, что это должно быть верно и для человека, поскольку капиллярная сеть выглядит хорошо развитой только у плодов 12 нед (63 мм ТКД), но даже в этом возрасте мы не обнаружили проникновения капилляров в толщу ВО. Капилляры в вомероназальном эпителии были выявлены нами только у плодов мужского пола в возрасте

22 нед. Таким образом, есть основания считать, что ВО у поздних плодов человека является сократимой структурой, обладающей способностью активно захватывать небольшие объемы слизи и анализировать растворенные в ней пахучие вещества.

ВЫВОДЫ

1. С помощью пластических и графических реконструкций по сериям срезов установлено, что ВО человека формируется в период между 5 и 7 неделями эмбрионального развития. Материалом для закладки ВО служат вомероназальная бороздка и плакода - участки эпителия, расположенные в основании передней части носовой перегородки.

2. Эмбриональный морфогенез ВО осуществляется в два этапа: 1 - миграция эпителиальных клеток в мезенхиму из плакоды и бороздки с образованием тяжа, 2 - формирование полости ВО в результате инвагинации эпителиального пласта и шизоцельного расхождения клеток тяжа. Развитие и первичная дифференцировка ВО являются автогенетическим процессом, который не зависит от влияния закладки хрящевой перегородки носа.

3. ВО человека сохраняется у большинства плодов. Он связан с полостью носа, имеет развитый нерв и систему кровоснабжения. Для ВО плодов характерен половой диморфизм и выраженная индивидуальная изменчивость. Если у плодов мужского пола обычной формой ВО является колбовидная, то для девочек характерен ВО в виде узкого канала или закругленного кармана. На цитологическом уровне различия в строении периферического отростка микровиллярных клеток ВО позволило выделить среди них 4 группы у плодов мужского пола. У плодов женского пола было выявлено 2 группы микровиллярных клеток.

4. Иммуногистохимическое изучение эпителия ВО и окружающих тканей с помощью антител к эпитопу Р-5 хордина подтверждает предположение о существовании вомероназального ганглия, в котором частично переключаются волокна вомероназального нерва. Этот эпитоп отсутствует в вомероназальном эпителии, но выявляется в нерве ВО и обонятельном нерве. Он обнаружен также в клетках.

мигрировавших из ВО и формирующих ганглиеподобные структуры. Число ветвей вомероназального нерва увеличивается по мере развития системы ВО от трех у эмбрионов 18-19 мм ТКД до 4-5 у плодов в возрасте 20-22 нед.

5. Электронно-микроскопическое исследование ВО плодов обоего пола в возрасте 18-22 нед. показало наличие в вомероназальном эпителии микровиллярных клеток, обладающих признаками рецепторов. Опорные клетки ВО являются в основном жгутиковыми, однако, по периферии их апикальной поверхности обнаружены короткие микровиллы. В вомероназальном эпителии также выявлены клетки смешанного типа, поверхность которых покрыта микровиллами и одновременно несет от одного до нескольких жгутиков.

6. Гистохимическое исследование эпителия ВО для выявления сродства к гормонам, меченым TRITC, позволило установить специфичность связывания эпителия ВО с прогестероном. Это дает основания считать, что в эпителии ВО присутствуют рецепторы к данному гормону, способные анализировать его присутствие в плодной жидкости. Специфического связывания вомероназального эпителия с тестостероном и окситоцином выявлено не было.

7. Не обладая мышечным аппаратом, ВО плодов человека имеет многочисленные жгутиковые клетки, которые обеспечивают ток жидкости в полости органа. На плодных стадиях система ВО также включает в себя капиллярную сеть, рецептороподобные элементы, дифференцированные нервные волокна и обонятельные луковицы, что дает основания предполагать ее функциональную активность в перинатальном периоде.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гулимова В.И. Дифференцировка нерва вомероназального органа в эмбриогенезе человека. - В сб.: Актуальн. аспекты совр. гисто- и цитопатологии, М.: 1991, С. 113-114.

2. Гулимова В.И., Савельев C.B. Формирование вомероназального органа и его нерва в раннем онтогенезе человека. - В сб.: Актуальн. аспекты совр. гисто- и цитопатологии, Vt.: 1992, С. 148-151.

3. Гулимова В.И., Савельев C.B. Морфогенез вомероназального органа человеческих эмбрионов. - В сб.: Актуальн. проблемы общей и частной патологии, М.: 1993, С. 174-177.

4. Гулимова В.И., Савельев C.B. Развитие вомероназального органа и его связи с передним мозгом у ранних эмбрионов человека. Материалы третьих научных чтений имени академика АМН Саркисова С.А. и симпозиума "Современные представления о структурно-функциональной организации мозга', M.: 1995, С.42.

5. Гулимова В.И., Савельев C.B. Раннее эмбриональное формообразование системы вомероназального органа человека. Известия РАН. Сер. Биологическая. 1995. N.3. С.327-335.

6. Гулимова В.И., Савельев C.B. Развитие системы вомероназального органа у эмбрионов человека 19-40 мм темя-копчиковой длины. Известия РАН. Сер. Биологическая. В печати.

Подписано в печать // 9>'г Объем /3 п.л. Тираж 100 экз. Зак. №

ПМЛ Института Африки РАН ул. Спиридоновка 30/1