Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Псевдогипертрофические прогрессирующие мышечные дистрофии у детей: алгоритмы диагностики и медико-генетического консультирования

На правах рукописи

003057Б77

ПОДАГОВА Екатерина Владимировна

ПСЕВДОГИПЕРТРОФИЧЕСКИЕ ПРОГРЕССИРУЮЩИЕ МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ У ДЕТЕЙ: АЛГОРИТМЫ ДИАГНОСТИКИ И МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ

14. 00.13 - нервные болезни 03. 00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2007

003057677

Работа выполнена в Государственном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального Образования «Российский Государственный Медицинский Университет федерального агенства по здравоохранению и социальному

развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент

Мальмберг С. А. Дадали Е. Л.

Зыков В.П. Ситников В.Ф.

Ведущая организация: ГУ НИИ Неврологии РАМН

Защита диссертации состоится "_" _200_ г. в _ часов

на заседании Диссертационного Ученого Совета

К 208.072.01 при Российском Государственном медицинском университете по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан "_" _2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Кандидат медицинских наук, доцент

JI.B. Губский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД)

- группа генетически гетерогенных заболеваний с изолированным или преимущественным поражением мышц плечевого и тазового поясов конечностей [Anastasi G et al. 2004, Arahata К. 2000, Kumagai T et al. 2001, Nigro V. 2003]. Показано, что наиболее злокачественное течение характерно для, так называемых, псевдогипертрофических вариантов ПКМД, которые делятся на дистрофинопатии и саркогликанопатии [Fischer D et al. 2005, Gulati S et al. 2003, Sunada Y. 2004]. В группу дистрофинопатий включены ПМД Дюшенна и Беккера, которые представляют собой аллельные варианты, обусловленные различными мутациями в гене белка дистрофина [Дадали Е.Л. 1999, Иллариошкин С.Н. и соавт. 1998, Nonaka I. 2004]. Группа саркогликанопатий представлена 4 вариантами ПКМД - 2С, 2D, 2Е, 2F типов, наследующихся по аутосомно-рецессивному типу и обусловленных мутациями в генах четырех трансмембранных белков - альфа, бета, гамма и дельта саркогликанов [Beckmann J.S. et al. 1996, Dincer P et al. 2000, Emery A.E. 2002]. Имеющиеся в литературе немногочисленные работы, посвященные проведению клинико-генетических корреляций, показали отсутствие выраженных различий клинических и нейрофизиологических проявлений ПМД Дюшенна и саркогликанопатий, что можно объяснить сходством патогенетических механизмов и морфологического дефекта, возникающего при этих группах заболеваний [Dua Т 2001, Zats М. et al. 1989, Мальмберг С.А., 2000]. Известно, что дистрофии и саркогликаны входят в состав дистрофин-гликопротеинового комплекса, посредством которого осуществляется связь цитоскелета миофибрилл с внеклеточным матриксом [Баранов А.Н. 2000, Гринио Л.П. и соавт. 1997, Ananda А et al. 1999]. Нарушение одного из компонентов этого комплекса приводит к его деградации и некрозу мышечных волокон, с последующим замещением их соединительной тканью [Бадалян Л.О. и соавт. 1988, Темин П.А. и соавт. 1997, Шишкин С.С. 1997]. Сходство клинических

проявлений этих генетически гетерогенных заболеваний осложняет проведение их дифференциальной диагностики и планирование профилактических мероприятий в отягощенных семьях в процессе проведения медико-генетического консультирования [Наштапоуа-РеЬизеичсг I а1. 2000, Ога\уа Е. 1999]. Это определяет необходимость создания четких алгоритмов диагностики отдельных генетических вариантов псевдогипертрофических форм ПМД, использование которых позволит избежать ошибок при расчетах риска и заключениях о состоянии здоровья будущего ребенка во время проведении дородовой диагностики. Однако разработка таких алгоритмов невозможна без проведения тщательного клинического, биохимического,

иммуногистохимического и молекулярно-генетического обследования больных и членов их семей. Основное внимание при проведении комплексного анализа должно быть направлено на изучение частот встречаемости и особенностей фенотипических проявлений различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД у больных мужского пола, а также характера клинических симптомов у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина и больных женского пола с аутосомно-рецессивными вариантами псевдогипертрофических форм ПМД. Результаты исследований позволят не только оптимизировать процесс диагностики и дифференциальной диагностики различных вариантов псевдогипертрофических форм ПМД, но и повысить результативность при проведении медико-генетического консультирования отягощенных семей.

Дель исследования: создание алгоритмов диагностики и медико-генетического консультирования семей отягощенных

псевдогипертрофическими вариантами ПКМД на основе проведения комплексного обследования больных и членов их семей.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить частоту встречаемости ПМД Дюшенна и аутосомно-рецессивных вариантов псевдогипертрофических ПКМД в выборке больных из популяции РФ.

2. Провести сравнительный анализ частот встречаемости основных клинических признаков и уровня активности КФК в группах больных с аллельными вариантами ПМД Дюшенна.

3. Оценить особенности клинических проявлений у больных женского пола с аутосомно-рецессивными вариантами псевдогипертрофических ПКМД и у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина.

4. Разработать алгоритмы дифференциальной диагностики псевдогипертрофических ПМД у больных мужского и женского пола.

5. Унифицировать протокол проведения медико-генетического консультирования семей, отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПМД.

Научная новизна

Впервые на основе проведения комплексного клинического, молекулярно-генетического, биохимического и иммуногистохимического методов обследования больных с фенотипическими проявлениями псевдогипертрофических ПМД проведена оценка частот встречаемости ПМД Дюшенна и псевдогипертрофических вариантов ПМД с аутосомно-рецессивным типом наследования. Выявлены особенности клинических проявлений и биохимических параметров у носительниц мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. Выявлены ранее не описанные в литературе особенности поражения мозга у гетерозиготной носительницы в гене дистрофина. Усовершенствованы алгоритмы диагностики, дифференциальной диагностики и медико-генетического консультирования семей с различными генетическими вариантами псевдогипертрофических форм ПКМД у лиц мужского и женского пола на основе современных иммунногистохимических и молекулярно-генетических данных.

Практическая значимость

Разработаны четкие протоколы диагностики и дифференциальной диагностики псевдогипертрофических вариантов ПМД у больных мужского и

женского пола, необходимые в практической деятельности врача-невролога и генетика. Использование этих протоколов в клинической практике позволит избежать ошибок при проведении профилактических мероприятий в ходе медико-генетического консультирования отягощенных семей.

Положения, выносимые на защиту:

1. В выборке больных мужского пола с псевдогипертрофическими вариантами ПМД из центральных регионов России подавляющее большинство случаев (96,7%) представлено ПМДД, тогда как на долю аутосомно-рецессивных вариантов саркогликанопатий приходится лишь 3,3% случаев. В противоположность этому в группе больных женского пола доля саркогликанопатий составляет 77,8 %, а в 22,2 % случаев заболевание возникает у гетерозиготных носительниц мутаций в гене дистрофина.

2. Существуют различия в частоте встречаемости аллельных вариантов ПМДД, обусловленных делециями, дупликациями и точковыми мутациями в гене дистрофина. В 60,5 % заболевание возникает в результате делеции, в 7,6 % -дупликации и 31,9 % - точковых мутаций в гене дистрофина. Показано отсутствие статистически значимых различий в возрасте начала, частотах встречаемости клинических проявлений и уровне активности креатинфосфокиназы в плазме крови при аллельных вариантах ПМДД.

3. Миопатический симптомокомплекс в проксимальных группах мышц конечностей и/или признаки кардиомиопатии выявляются при тщательном клинико-неврологическом обследовании у 41,8 % облигатных носительниц, что требует назначения профилактического лечения, препятствующего манифестации клинических симптомов. Выявлены ранее неописанные особенности клинических проявлений у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина, характеризующиеся симптомами поражения ЦНС.

4. Усовершенствованы алгоритмы диагностики псевдогипертрофических ПМД у лиц мужского и женского пола. У 10,6 % больных мужского пола и 78,6 % больных женского пола для дифференциальной диагностики ПМДД и аутосомно-рецессивных саркогликанопатий необходимо использовать

иммукогистохимический метод, направленный на обнаружение дистрофиновых волокон в мышечном биоптате.

5. Модифицированы расчеты повторного риска рождения больного ребенка с ПМДЦ и характер проведения профилактических мероприятий в отягощенных семьях. На основе различий частоты возникновения мутаций в гене дистрофина в женских и мужских гаметах установлено, что при аллельном варианте ПМДЦ, обусловленном точковыми мутациями вероятность гетерозиготного носительства его матери составляет 97,6 %, что значительно увеличивает эффективность и точность результатов проведения дородовой диагностики в семьях отягощенных ПМДЦ с использованием косвенных методов ДНК анализа.

Внедрение результатов исследования в практику Разработанные диагностические протоколы и алгоритмы проведения медико-генетического консультирования семей, отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПМД, успешно используются в практической работе отделения психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями ФГУЗ ДКБ № 38 - ЦЭП ФМБА России, которое является клинической базой кафедры нервных болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, а также в научно-консультативном отделе ГУ Медико-генетического научного центра РАМН. Данные проведенного исследования применяются в лечебной и педагогической работе на кафедре нервных болезней педиатрического факультета, а также включены в лекционные курсы по медицинской генетике на кафедре общей и медицинской генетики медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на юбилейной конференции «15-лет ФГУЗ ДКБ № 38-ЦЭП ФМБА» (2005 г), совместном заседании кафедры нервных болезней педиатрического факультета и кафедры генетики МВФ РГМУ (2007 г).

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 5 научных работ (4 статьи и 1 тезис).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и включает введение и главы, посвященные обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению и обсуждению полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 9 рисунками, 5 диаграммами, 17 оригинальными фотографиями, краткими выписками из историй болезни. Библиографический указатель включает 252 (65 отечественных и 187 зарубежных) источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованная выборка больных включала 142 пациента с псевдогипертрофическими формами ПМД: 123 больных мужского пола в возрасте от 2,5 до 18 лет и 19 - женского в возрасте от 2 лет 8 мес до 40 лет, находящихся под наблюдением в научно-консультативном отделе МГНЦ РАМН (директор - академик РАМН, профессор Е.К. Гинтер) и в отделении психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями (зав. - д.м.н. Мальмберг С.А.) ФГУЗ ДКБ №38 - ЦЭП ФМБА России (главный врач - к.м.н. Голоденко В.И.) в период с 2002 по 2005. Клиническое обследование больных включало неврологический осмотр по общепринятой в клинической нейромиологии методике, сбор анамнестических данных и генеалогический анализ. В соматической сфере был сделан акцент на тщательном контроле сердечной и дыхательной деятельности. Оценка уровня зрелости и специфики развития интеллекта исследовалась с помощью шкалы Векслера. Электромиографическое исследование проводилось с использованием 4-х канального электронейромиографа «Нейро-МВП» фирмы Нейрософт (Иваново, Россия). С целью обнаружения поражения сердечной мышцы проводилось эхокардиографическое исследование, регистрация ЭКГ и

суточное холтеровское кардиомониторирование на аппарате "Oxford Medilog Prima" в трех отведениях с определением среднесуточной частоты сердечных сокращений, циркадного индекса, стандартных параметров ЭКГ, аритмий, вариабельности ритма сердца с применением временного анализа. Определение уровня активности креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), мышечных изоформ аланинаминотрансферазы (АлАт) и аспартатаминотрансферазы (АсАт) проводилось по стандартной методике на автоматическом биохимическом анализаторе Vitalab Flexor PC и полуавтоматическом биохимическом анализаторе Eclipse фирмы Merck. ДНК-диагностика у больных мужского пола осуществлялась методом мультиплексной амплификации с анализом 20 экзонов и промоторной области в лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН (зав. - д.б.н., проф. Поляков A.B.). Больным женского пола с клиническими признаками псевдогипертрофической ПМД проводилось исследование кариотипа с использованием дифференцированной G окраски по стандартным методикам. При выявлении несбалансированной лайонизации одной из X хромосом учитывали данные о том, что основным фактором инактивации Х-хромосомы у девочек является дифференцированное метилирование в различных ее участках. Использование рестриктаз, чувствительных к метилированию, то есть расщепляющих ДНК только тогда, когда в сайте их рестрикции метилирование отсутствует, дает основание судить об уровне метилирования генов X хромосомы. При наличии несбалансированной лайонизации X хромосомы после обработки ДНК эндонуклеазой, будет преимущественно амплифицироваться один из двух аллелей, которые наблюдались в равном соотношении после проведения реакции амплификации на ДНК, не подвергнутой обработке рестриктазой. Имунно-гистохимический анализ, направленный на определение дичстрофиновых волокон в биоптате четырехглавых мышц проводился при помощи антител, специфичных к С-домену, Rod - домену и N-концу белка дистрофина. Мышечный биоптат обрабатывался согласно стандартному иммунно-цитохимическому протоколу.

Для выявления эпитопов дистрофина использовали антитела DYS-1, DYS-2 и DYS-3 "Novocastra" (Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Анализ частот встречаемости ПМДЦ в группе больных мужского пола с псевдогипертрофическими вариантами ПМД.

Точная диагностика ПМДД у больных мужского пола с псевдогипертрофическим вариантами ПМД осуществлялась в случаях: наличия X -сцепленного рецессивного наследования заболевания, обнаружения делеции в гене дистрофина и установления гетерозиготного носительства матерью пробанда в изолированных случаях на основе повышения уровня креатинфосфокиназы в плазме крови. Х-сцепленная сегрегация заболевания обнаружена в 26 семьях (21,2 % от общего количества семей), в двух обследованных семьях (1,6 %) наличие сходного заболевания выявлено у сестер пробандов, что дало основании диагностировать аутосомно-рецессивный вариант ПКМД, в остальных 95 семьях (77,2 %) пробанд был единственным больным в семье. При проведении ДНК анализа, направленного на выявление делеций и дупликаций в гене дистрофина, в группу больных с ПМДД отнесен еще 71 больной больных (при этом у 62 больных идентифицирована делеция, а у 9 больных дупликация в гене дистрофина).

В оставшихся семьях с наличием единственного больного всем матерям пробандов проведено исследование уровня КФК в плазме крови. В качестве порогового значения для установления носительства был принят показатель в 150 ед/л. Результатами этого исследования явилось установление гетерозиготного носительства мутации у 11 матерей больных мальчиков. Таким образом, в результате проведения такого комплексного исследования диагноз ПМДД установлен у 108 больных, что составило 87,8 % случаев в обследованной нами выборке больных мужского пола и в двух случаях идентифицирован аутосомно-рецессивный вариант псевдогипертофической ПКМД.

У 13 больных мальчиков, у матерей которых значения активности КФК были в границах нормы, а сами пациенты были единственными больными в семьях, проведение дифференциального диагноза между ПМДД/Б и псевдогипертофическими вариантами ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования требовало осуществления иммуногистохимического анализа биоптатов скелетных мышц с целью обнаружения дистрофин-позитивных волокон. Отсутствие дистрофин-позитивных волокон обнаружено у 11 из 13 обследованных, что позволило установить диагноз ПМДД/Б. В 2 случаях с выявленными дистрофин-позитивными волокнами у больных диагностирован аутосомно-рецессивный вариант ПКМД. Таким образом, на основании данных генеалогического и иммуногистохимического анализа количество случаев с аутосомно-рецессивными псевдогапертрофическими вариантами ПКМД увеличилось до четырех (см. таблицу 1).

Таблица 1. Распределение больных с изолированными случаями псевдогипертрофических ПМД, диагностируемых с помощью различных методов.

Метод диагностики ДНК-анализ Биохимический (повышение уровня КФК у матери больного) Иммуногистохим ический Всего

Количество семей (в%) 71 (74,7 %) 11 (11,6 %) 13 (13,7 %) 95 (100 %)

Таким образом, в обследованной нами выборке больных из России подавляющее количество случаев псевдогипертрофических вариантов ПМД у больных мужского пола представлено ПМДД, на долю которых приходится 96,7 % всех случаев заболеваний этой групп. Лишь в 3,3 % диагностировано наличие одного из аутосомно-рецессивных вариантов ПКМД.

Результаты проведенного исследования соответствуют таковыми, полученным в большинстве европейских популяций с низким уровнем инбридинга и позволяют сделать заключение о необходимости

первоочередного использования методов диагностики ПМДЦ у больных мальчиков с клиническими проявлениями псевдогипертрофических вариантов ПМД.

2. Особенности клинических характеристик аллельных вариантов ПМДЦ у больных мужского пола.

С целью выявления особенностей клинических и электромиографических характеристик вариантов ПМДЦ, обусловленных делениями в проксимальной и дистальной части гене дистрофина нами проведен сравнительный анализ частот встречаемости 18 наиболее типичных симптомов заболевания, а также возраста его манифестации. Сравнение этих показателей проведено в трех группах больных - с наличием делеции в проксимальной части гена, в дистальной части гена, а также с отсутствием делеции. Учитывая возраст-зависимую экспрессивность заболевания, характеризующуюся возможностью появления ряда клинических признаков по мере прогрессирования заболевания, нами проведен анализ тяжести течения заболевания у больных, включенных в каждую группу, на основании определения стадии миодистрофического процесса.

Анализ полученных результатов показал, что все три анализируемые группы больных были близки по численности, а также сопоставимы по количеству больных с 1, 2 и 3 стадиями заболевания, что дало возможность проведения корреляционного анализа в трех анализируемых группах больных без введения специальных поправок на различия в численности анализируемых групп.

В таблице 2 представлены результаты определения частот встречаемости основных клинических симптомов у больных трех проанализированных групп.

Таблица 2. Частоты встречаемости клинических признаков у больных с делеционными и неделеционными вариантами ПМДЦ

Наименование симптома Частота встречаемости признака в %

Группа 1 (п=31) Группа 2 (п=33) Группа 3 (п=44)

отсутствие коленного рефлекса 80,65 78,79 68,18

гиперлордоз поясничного отдела позвоночника 61,29 78,79 70,45

отсутствие карпо-радиалыюго рефлекса 54,84 36,36 40,91

отсутствие рефлекса с двуглавой мышцы 41,94 36,36 38,64

отсутствие ахиллова рефлекса 41,94 54,55 45,45

кардиопатия 29,03 42,42 47,73

снижение интеллекта 25,81 30,30 40,91

деформация грудной клетки 19,35 45,45 20,45

контрактуры голеностопных суставов 16,13 39,39 29,55

гипомимия, слабость лицевой мускулатуры 12,90 15,15 15,91

деформация стоп 9,68 27,27 11,36

контрактуры коленных суставов 6,45 21,21 9,09

контрактуры лучезапястных суставов 0 6,06 0

контрактуры локтевых суставов 0 18,18 6,82

контрактуры плечевых суставов 0 6,06 0

гипотрофия мышц лица 0 21,21 2,27

ожирение 0 3,03 2,27

фасцикуляции мышц 0 0 2,27

Полученные результаты не выявили значимых различий в спектре и частоте встречаемости основных фенотипических проявлений ПМДД в трех обследованных группах.

3. Клинические характеристики различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД у лиц женского пола.

Под нашим наблюдением находилось 19 больных женского пола (из 18 семей) в возрасте от 2 лет 8 мес до 40 лет с выраженными клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПМД. Известно, что наличие признаков заболевания у женщин может быть обусловлено, как манифестацией аутосомно-рецессивных вариантов псевдогипертрофических ПМД, так и возникновением заболевания у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина в результате количественных или структурных перестроек X-хромосомы. Всем больным женского пола проводилось исследование кариотипа с использованием дифференциальной в -окраски, молекулярно-генетический анализ, направленный на идентификацию несбалансированной

лайонизации Х-хромосомы в клетках крови, а также генеалогический анализ. Двенадцати больным, у которых используемые диагностические методы не позволяли уточнить генетический вариант, проведен иммуногистохимический анализ, направленный на идентификацию дистрофиновых волокон. В итоге -используемый комплекс диагностических методов позволил идентифицировать генетические варианты в рамках заданных критериев у всех больных женского пола.

Показано, что у 5 из 19 обследованных больных женского пола (26,3 %) возникновение выраженных клинических проявлений ПМД было обусловлено наличием мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. У одной пациентки клинические симптомы ПМД были обусловлены мозаичным вариантом синдрома Шерешевского-Тернера, а у 4 больных (21%) наблюдалась несбалансированная лайонизация Х-хромосомы, которая привела к преимущественной инактивации хромосомы, не несущей патологической мутации в гене дистрофина (Таблица 3).

Таблица 3. Распределение различных генетических вариантов в анализируемой группе псевдогипертрофических форм ПМД у больных женского пола.

Генетический вариант Клинические проявления у гетерозиготных носительниц Аутосомно-рецессивный вариант ПМД

Моносомия X Несбалансирован ная лайонизация Х-хромосомы Наличие дистрофина в мышечных волокнах Генеалогичес кий анализ

Количество больных 1 4 12 2

Учитывая полученные результаты, свидетельствующие о возможности возникновения выраженных клинических проявлений ПМДД у гетерозиготных носительниц, нами проведено клиническое, биохимическое и

электромиографическое обследование 43 облигатных носительниц из 40 семей в возрасте от 28 до 50 лет, не предъявлявших жалоб на момент осмотра.

Факт гетерозиготного носительства устанавливался на основании проведения генеалогическою анализа, свидетельствующего об Х-сцешенной рецессивной сегрегации заболевания и/иди обнаружения повышения уровня КФК в плазме крови. В результате проведения обследования клинические проявления обнаружены у 18 из 43 носительниц {см. рисунок 3),

Рисунок 3. Частота встречаемости отдельных клинических признаков у гетерозиготных носительниц.

2,30%

■ норма Н миопатия Ш миопатия+КМП ■ изолированная КМП

У И из 18 носительниц (61,1 %) выявлялись только миопатический симптомокомплеке наряду с умеренно выраженными псевдогипертрофиями икроножных мышц, у 6 больных (33,3 %) наблюдалось сочетание миопатического симптомов и кардиомиопатии. Лишь у I носительницы (5,5 %) были выявлены изолированные признаки кардиомиопатии.

4. Мед и ко-генетическое консультирование при

псевдогипертрофических вариантах ПМД.

Медико-генетическое консультирование (МГК) отягощенных семей является необходимым этапом при проведении обследования пробам до в с псе вдо ги пертрофи чески ми вариантами Г1КМД. МГК традиционно включает три основных этапа. Наиболее важным из них является первый, диагностический этап, от успешности проведения которого зависит эффективность

консультирования в целом. На основании результатов собственных исследований и анализа литературных данных нами усовершенствована методика проведения двух основных этапов МГК, направленных на диагностику и дифференциальную диагностику различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД и модифицированы таблицы расчетов риска рождения больного ребенка в семьях с аллельными вариантами ПМДД. Алгоритм диагностики у лиц мужского пола с клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПКМД представлен на рисунке 4. В абсолютном большинстве случаев псевдогипертрофических ПМД диагностический поиск будет ограничиваться предложенным алгоритмом.

Однако в части случаев (в нашей выборке количество таких больных не превышает 3 %) возникает необходимость продолжения диагностического поиска оставшихся четырех генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД. С этой целью нами предложен следующий алгоритм диагностики псевдогипертрофических ПМД с аутосомно-рецессивным типом наследования, который представлен на рисунке 5. Учитывая результаты собственных исследований, а также литературные данные, свидетельствующие об отсутствие значимых клинических, биохимических, электромиографических признаков, позволяющих уверенно дифференцировать ПМДД и псевдогипертрофические варианты ПМД, основой для предложенного диагностического алгоритма этой группы заболеваний явились литературные данные о частотах встречаемости отдельных генетических вариантов.

Нами показано, что 27,8 % обследованных больных женского пола возникновение выраженных клинических проявлений псевдогипертрофических вариантов ПМД было обусловлено наличием мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. В связи с этим дифференциальная диагностика у пациенток женского пола должна быть направлена в первую очередь на исключение гетерозиготного носительства патологической мутации в гене дистрофина (см. рисунок 6.)

Рисунок 4. Алгоритм диагностики у лиц мужского пола с клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПКМД.

Рисунок 5. Алгоритм диагностики псевдогипертрофических вариантов ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования.

Рисунок 6. Алгоритм дифференциальной диагностики различных вариантов псевдогипертрофических ПКМД у лиц женского пола.

4.3. Принципы расчетов риска возникновения ПМДД у потомков родственниц пробандов с различными аллельными вариантами заболевания.

При четком установлении генотипа матери пробанда и ее родственниц расчеты риска не представляют сложностей и проводят на основании типов образующихся гамет. Известно, что женщины-гетерозиготные носительницы мутаций имеют 50 % вероятность рождения больного сына или дочери-носительницы. Наибольшие сложности возникают при наличии единственного больного в семье, а генотип его матери установить не удалось, так уровень креатинфосфокиназы у нее был в пределах нормы. Традиционно, при расчетах вероятности носительства мутации в гетерозиготном состоянии у родственниц пробандов с Х-сцепленными-рецессивными заболеваниями используют теорему Байеса (расчеты риска с различной вероятностью возникновения 2-х независимых событий). В качестве априорной вероятности носительства женщиной патологической мутации в одном из генов Х-хромосом обычно принимают показатель в 4 ц (где ц- частота мутирования на гамету на поколение). Этот показатель складывается из частот мутирования в женских гаметах 2 ц и мужских 2у. При равной частоте мутирования в женских (ц )и мужских половых клетках (у) и фертильности больных £=0 (известно, что больные ПМДД не оставляют потомства) этот показатель принимается равным 4 ц. Используя этот показатель в качестве априорной вероятности при наличии единственного больного в семье и отсутствия родственников мужского пола по материнской линии, вероятность гетерозиготного носительства у матери пробанда оказывается равной 2/3 (66 %,) и риск рождения больного ребенка составляет 33 % (таблица 4).

Таблица 4. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда в спорадических случаях.

Вероятность Носительница Не носительница

Априорная 4ц 1-4ц«1

Условная 1/2 Ц

Совместная 2ц ц

Апостериорная 2/3 1/3

Однако в настоящее время стало ясно, что эти цифры должны быть уточнены, так как исследования ряда авторов показали, что для ряда генов, приводящих к Х-сцепленным рецессивным заболеваниям частота возникновения мутации в женских и мужских гаметах существенно различается. Показано, что возникновение точковых мутаций в гене дистрофина de novo в гаметах дедушек пробандов возникает в 40 раз чаще, чем бабушек по материнской линии. Принимая во внимание это обстоятельство, риск гетерозиготного носительства мутации в гене дистрофина у матерей пробандов с точно установленным диагнозом ПМДД и не имеющих делеции в гене дистрофина, значительно выше, чем считалось ранее. Продемонстрируем это заключение на примере родословной, представленной на рисунке 4.

Рисунок 4. Родословная

Таблица 5. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда с наличием точковой мутации при четко установленном диагнозе ПМДД.

Вероятность П2 носительница П2 не носительница

Априорная 82 ц 1-82 ц «1

Условная '/2 Ц

Совместная 41 ц Ц

Апостериорная 41/42 ц (97,6%) ц (2,4%)

Таким образом, вероятность гетерозиготного носительства мутации в гене дистрофина при наличии больного сына и отсутствия здоровых сыновей и братьев составляет не 66 % как можно было бы предполагать при равенстве частот мутации в женских и мужских гаметах а 97,6 %. Следовательно, повторный риск рождения у нее больного сына составляет 48,8 %. С другой стороны показано, что возникновение других частых мутаций - делеций и дупликаций - в гене дистрофина приблизительно в 3,3 раза чаще возникает в женских гаметах по сравнению с мужскими. Таким образом, в этих случаях V равно 0,3 ц и тогда априорная вероятность для П2 носительства мутации в гене дистрофина составляет 2,6 ц [2ц+ 2 (0,3 ц)]. Используя аналогичные расчеты, основанные на теореме Байеса получаем, что при отсутствии родственников пробанда мужского пола по материнской линии риск носительства для матери пробанда с ПМДД, обусловленного делецией или дупликацией в гене дистрофина составляет 56 %, а риск рождения больного сына составляет 28 % (Таблица 6.).

Таблица 6. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда с ПМДД, обусловленного делецией или дупликацией в гене дистрофина.

Вероятность Носительница Не носительница

Априорная 2,6ц 1-2,6 ц*1

Условная 0,5 И

Совместная 1,3 Ц И

Апостериорная 0,56 (56%) 0,44 (44%)

Таким образом, проведенные нами расчеты позволяют сделать вывод о том, что идентификация различных аллельных вариантов ПМДД с помощью методов ДНК анализа позволяет упростить процедуру идентификации генетического статуса родственниц пробанда по материнской линии и

оптимизировать процесс проведения пренатальной диагностики в отягощенных семьях.

Таким образом, разработанный диагностический протокол, регламентирующий и определяющий последовательность использования диагностических методов для дифференциальной диагностики ПМДД и саркогликанопатий, а также модификация расчетов риска носительства мутации в гене дистрофина позволят существенно повысить точность и эффективность проведения профилактических мероприятий в отягощенных семьях.

ВЫВОДЫ

1. На основании комплексного обследования выборки из 123 больных мужского пола из популяции центральных регионов России подсчитаны частоты встречаемости ПМДД и аутосомно-рецессивных саркогликанопатий. Показано, что 96,7 % случаев этой группы заболеваний приходится на долю ПМДД и лишь 3,3 % случаев представлено аутосомно-рецессивными саркогликанопатиями.

2. Установлено отсутствие статистически значимых различий в возрасте начала, частотах встречаемости клинических проявлений и уровне активности креатинфосфокиназы в плазме крови у больных мужского пола с ПМДД, обусловленной наличием делеций, локализованных в дистальных и проксимальных участках гена дистрофина, а также у больных ПМДД с отсутствием делеции в гене дистрофина.

3. Показано, что в группе больных женского пола с псевдогипертрофическими вариантами поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий саркогликанопатии составляют 77,8 %, а в 22,2 % случаев заболевание возникает у гетерозиготных носительниц мутаций в гене дистрофина, имеющих несбалансированную лайонизацию Х-хромосомы, не несущую патологический ген в клетках-мишенях.

4. Показано, что при проведении тщательного неврологического обследования миопатический симптомокомплекс с заинтересованностью

проксимальных мышц конечностей и/или признаки кардиомиопатии выявляется у 41,8 % облигатных носительниц, что требует назначения профилактического лечения, препятствующего манифестации клинических симптомов. Установлено отсутствие корреляцию! между наличием и степенью выраженности клинических проявлений у облигатных носительниц мутации в гене дистрофина и уровнем активности креатинфосфокиназы в плазме крови.

5. Предложены алгоритмы дифференциальной диагностики различных генетических вариантов псевдогипертрофических вариантов поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий. Установлено, что у 10,6 % (при идентификации только делеций) и у 4,2 % (при установлении делеций и дупликаций) больных мужского пола, а также у 78,6 % больных женского пола для уточнения диагноза необходимо использовать иммуногистохимический метод для обнаружения дистрофина в мышечных волокнах.

6. Модифицированы расчеты повторного риска возникновения ПМДЦ в отягощенных семьях в зависимости от типа мутации в гене дистрофина. Показано, что при наличии у больного с ПМДЦ делеции или дупликации в гене дистрофина в семьях с единственным пораженным риск рождения больного сына у матерей пробандов 28 %, а в случае наличия у пробанда точковой мутации - 48,5%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные алгоритмы диагностики и дифференциальной

диагностики и медико-генетического консультирования семей, отягощенных ПМДЦ и псевдогипертрофическими вариантами ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования у больных мужского пола, позволят существенно повысить эффективность работы практических врачей, занимающимися проблемами наследственных болезней нервной системы.

2. Выявленные особенности и спектр клинических симптомов у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина позволят

спланировать характер и объем диагностических методов, необходимых для их профилактики раннего выявления у родственниц больных.

3. Предложенная модель изучения группы генетически гетерогенных заболеваний, имеющих значительное сходство клинических проявлений, может быть использована для широкого круга наследственной патологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мальмберг С.А., Подагова Е.В. Молекулярные основы врожденных миопатий // Неврологический журнал. - 2005. - №. 1 - с. 50-55.

2. Подагова Е.В., Дадали E.JL, Мальмберг С.А., Кузнецов А.Б., Шаркова И.В. Особенности диагностики псевдогипертрофических вариантов поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий // Неврологический журнал. - 2007. - № 1. - с.24-28.

3. Дадали Е. JL, Мальмберг С. А., Подагова Е.В., Кузнецов А. Б., Максин Д.А. Псевдогипертрофические поясно-конечностные мышечные дистрофии у детей: алгоритм диагностики // Российский медицинский журнал.- 2007. - №3. - с..

4. Дадали E.JL, Мальмберг С.А., Подагова Е.В., Поляков A.B., Петрухин A.C. Особенности клинических проявлений прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина // Неврологический журнал. - 2007. - № 3. - с..

5. Подагова Е.В., Мальмберг С.А., Дадали Е.Л. Псевдогипертрофические прогрессирующие мышечные дистрофии: алгоритмы диагностики // XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Тезисы. -М. - 2007.

Заказ № 636. Объем 1п.л. Тираж 1 ООэкз. Отпечатано в ООО «Петроруш» г.Москва,ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru