Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Комплексная характеристика функционирования АВС-транспортеров в солидных опухолях человека методом проточной цитофлюориметрии
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.14
Автореферат диссертации по медицине на тему Комплексная характеристика функционирования АВС-транспортеров в солидных опухолях человека методом проточной цитофлюориметрии
На правах рукописи
Равчеева Анна Борисовна
КОМПЛЕКСНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АВС-ТРАНСПОРТЕРОВ В СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ
14.00.14 - Онкология
автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2005г.
РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОСУДАРСТВЕННОМ УЧРЕЖДЕНИИ РОССИЙСКОМ ОНКОЛОГИЧЕСКОМ НАУЧНОМ ЦЕНТРЕ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
Профессор, доктор биологических наук - Богуш Т.А. Доктор медицинских наук - Шишкин Ю.В.
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Доктор биологических наук - Николаева Т.Г. Доктор медицинских наук - Бухман В.М.
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:
Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена МЗ РФ
на заседании специализированного Совета К.001.17.01 при Российском Онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина Российской Академии медицинских наук (115478 Москва, Каширское шоссе, 24)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Российского Онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН Автореферат разослан .Л.(А^ЗМ.. 2005 г.
Защита диссертации состоится
часов
Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинский наук
Ю.А. Барсуков
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Одна из важных проблем в онкологии - врожденная и развивающаяся в процессе лечения невосприимчивость опухоли к цитостатикам, отличающимся по строению и механизму действия, так называемая множественная лекарственная резистентность. Среди ряда причин, обуславливающих феномен множественной лекарственной резистентности, важная роль отводится семейству АВС-транспортеров, представляющих собой АТФ-зависимые насосы, которые выбрасывают во внеклеточное пространство входящие в клетку цитостатики. Спектр субстратов ABC—транспортеров широк и включает большинство эффективных противоопухолевых препаратов, применяемых в клинике. В литературе эта большая группа противоопухолевых лекарств называется МЛУ-препаратами.
Функциональная активность ABC-транспортеров является признанным маркером множественной лекарственной резистентности лейкозов и используется для прогнозирования эффективности химиотерапии и течения этого заболевания. Что же касается солидных опухолей, то до последнего времени такая оценка была невозможной из-за отсутствия адекватной методики проведения функционального теста в интактных образцах плотных тканей. Использование же в качестве показателя экспрессии транспортных белков или кодирующих их генов часто дает неудовлетворительные корреляции с эффектом терапии и течением заболевания. И это неудивительно, так как экспрессия гена не означает наличие в клетке белка, а выявление белка не дает представления о его функциональной активности, что является определяющим для выброса цитостатиков из клеток, то есть для реализации механизма множественной лекарственной резистентности.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Учитывая сказанное, целью настоящего исследования явилась разработка подхода к прижизненной количественной оценке функциональной активности ABC-транспортеров в плотных тканях, в том числе солидных опухолях человека, методом проточной цитофлюориметрии.
з
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Подобрать оптимальные условия проведения прижизненной количественной
оценки функциональной активности ABC-транспортеров в плотных тканях:
• разработать подход к сохранению функции ABC-транспортеров в условиях ех vivo;
• выработать способ получения суспензии интактных клеток их плотного опухолевого узла;
• определить оптимальные концентрации модельного препарата доксорубицина и ингибиторов АВС-транспортеров;
• определить оптимальные временные параметры инкубации опухолевых клеток с доксорубицином и ингибиторами АВС-транспортеров;
2. Подтвердить адекватность разработанного подхода для оценки функционирования АВС-транспортеров:
• провести сравнительную оценку функции транспортных белков методом проточной цитофлюориметрии и спектрофлюориметрии;
• изучить частоту экспрессии функционально активных АВС-транспортеров в клетках опухолей, различающихся по чувствительности к химиотерапии (рак молочной железы и немелкоклеточный рак легкого);
• определить спектры сочетаний функциональной активности АВС-транспортеров в солидных опухолях разных локализаций.
3. Исследовать возможность использования разработанного подхода для дифференцированной оценки активности АВС-транспортеров, контролирующих цитоплазматическое и ядерное накопление противоопухолевых препаратов.
4. Изучить возможность регуляции цитоплазматического и ядерного накопления противоопухолевых препаратов при увеличении их внеклеточной концентрации.
5. Выработать оптимальный алгоритм оценки функциональной активности АВС-транспортеров, позволяющий получить многопараметрическую характеристику фенотипа множественной лекарственной резистентности опухоли.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
В работе впервые решена задача по адаптации метода проточной цитофлюориметрии для прижизненного количественного дифференцированного определения функциональной активности ABC-транспортеров (маркеров множественной лекарственной резистентности) в солидных опухолях человека.
Впервые показана возможность использования метода проточной цитометрии для прижизненного определения внутриклеточного распределения МЛУ-цитостатиков. Разработан новый подход к интерпретации данных, позволяющий описать ранее неучитываемые характеристики фенотипа множественной лекарственной резистентности: 1) сочетание активностей плазматической и ядерной форм АВС-транспортеров; 2) степень доступности ядра и место преимущественной локализации цитостатика в клетке; 3) выраженность экспрессии функции транспортных белков.
Выявлен новый механизм регуляции внутриклеточного распределения МЛУ-препаратов. Впервые показано, что внеклеточная концентрация цитостатиков является регулятором их распределения между ядром и цитоплазмой в клетках с фенотипом множественной лекарственной устойчивости: при высоких внеклеточных концентрациях препаратов увеличивается доля внутриклеточного препарата, поступившего в ядро и связавшегося с ДНК. Учитывая, что определяющим в реализации эффективности подавляющего большинства противоопухолевых препаратов является их взаимодействие именно с ядерными мишенями клетки, полученные результаты позволили объяснить превышение лечебного эффекта высокодозной химиотерапии в отношении опухолей с фенотипом множественной лекарственной резистентности над ожидаемым от повышения доз препаратов в интервале терапевтических.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Использование в рутинной клинической практике разработанного подхода к прижизненной количественной дифференцированной оценке функциональной активности ABC-транспортеров в плотных тканях методом проточной цитофлюориметрии позволит адекватно характеризовать фенотип
множественной лекарственной резистентности.
Выявленная возможность оценки функциональной активности транспортных белков, контролирующих ядерное и цитоплазматическое накопление МЛУ-цитостатиков, впервые позволит определять "тяжесть" фенотипа множественной лекарственной резистентности с учетом новых параметров функционирования АВС-транспортеров.
Выявленный новый механизм регуляции внутриклеточного распределения МЛУ-препаратов обосновывает целесообразность проведения высокодозной химиотерапии в отношении опухолей с фенотипом множественной лекарственной резистентности, несмотря на ее чрезвычайную сложность.
Выработанный оптимальный алгоритм оценки функциональной активности ABC-транспортеров позволит получать многопараметрическую характеристику фенотипа множественной лекарственной резистентности конкретной опухоли и адекватно прогнозировать эффективность действия противоопухолевых препаратов, в том числе и в комбинации с ингибиторами функции ABC- транспортеров.
ОБЪЕМ И СТРУТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 126 источников. Работа иллюстрирована 36 рисунками, включает 9 таблиц.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Апробация диссертационной работы состоялась 10 декабря 2004 г. на
совместной научной конференции лаборатории медицинской химии, отделения
6
планирования и координации научных исследований, отделов экспериментальной химиотерапии, радиобиологии, лабораторий экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, иммунофармакологии, фармакоцитокинетики, лазерных методов диагностики и лечения опухолей, по созданию нетоксических иммуномодуляторов, фармакокинетики, химического синтеза, разработки лекарственных форм, фармакологии и токсикологии, химии природных соединений, экспериментальной терапии метастазов, клеточного иммунитета, медицинской биотехнологии, комбинированной терапии опухолей, трансгенных препаратов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
Основные положения диссертации опубликованы в 21 научной публикации, доложены на международных и российских конференциях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы солидных опухолей человека (немелкоклеточный рак легкого, рак желудка, толстой кишки, молочной железы) получены во время хирургических операций в ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Линия клеток эритроидной лейкемии К562, стабильно трансфецированная геном Pgp и устойчивая к цитотоксическому действию доксорубицина, любезно предоставлена д.м.н. Штилем А.А.
Оценка функциональной активности ABC-транспортеров. Активность ABC-транспортеров оценивали по изменению внутриклеточного накопления модельного препарата доксорубицина при воздействии ингибиторов функции транспортных белков: верапамила, генистеина, азида натрия - ингибиторов Pgp, MRP и обратной транспортной системы в целом, соответственно.
Метод проточной цитофлюориметрии. Измерения проводили на проточном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson) при длине волны возбуждения 488 нм. Сбор и анализ клеток (не менее 10000 клеток) осуществляли по FL2 параметру.
Спектрофлюориметрический метод. Измерение флюоресценции доксорубицина в среде инкубации проводили на спектрофлюориметре "Hitachi F
2000" при длине волны возбуждения 470 нм и длине волны флюоресценции 590 нм.
Определение количества интактных клеток в суспензии по окрашиванию пропидием иодидом проводили на проточном цитофлюориметре по FL-3 параметру в интервале времени от 30 мин до 2 часов с момента окраски.
Статистическую обработку результатов проводили методом t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
Адаптация метода оценки функциональной активности АВС-транспортеров для исследования плотных тканей
При адаптации метода проточной цитофлюориметрии для оценки функциональной активности транспортеров в плотных тканях были решены следующие задачи. Определены оптимальные концентрации модельного препарата доксорубицина и ингибиторов ABC-транспортеров, позволяющие получать достоверную информацию на проточном цитофлюориметре, пригодную для последующей интерпретации и оценки функциональной активности транспортных белков. Определены оптимальные временные параметры, необходимые для сохранения функции ABC-транспортеров в условиях ex vivo, a также оптимальные сроки инкубации опухолевых клеток с доксорубицином и ингибиторами функции транспортных белков. Важным моментом является показанная нами возможность "мягкого" получения суспензии клеток из опухолевого образца путем кратковременного встряхивания без предварительной обработки протеолитическими ферментами и механического разрушения образцов опухоли. Количество клеток, переходящих при этом в суспензию, оказывается достаточным для проведения исследований на проточном цитофлюориметре в оптимальных условиях работы прибора.
Адекватность разработанного методического подхода для оценки функциональной активности ABC-транспортеров подтверждают следующие результаты. Во-первых, один и тот же ингибитор может вызывать в клетках опухолей одной и разных локализаций ответную реакцию разной степени
Фенотип МЛУ: Р&+ МЯР+ЛВС+
Рис.1. Примеры фенотипов множественной лекарственной резистентности (МЛУ) солидных опухолей человека.
Гистограммы распределения клеток по интенсивности флюоресценции доксорубицина: ■ - контроль; В - после воздействия ингибитора (Вер верапамил; Ген - генистеин; Аз № - азид натрия)
По оси абцисс - интенсивность внутриклеточной флюоресценции доксорубицина; по оси ординат - количество клеток.
выраженности. Во-вторых, ответная реакция на воздействие азида натрия, универсального блокатора обратной транспортной системы в целом, дублирует реакции в ответ на воздействие специфических ингибиторов АВС-транспортеров (рис.1). В-третьих, при оценке фенотипа множественной лекарственной резистентности опухолей одной и разных локализаций выявили разные сочетания проявления функциональной активности транспортеров: Pgp+MRP+ABC+, Pgp-MRP+ABC+, Pgp-MRP-ABC+, Pgp-MRP-ABC- (рис. 1). Включение в схему эксперимента азида натрия позволяет идентифицировать присутствие в опухолевых клетках активных транспортеров, отличных от Pgp и MRP (вариант фенотипа Pgp-MRP-ABC+). В-четвертых, результаты сравнительной оценки фенотипа множественной лекарственной резистентности методами проточной цитофлюорометрии и спектрофлюорометрии совпадают.
Метод проточной цитофлюориметрии позволяет регистрировать перераспределение антрациклина между ядром и цитоплазмой и определять присутствие в клетках опухоли ядерной фракции АВС-транспортеров
Анализ данных фенотипирования 100 образцов солидных опухолей разных локализаций показал, что при ингибировании функции АВС-транспортеров, приводящем к увеличению накопления доксорубицина в клетке, внутриклеточная флюоресценция антрациклина может не увеличиваться, а, наоборот, уменьшаться (рис.2).
Нам удалось объяснить этот феномен, приняв во внимание данные литературы о тушении флюоресценции доксорубицина при связывании с ДНК. Это свойство антрациклина положено в основу широко используемого в настоящее время спектрофлюориметрического метода, при использовании которого показателем связывания доксорубицина с ДНК служит тушение его флюоресценции в среде инкубации клеток. А раз это так, то уменьшение флюоресенции доксорубицина после воздействия ингибитора, регистрируемое проточным цитофлюориметром, означает увеличение связывания цитостатика с ДНК в результате его перехода из цитоплазмы в ядро.
Увеличение накопления доксорубицинав ядре
Увеличение накопления доксорубицина в цитоплазме
Рис.2. Два типа реакций на воздействие специфических ингибиторов Pgp и MRP.
Условные обозначения как на рис.1 (стр. 9)
Следовательно, сдвиг гистограммы влево (рис.2А и 2В) означает подавление функции ABC-транспортера, контролирующего накопление цитостатика в ядре, тогда как сдвиг вправо (рис.2Б и 2Г) указывает на подавление функции транспортного белка, контролирующего накопление в цитоплазме.
Сформулированные представления о существовании функционально активных ABC-транспортеров, контролирующих накопление антрациклина не только в цитоплазме, но и в ядре, подтверждают данные литературы. Методом флюоресцентной микроскопии показано, что в клетках дикого типа докосрубицин локализован в ядре, а в клетках трансфецированных геном Pgp - в цитоплазме. При ингибировании функции Pgp происходит внутриклеточное перераспределение препарата и антрациклин переходит в ядро. Аналогичные данные получены и при ингибировании функции MRP в клетках, трансфецированных геном, кодирующим этот белок. Более того, в самое последние время локализация ABC-транспортеров показана методом иммуногистохимии не только на плазматической, но и на ядерной мембране.
Такое совпадение результатов, полученных совершенно разными методами по существу является прямым подтверждением правомочности использования проточного цитофлюориметра для регистрации внутриклеточного распределения
11
препарата и дифференцированной оценки функциональной активности АВС-транспортеров, контролирующих локализацию препарата в клетке. Направленность изменения внутриклеточной флюоресценции доксорубицина при воздействии ингибиторов транспортных белков позволяет дифференцировать ABC-транспортеры, регулирующие накопление цитостатиков в цитоплазме и в ядре, а именно: сдвиг гистограммы вправо означает, что в клетках экспрессированы функционально активные АВС-транспортеры,
контролирующие накопление препарата в цитоплазме. Сдвиг гистограммы влево свидетельствует о том, что в клетке экспрессирована функция АВС-транспортеров, регулирующих поступление препарата в ядро.
Зависимость интенсивности внутриклеточной флюоресценции доксорубицина от концентрации ингибитора АВС-транспортера До сих пор мы рассматривали изменение (увеличение и уменьшение) интенсивности флюоресцентного сигнала доксорубицина относительно контроля как результат блокирования активности либо плазматических, либо ядерных транспортеров, соответственно. Такой вывод сделан ввиду того, что в разных опухолевых образцах наблюдали либо одну, либо другую реакцию. Однако, исследование влияния разных концентраций ингибитора на интенсивность внутриклеточной флюоресценции показало, что в одной и той же суспензии опухолевых клеток можно наблюдать флюоресцентный сигнал меньший, больший и даже равный контрольному (рис.3).
Данные, представленные на рис. 3, показывают, что в ряду концентраций ингибиторов ABC-транспортеров существует некая точка, при которой интенсивность флюоресценции равна контрольной. Эту концентрацию мы будем дальше называть точкой равной флюоресценции. Она разделяет ряд концентраций на два диапазона. При концентрациях больших точки равной флюоресценции проточный цитофлюориметр регистрирует интенсивность внутриклеточной флюоресценции доксорубицина ниже контрольного уровня. При меньших концентрациях ингибитора показатель флюоресценции доксорубицина превышает контрольный уровень.
Рис.3. Влияние ингибиторов транспортеров в разных концентрациях на выраженность ответной реакции клеток солидных опухолей.
Условные обозначения как на рис.1 (стр. 9)
Цифры на гистограммах обозначают изменение внутриклеточной флюоресценции
под воздействием ингибитора транспортера относительно контрольного уровня
(Т - увеличение; 4- - уменьшение; - без изменения).
Концентрации ингибиторов: Вер 1 =3,3* 1 О^М; Вер0,1=3,3*10"5М;
Вер0,05=1,7* 10"5М; Ген 1=3,2*10"5М; Ген 0,1=3,2*10^; Ген 0,05 =1,6*10"6М
Увеличение флюоресцентного сигнала клетки мы интерпретируем как уменьшение активности плазматических ABC-транспортеров, вследствие чего происходит увеличение накопления препарата в цитоплазме. Снижение внутриклеточной флюоресценции означает присутствие в клетке ядерных транспортеров, уменьшение активности которых при воздействии ингибитора повышает доступность ядра для антрациклина.
В точке равной флюоресценции часть внутриклеточного пула препарата не фиксируется прибором. Если принять во внимание, что "невидимой" для прибора становится доксорубицин, связавшийся с ядерной ДНК, становится очевидным, что при воздействии ингибитора в точке равной флюоресценции молекулы антрациклина, поступившие в клетку дополнительно к исходному контрольному уровню, накапливаются в ядре. В цитоплазме же остается то количество препарата, которое поступает в клетку и в отсутствии ингибитора. Поэтому в точке равной флюоресценции интенсивность флюоресцентного сигнала такая же, как и в контроле.
Из факта существования точки равной флюоресценции следует, что внутриклеточная флюоресценция обусловлена совокупной активностью обоих защитных барьеров, ядерного и плазматического. От того, каким образом соотносится уменьшение функциональной активности плазматических и ядерных транспортеров, зависит, как изменится интенсивность флюоресцентного сигнала по сравнению с контрольным уровнем.
Алгоритм оценки фенотипа множественной лекарственной резистентности
Одним из результатов изучения воздействия разных концентраций ингибитора на внутриклеточную флюоресценцию доксорубицина является то, что интенсивность флюоресцентного сигнала в определенном диапазоне концентраций ингибитора ABC-транспортера находится в обратной пропорциональной зависимости от его концентрации. Уменьшение внутриклеточной флюоресценции с увеличением концентрации ингибитора означает присутствие функционально активных ядерных транспортеров.
Существует два показателя экспрессии функции ядерных транспортеров в клетке: 1) уменьшение внутриклеточного флюоресцентного сигнала доксорубицина относительно контрольного уровня при воздействии ингибитора АВС-транспортеров; 2) обратная пропорциональная зависимость внутриклеточной флюоресценции антрациклина от концентрации ингибитора функции транспортного белка. На какой из показателей ориентироваться при выявлении экспрессии ядерных транспортеров зависит от конкретной ситуации.
Использование одной концентрации ингибитора не во всех случаях достаточно, для того чтобы с уверенностью констатировать факт экспрессии функции ядерных и плазматических транспортеров в опухоли. Мы рекомендуем при определении фенотипа множественной лекарственной резистентности опухоли включать в схему по две концентрации каждого ингибитора. Такая постановка эксперимента позволяет не только определить, экспрессирован ли МЛУ фенотип в опухоли в принципе, то есть присутствуют ли в опухоли функционально активные обратные транспортеры. Становится возможным
идентифицировать активности разных форм транспортеров - плазматических и ядерных, а, следовательно, оценить степень доступности ядра для цитостатиков.
Внеклеточная концентрация доксорубицина регулирует его распределение в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности Возможность характеризовать внутриклеточное распределение доксорубицина методом проточной цитофлюориметрии позволила проверить правильность сформулированной нами гипотезы о том, что регулятором распределения доксорубицина между ядром и цитоплазмой в клетках, экспрессирующих функционально активные АВС-транспортеры, может являться его внеклеточная концентрация. Мы предположили, что блокировать функцию АВС-транспортеров можно не только с помощью ингибиторов, но и увеличивая внеклеточную концентрацию доксорубицина в среде инкубации до уровня, когда транспортеры будут не способны справиться с лавинообразным поступлением субстрата в клетку. В результате нарастающая концентрация препарата в цитоплазме может достичь столь высокого уровня, с которым не в силах будут справиться защитные ядерные транспортеры, и цитостатик перейдет из цитоплазмы в ядро.
Проверка правильности предположения о возможности регулирования внутриклеточного накопления препарата в ядре при повышении его внеклеточной концентрации до некоторого критического уровня проверена на клетках К562, трансфецированных геном Pgp. Предварительные эксперименты показали, что клетки этой линии экспрессируют активный Pgp, регулирующий как ядерное, так и цитоплазматическое накопление цитостатика.
Из рис.4 (правая картинка) видно, что клеточная линия К562 представляет собой совокупность двух субпопуляций клеток, отличающихся по уровню внутриклеточной флюоресценции (субпопуляции с высокой и низкой флюоресценцией). Для каждой из субпопуляций клеток характерна прямая зависимость средней флюоресценции от концентрации доксорубицина во всем исследованном диапазоне. Что же касается всей популяции клеток в целом, то в диапазоне концентраций доксорубицина от 0,01 до 0,05 (рис.5) средняя
Рис.4. Влияние внеклеточной концентрации доксорубицина на внутриклеточную флюоресценцию доксорубицина линии К562, экспрессирующей Pgp-фенотип.
Гистограммы распределения клеток по интенсивности флюоресценции доксорубицина при разных концентрациях препарата.
Концентрации доксорубицина: Доке 0,01= 7,7 10"7М,Докс 1=7,7*10'5М.
внутриклеточная флюоресценция суммарно по всей популяции находится в прямой зависимости от концентрации доксорубицина. Однако, при более высоких концентрациях антибиотика (рис.5) зависимость становится обратной: чем больше концентрация доксорубицина в среде, тем меньше внутриклеточная флюоресценция суммарно по всей популяции. При этом все большую часть популяции составляют клетки в области низкой флюоресценции (рис.4 (правая картинка) и рис.6). Переход клеток из области высокой в область низкой флюоресценции означает перераспределение доксорубицина из цитоплазмы в ядро и связывание с ядерной ДНК, так как связывание с ДНК, как уже говорилось, приводит к значительному (до 40 и более раз) тушению флюоресценции антрациклина.
Таким образом, полученные результаты позволили нам сделать заключение, что внеклеточная концентрация МЛУ-препаратов является регулятором их распределения между ядром и цитоплазмой в клетках с фенотипом множественной лекарственной устойчивости: при высоких внеклеточных концентрациях препаратов увеличивается доля внутриклеточного препарата, поступившего в ядро и связавшегося с ДНК. Следует отметить, что аналогичный механизм регуляции внутриклеточного распределения доксорубицина между ядром и цитоплазмой показан нами и при изучении
Рис. 5. Средняя флуоресценция популяции клеток в целом линии К562, экспрессирующей Pgp-фeнoтип, в зависимости от внеклеточной концентрации докосрубицина.
по оси X - концентрации доксорубицина: Доке 0,1^7.7* Ю^М, Доке 1=7.7*10"5М.
по оси У - средняя флуоресценция клеток при концентрации доксорубицина ДоксХ, отнесенная к средней внутриклеточной флюоресценции при концентрации Доке 1.
5
|4,5
I 4
У'5
I 3
§ 2,5
I >
О 0,5 0
14 ■ V.,
1 II»
* - -ч \
> " Г
И ч *
\ * "'Зт, • * > ■
Ч ^ ■ ■ ■Ъ V
V > - я* «• Г и ■ ' |г >й» гК-
—- » ■ .
-ъ -н "ТУ1"
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Концентрация доксорубицина
0,9
1Д
Рис.6. Распределение клеток линии К562, экспрессирующей Pgp-фeнoтип, между областями высокой и низкой флуоресценции в зависимости от внеклеточной концентрации докосрубицина.
по оси X - концентрации доксорубицина: Доке 0,1=7.7* 10"®М, Доке 1=7.7* 10'5М.
по оси У - коэффициент распределения клеток между областями высокой (субпопуляция А) и низкой флуоресценции (субпопуляция Б) при концентрации доксорубицина ДоксХ, % клеток А ДоксХ/% клеток Б ДоксХ
клинического материала немелкоклеточного рака легкого, рака толстой кишки, желудка и рака молочной железы.
Учитывая, что определяющим в реализации специфической активности подавляющего большинства противоопухолевых препаратов является их взаимодействие именно с ядерными мишенями клетки, полученные результаты объясняют превышение эффекта над ожидаемым от увеличения доз препарата в интервале терапевтических при проведении высокодозной химиотерапии.
Выраженность ответной реакции опухолевых клеток на воздействие ингибиторов ABC-транспортеров определяется внеклеточной концентрацией антрациклина Выявленная способность внеклеточной концентрации антрациклина снижать активность выброса препарата из клетки позволила нам разработать подход к определению выраженности активности ABC-транспортеров при рутинной оценке фенотипа множественной лекарственной резистентности в клинике. Определяя выраженность реакции в ответ на воздействие ингибитора при разных концентрациях антрациклина, можно характеризовать выраженность
Рис.7. Примеры опухолей с разной выраженностью функциональной активности
Pgp и MRP. Условные обозначения как на рис.1 (стр. 9) Концентрации доксорубицина: Доке 0,1= 7,7 10"*М, Доке 1=7,7*10"5М.
функциональной активности ABC-транспортеров в данной опухоли. При этом экспрессия транспортной системы тем выраженней, чем при большей концентрации антрациклина проявляется реакция на ингибитор.
Примеры опухолей с разной выраженностью функции АВС-транспортеров представлены на рис.7. Остановимся на первом ряду гистограмм. Два левых верхних рисунка демонстрируют опухоль с выраженной функцией Pgp, так ка:: эффект верапамила проявляется при высокой концентрации доксорубицина. Два правых верхних рисунка относятся к опухоли с низкой степенью экспрессии транспортера, потому что опухолевые клетки реагируют на воздействие верапамила только при концентрации доксорубицина в десять раз меньшей. Нижний ряд гистограмм представляет собой пример опухолей с разной выраженностью экспрессии MRP. Левый рисунок - с высокой, правый - с низкой функцией MRP.
Важность оценки выраженности экспрессии функции АВС-транспортеров подтвердили результаты исследования немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы, которые находятся на противоположных позициях по чувствительности к МЛУ-препаратам, в частности, к антрациклинам.
Немелкоклеточный Рак Молочной Железы
Рак Легкого
Рис.8. Частота гиперэкспрессии MRP в клетках немелкоклеточного рака легкого и молочной железы.
Проявление функциональной активности MRP при концентрации доксорубицинаДокс 1 в образцах с фенотипом MRP+, выявленным при концентрации доксорубицинаДокс 0,1. Концентрации докорубицина: Докс O.l^.TMO^M; Доке 1=7,7*10"5М.
Исследованные группы больных с диагнозом рак молочной железы и немелкоклеточный рак легкого достоверно различаются по частоте гиперэкспрессии MRP (р< 0,05, п=9 (РМЖ) и п=32 (НМРЛ)).
Оказалось, что гиперфункция MRP является специфическим маркером фенотипа множественной лекарственной резистентности немелкоклеточного рака легкого и определена в 80% опухолей, экспрессирующих MRP. В случае же рака молочной железы гиперэкспрессия MRP выявляется лишь в 1/3 опухолей с экспрессией функции этого ABC-транспортера (р< 0,05). Получается, что различия в частоте гиперэкспрессии ABC-транспортеров в клетках немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы обратно коррелируют с важной клинической характеристикой этих опухолей, а именно, с чувствительностью к химиотерапии, включающей МЛУ-препараты. Таким образом, выраженность экспрессии функции ABC-транспортеров следует рассматривать как важную характеристику фенотипа множественной лекарственной резистентности, которая может иметь принципиальную клиническую значимость.
ВЫВОДЫ
1. Метод лазерной проточной цитофлюориметрии, адаптированный для изучения плотных тканей, впервые позволяет проводить прижизненную количественную дифференцированную оценку функциональной активности АВС-транспортеров в солидных опухолях человека разных локализаций.
2. Фенотип множественной лекарственной устойчивости солидных опухолей человека характеризуется широким спектром сочетаний функциональной активности разных ABC-транспортеров, регулирующих ядерную и цитоплазматическую внутриклеточную локализацию цитостатиков.
3. Внеклеточная концентрация препарата является важным фактором регуляции внутриклеточного распределения противоопухолевых лекарств, в том числе их накопления в ядре.
4. Выработаны критерии оценки "тяжести" фенотипа множественной лекарственной резистентности, которая усугубляется с увеличением количества и выраженности экспрессии ABC-транспортеров, а также с уменьшением степени доступности ядра для цитостатиков.
5. Выработан оптимальный алгоритм оценки функциональной активности АВС-транспортеров, позволяющий получить многопараметрическую характеристику фенотипа множественной лекарственной резистентности конкретной опухоли и адекватно прогнозировать эффективность действия противоопухолевых препаратов, в том числе и в комбинации с ингибиторами функции АВС-транспортеров.
СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Богуш Е.А., Равчеева А.Б., Конухова А.В., Богуш Т.А., Комов Д.В., Барышников А.Ю., Калганов И.Д., Жученко А.П. - Функциональная активность ABC-транспортеров (маркеров множественной лекарственной резистентности) в аденокарциномах и нормальной слизистой толстой кишки человека. - Антибиотики и химиотерапия, Москва, 2002, т.47, №8, с.3-8.
2. Богуш Т.А., Конухова А.В., Равчеева А.Б. - Спектрофлуориметрический метод определения функциональной активности ABC-транспортеров в солидных опухолях человека. - Сб. Трудов Научно-практического симпозиума 'Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", Москва, 20-21 июня 2002, с. 118-122.
3. Калганов И.Д., Равчеева А.Б., Филон А.Ф. - Функциональная активность АВС-транспортеров (маркеров множественной лекарственной резистентности) в опухолях и нормальной слизистой толстой кишки человека. - Российская конференция молодых ученых "Актуальные проблемы колопроктологии", Москва, 30-31 мая 2002, с.68-69.
4. Равчеева А.Б., Конухова А.В. - Методы оценки функциональной активности АВС-транспортеров в опухолях толстой кишки (устный доклад). - Российский симпозиум "Лечение распространенных форм рака толстой кишки", Москва, 6 декабря 2002.
5. Богуш Т.А., Конухова А.В., Равчеева А.Б., Богуш Е.А., Комов Д.В., Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г., Полоцкий Б.Е., Лактионов К.К., Давыдов М.И. - Ингибирование функции ABC-транспортеров в клетках немелкоклеточного рака легкого при воздействии препаратов платины. - Антибиотики и химиотерапия, Москва, 2003, № 10, с. 11-15.
6. Конухова А.В., Равчеева А.Б., Богуш ЕА, Буркова А.А., Лактионов К.К., Гришанина А.Н., Богуш Т.А. - Препараты платины как модификаторы множественной лекарственной резистентности немелкоклеточного рака легкого. - VI конференция молодых онкологов "Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии", Украина, Киев, 4 -5 декабря 2003, с.28-29.
7. Богуш Т.А., Жученко А.П., Калганов И.Д., Равчеева А.Б., Конухова А.В. - Роль функциональной активности ABC-транспортеров (маркеров множественной лекарственной
резистентности) при колоректальном раке. - I съезд колопроктологов России "Актуальные вопросы колопроктологов", Россия, Самара, 2003, с.181-182.
8. Конухова А.В., Равчеева А.Б., Покатаев И.А., Богуш Т.А., Буркова А.А., Тимофеева Н.В. -Цисплатин и карбоплатин как ингибиторы функции ABC-транспортеров - маркеров множественной лекарственной резистентности. - III конференция молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 20-24 января 2004, с.208.
9. Богуш Т.А., Равчеева А.Б., Конухова А.В., Полосухина Е.Р., Шишкин Ю.В., Штиль А.А., Барышников Ю.В. - Внеклеточная концентрация противоопухолевых препаратов является регулятором их внутриклеточного распределения и связывания с ДНК в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности. - 3-ая Всероссийская научно-практическая конференция "Отчественные противоопухолевые препараты", 17-18 марта 2004, с. 14-15.
10. Богуш Т.А., Богуш Е.А., Равчеева А.Б., Голомидова А.К., Гришанина А.Н., Барышников А.Ю., Полоцкий Б.Е., Лактионов К.К., Юдин Д.И., Давыдов М.И. - Гиперфункция MRP -специфический маркер фенотипа множественной лекарственной резистентности немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ). - Минск, Ш съезд онкологов стран СНГ, 24-28 мая 2004, с. 399.
11. Bogush Т., Koldaeva E., Smirnova G., Shubina I., Bogush E., Kalganov I., Tsarjuk V., Shishkin Ju., Konukhova A., Ravcheeva A., Zhuchenko A., Rustum Y. - Expression of ABC-transporters' functional activity in human solid tumors. - 18* UICC International Cancer Congress, Oslo, 30 June - 5 July 2002, P 936, p.429.
12. Bogush Т., Shubina I., Ravcheeva A., Konukhova A., Bogush E., Komov D., Barishnikov A., Kalganov I., Zhuchenko A. - Prognostic value of ABC-tranporters' functional activity in human colon cancer. - 14th International Congress of Anti-Cancer Treatment, France, Paris, February 1th-4th 2003, p.208.
13. Pokataev I., Konukhova A., Ravcheeva A., Bogush T. - Flow cytometric assay of ABCtransporters' functional activity in intact solid tumor specimens. - The Leiden International Medical Students Congress, Leiden, 14-15 March 2003 (тезисы доклада представлены в электронном виде на сайте www.limsc.nl).
14. Bogush Т., Ravcheeva A., Bogush E., Zabotina Т., Kadagidze Z., Laktionov К., Polotskiy В. -MRP functional activity is a main marker of multidrug resistance phenotype in most non-small cells lung cancer (NSCLC) . - "Tumor Biology", V.24, Suppl.l, 2003, p.95.
15. Bogush Т., Ravcheeva A., Bogush E., Shishkin Y., Zabotina Т., Kadagidze Z., Laktionov K., Polotskiy В., Barishnikov A. - MRP functional activity is revealed in most non-small cells lung cancer (NSCLC). - EJC Supplement, V.I, № 5,2003, p.246-247.
16. Bogush Т., Ravcheeva A., Bogush E., Timofeeva N., Ozherelyev A., Kalganov I., Zhuchenko A. -Functional activity of ABC-transporters (markers of multidrug resistance) in colon cancer . -"Techniques in coloproctology", V.7, Suppl. 1,2003, p.S48.
22
17. Pokataev J , Ravcheeva A , Konukhova A., Bogush T. - Fowcytometric assay of ABC-transporters' functional activity in intact solid tumor specimens. - The second Scientific conference for medical students in the GCC countres, 25-28 January, 2004. Emirates medical J, v.22, suppl. N1, p. 169.
18. Bogush T, Ravcheeva A, Bogush E, Komov D, Shishkin Yu, Tchemeris G, Golomidova A, Timofeeva N, Ozherelyev A, Laktionov K, Polotskiy B, Davidov M - MRP functional activity is a pronounced marker of multidrug resistance phenotype in non-small cells lung cancer (NSCLC) but not in breast cancer - International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France, 9lh-12"' February 2004, p.358 - 359.
19. Ravcheeva A., Pokataev I., Konukhova A., Golomidova A., Grishanina A., Bogush T. - MRP hyperfunction as a specific marker of multidrug resistance phenotype in non-small cell lung cancer (NSCLC). - The 12"1 Annual International Ain Shams Students' Congress, Egypt, February 15-18, 2004, p.153.
20. Bogush T, Konukhova A., Ravcheeva A., Bogush E., Timofeeva N., Ozherelyev A., Polotsky В., Laktionov K. - Cisplatin and carboplatin as inhibitors of ABC-transporter(s)' function in multidrug resistant solid rumors. - Journal of Chemotherapy, 2004, v. 16, suppl. №1, p. 170.
21. Bogush Konukhova A., Ravcheeva A., Polosukhina E., Shishkin Y., Shtil A., Baryshnikov A. -Extracellular concentration of anticancer drugs regulates their intracellular distribution and DNA binding in multidrug resistant cells. - Meeting of European Association for Cancer Research, Innsbruck, Austria, 3-6 July 2004, P389.
Служба множительной техники ГУ РОНЦ им НН БлохинаРАМН Подписано в печать /■>?/,<? Сй4"3аказ № ¿Г! Тираж 100 экз
Л'9 M
" V ' /
1808
Оглавление диссертации Равчеева, Анна Борисовна :: 0 :: Б.м.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
I. I. Лекарственная устойчивость и механизмы ее реализации в клетке.
1.2. Семейство АВС-транспортеров.
1.3. Взаимосвязь фенотипа множественной лекарственной резистентности и клинических характеристик опухоли.
1.4. Влияние функции АВС-транспортеров на внутриклеточное распределение доксорубицина.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.2. Методы оценки функциональной активности АВС-транспортеров.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Адаптация метода оценки функциональной активности АВС-транспортеров для исследования плотных тканей.
3.2. Метод проточной цитофлюориметрии позволяет регистрировать перераспределение антрациклина между ядром и цитоплазмой и определять присутствие в клетках опухоли ядерной фракции АВС-транспортеров.
3.3. Зависимость интенсивности внутриклеточной флюоресценции доксорубицина от концентрации ингибитора.
3.4. Алгоритм оценки фенотипа множественной лекарственной резистентности.
3.5. Внеклеточная концентрация доксорубицина регулирует его распределение в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности.
3.6. Выраженность ответной реакции опухолевых клеток на воздействие ингибиторов транспортеров определяется внеклеточной концентрацией антрациклина.
Введение диссертации по теме "Онкология", Равчеева, Анна Борисовна, автореферат
Одна из важных проблем в онкологии - врожденная и развивающаяся в процессе * лечения невосприимчивость опухоли к цитостатикам, отличающимся по строению и механизму действия, так называемая множественная лекарственная резистентность. Среди ряда причин, обуславливающих феномен множественной лекарственной резистентности, важная роль отводится семейству ABC-транспортеров, представляющих собой АТФ-зависимые насосы, которые выбрасывают во внеклеточное пространство входящие в клетку цитостатики. Спектр субстратов ABC-транспортеров широк и включает большинство эффективных противоопухолевых препаратов, применяемых в клинике: антрациклины, винкаалкалоиды, подофилотоксины, таксаны, актномицин Д, митоксантрон, амсакрин, митрамицин, митомицин С, топотекан и иринотекан. В литературе эта большая группа противоопухолевых лекарств называется МЛУ-препаратами.
В настоящее время перспективным считается преодоление множественной лекарственной резистентности, реализованной через систему обратного транспорта, путем применения модификаторов, блокирующих активность ABC-транспортеров и, тем самым, повышающих эффективность уже используемых в клинике цитостатиков. Этот подход с некоторой долей успеха применяется для преодоления множественной лекарственной резистентности в случае лейкозов, когда в качестве модифицирующего агента используют блокатор активности Pgp, одного из представителей семейства обратных транспортеров Другой путь - "обойти" лекарственную резистентность, исключив из схемы терапии МЛУt препараты, к которым предполагается невосприимчивость.
Прежде чем рекомендовать включить в схему модификатор активности обратных транспортеров или рекомендовать исключить из курса химиотерапии цитостатик, к которому нечувствительны опухолевые клетки, необходимо оценить активность обратной транспортной системы в данной опухоли и ее восприимчивость к воздействию модификатора. До сих пор экспрессию ABC-транспортеров продолжают определять методами обратной полимеразной цепной реакции и иммуногистохимии.
Несмотря на однозначно доказанную связь между экспрессией обратных транспортеров и развитием множественной лекарственной резистентности в экспериментах на культуре клеток in vitro, наблюдают частое отсутствие корреляции между уровнем экспрессии транспортеров в опухолевых клетках и чувствительностью к противоопухолевой химиотерапии. Неудачи при попытках провести такие корреляции в клинике отчасти объясняются неадекватностью перечисленных методов для определения присутствия в опухолевых клетках активных транспортеров. Ввиду существования таких сложных регуляторных механизмов как транскрипционная, посттранскрипционная и трансляционная регуляции, в клетке может отсутствовать работающий белок, и в то же время присутствовать 4
РНК, кодирующая транспортер, или сам белок, но в неактивной форме. Есть и еще причины, которые не позволяют признать метод имнуногистохимии адекватным для идентификации обратных транспортеров в клетке. Во-первых, в метод иммуногистохимии заложена ошибка, » обусловленная субъективностью оценки наличия положительной реакции при окрашивании срезов ткани. Во-вторых, в данном подходе присутствует также объективная ошибка, связанная с неотработанностью методики. Неоднократно продемонстрировано, что антитела к разным эпитопам белков обратных транспротеров могут давать не перекрывающееся положительное окрашивание В связи с высказанными соображениями становится очевидным, что при оценке экспрессии обратных транспортеров необходимо ориентироваться на функциональную активность транспортеров, то есть маркером множественной лекарственной резистентности является именно функционирующий транспортер.
Функциональную активность ABC-транспортеров определяют по изменению внутриклеточного накопления субстрата транспортеров после воздействия ингибитора активности транспортера. Одновременно, оценивается и чувствительность данной опухоли к воздействию модификатора. Если субстрат является флюоресцирующей меткой, то для регистрации его концентрации в клетке используют метод проточной цитофлюориметрии. Этот подход используют в случае лейкозов в качестве диагностического этапа при прогнозировании эффективности использования блокатора Pgp с целью повышения чувствительности опухоли к цитостатику. ' Проведение функционального теста методом цитометрии в потоке ограничено опухолями, клетки которых находятся в суспензии. Применение даже самых "мягких" 4 методов получения суспензии клеток из плотной ткани с использованием протеолитических ферментов приводит к неконтролируемому повреждению плазматической мембраны клетки, и, следовательно, к искажению результатов тестирования функциональной активности обратных транспортеров, так как ABC-транспортеры являются, в том числе, плазматическими белками. Адаптация функционального теста для оценки активности транспортеров в плотных тканях впервые позволит провести такое исследование в солидных опухолях, составляющих основную долю онкологических заболеваний, что безусловно важно для достижения прогресса в изучении и преодолении множественной лекарственной резистентности.
Все выше сказанное обуславливает актуальность исследования, его цели и задачи.
Целью настоящего исследования является разработка подхода прижизненной количественной оценки функциональной активности обратных транспортеров в плотных тканях, в том числе солидных опухолях человека, методом проточной цитофлюориметрии.
Для достижения поставленной цели необходимо: 1. подобрать оптимальные условия проведения оценки функциональной активности АВС-, транспортеров в плотных тканях, решив следующие задачи:
• разработать подход к активации активности обратной транспортной системы в клетках в тех случаях, когда опухолевый образец на предваряющем исследование этапе достаточно длительное время находится в неадекватных условиях для сохранения функции транспортеров;
• выработать способ получения суспензии интактных опухолевых клеток их плотного опухолевого узла;
• определить оптимальные временные показатели проведения исследования, оптимальные дозы модельного препарата доксорубицина (субстрата ABC-транспортеров) и специфических ингибиторов разных представителей обратных транспортеров;
• разработать алгоритм анализа данных, получаемых при оценке функциональной активности ABC-транспортеров с помощью проточного цитофлюориметра.
2. проверить адекватность созданного подхода, ориентируясь на способность выявлять с помощью данной методики
• фенотипы множественной лекарственной резистентности, различающиеся по спектру экспрессированных транспортеров;
• фенотип множественной лекарственной резистентности, совпадающий с показателями, определяемыми методом спектрофлюориметрии для того же образца солидной опухоли;
• существенные отличия в частоте экспрессии функционально активных транспортеров в клетках опухолей, различающихся по чувствительности к химиотерапии (в данной работе рассматривается пара - рак молочной железы, для которого исходно характерна высокая чувствительность к химиотерапии, и немелкоклеточный рак легкого, характеризующийся врожденной устойчивостью к цитостатикам).
Научная новизна и практическая значимость
В данной диссертационной работе решена задача по адаптации метода проточной цитофлюориметрии для оценки функциональной активности обратных транспортеров в плотных тканях, что впервые позволяет использовать метод цитометрии в потоке для прижизненного количественного дифференцированного определения функциональной активности транспортных белков в солидных опухолях человека. Выработан оптимальный алгоритм оценки активности ABC-транспортеров, удобный для проведения рутинных исследований и позволяющий характеризовать фенотип множественной лекарственной резистентности наиболее полно и с высокой степенью надежностью. Показана возможность идентифицировать присутствие в опухолевых клетках активных транспортеров, отличных от
Pgp и MRP, что доказывает важность включения в схему исследования азида натрия, энергетического яда и блокатора обратного транспорта в целом.
Метод проточной цитометрии впервые использован в новом качестве - для определения характера внутриклеточного распределения цитостатика. Учитывая выявленное свойство проточного цитофлюориметра установлено, что ингибиторы обратных 6 транспортеров, влияя на активность цитоплазматических и/или ядреных транспортеров, изменяют не только тотальную концентрацию препарата в клетке, но и его распределение между ядром и цитоплазмой.
Выявлен новый механизм регуляции внутриклеточного распределения МЛУ-препаратов. Внутриклеточное распределение доксорубицина между ядром и цитоплазмой, контролируемое ABC-транспортерами, регулируется его внеклеточной концентрацией: при высокой внеклеточной концентрации антрациклина увеличивается доля препарата, поступившего в ядро и связавшегося с ДНК Учитывая, что определяющим в реализации эффективности подавляющего большинства противоопухолевых препаратов является их взаимодействие именно с ядреными мишенями клетки, полученные результаты свидетельствуют о том, что лечебный эффект высокодозной химиотерапии в отношении опухолей с фенотипом множественной лекарственной резистентности должен превышать ожидаемый от повышения доз препаратов в интервале терапевтических, а следовательно, применение такой терапии, несмотря на ее чрезвычайную сложность, оправдано.
В процессе разработки методики выявлен новый подход к интерпретации данных, полученных с помощью метода проточной цитофлюориметрии, что позволяет описать ранее неучитываемые при определении фенотипа множественной лекарственной характеристики активности обратных транспортеров:
• сочетание активностей плазматической и ядерной форм транспортеров, из которых складывается суммарная активность обратного выброса цитостатиков из клетки;
• степень доступности ядра и место преимущественной локализации цитостатика в клетке, контролируемое транспортерами обоих защитных барьеров;
• выраженность экспрессии, присутствующих в клетке транспортеров.
Перечисленные выше новые параметры активности обратных транспортеров наряду с таким показателем как спектр экспрессированных транспортеров позволит дифференцированно подходить к оценке фенотипа множественной лекарственной резистентности солидных опухолей человека, учитывать все характеристики, по которым могут различаться опухоли.
Разработанный подход прижизненной количественной дифференцированной оценки функциональной активности обратных транспортеров в плотных тканях методом проточной цитофлюориметрии предполагается использовать:
1) для выбора адекватного метода определения экспрессии активных транспортеров в клетках опухолей различных локализаций;
2) для сравнения опухолей различных локализаций по разным характеристикам функциональной активности обратных транспортеров;
3) для определения "тяжести" фенотипа множественной лекарственной резистентности у конкретного больного с целью предсказания чувствительности к химиотерапии и коррекции 7 схемы терапии, путем исключения из нее МЛУ-препаратов, к которым предполагается невосприимчивость;
4) для индивидуального прогнозирования эффективности воздействия модификаторов » активности транспортеров в случае выявления их экспрессии в опухоли.
Заключение диссертационного исследования на тему "Комплексная характеристика функционирования АВС-транспортеров в солидных опухолях человека методом проточной цитофлюориметрии"
выводы
1. Метод лазерной проточной цитофлюорометрии, адаптированный для изучения плотных тканей, впервые позволяет проводить прижизненную количественную дифференцированную оценку функциональной активности ABC-транспортеров в солидных опухолях человека разных локализаций.
2. Фенотип множественной лекарственной устойчивости солидных опухолей человека характеризуется широким спектром сочетаний функциональной активности разных АВС-транспортеров, регулирующих ядерную и цитоплазматическую внутриклеточную локализацию цитостатиков.
3. Внеклеточная концентрация препарата является важным фактором регуляции внутриклеточного распределения противоопухолевых лекарств, в том числе их накопления в ядре.
4. Выработаны критерии оценки "тяжести" фенотипа множественной лекарственной резистентности, которая усугубляется с увеличением количества и выраженности экспрессии ABC-транспортеров, а также с уменьшением степени доступности ядра для цитостатиков.
5. Выработан оптимальный алгоритм оценки функциональной активности АВС-транспортеров, позволяющий получать наиболее полную характеристику фенотипа множественной лекарственной резистентности конкретной опухоли и адекватно прогнозировать эффективность действия противоопухолевых препаратов, в том числе и в комбинации с ингибиторами функции ABC- транспортеров.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 0 года, Равчеева, Анна Борисовна
1. Богуш Т.А., Баранов Е.П., Козорез А.Б., Танкович НИ. «Прижизненная оценка накопления доксорубицина в разных типах клеточных культур». Антибиотики и химиотерапия 1990; т.35(11): 16-18.
2. Allen J.D., Brinkhuis R.F., Wijnholds J. et all. «Amplification and overexpression in cell lines selected for resistance to topotecan, mitoxantrone, or doxorubicin». Cancer Res 1999; 59: 4237 - 4241.
3. Allikmets R., Schriml L.M., Hutchinson A., Romano-Spica V., and Dean M. «А human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is involved in multidrug resistance». Cancer Res 1998, 58: 5337 -5339.
4. Allouche M., Bettaieb A., Vindis C., Rousse A., Grignon C., Laurent G. «Influence of Bcl-2 overexpression on the ceramide pathway in daunorubicin-induced apoptosis of leukemic cells». -Oncogene 1997; 14(15): 1837-45.
5. Alton P.A., Harris A.L. «The role of DNA topoisomerases II in drug resistance». -Br J Haematol 1993; 85 (2): 241-5.
6. Ambudkar S.V., Dey S., Hrycyna C.A., Ramachandra M, Pastan /., Gottesman M.M. «Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter». -Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999; 39: 361-98.
7. Arced R.J. «Clinical significance of P-glycoprotein in multidrug resistance malignancies». -Blood 1993; 81 (9): 2215-22.
8. Barnouin K., Leier I., Jedlitschky G., Pourtier-Manzanedo A., Konig J., Lehmann W.D., Keppler D. «Multidrug resistance protein-mediated transport of chlorambucil and melphalan conjugated to glutathione». Br J Cancer 1998; 77: 201 -209.
9. Beer T.W., Rowlands D.C., Crocker J. «Detection of the multidrug resistance marker P glycoprotein by immunohistochemistry in malignant lung tumours». Thorax 1996; 51 (5): 526-9.
10. BorstP. «Genetic mechanisms of drug resistance». Acta Oncol 1991; 30(1):87-105.
11. Borst P., Evers R., Kool M., Wijnholds J. «А family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins». J Natl Cancer Inst 2000; 92(16): 1295-302.
12. Bosch /., Croop J. «Р-glycoprotein multidrug resistance and cancer». Biochim Biophys Acta 1996; 1288(2): F37-54.
13. Bourhis J., Benard J., Hartmann O., Boccon-Gibod L., Lemerle J., Riou G. «Correlation of MDR1 gene expression with chemotherapy in neuroblastoma». J Natl Cancer Inst 1989; 81(18): 1401-5.
14. Bradley G., Juranka P.F., Ling V. «Mechanism of multidrug resistance». Biochim Biophys Acta 1988 ; 948(1): 87-128.
15. Brinkmann U. and Eichelbaum M. «Polymorphisms in the ABC drug transporter gene MDRlv>. -Pharmacogenomics J 2001; 1:59 -64.
16. Broxterman H.J., Lankelma J., Pinedo H.M. «How to probe clinical tumour samples for P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein». Eur J Cancer 1996; 32A(6): 1024-33.
17. Broxterman H.J., Lankelma J., Pinedo H.M., Eekman C.A., Wahrer D.C., Ossenkoppele G.J., Schuurhuis G.J. «Theoretical and practical considerations for the measurement of P-glycoprotein function in acute myeloid leukemia». Leukemia 1997; 11(7): 1110-8.
18. Buschman E., Arceci R.J., Croop J.M., Che M., Arias I.M., Housman D.E., Gros P. «Mdr2 encodes P-glycoprotein expressed in the bile canalicular membrane as determined by isoform-specific antibodies». J Biol Chem 1992; 267(25): 18093-9.
19. Buschman E., Gros P. «The inability of the mouse mdr2 gene to confer multidrug resistance is linked to reduced drug binding to the protein». Cancer Res 1994; 54(18): 4892-8.
20. Chen C.J., Chin J.E., Ueda K„ Clark D.P., Pastan I., Gottesman M.M., Roninson LB. «Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells». Cell 1986; 47:381 -389.
21. Childs S. and Ling V. «The MDR superfamily of genes and its biological implications». -Important Adv Oncol. 1994; 21-36.
22. Chiou S.K., Rao L., White E. «Bcl-2 blocks p53-dependent apoptosis». Mol Cell Biol 1994; 14(4): 2556-63.
23. Chu G. «Cellular responses to cisplatin. The roles of DNA-binding proteins and DNA repair». J Biol Chem 1994; 269(2): 787-90.
24. Davies R., Budworth J, Riley J, Snowden R., Gescher A., Gant TW. «Regulation of P81glycoprotein 1 and 2 gene expression and protein activity in two MCF-7/Dox cell line subclones». -Br J Cancer 1996; 73(3): 307-15.
25. Dean M, Allikmets R. «Evolution of ATP-binding cassette transporter genes». Curr Opin Genet Dev 1995; 5: 779-785.31 .Dean M„ Hamon Y., Chimini G. «The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily». J Lipid Res 2001; 42: 1007 -1017.
26. Decottignies A., GoffeauA. «Complete inventory of the yeast ABC proteins». Nat Genet 1997; 15: 137-145.
27. DelaFlor-Weiss E„ Uziely В., Muggia F.M. «Protracted drug infusions in cancer treatment: an appraisal of 5-fluorouracil, doxorubicin, and platinums». Ann Oncol 1993; 4(9): 723-33.
28. Dive C. «Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance». J Intern Med Suppl 1997; 740: 139-45.
29. Dolfini E., Dasdia Т., Arancia G., Molinari A., Calcabrini A., Scheper R.J., Flens M.J., Gariboldi M.B., Monti E. «Characterization of a clonal human colon adenocarcinoma line intrinsically resistant to doxorubicin». Br J Cancer 1997; 76:67 -76.
30. Doyle L.A., Yang W„ Abruzzo L. V. et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 15665 15670.
31. Doyle L.A., Yang W., Abruzzo L. V., Krogmann Т., Gao Y., Rishi A.K., Ross D.D. «А multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells». Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:15665 -15670.
32. Egyhazi S„ Edgren M.R, Hansson J., Krockel D., Mannervik В., Ringborg U. «Role of 06-methylguanine-DNA methyltransferase, glutathione transferase M3-3 and glutathione in resistance to carmustine in a human non-small cell lung cancer cell line».
33. Eur J Cancer 1997; 33(3): 447-52.
34. Ejendal K.F., Hrycyna C.A. «Multidrug resistance and cancer: the role of the human ABC transporter ABCG2». Curr Protein Pept Sci 2002; 3(5): 503-11.
35. Fojo A.T., Ueda K., Slamon D.J., Poplack D.G., Gottesman M.M., Pastan I. «Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues». Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:265 -269.
36. Giaccia A.J., Kastan M.B. «The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals». Genes Dev 1998; 12(19): 2973-83.
37. Goldstein L.J., GalskiH., FojoA., Willingham M„ Lai S.L., Gazdar A., Pirker R., Green A., Crist W., Brodeur G.M. et al. «Expression of a multidrug resistance gene in human cancers». J Natl Cancer Inst 1989; 81(2): 116-24.
38. Grant C.E., Valdimarsson G., Hipfner D.R., Almquist K.C., Cole S.P., Deeley R.G. «Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs». Cancer Res 1994; 54(2): 357-61.
39. Gros P., Croop J., Housman D. «Mammalian multidrug resistance gene: complete cDNA sequence indicates strong homology to bacterial transport proteins». Cell 1986; 47:371 -380.
40. Guo W„ Healey J.H., Meyers P.A., Ladanyi M„ Huvos A.G., Bertino J.R., Gorlick R. «Mechanisms of methotrexate resistance in osteosarcoma». Clin Cancer Res 1999; 5(3): 621-7.
41. Hector S., Bolanowska-Higdon W., Zdanowicz J., Hitt S„ Pendyala L. «In vitro studies on the mechanisms ofoxaliplatin resistance». Cancer Chemother Pharmacol 2001; 48(5): 398-406.
42. Higgins C.F. «АВС-transporters: from microorganisms to man». Annu Rev Cell Biol 1992; 8: 67-113.
43. Hipfner D.R., Deeley R.G., Cole S.P. «Structural, mechanistic and clinical aspects of MRP1». -Biochim Biophys Acta 1999; 1461: 359-76.
44. Hipfner D.R., Deeley R.G., Cole S.P. «Structural, mechanistic and clinical aspects of MRP1». -Biochim Biophys Acta 1999; 1461: 359 -376.
45. Hirohashi Т., Suzuki H., Sugiyama Y «Characterization of the transport properties of cloned rat multidrug resistance-associated protein 3 (MRP3)». J Biol Chem 1999; 274: 15181-5.
46. Hooijberg J.H., Broxterman H.J., Kool M„ Assaraf Y.G., Peters G.J., Noordhuis P., Scheper R. J., Borst P., Pinedo H.M., Jansen G. «Antifolate resistance mediated by the multidrug resistance proteins MRP1 and MRP2». Cancer Res 1999; 59:2532 -2535.
47. Jedlitschky G., Leier /., Buchholz U„ Barnouin K, Kurz G„ Keppler D. «Transport of glutathione, glucuronate, and sulfate conjugates by the MRP gene-encoded conjugate export pump».- Cancer Res 1996; 56: 988-94.
48. Jedlitschky G., Leier I., Buchholz U„ Center M, Keppler D. «АТР-dependent transport of glutathione S-conjugates by the multidrug resistance-associated protein». Cancer Res 1994; 54: 4833-6.
49. Kast C., Gros P. «Epitope insertion favors a six transmembrane domain model for the carboxy-terminal portion of the multidrug resistance-associated protein». Biochemistry 1998; 37:2305 -2313.
50. Kawasaki M, Nakanishi Y., Kuwano К, Takayama K, Kiyohara С., Hara N. «Immunohistochemically detected p53 and P-glycoprotein predict the response to chemotherapy in lung cancer». Eur J Cancer 1998; 34(9): 1352-7.
51. Klein I., Sarkadi В., Varadi A. «An inventory of the human ABC proteins». Biochim Biophys Acta 1999; 1461:237-262.
52. Kokkinakis D.M., Ahmed M.M., Delgado R., Fruitwala M.M., Mohiuddin M., Albores-Saavedra J. «Role of 06-methylguanine-DNA methyltransferase in the resistance of pancreatic tumors to DNA alkylating agents». Cancer Res 1997; 57(23): 5360-8.
53. Konig J., Nies A.T., Cui Y, Leier I., Keppler D. «Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRP) family: localization, substrate specificity, and MRP2-mediated drug resistance». Biochim Biophys Acta 1999; 1461: 377-94.
54. Kreisholt J., Sorensen M, Jensen P.В., Nielsen B.S., Andersen C.B., Sehested M. «Immunohistochemical detection of DNA topoisomerase Ilalpha, P-glycoprotein and multidrug resistance protein (MRP) in small-cell and non-small-cell lung cancer».
55. Br J Cancer 1998; 77(9): 1469-73.
56. Lazaris A.C., Kavantzas N.G., Zorzos H.S., Tsavaris N.V., Davaris P.S. «Markers of drug resistance in relapsing colon cancer». J Cancer Res Clin Oncol 2002; 128(2): 114-8.
57. Leier /., Jedlitschky G„ Buchholz U„ Cole S.P., Deeley R.G., Keppler D. «The MRP gene encodes an ATP-dependent export pump for leukotriene C4 and structurally related conjugates». J Biol Chem 1994; 269: 27807-10.
58. Litman Т., Brangi M., Hudson E„ Fetsch P., Abati A., Ross D., Miyake K„ Resau J., Bates S. «The multidrug-resistant phenotype associated with overexpression of the new ABC half-transporter, MXR (ABCG2)». J Cell Sci 2000; 113(11): 2011 - 2021.
59. Lockhart A.C., Tirona R.G., Kim R.B. «Pharmacogenetics of ATP-binding cassette transporters in cancer and chemotherapy». Mol Cancer Ther 2003; 2(7): 685-98.
60. Loe D. W„ Deeley R. G„ Cole S.P. «Biology of the multidrug resistance-associated protein, MRP». Eur J Cancer 1996; 32A(6): 945-57.
61. Maliepaard M„ van Gastelen M.A., Tohgo A. et al. «Circumvention of breast cancer resistance protein (BCRP)-mediated resistance to camptothecins in vitro using non-substrate drugs or the BCRP inhibitor GF120918». Clin Cancer Res 2001; 7(4): 935 - 941.
62. Merkel D.E., Fuqua S.A., TandonA.K., Hill S.M., Buzdar A.U., McGuire W.L. «Electrophoretic analysis of 248 clinical breast cancer specimens for P-glycoprotein overexpression or gene amplification». J Clin Oncol 1989; 7(8): 1129-36.
63. Michaelis S„ Berkower C. «Sequence comparison of yeast ATP binding cassette (ABC) proteins». Cold Spring Harbor Symposium in Cold Spring Harbor, NY, 1995.
64. Michaelis S. «STE6, the yeast a-factor transporter». Sem Cell Biol 1993; 4:17-27
65. Miyake K., Mickley L., hitman T. et al. «Molecular cloning of cDNAs which are highly overexpressed in mitoxantrone-resistant cells: demonstration of homology to ABC transport genes». -Cancer Res 1999; 59:8-13.
66. Nikaido H., HallJ.A. «Overview of bacterial ABC transporters». Methods Enzymol 1998; 292:3 -20.
67. Res 1997; 57(19): 4285-4300.
68. Paulusma C.C., BosmaP.J., Zaman G.J.R., Bakker C.T.M., Otter M., Scheffer G.L., Scheper R.J., Borst P., Oude Elferink R.P.J. «Congenital jaundice in rats with a mutation in a multidrug resistance-associated protein gene». Science 1996; 271:1126-1128.
69. Perego P., De Cesare M., De Isabella P. «А novel 7-modified camptothecin analog overcomes breast cancer resistance protein-associated resistance in a mitoxantrone-selected colon carcinoma cell line». -Cancer Res 2001; 61: 6034 6037.
70. Pommier Y., Leteurtre F., Fesen M.R., Fujimori A., Bertrand R„ Solary E„ Kohlhagen G., Kohn K. W. «Cellular determinants of sensitivity and resistance to DNA topoisomerase inhibitors». Cancer Invest 1994; 12(5): 530-42.
71. Punzi J.S., Duax W.L., Strong P., Griffin J.F., Flocco M.M., Zacharias D.E., Carrell H.L., Tew K.D., Glusker J.P. «Molecular conformation of estramustine and two analogues». Mol Pharmacol 1992; 41(3): 569-76.
72. Qin В. and McClarty G. «Effect of 6-thioguanine on Chlamydia trachomatis growth in wild-type and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase-deficient cells». J Bacteriol. 1992; 174 (9): 2865-2873.
73. Rosenberg M.F., Callaghan R., Ford R.C., Higgins C.F. «Structure of the multidrug resistance P-glycoprotein to 2.5 nm resolution determined by electron microscopy and image analysis». J Biol Chem 1997; 272:10685 -10694.
74. Sanfilippo 0., Ronchi E., De Marco C., Di Fronzo G., Silvestrini R. «Expression of P-glycoprotein in breast cancer tissue and in vitro resistance to doxorubicin and vincristine». Eur J Cancer 1991; 27(2): 155-8.
75. Sauerbrey A., Sell W„ Steinbach D„ Voigt A., Zintl F. «Expression of the BCRP gene (ABCG2/MXR/ABCP) in childhood acute lymphoblastic leukaemia». Br J Haematol 2002; 118: 147- 150.
76. Schinkel A.H. «The physiological function of drug-transporting Р-glycoproteins». Semin Cancer Biol 1997; 8:161 -170.
77. Schisselbauer J.C., Silber R, Papadopoulos E„ Abrams K., LaCreta F.P., Tew K.D. «Characterization of glutathione S-transferase expression in lymphocytes from chronic lymphocytic leukemia patients». Cancer Res 1990; 50(12): 3562-8.
78. Schneider J., Bak M., Efferth Т., Kaufmann M., Mattern J., Volm M. «P-glycoprotein expression in treated and untreated human breast cancer». Br J Cancer 1989; 60(6): 815-8.
79. Schuetz J.D., Connelly M.C., Sun D., Paibir S.G., Flynn P.M., Srinivas R. V. et al. «MRP4: a previously unidentified factor in resistance to nucleoside-based antiviral drugs». Nat Med 1999; 5: 1048-51.
80. Schwarzenbach H. «А diagnostic tool for monitoring multidrug resistance expression in human tumor tissues». Anal Biochem 2002; 308(1): 26-33.
81. Shen H., Kauvar L., Tew K.D. «Importance of glutathione and associated enzymes in drug response». Oncol Res 1997; 9(6-7): 295-302.
82. Sinha B.K., Mimnaugh E.G., Rajagopalan S„ Myers C.E. «Adriamycin activation and oxygen free radical formation in human breast tumor cells: protective role of glutathione peroxidase in adriamycin resistance». Cancer Res 1989; 49(14): 3844-8.
83. Stambolic V, Suzuki A., de la PompaJ.L., Brothers G.M., Mirtsos C., Sasaki Т., Ruland J., Penninger J.M., Siderovski D.P., Мак T.W. «Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell
84. Survival by the tumor supressor PTEN». Cell 1998; 95(1): 29-39.
85. Steinbach D„ Sell W., Voigt A. et al. «BCRP gene expression is associated with a poor response to remission induction therapy in childhood acute myeloid leukemia». Leukemia 2002; 16: 1443 - 1447.
86. Sugawara /., Akiyama S., Scheper R.J., Itoyama S. «Lung resistance protein (LRP) expression in human normal tissues in comparison with that of MDR1 and MRP». Cancer Lett 1997; 112(1): 23-31.
87. Thiebaut F., Tsuruo Т., Hamada H., Gottesman M.M., Pastan I., Willingham M.C. «Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues». Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:7735 -7738.
88. Volk E.L., Farley K.M., Wu Y., Li F„ Robey R. W., Schneider E. «Overexpression of wild-type breast cancer resistance protein mediates methotrexate resistance». Cancer Res 2002; 62(17): 5035 -5040.
89. Wijnholds J., Mol C.A., van Deemter L., de Haas M, Scheffer G.L., Baas F. et al. «Multidrug-resistance protein 5 is a multispecific organic anion transporter able to transport nucleotide analogs». Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 7476-81.
90. Wishart G.C., Plumb J.A., Going J. J., McNicolA.M., McArdle C.S., Tsuruo Т., Kaye S.B. «Р-glycoprotein expression in primary breast cancer detected by immunocytochemistry with two monoclonal antibodies». Br J Cancer 1990; 62(5): 758-61.
91. Yokoyama H., Ishida Т., Sugio K., Inoue Т., Sugimachi K. «Immunohistochemical evidence that P-glycoprotein in non-small cell lung cancers is associated with shorter survival». Surg Today 1999; 29(11): 1141-7.