Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Прямое распознавание молекул главного комплекса гистосовместимости в иммунном ответе на клетки аллогенных опухолей

ш

На правах рукописи

КАЗАНСКИЙ ДМИТРИЙ БОРИСОВИЧ

ПРЯМОЕ РАСПОЗНАВАНИЕ МОЛЕКУЛ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ НА КЛЕТКИ АЛЛОГЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

14.00.14- онкология

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических на^к

Москва 2005

Работа выполнена в ГУ Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН

Консультант: доктор мед. наук, профессор Ярилин A.A.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе З.Г. Доктор биологических наук, профессор Апт A.C. Доктор биологических наук, профессор Галактионов В.Г.

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится _^

На заседании диссертационного совета

^/ч6* д о^л

_ 2005 года

По адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе 24. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

Li

ЪЧ-&ЪЪ

%%

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

Хорошо известно, что инициация первичного иммунного ответа осуществляется профессиональными аитигенпрезентирующими клетками (АПК). Вместе с тем это положение вошло в очевидное противоречие с базовым феноменом, положившим начало развитию клеточной иммунологии, - отторжением аллогенных опухолей, клетки которых лишь в редких случаях способны выполнять функции профессиональных АПК. Возможность прямого распознавания аллогенных молекул МНС, в котором рецептор Т-лимфоцита распознает интактную чужеродную молекулу МНС на поверхности аллогенных опухолевых клеток, хорошо объясняет специфичность их отторжения, но делает неясным источник костимуляторных сигналов, необходимых для дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Возможность непрямого распознавания аллоантигена, процессированного и представленного в комплексе с молекулами МНС на поверхности АПК реципиента, ставит вопрос о специфичности индуцированных Т-клеток и их возможной кросс-реактивности с аллогенными молекулами МНС.

Иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей в эксперименте является одним из немногих примеров успешного распознавания опухолевых клеток иммунной системой хозяина и их последующего отторжения. Идентификация механизма распознавания молекул главного комплекса гистосовместимости аллогенных опухолей может дать важную информацию об особенностях этого типа иммунного ответа, отличающих его от иммунного ответа на аутологичные опухоли. Понимание механизмов, лежащих в основе его высокой эффективности, может быть важным для разработки новых подходов к иммунотерапии опухолей в клинике.

1.2. Цель и задачи исследования

Данная работа имеет целью определение роли и молекулярных основ прямого аллогенного распознавания в иммунном ответе на клетки аллогенных опухолей. Для

достижения этой цели были поставлены следующие задачи: (1) Характеристика клеток врожденного иммунитета, вовлеченных в ответ на аллогенные опухолевые клетки и способных быть возможным источником костимуляторных сигналов для Т-лимфоцитов. Оценка их зависимости от распознавания трансплантационных антигенов опухолевых

" РОС ЧДИП'НАЛЬМАИ

Г.~г IИ('ТЦ(А у, С i'^Tcp&y^r

(2) Проведение теоретических и экспериментальных исследований, направленных на выяснение механизмов распознавания трансплантационных антигенов опухолевых клетбк Т-лимфо-цитами.

(3) Экспериментальная оценка нового метода определения функциональной активности клеток памяти CD8+, их специфичности, биологических особенностей и новых путей клонирования.

(4) Проведение теоретических и экспериментальных исследований по поиску эпитопов, определяющих консервативные взаимодействия молекул МНС с TCR, моделирование их оптимальной структуры и исследование биологической активности.

(5) Оценка возможности управления процессами внутритимусной селекции синтетическими конструкциями, представляющими собой древовидные пептиды с последовательностью фрагментов молекул МНС класса I.

1.3. Научная новизна

Эксперименты по исследованию механизма распознавания клеток аллогенных опухолей Т-лимфоцитами CD8+ показали, что ведущим механизмом распознавания ими аллоантигенов является прямое аллогенное распознавание. Впервые показано, что в ответ на иммунизацию клетками аллогенных опухолей в селезенке реципиентов имеет место накопление особой популяции нейтрофилов, экспрессирующих CD80 и молекулы МНС класса II. Эта реакция зависит от распознавания молекул МНС класса I Т-клетками CD8+ и имеет место у животных с нокаутированными генами CD40 и CD4, что может свидетельствовать о ее независимости от АПК реципиента.

Разработан метод селективного тестирования клеток памяти CD8+ по пролиферации в ответ на стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку. Впервые показано, что роль АПК в пролиферативном ответе клеток памяти на аллоантигены опухолевых клеток пассивна и сводится к предоставлению спектра костимуляторных сигналов, необходимых для индукции ответа Т-клеток. Показана способность клеток памяти подавлять ответы наивных Т-клеток in vitro и in vivo. Получен долгоживущий клон Т-клеток памяти CD8+, охарактеризована его специфичность,

определен спектр продуцируемых цитокинов и первичная структура реаранжированных регионов цепей Т-кяеточного рецептора. Анализ специфичности Т-клеточных гибридом, полученных из клеток памяти CD8+, показал, что их ответ на иммунизирующую аллогенную молекулу МНС подавляется антителами, специфичными к ней, но не к молекулам МНС класса I реципиента. Этот факт указывает на прямое распознавание аллоантигена Т-клетками и противоречит гипотезам как о непрямом примировании аллореактивных Т-клеток, так и и их кросс-реактивности с молекулами МНС реципиента. В реакции на стимуляторы мышей-нокаутов по генам ТАР и 02-микроглобулина, показано, что распознавание является прямым и зависит от пептидов, связанных с аллогенной молекулой МНС.

Определен мотив в первичной структуре классических молекул МНС класса I млекопитающих и охарактеризована вариабельность всех аминокислотных остатков доменов он и аг. В регионе аномальной укладки a-спирали домена аг обнаружен участок максимального сходства с молекулами МНС класса II. Синтез последовательности этого участка в виде древовидных пептидов позволил получить конструкции, способные активировать Т-клетки CD4+ in vivo и усиливать ответы Т-лимфоцитов реципиентов на слабо иммуногенные аллельные формы молекул МНС класса I. Подкожная иммунизация тетрамерами АА158-175 молекул МНС класса I приводит к достоверному продлению жизни реципиентов bm1 (Kbm1lbDb), получивших летальную дозу клеток тимомы EL4. С использованием органных культур эмбрионального тимуса показана способность синтезированных конструкций влиять на процессы формирования репертуара Т-лимфоцитов. Отсутствие МНС-рестрикции действия тетрамеров свидетельствует о возможности их использования как адъювантов для стимуляции ответа на слабо иммуногенные антигены.

1.4.Научно-практическая значимость исследования

Результаты данной работы могут быть использованы как в области фундаментальных, так и прикладных исследований. Полученные данные способствуют углубленному пониманию биологии клеток памяти и механизмов взаимодействия Т-клеточного рецептора с молекулами МНС. Они могут быть использованы для исследований структурных основ взаимодействия TCR с молекулой МНС, процессов активации и внутритимусной селекции Т-клеток. Полученная информация о консервативных эпитопах молекул МНС, взаимодействующих с TCR,

создает фундаментальную основу для разработки новых типов вакцин, способных стимулировать клеточный иммунитет и управлять разнообразием репертуара Т-клеток. Практическое использование синтезированнных конструкций может иметь значение для иммунотерапии опухолей человека, повышения эффективности существующих и создания принципиально новых типов противоопухолевых вакцин.

1.5. Апробация работы

Диссертационная работа прошла апробацию 10 декабря 2004 года на совместной конференции лабораторий иммунохимии, противоопухолевого иммунитета, иммунологии онкогенных вирусов и механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН. Результаты работы представлены на заседаниях Ученого Совета НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН и Объединенного Ученого Совета ГУ РОНЦ РАМН. Материалы работы были представлены на Российских и международных конференциях и симпозиумах. По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 20 - в рецензируемых научных журналах, 5 статей представлены в сети Интернет http://kazan-skyl .narod.ru/pubol.html.

1.6. Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 368 страницах машинописного текста и включают 50 рисунков, 45 таблиц и список литературы из 549 источников.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен описанию основных закономерностей функционирования трансплантационного и противоопухолевого иммунитета, структурных аспектов распознавания антигенов Т-лимфоцитами, процессов раннего развития Т-лимфоцитов и их дифференцировки на периферии. Приводятся данные, указывающие на связь процессов внутритимусной негативной селекции с неспособностью иммунной системы к ответу на опухолеассоциированные антигены.

2.2. Материалы и методы

Животные. В работе использованы мыши C57BL/6 (Kbl-AbDb), C57BL/10 (Kbl-AbDb), B10.D2 (Kdl-Adl-EdDdLd), B10.D2(R101) (Kdl-Adl-EdDb), B10.A (Kki-Akl-EkDdLd), B10.A(4R) (Kkl-Akl-Ek/bDb), B10.A(3R) (Kbl-Abl-Eb/kDdLd), B10.MBR (Kbl-Akl-ElW), B10.AKM (Kkl-Akl-ElW), B10.M (K'I-A'D'), C3H (Kkl-Akl-EkDk), B6.C-H-2bm1(Kbm1l-AbDb), C57BL/6J-H-2bm3 (Kbm3l-AbDb), B6.C-H-2bm4(Kbm4l-AbDb), B6.C-H-2bm12 (Kbl-Abm12Db) разведения вивария Российского онкологического научного центра РАМН. Нокауты по молекулам Эг-микроглобулина - C57BL/6J-B2mm1Unc (H-2b), транспортеров, ассоциированных с процессингом (ТАР) - C57BL/6J-Тар ftmlArp, а-цепи TCR - C57BL/6J-TCRatm,Mom (Н-2b), CD4 - B6.129S2-Cd4tm1Mak, CD8 - B6.129S2-CdSafm,Mak , CD40 -B6A29P2-Tnfrsf5tm1Kik были получены из Jackson Laboratory (Bar Harbor, Main, USA) и поддерживались в лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН. Поддержание и генотипирование генетически модифицированных животных проводили в соответствии с инструкциями, размещенными на web-сайте Jackson Laboratory - http://www.jax.org/imr/tech_info.html. Для получения мышей B10.D2 (R101), экспрессирующих трансген зеленого белка (green fluorescent protein - GFP) под контролем актинового промотора, мышей C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)10sb, скрещивали с мышами B10.D2(R101), а гибридов первого поколения подвергали возвратному скрещиванию с той же родительской линией. Во втором поколении селекцию гомозигот B10.D2(R101), экспрессирующих трансген, проводили по выживанию после внутрибрюшинного введения 2 х 107 клеток тимомы EL4 (KbDb). Наличие трансгена у животных определяли по зеленой флуоресценции открытых участков тела на УФ-трансиллю-минаторе.

Клеточные линии. Клетки саркомы MC-11 (KbDb) и тимомы EL4 получали в асцитной форме, трансплантируя их в количестве 3-5 х 106 сингенным мышам C57BL/10 соответственно. Клетки тимомы BW5147 (KkDk), мастоцитомы Р815 (KdDd) пассировали in vitro в среде-RPMI-1640 с добавлением 4 ммоль L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В некоторых экспериментах клетки тимомы EL4 перед иммунизацией вели в культуре in vitro в течение 4-5 пассажей. В тех же условиях культивировали линии трансформированных мышиных фибробластов bmlSV (Kbm1Db), bm3SV (Kbm3Db) , C57SV (H-2b), BRSV (H-2k), D2SV (H-2d), MSV (H-2f), SSV (H-2S). Как источник

мышиного IL-2 использовали линию EL4 с высокой спонтанной продукцией этого цитокина (линия любезно предоставлена профессором А. В. Червонским, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Main, USA). Линию поддерживали в среде DMEM с добавлением 4 мМ L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для определения концентрации IL-2 использовали тест, основанный на измерении катаболизма МТТ клетками IL-2-зависимой линии CTLL-2 с незначительными модификациями [Sladowski D.,'et al., 1993]. Линию CTLL-2 поддерживали в среде RPMI-1640 с добавлением 4 ммоль L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 5 МЕ/мл IL-2. Линию BWZ.36 CD8 alpha использовали с любезного разрешения доктора N. Shastri (Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley 94720-3200, USA)

Линии и клоны клеток памяти получали методом лимитирующих разведений популяции клеток памяти, обогащенной в течение 10 дней в MLR с прогретыми стимуляторами. Для этого клетки собирали, очищали от погибших клеток центрифугированием на ступенчатом градиенте плотности фиколла-верографина с плотностью 1,09 и затем клонировали методом лимитирующих разведений в лунках плоскодонных 96-луночных планшет, содержащих фракцию аллогенных облученных спленоцитов, прилипающих к пластику, и 10 МЕ/мл мышиного IL-2. Рестимуляцию растущих клонов проводили каждые 8-10 дней. Цитолитическую активность против тимом EL4, BW5147 и мастоцитомы Р815 определяли, используя модификацию теста Винна in vitro с МТТ [van de Loosdrecht A.A., et al., 1991].

Антитела. В работе использованы следующие антитела фирмы Pharmingen (USA) : анти-СОЗе-FITC (Cat. No. 01084A), анти-CD4-PE (Cat. No. 09425A), анти-С08-АРС (Cat. No. 01049A), анти-CD11 b-PE (Cat. No. 01715A), анти-CDI 1c-FITC (Cat. No. 09704A), анти-С031-PE (Cat. No. 01955B), анти-CDeO-FITC (Cat. No. 09604D), анти-NKI. 1 -PE (Cat. No. 01295A), анти-TCRp chain-FITC (Cat. No. 01304A), анти-ТСЯуб-РЕ (Cat. No. 01315A), aH™-CD45R/B220-PE (Cat. No. 01125A), энти-rat Ig (mouse adsorbed)-FITC (Cat. No. 12314D). В качестве источника антител к молекуле Аь использовали супернатант гибридомы Y3JP, к молекуле Ly6G (Gr-1) - супернатант гибридомы RB6-8C5, молекуле NK1.1 - супернатант гибридомы РК136. Антитела к иммуноглобулинам мыши, меченные FITC (Cat. No. F1010), и вторичные антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулинов

мыши, меченные FITC (Cat. No. F2772), приобретены у фирмы Sigma (USA). Антитепа к маркеру макрофагов F4/80, меченные FITC, любезно предоставлены Т. Duffy (Jackson Laborarory, Main, USA). В качестве источника моноклональных антител к антигенам CD4 и CD8 Т-лимфоцитов мыши использовали сулернатанты гибридом GK1.5 (lgG2a) и 3.168 (lgG2a) соответственно, которые применяли для разделения клеток методом комплементзависимого цитолиза с комплементом кролика, отобранным на высокую специфическую и низкую спонтанную литическую активность. Антитела к мышиному CD3 (Clone 145-2С11) использовали в виде супернатанта гибридомы.

Синтетические древовидные (мультиплетные) пептиды получены методом твердофазного синтеза с последующей очисткой методом обратнофазовой HPLC и лиофилизацией Л. Ю. Скляровым в Институте иммунологии Минздрава РФ. Были синтезированы древовидные тетрамеры последовательностей из контактного эпитопа 158175 домена аг молекул МНС класса I мыши - H-2Db, Н-2К\ Н-2КЬ и Н-2Db с инвертированной последовательностью аминокислотных остатков. Выбор контактной области домена аг для синтеза мультиплетных конструкций был продиктован его гомологией с ß-цепями молекул МНС класса II и пространственной локализацией гомологичного участка в С-концевой области а-спирали молекул класса II.

Иммунизацию мышей проводили внутрибрюшинной инъекцией каждому животному 25 х 10е клеток аллогенной опухоли. Через 2 месяца после иммунизации спленоциты таких мышей использовали в экспериментах как источник клеток памяти. Мультиплетные пептиды вводили подкожно в дозе 100 мкг.

Приготовление клеточных суспензий. Стимулирующие (стимуляторы) и отвечающие лимфоциты (респондеры) выделяли из селезенок мышей в гомогенизаторе Поттера с коническим пестиком осторожным выдавливанием из стромы органа. Для разделения субпопуляций Т-лимфоцитов методом комплементзависимого цитолиза в качестве отмывочной среды использовали 0,2% раствор БСА (Sigma, USA, Cat N 84F-9435) в среде RPMI-1640 (Институт полиомиэлита и вирусных энцефалитов, Москва). Жизнеспособные клетки подсчитывали в смеси трипанового синего и эозина.

Реакция MLR. Для постановки MLR 3 х 105 респондеров мышей B10.D2(R101) или C57BL/6 инкубировали в присутствии аллогенных и сингенных стимуляторов в полной среде: RPMI-1640 с добавлением

5% сыворотки человека, 0,016% гентамицина сульфата (Производственное объединение "Мосхимфарпрепараты"), 4 ммоль L-глутамина (Serva), 20 ммоль HEPES (Sigma) и 5 х 10"5 M 2-меркаптозтанола (Merck) при различных соотношениях респондеров и стимуляторов при 37°С в атмосфере с 5% СОг и абсолютной влажностью [Brondz B.D., et at., 1995].

Для постановки вторичной MLR клетки памяти обогащали в первичной MLR с прогретыми аллогенными стимуляторами в течение 10 дней, собирали, очищали от погибших клеток центрифугированием на ступенчатом градиенте плотности фиколла-верографина с плотностью 1.09 и затем в количествах от 6-48 х 103 помещали в лунки плоскодонных 96-луночных планшет, содержащие 2 х 10е облученных либо прогретых стимуляторов в присутствии либо в отсутствие облученных спленоцитов, прилипающих к пластику и/или 10 МЕ/мл мышиного IL-2. Через 3 суток инкубации интенсивность пролиферации (СРМ) определяли по включению [3Н]-тимидина в течение 18 ч. Аллогенный ответ подсчитывали как разность между включением [3Н]-тимидина в культуры с аллогенными и сингенными стимуляторами. Индексы стимуляции (ИС) подсчитывали как отношение этих величин.

Культуру MLTC готовили сходным образом, используя метод [Kedar Е., et al., 1984] с незначительными вариациями.

Получение и тестирование специфичности Т-клеточных гибридом. Т-клетки памяти, обогащённые в ответе на прогретые стимуляторы в течение 4 дней, и клетки BWZ.36 CD8 alpha отмывали два раза в среде без сыворотки. Затем смешивали в соотношении 3:1 в плоскодонных стеклянных флаконах, центрифугировали 4 мин. 1500 g и инкубировали 20 мин. при 37°С в СОг-инкубаторе. После этого удаляли супернатант и добавляли 50% раствор полиэтиленгликоля PEG-1500 (Merck) в 75 мМ HEPES, рН 7,0, предварительно нагретый до 37°С, на 70 секунд. Затем три раза отмывали средой без сыворотки по 2 мин. при 1000 д. После последней отмывки добавляли 20 мл среды с сывороткой и инкубировали 45 мин при 37°С в СОг-инкубаторе. Затем клетки подсчитывали и суспензию помещали "в 96-луночные планшеты в концентрации 0,4 млн/мл. Через 2 суток среду в лунках замещали селективной средой, содержащей HAT, а через 2 недели выросшие клоны переводили в селективную среду, содержащую НА. Тестирование Т-клеточных гибридом проводили, помещая гибридомные клетки в лунки плоскодонных планшет, содержащие АПК, экспрессирующие различные аллельные формы МНС. Через сутки планшеты замораживали и впоследствии

тестировали супернатанты по способности поддерживать рост и жизнеспособность клеток линии CTLL-2 [Sladowski D., et al., 1993].

Обработка стимулирующих клеток. Стимуляторы облучали в дозе 25 Гр. Прогревание стимулирующих клеток проводили в водяной бане, поддерживающей температуру с точностью 0,2°С. Острый тепловой шок индуцировали инкубацией при 45°С в течение 60 мин. В ряде экспериментов использовали популяции обогащенных профессиональных АПК. Для их получения облученные спленоциты в полной среде помещали в культуральные полистиреновые плоскодонные планшеты из расчета 5 х 104 мононуклеаров селезенки на 1 мм2 поверхности пластика и инкубировали в течение 2 ч. После этого клетки, неприкрепившиеся к пластику, удаляли 3-кратной отмывкой средой, подогретой до 37°С.

Органные культуры эмбрионального тимуса (FTOC). Неповрежденные доли тимуса, выделенные из 14-дневных эмбрионов помещали в полную среду, содержащую 10% ЭТС, в трансвеллы с размером пор 0,45 мкм (Costar) и добавляли древовидные пептиды до нужной концентрации. Среду меняли каждые 48 час. После недельной инкубации при 37°С в атмосфере СОг доли тимуса аккуратно гомогенизировали и выделенные клетки окрашивали антителами нужной специфичности для последующего анализа на проточном цитофлуориметре.

RT-PCR. Для определения экспрессии генов HSP70.1 и В7-1 суммарную РНК экстрагировали из культивируемых клеток в количестве 6 х 105 общепринятым методом [Chomczynskí Р., Sacchi N., 1987] с небольшими модификациями. Выделенную РНК растворяли в деионизованной воде. Для защиты от РНКаз в раствор РНК вносили RNAzine (Promega) в количестве 80 ед. на 100 мкл. Стандартная реакционная смесь для обратной транскрипции с конечным объемом 10 мкл содержала 67 ммоль Трис-HCI, рН 8.8 (при 25°С), 16.6 ммоль (NH4)2S04, 1 ммоль МпС1г, 200 мкмоль каждого dNTP, 20 пмоль праймера, антисмыслового или смыслового (контроль), 8-500 нг суммарной РНК, 4 ед. ДНК-полимеразы Tth. Реакционную смесь инкубировали 10 мин при 70°С. После проведения обратной транскрипции в пробирку добавляли 40 мкл смеси для PCR, содержащей 67 ммоль Трис-HCt, рН 8.8 (при 25°С), 16.6 ммоль (NH4)2S04, 3,5 ммоль МдС1г, по 200 пмоль каждого dNTP и 20 пмоль дополняющего праймера. После денатурации (5 мин при 95°С) проводили 30-37 циклов PCR со следующими режимами: 94°С,45 с, 55°С, 45 с, 72°С, 90 с. После

Таблица 1. Структура праймеров, использованных для определения экспрессии цгаопшоа и косташулжторов

Наименование Структура праймеров Размер продукта, b

GAPDH AS-5'-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC- 3' S-5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG - 3' 528

ИЛ-2 AS- 5'-TGATGAAATTCTCAGCATCTTCCA-3' S-5'-GACACTTGTGCTCCTTGTCAACAG-3• 329

ИЛ-4 AS-5'-TGCATGATGCTCTTTAGGCTTTCC-3' S-5'-AGATCATCGGCATTTTGAACGAGGTC-3' 313

ИЛ-10 AS-51-AAAATCACTCTTCACCTGCTCCAC-3' S-5 *-GGACAACATACTGCTAACCGACTC-3' 256

IFNf AS-5'—GGACAATCTCTTCCCCACCCCGAA-3' S-5'-AGCTCTGAGACAATGAACGCTACA-3' 504

TNFa AS-5'-GCTGAGTTGGTCCCCCTTCTCCAG-3' S-5'-AGTGGTGCCAGCCGATGGGTTGT-3' 252

TGFßi AS-5'-ATCCACTTCCAACCCAGGTCCTT-31 S-5'-AGGAGACGGAATACAGGGCTTTCG-3' 303

SCF AS-5'-ACTGCTACTGCTGTCATTC-3' S-5'-TCTTCAACTGCTCCTATTT-3' 562

GM-CSF AS-5'-CTCGTTTGTCTTCCGCTGT-3' S-5'-TCCTGGGCATTGTGGTCTA-3' 584

Перфорин AS-5'-CTGTAAAAACTCCCTAATGAGA-3' S-5'-AGTCAAGGTGGAGTGGAGGTTT-3' 353

CTLA-4 AS-5'-CAGTCATTTGGTCATTTGTCTGC-3' S- 5'—TTGTAGCCCTGCTCACTCTTC-3' 183

CD80 AS-5'-TCAAAGGTCCCCAGAACTCT-3' S-5'-CACCTCACTGTGTTCTAGTGT-3' 194

FasL AS-5 * —TCCTCCATTAGCACCAGATCC-3 ' S-5'-AGAAGGAACTGGCAGAACTCC-3' 358

CD40L AS-51-TGCTTTTCATGGTATAATATC-3' S-5'-CTGTGTATCTTCATAGAAGATTGG-3' 321

завершения PCR 10 мкл реакционной смеси наносили на 2% гель агарозы, содержащий бромистый этидий и разделяли электрофорезом в Трис-боратном буфере в режиме 8 В/см в течение 45 мин. Гели фотографировали и анализировали, используя УФ-трансиллюминатор. Результатат считали положительным, если после 30 циклов можно было наблюдать образование видимой электрофоретической полосы амплифицированного продукта и отрицательным, если продукт не обнаруживался после 37 циклов.

Для определения экспрессии и клонирования вариантов

TCR осадок 5-10x10® клеток лизировали 0,75 мл реагента TRIZOL LS (GibcoBRL, USA) 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 0,2 мл хлороформа и хорошо перемешивали, инкубировали 2-15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали (12000д, 15 мин) на центрифуге с охлаждением. После центрифугирования в бесцветную часть раствора, содержащую РНК, добавляли 0,5 мл изопропилового спирта, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и осаждали (12000д, 15 мин) на центрифуге с охлаждением. Осадок РНК промывали 70% раствором этанола и растворяли в воде. Синтез кДНК: 10 мкг РНК ресуспедировали в 15,5 мкл НгО (обработанной DEPC), инкубировали при 65°С 5 мин и затем охлаждали на льду 2 мин. Раствор обратной транскриптазы в количестве 14,5 мкл, который содержал 1 мкл (U/мкл) Superscript RT (Promega, USA), 1 мкл RNase inhibitor (40и/мкл), 6 мкл 5х буфера, 3 мкл DTT (100 тМ), 1,5 мкл dNTPs (10 тМ каждого) и 2 мкл oligo dT (0,5 мг/мл), добавляли в приготовленный раствор РНК и инкубировали 45 мин при 42°С. На ПЦР использовали 2-3 мкл полученного раствора кДНК. Структура праймеров и условия RT-PCR описаны в [Casanova J.L., et at., 1991]. После завершения PCR реакционную смесь наносили на 2% гель агарозы, содержащий бромистый этидий, и разделяли электрофорезом в Трис-боратном буфере в режиме 8 В/см в течение 45 мин. Гели фотографировали и анализировали, используя УФ-трансиллюминатор, оборудованный CD-камерой. Амплифицированные продукты клонировали с использованием ТА-вектора с последующим выделением плазмидной ДНК и секвенированием в ЦКП "Геном" Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта. Результаты секвенирования анализировали с помощью программ Chromas v. 1.45, DNAssist v. 1.0 и программы BLAST в режиме on-line.

Определение мотивов в первичной структуре молекул МНС. В работе проанализировано 18 аллельных форм классических молекул МНС класса I мыши (Mus musculus), 197 - человека (Homo sapiens), 8 - быка (Bos taurus), 4 - собаки (Canis familiaris), 10 - кошки (Felis catus), 11 - лошади (Equus caballus), 8 - крысы (Rattus norvegicus), 15 -макаки-резуса (Macaca mulatta), 3 - кролика (Oryctolagus cuniculus), 1 -пятнистого тюленя (Phoca vitulina), 9 - голубого коала (Phascolarctos cinereus), 5 - кенгуру Бенетта (Macropus rufogriseus), 3 - серого короткохвостого опоссума (Monodelphis domestica), 28 - курицы (Gallus galfus), 5 - африканской шпорцевой лягушки

(Xenopus laevis), 5 - zebra fish (Danio rerio), 38 - куньей акулы (Triakis scy-llium), полученных из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Проанализированы также неклассические молекулы МНС класса I: 19 форм мыши, 9 - человека, 3 - свиньи (Sus scrofa), 1 - обезьяны (Saguinus oedipus), 5 - крысы (Rattus norvegicus). Для определения мотивов и поиска гомологий использована программа BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.html). Пространственную локализацию аминокислотных остатков определяли с помощью программы Cn3D. Дополнительная независимая группа классических молекул МНС класса I включала: 47 последовательностей свиньи (Sus scrofa), 1 - золотистого хомячка (Mesocricetus auratus), 4 - овцы (Ovis aries), 1- гепарда (Acinonyx jubatus), 2 - леопарда (Leopardus pardalis), 3 - малого двурогого носорога (Diceros bicornis minor).

Проточный цитофлуориметрический анализ. Субпопуляции клеток, окрашенные в соответствии с рекомендациями производителя, анализировали на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) с использованием программы CellQuest. Погибшие клетки исключали из анализа по окрашиванию йодистым пропидием (PI) и по показателям прямого и бокового рассеивания. Анализировали не менее 200 тыс. событий для идентификации гранулярных и адоптивно перенесенных клеток, 40 тыс.- для описания субпопуляций тимуса, 10 тыс.-для характеристики периферических популяций Т-лимфоцитов и культур in vitro. Для определения соотношения числа диплоидных и гипо-диплоидных клеток их фиксировали охлажденным 96° этанолом в соотношении 3:1 к клеткам, ресуспендированным в PBS (4°С, 1 час.). Клетки окрашивали йодистым пропидием в конечной концентрации 7,5-10'5 M в присутствии РНКазы в концентрации 40 мкг/мл (37°С, 20 мин.). Для анализа результатов использовали программу WinMDI 2.8.

Статистическая обработка. Для каждой экспериментальной группы подсчитывали среднее арифметическое и среднюю ошибку выборки. Оценку достоверности различий между средними проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

2.3. Результаты работы

2.3.1. Роль аллогенного распознавания в индукции реакций врожденного иммунитета

При цитофлуориметрическом анализе большого числа мононуклеаров селезенки (более 200 тыс. событий) мышей C57BL/6 ' (Кь1ьОь), иммунизированных живыми клетками мастоцитомы Р815

(KdDd), на плотах, характеризующих распределение плотности кле ток с различными показателями прямого и бокового рассеивания , (density plots), обнаруживается дополнительная популяция клеток с

повышенной гранулярностью. Исследование динамики "грануляр ного ответа" показало, что его пик имеет место на 6 день после иммунизации. По данным пяти независимых экспериментов на этот день доля гранулярных клеток в селезенке возрастает в пять раз - с 1,91 ± 0,48% у неиммунизированных животных до 10,03 ± 3,38% (М ± SE) на пике ответа иммунизированных (Рис. 1). С целью идентификации гранулярных клеток спленоциты иммунизированных животных окрашивали антителами к маркерам различных популяций клеток, участвующих в иммунном ответе, и анализировали мето дом проточной цитофлуориметрии. Результаты, представленные на Рис. 2 показывают, что анализируемые клетки не экспрессируют В-клеточных маркеров IgM и В220, Т-клеточных маркеров CD3, р- и 6-цепей TCR, маркера дендритных клеток CD11с, маркера естественных киллеров NK1.1 и маркера макрофагов F4/80. На них обнаруживается слабая экспрессия молекул МНС класса II и костимулятора В7-1 (CD80). Для исследуемой популяции клеток характерна экспрес сия CD 11b (Мас-1) и маркера клеток миелоидного ряда Gr-1. Гранулярные клетки не экспрессируют маркер CD31, утрата которого характерна для нейтрофилов, активированных в процессе воспаления и способных к проникновению в ткани. Морфологическое исследование клеточного состава селезенки интактных и иммунизированных животных, окрашенных по Романовскому-Гимза, показало увеличение процента нейтрофилов с 1,95 ± 0,06% у интактных до 13,83 ± 4,43% у иммунных животных. Таким образом, анализируемые клетки обладают фенотипом нейтрофилов, активированных в процессе воспаления. "Гранулярный" ответ развивается на аллоантигены не только опухолевых, но и нормальных аллогенных клеток. Результаты, сходные с описанными выше были нами получены при внутрибрюшинной иммунизации мышей нормальными аллогенными спленоцитами в дозе

ssc

Интактпые Rl-1,91 ±0,48%

Иммунные Rl-10,03 ± 3,38%

FSC

Рис. 1. Результаты анализа прямого и бокового рассеивания популяций спленоцитов интактных мышей C57BL/10 и мышей, иммунизированных 2 х 107 клеток мастоцитомы Р815, методом проточной цитофлуориметрии (FACS).flo оси абсцисс - интенсивность прямого рассеивания (FSC), по оси ординат - интенсивность бокового рассеивания (SSC) индивидуальными анализируемыми клетками. Результаты представлены как распределение по плотности анализируемых событий в каждой точке координат на графике (density plots). Хорошо видно появление дополнительного "ядра" клеток с повышенными показателями бокового рассеивания.

1 х 10®, а также в ответ на инъекцию Т-клеточного митогена конканавалина А. Сходная популяция клеток обнаруживается в ответе на классический индуктор врожденного иммунитета - липополи-сахарид. Реакция отсутствует при иммунизации бараньими эритроцитами или аллогенными опухолевыми клетками, убитыми замораживанием-оттаиванием (данные не представлены).

Для выяснения генетических условий возникновения "гранулярного" ответа в качестве реципиентов использовали мышей, экспрессирующих различные гаплотипы МНС, в том числе мышей линий, конгенных по МНС. Из результатов, представленных в Табл. 2. видно, что иммунный ответ на клетки тимомы Е1.4 (КЬ0Ь) отсутствует у мышей С57В1./10 и С57В1./6 (КЬ0Ь) которые хотя и не являются конгенными, почти полностью идентичны по экспрессии широкого

ряда аллельных форм главных и минорных антигенов гистосов-местимости. Вместе с тем, у мышей рекомбинантной линии B10.D2 (KdldDd), конгенной по МНС линии C57BL/10, но отличающейся от иммунизирующих клеток экспрессией двух аллельных продуктов МНС класса I (молекулы Kd и Dd вместо Кь и Db), развивается интенсивный иммунный ответ. Заметно более низкий ответ развивается у мышей B10.D2(R 101) (KdldDb), отличающихся от иммунизирующих клеток экспрессией только одного аллельного продукта (Kd вместо Кь). "Гранулярный" ответ на клетки тимомы EL4 обнаруживается также у мышей серии bm-мутантов. Наиболее высокий ответ развивается у мутантов ЬтЗ и Ьт1, представляющих собой высокоиммуногенные мутантные варианты молекулы МНС класса I Н-2КЬ. Ответ не наблюдается у мутанта Ьтб, имеющего наименьшие антигенные отличия от молекулы Н-2КЬ мышей C57BL/6. Ответ на клетки тимомы EL4 не обнаруживается также у мышей bm12, экспрессирующих измененную молекулу МНС класса II.

Для выяснения механизма возникновения "гранулярного" ответа его определяли у животных, нокаутированных по генам, кодирующим молекулы процессинга и корецепторы. В таблице 3 представлены результаты оценки накопления гранулярных клеток в селезенке нокаутов на генетической основе C57BL/6 (KblbDb) после иммунизации клетками мастоцитомы Р815 (KdDd). В этой системе возникает ответ на аллельные продукты Kd и Dd МНС класса I. Отсутствие Т-клеток у нокаутов по а-цепи Т-клеточного рецептора приводит к полному исчезновению эффекта, что однозначно свидетельствует о его зависимости от распознавания аллоантигена Т-лимфоцитами. У нокаутов по генам ТАР и рг-микроглобулина интенсивность ответа снижена. По всей видимости, это снижение связано со снижением доли клеток CD8+ в периферических лимфоидных органах нокаутов, обусловленным утратой молекул МНС класса I, необходимых для позитивной селекции этой субпопуляции клеток. Как и следовало ожидать, подавление "гранулярного" ответа наблюдается также у нокаутов по молекуле корецептора CD8. С целью выяснения возможной роли клеток CD4+ и необходимости индуцированной ими костимуляции в развитии "гранулярного" ответа такие же эксперименты были поставлены на мышах-нокаутах по корецептору CD4 и костимуляторному рецептору CD40. Как видно из результатов, приведенных в таблице 3, у нокаутов по молекулам корецептора CD4 и костимуляторного рецептора CD40 снижения ответа не наблюдается.

Интактные умчуииые Иртяктные Нмцуняые

1

ПеПе*

МНС с1а«1 II А'

I 1

В7-1

ПоИг

1вМ «

I

СОЗ

ТСЧу/б I

I

Мас-1

I

I

В220

I

Сг1

СШ1

СШ1с

I

I

N10.1

|

ж / 1

' V г

тсир

Р4/80

Рис. 2. Результаты анализа экспрессии различных поверхностных маркеров "гранулярными" клетками методом проточной цитофлуориметрии. Серым цветом заштрихованы диаграммы распределения общей популяции спленоцитов по яркости

окрашивания антителами, без штриховки - диаграммы распределения "гранулярных* клеток. По оси абсцисс - интенсивность окрашивания клеток антителами к соответствующему маркеру. По оси ординат - нормализованное число событий.

Использование мышей, конгенных по МНС, а также животных, нокаутированных по молекулам, участвующим в презентации, и корецепторам CD4 и CD8, показало, что появление активированных/ нейтрофилов в селезенке реципиентов опухолевых клеток зависит от экспрессии аллогенной молекулы МНС класса I опухолевыми клетками и корецептора CD8 Т-лимфоцитами в организме реципиента. Полное отсутствие эффекта у нокаутов по а-цепи TCR однозначно свидетельствует о том, что эффект зависит от распознавания аллоантигена Т-клетками, экспрессирующими TCRa/p, и эта функция не может быть замещена естественными киллерами и Т-клетками, экспрессирующими TCR7/8. Хотя зависимость специфического ответа на клетки опухолей от активации АПК реципиента Т-хелперами С04+ через CD40 показана неоднократно, отсутствие корецептора CD4 и костимуляторного рецептора CD40 на клетках реципиента не оказывают влияния на интенсивность этой реакции. Таким образом, индукция транзитной нейтрофилии в селезенке в ходе ответа на клетки аллогенных опухолей имеет место в результате ранних последствий распознавания аллоантигена клетками CD8+ и может быть независимой от функций хелперов и профессиональных АПК. Вполне возможно, что нейтрофилы сами выполняют вспомогательные костимуляторные функции в процессе индукции специфического иммунного ответа на трансплантационные антигены опухолевых клеток. Такое предположение основывается на относительно высоком уровне экспрессии B7-1(CD80) на гранулярных клетках по сравнению с основной популяцией лимфоидных клеток селезенки (Рис. 2). Более того, при иммунизации клетками аллогенной опухоли в селезенке реципиентов не наблюдается увеличения доли дендритных клеток CD11c+Mac-1+ и общий прирост числа клеток, экспрессирующих CD80, происходит исключительно за счет гранулярных клеток (данные не представлены). Таким образом, в ответе на клетки аллогенных опухолей накопление активированных нейтрофилов в селезенке зависит от первичного распознавания аллогенной молекулы МНС класса I Т-клетками CD8+. Этот факт указывает на возможность существования механизма регуляции функций врожденного иммунитета Т-клетками CD8+, способными распознать комплексы молекул МНС

Таблица 2. Интенсивность накопления иейтрофклов в селееенке мышей Р&ЗЛЙЧ1ШХ ЛИНИЙ t мммунцВАЦш^атши КЛвТКВМИ ТИМОМЫ EL4

(kV)

Линии мышей(гаплотип) Накопление нейтрофилов в селезенке, %%*

С57ВЬ/10 (К01ВЕ>В) 1,13 ± 0,62 (7)

С57В1./6 <КвХьОь) 1,68 ± 0,49 (4)

В10.02 (11101) (К°1',1>в). 3,31 ± 0,08** (10)

В10.02(К101) втор, ответ 0,38 ± 0,09 (6)

В10.02 (Ка1а0а) 14,24 ± 3,54** (8)

ЬтЗ (Квли'1в0в) 7,27 ± 2,17** (4)

Ьт1 (Ки"11вОв) 6,03 ± 3,3** (3)

Ьшб <Км,61вОв) -0,26 ± 0,39 (4)

Ьш12 (К0!"""^) 0,92 ± 0,42 (4)

В скобках - количество животных

* - Разность между процентным содержанием гранулярных клеток в селезенке в опыте и яятактном контроле (варьировал в пределЛ от 1,07 до 2,58%). ** - Достоверные отличия от контроля (Р<0,05)

Таблица 3. Интенсивность накопления нейтрофилов а селезенке мышей-нокаутов на генетической основе ишей С57ВЬ/б (Къ1ьОь) , иммунизированных клетками мастоцитомн РВ15 (^С-)

Линии мышей Интенсивность «гранулярного ответа» (%%) *

DBA/2 (сингенная Р815) 3,9 ± 0,6 (3)

C57BL/6 WT 9,79 ± 1,28* (6)

рг-микроглобулин КО 2,18 ± 0,75** (4)

ТАР КО 4,76 ± 0,53** (3)

CD8 КО 2,67 ± 0,49** (6)

CD4 КО 13,91 ± 3,66 (2)

CD40 КО 7,09 ± 1,66 (3)

TCRa КО -2,6 (1)

Разность между процентным содержанием гранулярных клеток в селезенке в опыте и иитактном контроле. Каждое число представляет собой результат независимого эксперимента.

*- Достоверные отличия от отрицательного контроля (ОВА/2, иммунизированные Р815, Р<0,05)

**- Достоверные отличия от положительного контроля (С57В1Уб \УТ, иммунизированные Р815, Р<0,05)

с антигенными пептидами в отсутствие его классических индукторов. Независимость эффекта от клеток CD4+ и костимуляторного лиганда CD40 может указывать на его независимость от презентации антигена профессиональными АПК реципиента и возможность прямого распознавания аллоантигена опухолевой клетки Т-лимфоцитами CD8+ реципиента.

2.3.2. Метод функционального тестирования/ клеток памяти CD8 +

t После иммунизации мышей клетками аллогенных опухолей на 9-

10-й день наблюдается пик активности первичных эффекторных CTL CD8+, эффективно уничтожающих клетки опухоли. Затем цито-литическая активно.сть аллоспецифических CTL падает и окончательно исчезает через 1-1,5 месяца после иммунизации. Через 2-4 месяца после иммунизации в селезенке мышей присутствук^ иммунные клетки, способные, в отличие от наивных клеток, к дифференцировке в CTL после стимуляции прогретыми, облученными ультрафиолетом или фиксированными аллогенными клетками. Наши данные по исследованию экспрессии антигенов CD3, CD4, CD8, CD44 и TCRa/ß на мембране спленоцитов мышей В10.D2(R101) (KdldDb) на пике первичного ответа и через 2 месяца после иммунизации клетками тимомы EL4 {KbDb) показывают, что в первичный иммунный ответ in vivo вовлечены исключительно Т-клетки CD8+ (Рис. 3). На пике первичного ответа их процентное содержание в селезенке реципиентов возрастает вдвое по сравнению с контролем. Доля клеток CD4+ при этом существенно не изменяется. По всей видимости, они даже не подвергаются активации,

i поскольку существенных изменений доли клеток CD4+CD44'"ff'' не

наблюдается даже на пике ответа. Этот факт указывает на то, что в первичном ответе на аллогенные опухолевые клетки примирование Т-лимфоцитов осуществляется аллогенными молекулами МНС класса I опухолевых клеток, а не дендритными клетками, которые могли контаминировать асцит у мышей C57BL/6, использованных для перевивания опухоли. В противном случае, мы бы наблюдали примирование Т-клеток CD4+ реципиента аллогенными молекулами МНС класса II дендритных клеток донора (Рис. 3). При активации предшественников вторичных CTL в ответ на прогретые (45°С, 60 мин) аллогенные стимуляторы in vitro мы обнаружили, что на 3-4-й день культивирования в культурах, содержащих отвечающие клетки (респондеры) предварительно иммунизированных животных, число

Контроль

U дней

в© дней

Аяти-CD8-PE

ТБ5 lY "'О1

0.93 17.02

... ...

Awn«-CD3-F1TC

Анти-CD44-PE

Аити-ТСКа/^-ПТС

Рис. 3. Экспрессия CD3, CD4, CD8, CD44 и TCRa/0 на спленоцитах мышей 810.D2(R101) через различные сроки после иммунизации клетками тимомы EL4.

Антн-СЮ4-РЕ

В10Л>2(Н101) 30.52 235

ЯШ

Щр- 56.84

•• ' « 50.92 '¿■■""V « 2.13

45.16 1.79

35.74 1.86

Ш

. 57.2 ■ '•1& .V* г . "г? 5.19

и1 ' к>

47.97 6.29

щ

¥ 4338 с" П* 2.36

СТИМУЛЯТОРЫ: С57В1Л0 3938 4.92

сзн

ь 21.08 9.62

В

ш

# 2649

ш . ' .

, . '«и«" ,

•Щг'- • Ч-А'

48.18 ' Ы " ' №

Антн-СМ-ИТС

Рис. 4. Результаты анализа властной популяции спленоцитов интахтных (А, Б) и иммунных (В, Г) мышей Н101 на сингенные, аллогенные и посторонние стимуляторы, обработанные митомицином С (А, В) либо тепловым шоком (Б, Г).

жизнеспособных лимфоцитов значительно (в 5 и более раз) превышает число жизнеспособных клеток в нестимулированных культурах, причем многие из них находятся в властной форме. Напротив, в культурах клеток, содержащих респондеры неиммунизированных животных и прогретые аллогенные стимуляторы, количество жизнеспособных клеток постепенно снижается, как нестимулированных культурах. На рис. 4 представлены результаты анализа властных клеток, накапливающихся в культурах in vitro на 5-й день после индукции ответа на сингенные и аллогенные стимуляторы, обработанные митомицином С либо подвергнутые острому тепловому шоку. Эти результаты показывают, что респондеры интактных животных пролиферируют в ответе на стимуляторы, обработанные митомицином С, и не пролиферируют в ответе на прогретые. В ответе респондеров иммунных животных на прогретые аллогенные стимуляторы специфически пролиферируют в клетки CD8+. Эта пролиферация наиболее выражена в ответе на клетки, экспрессирующие иммунизирующий аллоантиген, и намного слабее в ответе на посторонний антиген (стимуляторы мышей линии СЗН, Н-2к) Поскольку первичная иммунизация проводилась в условиях различий по единственной молекуле гистосовместимости класса I (Н-2КЬ), распознаваемой Т-лимфоцитами CD8+, можно было предположить, что в ответе на прогретые аллогенные стимуляторы избирательно пролиферируют Т-лимфоциты CD8+, которые были примированы аллоантигеном в первичном ответе in vivo (клетки памяти). Сходные результаты были нами получены и с использованием другой, неконгенной системы иммунизации, в которой мыши C57BL/10 (KblbDb) получают внутрибрюшинную инъекцию 2 х 107 клеток мастоцитомы Р815 (KdDd), происходящей из мышей DBA/2 (KdldDd). Через 2 месяца после иммунизации Т-лимфоциты CD8+ реципиентов приобретают способность избирательно пролиферировать в ответ на прогретые стимуляторы мышей B10.D2 или BALB/c (KdldDd).

Селекция клонов Т-клеток в тимусе продолжается в течение всей жизни животного и после первичной иммунизации возможно появление и накопление клонов наивных Т-клеток с рецепторами, специфичными к тому же аллоантигену. Чтобы оценить селективность активации клеток памяти следовало выяснить, вовлекаются ли наивные клетки в ответ клеток памяти на прогретые аллогенные стимуляторы. С этой целью мышей C57BL/10 и мышей B10.GFP. иммунизировали клетками мастоцитомы Р815. Через 2 месяца после иммунизации спленоциты иммунизированных мышей C57BL/10 и B10.GFP в соотношении 1 : 1 смешивали со спленоцитами

Общая популяция 22.41 4.51

БЛАСТЫ: GFP+

23.57 5.18

тщ

•Mjt't

^Щг-

' ^7.48 (Ь> »'в1 5.6

14.75 5.33

21.78 5.93

1щУ

А: 5.85

■Щ,

- гняпв® 23.89 ^W.55

«ЯР Ik?

5^6

V Л1 иг 1'«' ,«■ 23.15 7.41

ш

'54.64 - ¿4 •f' 14.8

«9" tO' ft» 4 23.43 7.26

V^LIS ъу 6.1«

to* Ik* Л' 5.72 7.24

_

. 4яВи * 18.3 H»4

GET

19.68 2.96

, .-f&ir ;

-

4.

""71.76 5.6

«' A1 A' ' v 4-

7.45 3.56

i " *

• Ш-

»

' 25.71' r——да [63.28 i

1731 235

tFft1 V

■-Ш

7533 5.01

A1 «■

16.J7 2.08

£

68.16 13.49

В

Ahth-CD8-APC

Рис. 5. Результаты анализа бластов из MLR смесей респондеров иммунных C57BL/10 и интактных B10.GFP (А, Б), интактных C57BL/10 и иммунных B10.GFP {В, Г) в ответе на сингенные (C57BL/10 - А, В) либо аллогенные (B10.D2 - Б, Г) стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку.

Таблица 4. Экспрессия различных цитокииов и маркеров наивными клетками и клетками памяти после стимуляции облучеииоди и прогретыми стимуляторами

Источник анализируемых клеток:

Цитокины Спленоциты интактных Спленоциты иммунных Клон МСС-1*,

и мышей R101, мышей R101, стимули-

маркеры стимулированные стимулированные рованный

Облучен- Прогретыми Облучен- Прогретыми Антителами к

ными C57BL/10 ными C57BL/10 CD3 + IL-2

C57BL/10 C57BL/10

GAPDH + + + + +

IL-2 + - - - -

IL-4 - - - - -

IL-10 + - + + +

IFNy + - + + +

TNFa + - +/- + +

TGFPi CD40L + + + + +/- + + +

FasL +/- +/- +/- + +

+ +/- + +

Bcl-2

Примечание: В таблице представлены результаты PCR указанных генов из библиотек кДНК, полученных с использованием фермента Superscript для обратной транскрипции мРНК клеток, выделенных из культур на 6-й день после стимуляции. Было выполнено от 32 до 38 циклов PCR. После завершения PCR реакционную смесь наносили на гель агарозы, содержащий бромистый этидий и разделяли гель-электрофорезом Гели анализировали, используя УФ-трансилпюминатор. Определение мРНК глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) использовали как контроль. Знаком (+) отмечено появление четкой полосы ампифицированного продукта после 32 цикла PCR, (+/-) -если полосы появлялись между 32 и 38 циклом PCR и (-) - если никакого амплифицированного продукта не выявлялось после 38 циклов PCR. * - описание условий получения и свойств клона клеток памяти МСС-1 см. ниже.

неиммунных животных B10.GFP и C57BL/10 соответственно. Такие смеси использовали в качестве респондеров в MLR в ответе на сингенные (C57BL/10) и аллогенные (B10.D2) прогретые стимуляторы. По прошествии 3-х суток клетки собирали, окрашивали антителами к корецепторам CD4 и CD8 и анализировали бласты методом проточной цитофлуориметрии. Результаты, представленные на рис. 5 показывают, что в таких MLR пролиферируют только клетки памяти CD8+ иммунных животных, тогда как наивные Т-лимфоциты неиммунных животных в ответ не вовлекаются.

Таблица 5. Влияние адоптивного переноса клеток памяти GFP+ на пролиферативний ответ наивных клеток реципиента CD8+G!T?~

Реципиентам вводили Стимуляторы в MLR %% Т-клеток CD8+GFP~ в властной популяции

Спленоциты интактных животных GFP+ Спленоциты иммунных животных GFP* Клетки тимомы EL4

+ + BIO.D2(R101), MC C57BL/10, MC 3,93 ± 0,97 43,3 ± 16,0

+ + BIO.D2(R101), прогретые C57BL/10, прогретые 2,38 ± 0,04 32,6 ± 6,81

+ + BIO.D2(R101), MC C57BL/10, MC 3,24 + 0,08 8,06 ± 0,77*

+ + B10.D2(R101), прогретые C57BL/10, прогретые 2,88 ± 0,23 8,51 ± 0,55*

+ BIO.D2(R101), MC C57BL/10, MC 3,73 ± 0,52 7,23 ± 1,94

+ BIO.D2(R101), прогретые C57BL/10, прогретые 3,02 ± 0,68 3,65 ± 0,32

* - Достоверное подавление ответа клеток С08+СРР" реципиента клетками памяти донора по сравнению с ответами реципиентов, получивших инъекцию спле-ноцитов неиммунных мышей (выделены жирным шрифтом) МС -митомицин С.

На Рис. 4 хорошо видно, что ответ Т-лимфоцитов интактных животных сопровождается заметной пролиферацией Т-лимфоцитов С04+, тогда как ответ этих лимфоцитов у иммунизированных животных угнетен. Это угнетение имеет место не только в ответе на прогретые стимуляторы, но и на стимуляторы, обработанные митомицином С. Таким образом, создается впечатление, что в присутствии клеток памяти ответы других субпопуляций Т-клеток угнетены, т. е. имеет место поляризация иммунного ответа в сторону селективного ответа клеток памяти. Характеристика спектра продуцируемых им цитокинов и маркеров представлена в таблице 4. Из представленных результатов хорошо видно, что в этих условиях клон МСС-1 (описание уело вий получения и свойств клона клеток памяти МСС-1 см. ниже) экспрессирует мРНК цитокинов, характерных для активированных СТ1_. Паттерн экспрессируемых цитокинов весьма сходен с таковым у

поликлональной популяции клеток памяти, отвечающих как на облученные, так и на прогретые аллогенные стимуляторы. Неожиданным свойством поликлональных популяций клеток памяти оказалось отсутствие в них после стимуляции мРНК IL-2, что говорит о возможности их пролиферации в отсутствие этого цитокина. Экспрессия в лимфоцитах иммунных животных мРНК цитокинов TGF|3i и IL-10, способных поддерживать рост клеток CD45RO+ in vitro, может служить подтверждением тому, что как полученный клон, так и поликлональная популяция, отвечающая пролиферацией на прогретые аллогенные клетки, действительно представляют собой клетки памяти [Rich S., et al., 1995]. Как и следовало ожидать, в наивных лимфоцитах, стимулированных прогретыми клетками, не обнаруживается мРНК цитокинов, экспрессируемых при иммунной стимуляции, что сопровождается утратой экспрессии гена bcl-2. В отличие от клеток памяти, стимуляция наивных лимфоцитов облученными аллогенными стимуляторами сопровождается экспрессией мРНК IL-2, что вполне объяснимо активацией аллореактивных клеток CD4+, распознающих аллогенные молекулы МНС класса II на облученных стимуляторах.

Было важным выяснить также, вовлекаются ли наивные Т-лимфоциты в ответ клеток памяти in vivo. С этой целью интактных мышей В10.D2(R101) иммунизировали клетками тимомы EL4 совместно с 2,5 х 107 спленоцитов интактных либо иммунных мышей B10.D2(R101), экспрессирующих трансген GFP. Через 2 месяца в MLR анализировали ответы реципиентов на сингенные и аллогенные стимуляторы, обработанные митомицином С либо подвергнутые острому тепловому шоку. На проточном цитофлуориметре в культурах определяли процент бластных клеток CD8+, не экспрессирующих GFP. Результаты, представленные в таблице 5, показывают, что адоптивный перенос трансгеннных клеток памяти в момент иммунизации приводит к блокаде пролиферативного ответа Т-клеток CD8+ реципиента в ответе на аллогенные стимуляторы, как прогретые, так и обработанные митомицином С.

Таким образом, Т-клетки памяти CD8+, индуцированные в первичном ответе in vivo, можно селективно активировать in vitro в ответе на прогретые аллогенные стимуляторы, несущие иммунизирующий антиген. Клетки памяти пролиферируют в ответе на иммунизирующий антиген, несмотря на экспрессию ими мРНК супрессорных цитокинов IL-10 и TGFp и на отсутствие экспрес сии IL-2. Используя адоптивный перенос клеток памяти мышей,

экспрессирующих трансген зеленого флуоресцентного белка (GFP), мы показываем, что долгоживущие клетки памяти подавляют ответ наивных Т-клеток и их вовлечение в пул клеток памяти in vivo. Способность клеток памяти к подавлению ответов наивных клеток на аллоантигены аллогенных опухолей может лежать в основе эффекта, описанного ранее как "original antigenic sin", и служить механизмом клонального

* доминирования и периферической селекции Т-лимфоцитов.

2.3.3. Прямое распознавание аллоантигена клетками памяти CD8+ и их зависимость от профессиональных АПК

По всей видимости, неспособность наивных клеток отвечать in vitro на стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку, вызвана разобщением антигенспецифического и костимуляторного сигнала. Прогревание стимулирующих клеток при температуре 45°С в течение 1 ч ведет к гибели АПК, на которых экспрессирован аллоантиген [Kazanskii D.B., et al., 1999]. Одним из наиболее ранних и ярких проявлений ответа на тепловой шок, отмеченных в литературе, является утрата клеткой способности к перестройке цитоскелета, необходимой для формирования стабильного иммунологического синапса между Т-лимфоцитом и АПК в процессе индукции иммунного ответа [Coss R.A., Linnemans W.A., 1996; Al-Alwan М.М., et al., 2001]. Тепловой шок ведет также к подавлению экспрессии костимулятора В7-1 (CD80) и способности АПК к костимуляции ответов Т-клеток [Kazanskii D.B., et al., 1999]. Поэтому было важным определить, участвуют ли в ответе профессиональные АПК, содержащиеся в популяции отвечающих клеток, и необходимы ли клетке

^ памяти костимуляторные сигналы профессиональных АПК. С этой целью

суспензии спленоцитов интактных и иммунных животных в полной среде в количестве не более 2 х 107/мл помещали в пластиковые культуральные флаконы с площадью дна 25 см2 и помещали в СОг-инкубатор на 2 часа.

* Неприкрепившиеся клетки, обедненные профессиональными АПК, в дальнейшем тестировали по их способности к пролиферативному ответу на облученные и прогретые аллогенные стимуляторы в отсутствии и в присутствии фракции облученных спленоцитов интактных мышей R101, прилипающей к пластику. Результаты однозначно свидетельствовуют о необходимости присутствия профессиональных АПК для развития ответов клеток памяти в ответ на стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку. Удаление из популяции отвечающих клеток профессиональных АПК приводит к глубокому подавлению пролифе-

ративного ответа на прогретые аллогенные клетки, но этот ответ восстанавливается в присутствии облученных АПК из селезенки интактных животных.

Подтверждение зависимости ответа клеток памяти от профессиональных АПК было получено в экспериментах по обогащению клеток памяти в MLR in vitro с последующим определением условий их рестимуляции. Клетки памяти, обогащенные в ответе на прогретые *

аллогенные стимуляторы in vitro в течение 10 дней, не отвечают на них вторично, но ответ может быть восстановлен либо добавлением в культуры профессиональных АПК, либо экзогенного ИЛ-2. Еще одним *

подтверждением такой зависимости является способность антител к ICAM-1 подавлять пролиферативный ответ клеток памяти на прогретые аллогенные стимуляторы, что свидетельствует о необходимости контакта Т-лимфоцита с АПК в процессе индукции ответа (данные не представлены).

Таким образом, возникло противоречие: с одной стороны, результаты, изложенные выше, наилучшим образом согласуются с моделью прямого распознавания аллоантигена на опухолевой клетке; с другой стороны, клеткам памяти для развития ответа необходимы жизнеспособные АПК. Чтобы его разрешить, следовало идентифицировать механизм распознавания аллоантигена Т-клетками памяти. Специфичность Т-клеток, ответивших на антиген, является прямым отражением механизма, в соответствии с которым они впервые его распознали. С целью идентификации механизма распознавания аллоантигена Н-2КЬ клетками памяти их ответы определяли в MLR на прогретые и обработанные митомицином С стимуляторы мышей C57BL/6 и нокаутов C57BL/6J-B2m,m1Unc по молекуле Эг-микроглобулина и #

C57BL/6J-Tap1,mUrp по молекулам ТАР (transport associated protein). У обоих нокаутов сохранен синтез тяжелых цепей аллоантигена Н-2КЬ и их расщепление протеасомой.но нарушен процесс сборки комплекса «

молекула МНС/Эг-микроглобулин/пептид и его экспрессия на мембране клетки. Поэтому прямое аллогенное распознавание комплекса на поверхности прогретой клетки нокаута должно быть исключено, тогда как непрямое аллогенное распознавание фрагментов аллоантигена в контексте молекул МНС дендритных клеток респондера - т. н. кросс-прайминг - сохранено. В таблице 6 представлены данные, показывающие, что пролиферативные ответы клеток памяти на прогретые стимуляторы мутантов значительно снижены по сравнению с ответами на

стимуляторы дикого типа, что свидетельствует о прямом распознавании интактной структуры аллогенной молекулы МНС на поверхности прогретых аллогенных стимуляторов, зависимом от связанных с ней пептидов. Были также получены независимые доказательства прямого распознавания аллоантигена клетками памяти. Добавление поликлональных антител к молекуле Н-2КЬ в MLR полностью блокирует пролиферативный ответ клеток памяти на аллогенные стимуляторы,' подвергнутые острому тепловому шоку. Независимым подтверждением прямого распознавания аллоантигена клетками памяти является также подавление пролиферативного ответа клеток памяти, специфичных к молекуле Н-2КЬ, на мутантные формы этой молекулы - Kbm4, имеющую аминокислотные замены в позициях, важных для прямого взаимодействия этой молекулы с TCR и КЬт3 с мутациями в остатках, влияющих на презентацию пептидов (данные не представлены).

Таким образом, несмотря на зависимость от контакта с профессиональной АПК, клетки памяти CD8+ распознают аллоантиген в соответствии с механизмом прямого аллогенного распознавания. Вне зависимости от различий в условиях активации наивных клеток и клеток памяти это означает, что первичное примирование Т-клеток в ответе на аллогенные опухолевые клетки происходит в результате прямого взаимодействия рецептора Т-лимфоцита с аллоантигеном опухолевой клетки. Их зависимость от наличия профессиональных АПК определяется необходимостью получения костимуляторного, но не антигенспецифического сигнала, что делает наиболее вероятной трехклеточную модель кооперации между Т-лимфоцитом, получающим антигенспецифический сигнал от опухолевой клетки, и АПК, являющейся источником костимуляции. Не исключено, что при первичном ответе на клетки аллогенной опухоли в роли таких АПК выступают не дендритные клетки, как принято полагать, а особая популяция нейтрофилов со свойствами профессиональных АПК, описанная выше. Нейтрофилы являются единственным источником CD80, индуцируемым в ответе на клетки аллогенной опухоли. Являясь естественным депо IL-12, они могут быть важным фактором секвестрации иммунного ответа Т-лимфоцитов CD8+ в отсутствие классических индукторов врожденного иммунитета. Такая секвестрация могла бы "включаться" в результате первичного распознавания аллогенной молекулы МНС класса I Т-лимфоцитом CD8+, приводить к массивной миграции нейтрофилов в селезенку, выбросу ими поляризующих цитокинов, костимуляции и преимущественной индукции CTL.

Таблица 6. Пролиферативный ответ клеток памяти минтай R101 на стимуляторы нокаутов по генам Рг-микрогловуляна и ТАР.

Стимуляторы Интенсивность пролиферации (СРМ)

Спленоциты интактных животных Спленоциты иммунных животных

И101 обработанные МС С57ВЬ/6 обработанные МС (Згш КО обработанные МС ТАР КО обработанные МС 2834 ± 104 25146 ± 1752 14054 ± 1038 47905 ± 4063 4096 ± 274 41279 ± 1719 53726 ± 2009 44374 ± 8005

И01 прогретые С57ВЬ/6 прогретые Рггч0'0 прогретые ТАР0/0 прогретые 3859 ± 703 3646 ± 259 3209 ± 467 5138 ± 388 3941 ± 399 19Э7Э ± 3065 8032 ± 1395* 5215 ± 75*

Примечания: *- достоверное подавление ответа на прогретые стимуляторы нокаутов по генам р2-микроглобулина (Рг'"0''0) и ТАР (ТАР0''0) по сравнению с ответом на аллогенные стимуляторы дикого типа (выделен жирным шрифтом).

2.3.4. Специфичность репертуара и клонирование клеток памяти

Аллогенный иммунный ответ является поликлонаьным. По этой причине следовало выяснить механизм распознавания аллоантигена Н-2К" рецепторами Т-лимфоцитов на уровне ответов индивидуальных Т-клеточных клонов. Клетки памяти стимулировали прогретыми аллогенными стимуляторами in vitro и клонировали методом лимитирующих разведений. Результаты анализа предшественников CTL методом лимитирующих разведений в присутствии IL-2 показали, что частоты аллореактивных CTL у интактных и иммунных мышей R101 через 2-4 месяца после иммунизации клетками тимомы EL4 различаются лишь в 2-3 раза (данные не представлены). Результаты анализа полученных клонов представлены в таблице 7. Из 12 полученных клонов все были способны к лизису мишеней, несущих молекулу Н-2КЬ - макрофагов мышей линии C57BL/10 (KblbDb) и макрофагов B10.MBR(KblkD4), на которых молекула Н-2КЬ коэкспрес-сирована с другими аллогенными молекулами. Таким образом, не менее 90% клеток, пролиферирующих в ответ на прогретые аллогенные стимуляторы, являются вторичными предшественниками CTL, прямо распознающими молекулу Н-2КЬ. Один клон из 12, названный МСС-1, и одна линия, полученная при рестимуляциях прогретыми клетками, оказались способными к длительному поддержанию in vitro. Его оказалось возможным осуществлять простым добавлением антител к CD3 (супернатант гибридомы 145-2С11 в конечном

Таблица 7. Характеристика клонов и клеточной линии, полученных посла обогащении клеток памяти в ответе на стимулятор», подвергнутые тепловому иоку.

Полученные клоны и Цитолитическая Способность к Дополнитель ные

линия активность длительному сведения

против мишеней, поддержанию в

экспрессируицих культуре In

Н-2К" vitro

Клоны:

1 (клон МСС-1) 4 Да TCRa/p', Vp3, CD8*

2 + Нет -

3 4 Нет -

4 4 Нет _

5 4 Нет _

6 + Нет _

7 + Нет _

8 + Нет _

9 + Нет _

10 4 Нет _

11 + Нет _

12 Нет

Линия MCL-1 4 Да -

разведении 1/200) и IL-2 без добавления каких-либо АПК. Как и следовало ожидать, клон МСС-1 экспрессирует TCRa/p и корецептор CD8. Интенсивность пролиферации клона в ответ на стимуляторы, экспрессирующие молекулу H-2Kb - C57BL/10 (KblbDb), B10.A(3R) (Kbl-Ab|_Eb/kDd Ldj и B10.MBR (KblkDqL4) - примерно одинакова. Он обладает выраженной кросс-реактивностью с мишенями, экспрессирующими посторонние продукты МНС H-2Dd(Ld) и H-2Dq(Lq) в отсутствие иммунизирующего аллоантигена. Оказалось, что эти продукты вызывают даже более интенсивную пролиферацию клона, чем иммунизирующий аллоантиген Н-2КЬ, что может объясняться супраоптимальной стимуляцией клона в ответе на иммунизирующий антиген и гибелью активированных клеток. Методом RT-PCR с использованием праймеров для определения вариабельных сегментов р-цепей TCR и константным участкам р-цепей с последующим клонированием и секвенированием реаранжированной области показано, что ген р-цепи клона состоит из сегмента Vp3 (TCRBV3S1), состыкованного с сегментами D1 и J2S7 и способен привести к экспрессии полноценной р-цепи (Рис. 6). Экспрессия a-цепей TCR не подчиняется правилам аллельного исключения. Поэтому довольно часто (в 20% случаев) обнаруживаются Т-клеточные клоны, экспрессирующие две a-цепи и поэтому два Т-клеточных рецептора. Типирование вариабельных фрагл*в*авв«-цвпвй-Т6й-клона МСС-1

m

и ( < (Н

:"TFKA

V-сегмвнт N J-еегмент

Непродуктивная

реаранжировка TCRAV5-TTCTGCGCAG] CCA [ TGTCTAATTA- J- a lpha_l 4-4 V-сегмеят J-cmun

Продуктивная

реараяжировка TCRAV13S1-TGT0CTGCAA] [CAßGCACTCO-J-alpha_n«nr08

V-сегмент D-сегмент N J-сегмент

Продуктивная

p«аранжировка TCRBV3S1-AGCAGTCTGT] [GGACAGGGGGC] TGG [GAACAGTACT-J237

Рис. 6. Последовательности реаранжированных областей субъединиц TCR клона МСС-1. Квадратными скобками обозначены границы V и J-сегментов a-цепей ТСП и V, D и J-сегментов ß-цепей. Подчеркнуты N-нуклеотиды.

методом RT-PCR с праймерами, специфичными к различным Va и к константному региону a-цепи привело к амплификации продуктов праймерами к Va5, Va13, Va14, Va17, Va19. Секвенирование этих продуктов показало, что последовательность кДНК транскрипта, амплифицируемая праймерами к Va17, не имеет отношения к TCR. Последовательность кДНК транскрипта, амплифицируемая праймером к Va5 является продуктом полностью реаранжированной a-цепи (TCRAV5-J-alpha_14-4), неспособной к трансляции белкового продукта из-за наличия stop-кодонов. Секвенирование продуктов, амплифицированных праймерами к Va13, Va14 и Va19 привело к идентификации одной и той же последовательности гена Va 13 (TCRAV13S1), состыкованной с последовательностью J-alpha_new08 и способной к экспрессии полноценной a-цепи. Идентификация двух реаранжированных генов a-цепей TCR у клона МСС-1, одна из которых является нефункциональной, однозначно свидетельствует о том, что клон экспрессирует только одну a-цепь TCR и, следовательно, только одну форму TCRa/ß. Таким образом, кросс-реактивность клона обусловлена вырожденным распознаванием аллоантигена лишь одним вариантом TCRa/ß клона МСС-1. Чтобы преодолеть малую эффективность клонирования, длительность и трудоемкость получения долгоживущих клонов Т-клеток CD8, а также свести к минимуму селектирующие воздействия экспериментальных процедур, были получены Т-клеточные гибридомы клеток памяти. Для их получения использовали клетки памяти, активированные в ответе на прогретые аллогенные стимуляторы, и партнер для слияния, представляющий собой тимому, трансфецированную CD8a, чувствительную к добавлению в культуру смеси гипоксантина, аминоптерина и тимидина (HAT). Полученные клоны тестировали на специфичность.

Таблица 8. Характеристика специфичности репертуара клеток памяти мышей R101, иммунизированных клетками тхмомы EL4

Гибридомы Интенсивность продукции IL-2 Т-гибридомами клеток памяти в ответе на стимуляторы

BIO В10 + amn-Db B10 + шти-К* bmlSV bm3SV BIO прогретые BIO прогретые + шгги-К" BIO прогретые + R101 C57SV(b) BRSV(k) D2SV(d)

1НЗ + + • - - + ++ -

1Ы2 • * - - + ++

2А9 ++ + - •H- + +++

1EIÖ " - - - - - +++

2D9 + -t- - • - +++

IF1I* +т ++ -н- +++ ■H-t- +++ +++ +-H-

1ВЗ* ■Ь- -t-t- + +++ + + ++ +

1С6* ■ь- f + -H- + +++ -

- 2F11* - ++ + +-H-

ID1* ++ + + +++ ++ +++

2F2» + + + - + ++

2А4* -н- - + + +++

1D2** + - +++ - - +

' 2DÄ" + + +++ - -H-

1А7** + -f - - - +

Примечании: Специфичность подученных гибридомвых клонов оценивали в ответе на спленоциты мышей C57BL/10 а отсутствие и 1 присутствии антител к молекулам Н-2КЬ (НВ41) и Н-201* (28-14.А). Определяли также способность гибридом отвечать на прогретые аллогенные стимуляторы а отсутствие и а присутствии антител к молекуле Н-2Кк и еннгенных спленошггов мышей R101. В качестве стимуляторов, репрессирующих различные аллельные и мутантные формы молекул МНС класса 1 и лишенных экспрессии молекул МНС класса 11 использовали линии трансформированных фнбробластов bmlSV (Kb,"'Dk). bm3SV (K^D11), C57SV (H-2'), BRSV (H-211), D2SV (H-24), MSV (Н-2'), SSV (Н-2'). Ответ гибридомы считали положительным (+), если он на 3-10 стандартных отклонений превышал средний ответ всех гибридом на сиигенные стимуляторы R101. Ответ считали промежуточным по интенсивности (++), если он превышал средний сингеиный ответ на 10-20 стандартных отклонений, и сильным (+++) - при превышении сингенного ответа более, чем на 20 стандартных отклонения. В свази с тем, что ни одна из гибридом не отвечала на фибробласты MSV и SSV, в таблице данные не представлены. По характеру ответа клоны могли быть охарактеризованы как аитигснспецифическис - 5 гибридом в верхпей части таблицы, кросс-реактивные (*) я гстероклнтнческие (**). Клоны 1Е12 н IEI0, по всей видимости, отвечают на большой Т-актиген вируса SV40, использованного для трансформации фнбробластов.

Из 40 полученных гибридом 25 отвечали на иммунизирующий аллоантиген. С использованием теста, основанного на поддержании роста клеток линии CTLL-2 супернатантами гибридом, получены результаты, представленные в таблице 8. Среди 15 наиболее полно изученных гибридом клеток памяти можно увидеть 3 различных типа ответа на аллогенные стимуляторы. К первой группе можно отнести 5 клонов, которые имеют строгую специфичность к антигенам трансформированных фибробластов C57SV. Из них аллореактивными можно считать лишь три, реагирующие со спленоцитами мышей C57BL/10, тогда как 2 клона - 1 El 2 и 1Е10 - реагируют только с трансформированными фибробластами и, по всей видимости, распознают большой Т-антиген вируса SV-40, использованный для иммортализации фибробластов. Ответы аллореактивных клонов в этой группе блокируются антителами к молекуле Н-2КЬ, но не H-2Db, что указывает на прямое распознавание ими аллоантигена Н-2КЬ. Среди этой группы клонов ни один не реагирует с мутантными формами молекулы Н-2КЬ - К1""1 (мутация в остатках 152, 155 и 156 домена аг) и КЬт3 (мутации в остатках 77 и 89 домена ai) и только клон 2А9 обладает способностью отвечать на прогретые аллогенные стимуляторы. Ко второй группе можно отнести гибридомы, характеризующиеся более или менее широким спектром кросс-реакций с мутантными формами молекулы Н-2КЬ и с другими аллельными формами молекул МНС. Для гибридом этой группы характерна способность реагировать на прогретые аллогенные стимуляторы (хотя и с меньшей интенсивностью, чем на интактные аллогенные клетки) и неполное блокирование их ответов на интактные аллогенные клетки антителами к Н-2КЬ. Вместе с тем, их ответ на прогретые аллогенные клетки полностью подавляется этими антителами. Этот факт однозначно свидетельствует о возможности прямого распознавания Т-клеткой аллоантигена на поверхности мертвой аллогенной клетки. Большинство клонов этой группы реагирует с мутантом ЬтЗ, но не Ьт1, что может свидетельствовать о преимущественном взаимодействии рецепторов этой группы клеток с участком тяжелой цепи аг-домена молекулы Н-2КЬ. Последнюю, группу гибридом характеризует гетероклитический ответ -т. е. способность реагировать на мутантные формы аллоантигенов с большей интенсивностью, чем на иммунизирующий антиген. Ответы этих гибридом полностью блокируются как антителами к молекуле Н-2КЬ, так и прогреванием аллогенных клеток. Ответы всего пула полученных гибридом блокируются моноклональными антителами к иммунизирующей молекуле Кь, являющейся мишенью прямого

аллогенного распознавания, но не Оь, представленной и на АПК мышей R101 и на стимуляторах, в контексте которой могло бы иметь место непрямое распознавание пептидов коэкпрессированной молекулы Кь. Таким образом, полученные данные позволяют отвергнуть гипотезу о кросс-реактивности клонов, специфичных к аллогенной молекуле, со "своими" молекулами МНС, презентирующими аллогенные пептиды.

2.3.5. Структурные основы прямого аллогенного^ распознавания

Одним из примеров микроэволюции аллоантигенных свойств являются мутации МНС серии bm. Исследование первичной структуры мутантов молекулы Кь обнаружило, что у всех bm-мутантов по меньшей мере одна из аминокислотных замен приводит к появлению фрагмента, присутствующего в какой-либо из уже известных аллельных форм молекул МНС. Этой закономерности подчиняются мутанты и других, значительно более редко мутирующих молекул Кк и Dd [Kazanskii D.B., et al., 1998]. Существование такого "закона гомологических рядов" аллоре-активности не ограничено рамками одного вида экспериментальных животных - даже если образующийся в результате мутации фрагмент последовательности не обнаруживается среди молекул МНС мыши, его можно найти в молекулах МНС других видов млекопитающих. Распознавание молекул МНС рецепторами Т-клеток не имеет видовых ограничений - для него важно совпадение в видовой специфичности лишь акцессорных молекул (корецепторов, костимуляторных лигандов, цитокинов и их рецепторов), участвующих в иммунном ответе [Auchincloss H.Jr., Sachs D.H., 1998]. Поэтому описание канонической структуры молекул МНС класса I млекопитающих могло стать весьма информативным для углубленного понимания их функций. В результате анализа 275 аллельных форм, встречающихся у различных видов, было обнаружено, что инвариантные остатки присутствуют, главным образом, в областях контакта ß-складчатых структур с а-спиралями, в "петлях" перехода ß-складок друг в друга, а также в а-спиральные структуры. Такое расположение говорит о том, что роль инвариантных остатков состоит в формировании внутримолекулярных взаимодействий, определяющих третичную структуру молекул МНС класса I. Этот результат дал основание провести анализ с целью идентификации единого мотива, оценки вариабельности и определения полного спектра допустимых замен аминокислотных остатков в каждой позиции молекул МНС класса I. Результаты этого анализа представлены в таблице 9.

Таблица 9. Вариабельность «минохислотшх остатков молекул МНС класса I

Инвариантные остепси и остался, предстаяленные «молчащими» заменами

1-0 26-а 60ЛУ 100-0 130-1, 157-1Щ

3-Н 27-У,И 64-Т 101-С 132-8,Т 159-У

5-Ь.М 28-УХ 78-Ь 103-У,Ц1,м 133-\У 160-ЦУ

7-У.Г 35-11,0 85-У,\У 118-У 134-Т.8 164-С

Я-УД 36-Р,У 86-Ы 119-0,Е 135-А 168-Ь

12-У,1,М 37-0>1 88-Б 122-ИЗ 140-А 172-ЦМ

13-5 38-5 92-Б,Т 123-У 143-Т.8 179-ЦУ

15-Р 51^ 93-Н 126-1. 148-ЕДЭ

25-У 59-У 96-0 129-0 153-А

Копссрвапгвныс ист ни (2-3 аминокислотных замел)

2-3,РДД зо-о,чн,о 52-М,1,У,А вз-вддн П1-А,8,0Д.Н 144-0, К,0Д,Ь

4-8.Р 31-Т.К 53-Е,К,К,0 84-У,О 112-А.ОД 146-К^

32-О.Е,Ь 54-ОД,Н,Р 87-0,Н 113-Р,У,Н,8,У Ш-О.НДЛО

10-Т,1,Л 33-Р,У 55-Е,К,У 89-Е,К,ОАО 115-Е,0,Ы,Т 161-О,Е,0

14-^0 34-А,5,ЦУ,М 56-Е,0,ОД 90-А,8,Т,0,0, И7-0,5Л 162-0,0,ТД

16-0,5 39-ОЛ,А 57-РД 91 -ад 120-0,0,8 165-УХД

17-Л-8,Р,1.Д 40-А,8,Т,0 58-Е,0,0.0 94-1, N/1" 124-1,ЦР 166-0,Е,К,0,У

1Я-0,Р,\У,ЕД 42-0,N,5,Т.К. 61-0,Е,Н 98-1,ЦМД,Т 125-А,8,Т,У 167-03,

19-ав,к,о 43-ОДОД 65- О.Е,0Д 102-0,Е,Н,У 127-ЫДК 170-СДД

20-Р.5 44-КД.О 68-КДД.,А 104-0,Е,0 128-Е,К,0,О 171-Н.УД

46-Е,Л 71-А,8,Т,Е,К. 105-1.,Р,Т,5,А 131-11Л,8,Н 173-О,Е,К,0,У

22-1,Р,У 47-Р.ОЛ 75-Й.Р 106-0,0,У,Н 13б-А,С,У 175-О,0

8о-ол,ус,т ю7-ало^ 137-М,0,Е,0 176-К,Ы

24-А,8,Т,Е,1 49-А,Б,У 81-АД,ЦМ,Т 109-ЦК,Р,Р 139-АД,М,У,Т >77-А,О.Е,К

29-0,А 50-11,0, Р 82-ЦОД 1Ю-1.ДДД 141-Ц0Д

Вариабельные остатки (свыше 3 аминокислотных замен)

9- К,Е,ГХИ,Н,У,Р,5,Т,У,ЦС,0 - 11 108-А,8^,Н,РД-5

11-Л,3,Т.О,У,У 114- 8,И,О,Е,0Д,Н,У,\У,Р>1.,М,У,0 - 11

4!-А,0,Е,К,РД,Т,У-6 116-0,Е,Н,УД^ХМУДД - 7

45-Л.0,Е,К,РЛМ,М,У,Т,О - 7 121 -А,С,ЦР,К Д ,Н — 6

62-Е,0Д,О,ЦР -5 138-А,К,Е,1.,М,У,ТД-5

63-Е,ОД,1,Н,А -5 ]42-],У,ТЛ,КД-5

145-ОД,Т,8.>1,Н-4

67-А,5,Т,С,Р,У ЛМ.УХ - 5 147-А,8,КДД,,М,\У-4

69-А,5,К.О,Е,8,Т,ОД,11Лг - 9 149-АДЕ,0Д,Т,У,О-7

150-ААТ,ЕД),0-4

72-0,ЕД,Н,\У,Ь - 5 152-Л,Т,Е,0,Ч У.Ш.У Д - 7

73-ЛД,М,0,Р,1и"Ж1,У,Ь - 8 154-А,0,Е,К,0,0-4

74-Л,8,КО,Е,Н,У,Р,С- 8 155- Б.Ы.ОДД.О.ИЛ.У.Ь.У.Т -9

76-А,8.Е.О,У,Ь -4 156- 8,О,Е,К,0Д,Р,У,Н,\У,1,М,У,и 8

77-Л,5,1ШО,У,У -б 158-Л,8,Т,И,1,У -4

79- 4М,ПХ,0Д,С1 - 5 163-Л,Е,К,0Д,Т,ЦУ,Р - 6

95-Р,У,1,ЦУДЛУ-4 169-А Д1,К,Н,0,Р - 6

97-А,5,М,0,Е,К,ОД,и.,М,У,Т,\У,У,0-Ю !74-1,ЦМ,0,М,Н,КД,Т-5

99 Л.ЗДУ.НЛУ.С - 6 178 А.8,ТДДМ-4

Из 179 аминокислотных остатков 52 являются инвариантными либо представлены "молчащими" заменами. Подавляющее большинство остатков (89) консервативны и могут быть представлены не более чем пятью заменами. Вариабельные остатки, представленные шестью и более вариантами замен, обнаруживаются в 38 позициях двух первых доменов. Мутации в местах контакта а-спиралей с р-слоями часто обнаруживаются у Ьт-мутантов. В частности, в мутантных формах КЬт8 и К1""1 аминокислотные замены присутствуют исключительно в таких позициях. Таким образом, мутация в области взаимодейс твия а-спирали с р-слоем может быть достаточным условием для возникновения аллоантигенных свойств у молекулы МНС. Обнаружение мотива в структуре молекул МНС позволило оценить сходство первичной структуры молекул МНС классов I и II, учитывая весь спектр аминокислотных замен, которые могут присутствовать в каждой позиции. Сопоставление гомологичных участков р-цепей молекул МНС класса II и аг-домена молекул МНС класса I привело к

обнаружению фрагмента АА63-73 Ар-цепей и АА69-79 Ер-цепей, в

** ** *****

Ар* 63 ЕКТЯАЕЬРТУС 73

Ей ЯА С

Н-2КЬ 154 ЕЮ-ЛАУЬЕСТС 164 Е+ ИА ++ С

Ер4 69 ЕОКИААУОТУС 79

***** *** *

Рис. 7. Сходство первичной структуры региона АА154-164 молекулы МНС класса I с гомологичными участками молекул МНС класса II. Знаком (+) отмечены консервативные замены аминокислот, знаком (*) отмечены аминокислотные остатки молекул МНС класса II, встречающиеся в гомологичных позициях молекул МНС класса I и, таким образом, соответствующие каноническому мотиву, описанному в таблице 9.

котором имеет место высокая степень соответствия мотиву, выявленному в участке АА154-164 молекул МНС класса I. Как видно на рисунке 7, в двух аллельных формах молекул МНС класса II мыши - Арк и Ер4 - 9 аминокислотных остатков из 11 могут быть обнаружены в соответствующих позициях молекул МНС класса I плацентарных млекопитающих. Такая "комбинационная гомология" не является случайной, так как на пространственных моделях этих аллельных форм молекул МНС выявленный участок перекрывает область излома альфа-спиральной структуры, присутствующий в полипептидных цепях обоих типов молекул. Пространственная локализация гомологичных

аминокислотных остатков этих типов молекул тоже совпадает. Исследование Lawren С. Wu из группы Mark М. Davis показало, что фрагмент АА64-73 ß-цепи молекулы МНС класса II Еч наиболее сильно влияет на стабильность связывания молекулы МНС с TCR, что предполагает его "якорную" функцию в узнавании молекулы МНС Т-клеточным рецептором. Таким образом, выявленный нами участок может формировать консервативный эпитоп, служащий своего рода "якорем", который позволяет Т-клеточному рецептору "увидеть", что перед ним - молекула МНС и отличить ее от прочих полипептидов.

2.3.6. Использование древовидных пептидов с последовательностью "якорного" эпитопа для стимуляции клеточного иммунитета и воздействия на внутритимусную селекцию Т-клеток

Идентификация эпитопов, обеспечивающих узнавание Т-клеточным рецептором молекул МНС, может иметь важное значение для создания новых типов иммуностимуляторов и адъювантов. Получение их в форме синтетических пептидных конструкций, не требующих процессинга и презентации антигена в АПК реципиента, позволило бы решить проблему малой эффективности пептидных вакцин, обусловленной аллельной гетерогенностью МНС реальных популяций. Потенциальная способность таких конструкций воздействовать на процессы внутри-тимусной селекции могла бы дать средства для коррекции репертуара Т-лимфоцитов. В начале 90-х нами были показаны супрессорные свойства линейных пептидов молекулы МНС класса I Н-2КЬ с последовательностью областей контакта молекулы с TCR и не содержащих мотивы для связывания с молекулами МНС реципиента

158

AYLEGECVEWLH AYLEGECVEWLH AYLEGECVEWLH AYLEGECVEWLH

175

RYLKNG-GKC {Pyr-5)

RYLKNG-GKC (Pyr-5)

RYLKNG-GKC (Pyr-5)

RYLKNG-GKC (Pyr-5)

^Orn ßAla К / \

Orn G-OH

K \ /

^Orn ßAla К '

Рис. 8. Структура тетрамерного пептида с последовательностью АА158-175 сайта аг-домена молекулы Н-20ь (Н-21А Н-21_ч, Н-20Ч), контактирующего с ТСЯ.

Таблица 10. Влияние иммуяиаации кыагай различит линий те'1'fi«пером АА158-175 молекулы H-2Db на пролиферативяме отвеете сплеиоцитов a KLR череа рааличнпе сроки после иммунизации.

Стимуляторы Индексы стимуляции пролиферативного ответа 1 мышей

BI0.D2 (jCfDV) СЗН IK'lVL1) B10.A(4R) kW)

Через 10 дней Через 20 дней Через 10 дней Через 20 дней Через 10 дней Через 20 дней

Тетрамер 0,1 мкг/мл 1 мкг/мл 10 мкг/мл 1,12 2,93 5,79 1,64 1,85 1,17 2,32 2Д7 2,28 1,7 1,64 1.7 1,84 2,64 3,03 ND ND ND

Спонтанная пролиферация 2,63 1,59 2,63 1,48 2,57 1,37

Сингенная пролиферация 2,43 7,22 3,17 1,79 2^2 3,3

Аляогенная пролиферация 2,89 2,56 2,67 1,6 2,15 1,6

Аллогенвые стимуляторы в MLR М01 (кУо*) RIO! (KW) B10.AT4R) (К"1кГП В10.А^) (КТО") В10.Ш B10.D2 (Kdr*D'iLi)

Индексы стимул и п*ги подсчитаны как отношение пролнфератвввых ответов (СРМ) иммунных животных к ответам иенммуиизвровяниых.

Контроль

Тетрамер Кк

Тетрамер Кь

-р.->

Ahth-CD«2L-FITC Аятн-С044-РЕ

Рис. 9. Экспрессия актияационных маркеров на Т-лимфоцитах С04+ лимфатических узлов мышей линии С57В1./10 через 12 дней после иммунизации тетрамерами АА158-175 молекул Н-2Кк и Н-2КЬ.

[Brondz B.D., et al., 1995; Kazanskii D.B., et al., 1999]. Впоследствии для усиления иммуногенных свойств мы использовали их олигомеризацию с использованием технологии синтеза древовидных пептидов [Скляров Л.Ю., Николаев А.Ю., Копина H.A., 1988]. Структура одного из таких пептидов показана на Рис. 8. Однократная подкожная иммунизация такой конструкцией в дозе 100 мкг без применения адъювантов приводит к стимуляции иммунного ответа мышей различных линий как на сам тетрамер, так и на аллогенные молекулы МНС, в том числе и слабо иммуногенные (Табл. 10). Стимуляция ответов на сингенные стимуляторы в MLR, наблюдаемая у реципиентов всех линий указывает на то, что периферический репертуар Т-лимфоцитов у мышей, иммунизированных пептидом, изменен. Стимуляция имеет место независимо от того, экспрессируется последовательность звеньев тетрамера в составе молекул МНС реципиента или нет, что предполагает распознавание этой конструкции Т-лимфоцитами без участия эндоцитарного процессинга и разрушения мультиплетной структуры. Через 10-12 дней после подкожной иммунизации тетрамерами, содержащими последовательности АА158-175 молекул H-2Db, H-2Kk и Н-2КЬ в лимфатических узлах и селезенке реципиентов различных линий обнаруживается увеличение доли клеток CD4+, составляющее от 2 до 12%, что вполне сопоставимо с ответами на аллоантигены in vivo (данные не представлены).

Иммунизация мультиплетным пептидом АА158-175 молекулы МНС Н2-Кк приводит к увеличению доли Т-клеток CD4+ с активационным фенотипом в лимфатических узлах экспериментальных животных. На рисунке 9 представлены качественные результаты такого эксперимента, показывающие изменения профиля экспрессии активационных маркеров CD62L и CD44, Т-лимфоцитами CD4+ лимфатических узлов под воздействием иммунизации тетрамерами с последовательностью контактных участков а2-ДОменов молекул Н-2Кк и Н-2КЬ. Активация Т-клеток сопровождается снижением поверхностной экспрессии рецептора хоминга в лимфатические узлы CD62L и усилением экспрессии рецептора гиалуроновой кислоты CD44, что позволяет Т-клеткам изменять пути миграции и проникать в сайты воспаления. Результаты количественного анализа показаны в таблице 11. Как следует из таблицы, подкожная иммунизация мышей линии C57BL/6 тетрамером АА158-175 Кк в дозе 100 мкг приводит к 60-65% увеличению абсолютного числа клеток CD4+CD62L|0W в селезенке и в лимфатических узлах.

Таблица 11. Влияние тетраыерое АА158-175 молекул К* и К*1 на еоопкяашп субпопуляций я лимфатических умах и селеаеяхе мшей С57В1./10 (%%)

Субпопуляции клеток периферических лнмфоидных оргавов

С04+СГ)621_к' €04*0044* СОЗ+ Р10104'0'8М+)

Мононуклеары лимфатически! узлов (%%)

Конт. 17,28±1,1б 26,74+2,3 22±0,45 46,08+0,83

К* 22,67±0,97* 34,51 ±0,5 21,6+1,31 36,14±2,24*

Кь 22,24±1* 27,99±1,62 24,86±2,07 45,93±4,33

Мононуклеары селезенки (%%)

Коят. 38,97±1,13 36,65±3,24 12,56±2,7 49,16±3,7

К1 43,3610,96« 43,61±0,51 12,18±1,71 4335±3,81

кь 40,42±2,42 37,65±1,18 16,66±0,12 48,32±1,6

Мононуклеары лимфатических узлов (х 10*)

Конт. 0,83±0,04 1,28±0,09 3,81±0,075 7,97±0,14

К1 1,38±0,115» 2,11±0,29* 4,53±0,63 7,5±0,13

кГ 1,09+0,03» 1,38±0,015 4,63+0,3* 8,58±0,97

Мононуклеары селезенки (х 10*)

Конт. 3,33±0,64 3,09±0,41 5,14±1,74 19,73±4,05

К' 5,4±0,58* 5,43±0,53 7,9±0,71 28,39±1,19

К" 3,76±0,075 3,51+0,17 7,55±0,75 21,82±1,6

Примечание: * -достоверные отличия от ответа иитактных животных. Мононуклеары лимфатических узлов получали из паховых, подмышечных и подключичных лимфатических узлов

Снижение плотности маркера С0621 сопровождается одновременным увеличением плотности активационного маркера С044. Оценка биологической активности тетрамера АА158-175 Кь показала менее выраженные эффекты введения препарата (12% увеличение абсолютного числа клеток С04+С0621,о,¥ в селезенке и 30% - в лимфатических узлах при отсутствии увеличения числа клеток с высокой плотностью С044). Таким образом, тетрамеры с различной первичной структурой в различной степени активируют Т-лимфоциты с хелперной функцией. Важно то, что тетрамеры АА158-175 молекул Н-2Кк и Н-2КЬ не содержат мотивов для связывания с известными классическими и неклассическими молекулами МНС мышей линии С57В1./10. Таким образом, различия в их биологической активности не могут быть объяснены различиями в эффективности их презентации молекулами МНС реципиента, что предполагает возможность их прямого взаимодействия с рецепторами Т-клеток.

Таблица 12. Сравнительное исследование влияния древовидного татраиера участка АЛ 158-175 молекулы Н-20ь и тетрамара с обратной последовательностью аминокислот на соотношение основных популяций бласто» а органных культурах эмбрионального тимуса шавй В10.02

Эксперименталь ные группы Субпопуляции клеток тимуса (%%)

СЭ4+С08~ С04*СБ8* С04~С08~ СЭ4~С08+

Контроль 40,34 4,24 39, 42 15, 92

«антисенс» 100 нг/ыл 44,53 5,41 37,53 12,53

Тетрамер АА158-175 Н-20" 100 нг/мл 33,74 5,69 47,78 12,7

«антисенс» 5 мкг/мл 32,91 5,7 48,65 12,79

Тетрамер АА158-17 5 Н-2СЬ 5 мхг/мл 24,91 3,63 55,21 16,25

Контроль

«Антисенс», 100 нг/мл Тетршкер, 100 яг/мл

ив* № 1Ь*

да"——ж1—То-

•О1 1С1 Го* 10' 1П' 10* л1 Т(Т*

VI1 -V 7:1< а*

Аити-СМ-ПТС

Рис. 10. Появление клеток С03"С04+С08" под воздействием мультиплетного тетрамера пептида АА158-175 молекулы Н-20ь на органные культуры тимуса. В верхнем ряду -анализ клеток С04+С08", 8 нижнем - С04"С08+.

Полученные результаты убедительно свидетельствуют о способности тетрамерных конструкций к активации хелперных клеток CD4+. Представляло большой интерес исследование возможности стимуляции противоопухолевого ответа с применением моделей, в которых показана зависимость индукции противоопухолевых CTL от хелперных клеток. Одной из таких моделей является система иммунизации мышей bm1 клетками тимомы EL4 [Tomita Y., et al., 1990]. По сравнению с мышами дикого типа (C57BL/6) у мышей bm1 имеют место три аминокислотные замены в позициях АА152, 155 и 156 a-спирали домена а2 молекулы Н-2КЬ. Несмотря на то, что эти антигенные различия оказываются достаточными для протекания MLR in vitro и индукции CTL CD8+, ответ на опухолевые клетки in vivo оказывается неэффективным и животные погибают при введении относительно небольшого количества опухолевых клеток ( 103-106). Реципиентам bm1 по схеме (-7-5-3) до переноса опухолевых клеток в дозе 2 х 10е, вводили по 30 мкг тетрамеров АА158-175 молекул H-2Db, H-2Kk и H-2D" с инвертированной последовательностью аминокислотных остатков ("антисенс"). Средняя продолжительность жизни в контроле составила 26,7 ± 2,3 дня (17 животных), в группе, получившей "антисенс" - 21,2 ± 2,1 (10 животных), тетрамер H-2Db - 25,9 ± 1,6* (10 животных), тетрамер Н-2К" - 47 ± 4,0* (10 животных, Р < 0,001). Таким образом, древовидные тетрамеры с последовательностью "якорного" участка домена а2 обладают потенциалом для терапии иммуногенных вариантов злокачественных опухолей, а для механизма их действия характерна сиквенсная специфичность.

Четкие результаты, показывающие сиквенсную специфичность тетрамера АА 158-175 молекулы H-2Db, были получены также при исследовании влияния концентрации обоих препаратов на дифференцировку тимоцитов в органных культурах эмбрионального тимуса. В культуре in vitro присутствие тетрамера приводит к снижению доли клеток CD4+CD8' и увеличению CD4'CD8" (Табл. 12). Этот эффект сопровождается существенным увеличением процента клеток CD3' в популяции CD4+CD8" и менее значительным в популяции CD4'CD8+ (Рис. 10). Он может быть обусловлен активацией развивающихся Т-клеток CD4+ и делецией части клонов Т-клеток, аналогичной делеции, вызываемой суперантигенами. С другой стороны, снижение доли клеток CD4+CD8' на фоне отсутствия существенного влияния препарата на фракцию тимоцитов CD4+CD8+ может указывать также на возможность замещения тетрамером

Таблица 13. Влитие древовидного тетрамера участка АЛ 158-175 мол «хулы Н- 2К* на баланс субпопуляций тшацяюв CD3+ в органных культурах эмбрионального «nqrca иапй B10.D2 на 7-й дю культивирован**

Тетрамер, нг/мл Субпопуляции тимоцитов CD3*

Общая CD4* CD4+CD8+ CD4'CD8" CD8*

Контроль 19,79 4,43 6,8 73,43 15,33

0,1 27,75 7,3 21,06 47,53 24,1

1 27,51 9,29 23,43 48,13 19,5

10 28,35 11,0 18,45 55,21 15,34

100 0,23 0,09 0,23 96,95 2,72

естественных пептидов, связанных в тимусе с молекулами МНС класса II. Это может приводить к модификации процессов внутритимусной селекции подобной той, которая наблюдается в моделях "single МНС-peptide ligand".

Добавление в органные культуры тимуса "чужеродного" тетра-мера АА158-175 Н-2К" в малых концентрациях 0,1-10 нг/мл приводит к выраженному увеличению доли тимоцитов, экспрессирующих CD3, наблюдающееся в субпопуляциях CD4+, CD8+ и CD4+CD8+, что может рассматриваться как следствие увеличения эффективности позитивной селекции {Табл. 13). Добавление тетрамера H-2Db в тех же концентрациях приводит к тому же эффекту, но менее эффективно (данные не представлены). Вполне вероятно, что регион молекулы АА 158-175, перекрывающий область аномальной укладки а-спирали, "узнается" в ходе позитивной селекции, что обусловливает различия в биологических эффектах тетрамеров, один из которых является "своим" (последовательность тетрамера H-2Db присутствует в молекуле Ld и поэтому не приводит к существенному увеличению ее эффективности), а другой - "чужеродным" (Н-2Кк, и поэтому приводит к позитивной селекции дополнительной части репертуара).

Принципиальная новизна полученных результатов состоит в том, что впервые удалось управлять процессами позитивной и негативной селекции репертуара Т-клеток в тимусе мышей дикого типа, применяя полностью синтетические пептидные конструкции без использования методов генетической модификации реципиентов. Эти результаты представляют особый интерес ввиду открывающихся возможностей коррекции репертуара Т-клеток, что представляет особый интерес для онкологов как возможная альтернатива использованию адоптивной иммунотерапии аллорестриктированными Т-клетками.

ВЫВОДЫ

1. Первичный иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей сопровождается накоплением активированных нейтрофилов CD31' CD80+ в селезенке реципиентов. Эта реакция зависит от специфического распознавания аллогенных молекул МНС класса I Т-клетками CD8+ и не зависит от корецептора CD4 Т-хелперов и костимуляторного рецептора CD40 на АПК реципиента.

2. Вторичный ответ на клетки аллогенных опухолей обусловлен прямым распознаванием аллоантигена рецепторами клеток памяти CD8+. Их ответ поляризован и сопровождается супрессией ответа других субпопуляций Т-клеток - хелперов CD4+ и наивных клеток CD8+.

3. Исследование специфичности репертуара Т-клеток, отвечающих на клетки аллогенных опухолей in vivo, показало, что механизм прямого аллогенного распознавания является ведущим в ответе иммунной системы на клетки аллогенных опухолей.

4. Синтетические древовидные пептиды с последовательностью "якорного" участка молекулы МНС класса I способны вызывать иммунный ответ Т-клеток CD4* и модифицировать процессы внутритимусной селекции Т-клеток.

5. Единый план строения классических молекул МНС класса I у млекопитающих обусловлен наличием в их первичной структуре инвариантных аминокислотных остатков, взаимодействие между которыми определяет взаимное расположение a-спиралей и (3-слоев. Инвариантные остатки формируют единый мотив, общий для молекул МНС этого типа у млекопитающих.

6. Идентификация единого мотива молекул МНС класса I позволила обнаружить участок, в котором имеется структурное сходство между молекулами МНС классов I и II. Этот участок, локализованный в районе аномальной укладки a-спирали а2-домена молекул МНС класса I и р-цепей молекул МНС класса И, может играть роль "якоря" для взаимодействия с Т-клеточным рецептором.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Арцимович Н.Г., Ломакин М.С., Казанский ДБ. Биологически активные молекулы, ассоциированные с клетками печени. Успехи совр. Биол , 1991, Т. 111, № 6, С. 931-946.

2. Kazansky D., Nastoyashchaya N., Lomakin M., Artslmovlch N. Immunosuppressive factor from liver and its influence on T cell development. Immunol. Lett., 1992, V. 33, N. 1, P. 9398.

3. Brondz В D., Kazanskii D В , Chernysheva A.D., Ivanov V.S , Ostrovskli A.G., Erokhin V.P. Use of peptides of major histocompatibility type I molecules for induction of specific T-sup-pressors in vivo in an allogeneic system and extending the life of a murine skin transplant. Mol. Biol. (Mosk), 1994, V. 28, N. 5, P. 1113-1120.

4. Brondz B.D., Kazanskii D.B., Chernysheva A.O., Ivanov V.S., Ostrovskii A.G., Erokhin V.P. Use of histocompatibility class I molecule peptides for in vivo induction of specific T-sup-pressors in allogenic systems and prolongation of mouse skin graft life. Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk, 1995, V. 4, P. 38-42.

5. Kazansky D.B., Agranovich I.M., Azhipa O.Y., Shtil A.A., Anosova N.G., Chernysheva A.D., Brondz B.D. Immunosuppressive factor from liver induces apoptosis in thymoma EL-4 cells but not normal MHC class li-specific T lymphocytes. Immunol. Lett., 1995, V. 45, N 1-2, P. 5-11.

8. Brondz B.D., Kazansky D.B., Chernysheva A.D., Ivanov V.S. Peptides of a major histocompatibility complex class I (Kb) molecule cause prolongation of skin graft survival and induce specific down-regulatory T cells demonstrable in the mixed lymphocyte reaction. Immunology, 1995, 86 (2): 219-223.

7. Chernysheva A.D., Brondz В D., Anosova N G., Boiko R.Z., Aizenberg L.V., Kazanskii D.B. Functional characteristics of liver T-lymphocytes in the allogenic response to mutant MHC class I and II molecules. Mol. Biol. (Mosk), 1996, V. 30, N 3, P. 721-728.

8. Brondz В D., Kazanskii D.B., Chernysheva A.D., Pavlova T.N., Ivanov V.S. Differences in recognition of peptides of the MHC H-2Kb molecule between cytotoxic T-lymphocytes, memory cells, and T-suppressor cells, specific for alloantigen H-2Kb. Mol. Biol. (Mosk), 1996, V. 30, N 1, P. 156-162.

9. Kazansky D., Chernysheva A , Abronina I , Anosova N., Sernova N., Rodin D., Aizenberg L. The allospecific response of intrahepatic T lymphocytes. Immunol. Lett., 1997, V. 56, N. 1-3, P. 197-198.

10.Казанский Д.Б., Чернышева А.Д., Сернова Н.В., Петрищев B.H., Побезинский Л.А., Агафонова Е.Л. Природа эпитопов, распознаваемых T-лимфоцитами в аллогенном иммунном ответе. Мол. Биол., 1998, Т. 32, № 4, С. 692-702.

11.Kazanskii D.B., Chernysheva A.D., Sernova N.V., Abronina I.F., Anosova N.G., Rodin D.V.,Pobezinskii L.A., Agafonova E.L. Functional properties of hepatic T-lymphocytes from mice immunized with an alloantigen in vivo. Mol. Biol. (Mosk)., 1998, V. 32, N. 6, P. 10361043.

12.Казанский Д.Б., Петрищев В.Н., Штиль А.А., Чернышева А.Д., Сернова Н.В., Абронина И.Ф., Побезинский Л.А., Агафонова Е.Л. Использование теплового шока антигенпрезентирующих клеток для функционального тестирования аллоспе цифических T-клеток памяти. Биоорг. Химия, 1999, Т. 25, С. 117-128.

13.Казанский Д.Б., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Петрищев В.Н., Агафонова Е.Л., Сернова Н.В., Лим Д.А., Силаева Ю.Ю., Скляров Л.Ю., Сбитнева И Н., Копина Н.А. Использование мультиплетных пептидов для форсификации вакцин, стимулирующих специфический клеточный иммунитет Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 1999. №9. С 57-60.

14.Kazansky D.B., Petrishchev V.N., Lim D.A., Silaeva Y.Y., Anfalova T.V., Khromykh L.M. Heat shock of APC results in profound decrease in constitutive expression of CD80 and CD86:

Implication for expression of different patterns of cytokines by naive and memory T cells. John Humphrey Course "Self tolerance and self-recognition", 2000, Sinaia, Romania, May 15-19, P. 44-45.

15. Antalova T.V., Khromykh I M., Kazansky О В., Petrishchev V.N. Anergic CTL as suppressor cells in vitro. Role of cytokines John Humphrey Course "Self tolerance and self-recognition", 2000, Sinaia, Romania, May 15-19, P. 22-23.

16. Д.Б.Казанский, Ю.Ю.Силаева, Т.В.Анфалова, Л.М.Хромых, В.Н.Петрищев, Л.А. Побезинский, Е.Л. Агафонова, Л.Ю. Скляров, И.Н. Сбитнева, Н.А. Копина, И.Г. Сидорович. Использование мультиплетных пептидов для стимуляции специфического клеточного иммунитета. Аллергия, астма и клиническая иммунология 2001, N. 1, С. 48-51.

17. Golovkina Т., Agafonova Y., Kazansky D., Chervonsky A. Diverse repertoire of the MHC class ll-peptide complexes is required for presentation of viral superantigens. J. Immunol., 2001, V. 166, N. 4, P 2244-2250

18. Д.Б.Казанский. Памяти Бориса Давидовича Брондза Иммунология, 2001, №5, С. 58-61.

19. Д.Б.Казанский. Современные проблемы иммунологии опухолей. "Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии", Оренбург, 2001, С. 36-

к 43"

20. Kazansky О.В., Pobezinsky L.A., Pobezinskaya E.L., Petrishchev V.N., Tereshchenko T.S , Anfalova T.V., Khromykh L.M., Skliarov L.Yu., Kopma N.A., Sidorovich 1.6. New synthetic ligands for TCRs: multiplet peptides with the sequences of MHC molecule site contacting with TCR. 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology, Molecular basis of the immune response, Pushchino, September 15-22, 2002, P. 50-51.

21. Pobezinskaya Y.L., Pobezinsky LA , Tereshchenko T.S., Petrishchev V.N., Kazansky D.B. Memory cells influence proliferation of naive cells in response to alloantigen. 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology, Molecular basis of the immune response, Pushchino, September 15-22, 2002, P. 106-107.

22. Pobezinsky L.A., Pobezinskaya Y.L., Tereshchenko T.S., Kazansky D.B., Chervonsky A.V. T cells with autoreactive TCRs escape negative selection by substitution of CD4 co-receptor to CD8. 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology, Molecular basis of the immune response, Pushchino, September 15-22, 2002, P. 108-109.

23. Казанский Д.Б., Побезинский Л А., Побезинская Е.Л., Терещенко Т.С., Петрищев В Н., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Скляров Л Ю., Копина H.A., Сидорович И.Г. Исследования механизма действия и биобезопаскости применения синтетических древовидных (мультиппетиых) пептидов для использования в качестве форсификаторов иммунного ответа на слабые иммуногены опухолевых клеток. Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003, №9, С. 79-83.

24. Л.А.Побезинский, Е.Л.Побезинская, Т С.Терещенко, А В.Червонский, Д.Б Казанский. Периферический пул Т-клеток CD8+ содержит лимфоциты с антигенспецифическими рецепторами, распознающими сингенные молекулы МНС класса II. Онтогенез, 2004, Т. 35, N»3, С. 183-189.

25. Побезинская Е.Л., Побезинский Л А., Силаева Ю.Ю., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Терещенко ТС., Звездова ЕС, Казанский ДБ Кросс-реактивность Т-клеточного рецептора клона клеток памяти С08+, полученного в ответе на иммунизацию клетками аллогенной опухоли. Бюлл. эксп. биол и мед , 2004, Т. 137, №5, С. 563-568.

26. Д.Б. Казанский, Л.А. Побезинский, Т.С. Терещенко. Мотивы в первичной структуре молекул МНС класса 1 и их использование для создания синтетических лигандов Т-клеточных рецепторов. Вестник РАМН, 2004, № 12, С 25-32.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н И Вяохпиа РАМН Подписано в печать 24 . 02 . 05 Заказ № 146 Тираж 100 экз

РЫБ Русский фонд

2007-4 4487

0 9 Й1С:!2005

*! з т' /

Начало развитию современной иммунологии и генетики тканевой совместимости положили достижения экспериментальной онкологии. Еще в начале прошлого века многие исследователи пытались понять, какой дефект вызывает бесконтрольный рост клеток опухоли. Находится ли он исключительно в злокачественно трансформированной клетке или в организме, в котором она появилась. В попытках ответить на этот вопрос исследователи выделяли кусочки опухолевой ткани и трансплантировали их здоровому хозяину. Но результаты были крайне противоречивы. Иногда трансплантированные опухоли росли в организме нового хозяина и даже поддерживались пассированием от одного животного другому, но затем необъяснимо и неожиданно погибали. В других случаях пересаженные опухоли не росли совсем. Объяснение этому было получено лишь спустя полвека, когда были выведены генетически чистые линии инбредных животных и открыты законы трансплантации [Gorer Р.А., 1937; Snell G.D., 1948]. Комплекс генов, кодирующих антигены гистосовместимости донора, был локализован в 6-й хромосоме у человека (в 17-й хромосоме у мыши) и назван главным комплексом гистосовместимости (МНС), тогда как само отторжение оказалось функцией клеток реципиента, происходящих из тимуса - Т-лимфоцитов. Главной особенностью молекул МНС оказался исключительно высокий аллельный полиморфизм, тогда как важнейшей чертой Т-лимфоцитов оказалась клональная организация их репертуара. Способность Т-лимфоцитов к прямому взаимодействию с аллогенными клетками и их лизису в культуре in vitro показала, что антигенспецифические рецепторы Т-лимфоцитов непосредственно распознают аллогенные молекулы МНС. Более того, Т-лимфоциты оказалось возможным разделить по специфичности к отдельным аллельным продуктам МНС [Brondz B.D., 1964; Brondz B.D., 1968; Brondz B.D., et al., 1975].

В сфере особых интересов иммунологов молекулы МНС оказались в связи со способностью связываться с антигенными пептидами белков внутриклеточных патогенных микроорганизмов и транспортировать их на мембрану клетки. Этот механизм, получивший название «презентации», дает иммунной системе возможность «заглянуть» внутрь клетки и «увидеть» в ней чужеродный или собственный мутантный протеин. Т-лимфоциты, индуцированные в ответе на вирус, специфически распознают антигены вируса в комплексе с молекулами МНС хозяина, но не с посторонними (феномен МНС-рестриктированного распознавания) [Zinkernagel R. М., Doherty Р. С., 1974]. Молекулярная основа этого явления состоит в том, что различные аллельные формы молекул МНС связывают пептиды, содержащие в своей первичной структуре различные мотивы [Fallc К., et al., 1991]. Это открытие сделало возможным направленный поиск потенциально иммуногенных фрагментов белкового антигена, зная лишь последовательность аминокислот в молекуле антигена и спектр аллельных форм продуктов МНС реципиента [Rotzschlce О., Falk К., 1994]. Открытые закономерности оказались справедливыми для широкого ряда экспериментальных систем - ответов CTL CD8+ на антигены вирусов, опухолей и бактерий с внутриклеточной локализацией, ответов клеток CD4+ на минорные антигены гистосовместимости и экзогенные белки. Они нашли применение в исследованиях механизмов центральной толерантности и аутоиммунных заболеваний. Широкий фронт работ, проводимых иммунологами-инфекционистами, привел к осознанию того факта, что не все клетки организма способны эффективно презентировать антигены Т-клеткам. Для этого нужны так называемые «профессиональные» антигенпрезентирующие клетки (АПК) - дендритные клетки, В-клетки и макрофаги, способные в дополнение к антигенспецифическому сигналу предоставить Т-клетке костимулирующий сигнал. Поскольку конститутивная экспрессия главного костимулирующего лиганда В7-1 (CD80) имеет место лишь на дендритных клетках организма, именно им отводится центральная роль в инициации первичных иммунных ответов. Эти представления в виде «обратной волны» вернулись в область исследований трансплантационного и противоопухолевого иммунитета. Появилось множество работ, исследующих механизм «непрямой» презентации аллоантигенов (аллоантигенов, процессированных дендритной клеткой реципиента на пептиды и представленных в комплексе с молекулами МНС класса II реципиента) и «кросс-примирования» (переноса антигенного пептида из погибшей клетки трансплантата в дендритную клетку хозяина в комплексе с белком-шапероном для последующей презентации в комплексе с молекулой МНС класса I хозяина). Многие стратегии предотвращения отторжения пересаженных органов и тканей строятся на блокаде костимуляторных лигандов и рецепторов. Напротив, стимуляция созревания дендритных клеток и усиление их антигенпрезентирующих и костимуляторных функций в значительной мере определяют стратегию иммунотерапии злокачественных новообразований.

Вместе с тем, очевидно, что эти представления вошли в конфликт с базовым феноменом клеточной иммунологии - феноменом отторжения аллогенных опухолей. Несмотря на то, что опухолевые клетки лишь в редких случаях являются профессиональными АПК, в ответе на них у аллогенного реципиента индуцируются специфические CTL, убивающие опухолевые клетки, а не АПК реципиента, презентирующие их антигены. Несмотря на почти столетнюю историю этого феномена, мы почти ничего не знаем о механизмах презентации трансплантационных антигенов аллогенных опухолей. Индуцируют ли их аллогеиные молекулы ответ Т-клеток прямо, минуя дендритные клетки реципиента, как следовало бы ожидать, учитывая их специфичность к аллоантигенам опухолевого трансплантата (См. цветную вкладку)? Что является источником костимуляции их ответа? Имеет ли место кросс-реактивность рецепторов аллоспецифических клеток памяти с молекулами МНС реципиента, коэкспрессированными с аллогенной молекулой (что свидетельствовало бы о непрямом распознавании аллоантигена)? Каковы структурные основы аллогенного распознавания и почему Т-клетки распознают именно продукты МНС, а не другие макромолекулы? Существуют ли в молекулах МНС консервативные эпитопы, определяющие такую избирательность, и есть ли перспективы их практического использования?

Данная работа имеет целью определение роли и молекулярных основ прямого аллогенного распознавания в иммунном ответе на клетки аллогенных опухолей. Актуальность проблемы определяется тем, что иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей в эксперименте является одним из немногих примеров успешного распознавания опухолевых клеток иммунной системой хозяина и их последующего отторжения. Идентификация механизма распознавания молекул главного комплекса гистосовместимости аллогенных опухолей может дать важную информацию об особенностях этого типа иммунного ответа, отличающих его от иммунного ответа на аутологичные опухоли. В этой работе впервые показано, что на ранних стадиях первичного иммунного ответа Т-клеток CD8+ на аллогенные молекулы МНС класса I опухолевых клеток в селезенке реципиентов накапливаются клетки, сочетающие свойства активированных, нейтрофилов (Gr-1+CD1 lb+F4/80'CD31') и профессиональных АПК (CII+CD80+), которые являются возможным источником трапс-костимуляции ответа на аллогенные опухолевые клетки. Исследование специфичности поликлональных популяций и клонов клеток памяти показало, что прямое аллогенное распознавание является ведущим механизмом распознавания аллоантигенов опухолевых клеток. Полученные результаты не содержат оснований предполагать существенное вовлечение кросс-примирования или непрямой презентации аллоантигенов в ответ на клетки аллогенных опухолей. Молекулы МНС классов I и II млекопитающих содержат участок, в котором имеет место «комбинационная гомология», выражающаяся в совпадении спектра допустимых замен аминокислотных остатков. Он локализован в области аномальной укладки а-спирали домена аг молекул МНС класса I и Р-цепи молекул МНС класса II. Синтетические древовидные пептиды с последовательностью этого участка эффективно активируют Т-клетки CD4+, стимулируют ответ на слабо иммуногенные формы молекул МНС класса I и увеличивают продолжительность жизни мышей bml, получивших летальную дозу клеток тимомы EL4. В эмбриональных органных культурах тимуса эти пептиды влияют на процессы селекции и дифференцировки Т-клеток.

Цветная вкладка I.

Схематическое изображение проблемы, возникающей при распознавании аллоантигенов аллогеннмх опухолей

Непрямое аллогенное распознавание

Прямое аллогенное распознавание

Т-лимфоциты CD8 +

TCR, специфичный к сингенной молекуле МНС + аллогенный пептид X

TCR, специфичный к аллогенной молекуле МНС + аллогенный пептид У

Дендритная клетка реципиента

Клетка трансплантата

Согласно существующим представлениям, инициация иммунного ответа осуществляется дендритными клетками, обладающими свойствами профессиональных антигенпрезентирующих клеток. Чтобы устранить аллогенный трансплантат, Т-лимфоциты реципиента должны обладать специфичностью к аллогенной молекуле МНС + пептид У. Однако дендритные клетки экспрессируют молекулы МПС хозяина, которые презентируют пептиды антигенов трансплантата X, отличающиеся от пептидов Y. Таким образом, Т-лимфоциты, активированные дендритной клеткой хозяина, будут специфичны к сингенной молекуле МНС + пептид X и в силу этого не смогут устранить клетки трансплантата, экспрессирукяцие аллогенпую молекулу МНС + пептид Y. Это означает, что 1) либо непрямое распознавание не вовлечено в ответ на клетки ал л ore иных опухолей и распознавание идет по «прямому» пути, 2) либо индуцированные клетки совпадают по специфичности к сингенной молекуле МНС + пептид X и к аллогенной молекуле + пептид У и в силу этого будут перекрестно реагировать с обоими комплексами МНС/пептид.

ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Первичный иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей сопровождается накоплением активированных нейтрофилов CD31'CD80+ в селезенке реципиентов. Эта реакция зависит от специфического распознавания аллогенных молекул МНС класса I Т-клетками CD8+ и не зависит от корецептора CD4 Т-хелперов и костимуляторного рецептора CD40 на АПК реципиента.

Вторичный ответ на клетки аллогенных опухолей обусловлен прямым распознаванием аллоантигена рецепторами клеток памяти CD8+. Их ответ поляризован и сопровождается супрессией ответа других субпопуляций Т-клеток - хелперов CD4+ и наивных клеток CD8+.

Исследование специфичности репертуара Т-клеток, отвечающих на клетки аллогенных опухолей.in vivo, показало, что механизм прямого аллогенного распознавания является ведущим в ответе иммунной системы на клетки аллогенных опухолей.

Синтетические древовидные пептиды с последовательностью «якорного» участка молекулы МНС класса I способны вызывать иммунный ответ Т-клеток CD4+ и модифицировать процессы внутритимусной селекции Т-клеток.

Единый план строения классических молекул МНС класса I у млекопитающих обусловлен наличием в их первичной структуре инвариантных аминокислотных остатков, взаимодействие между которыми определяет взаимное расположение а-спиралей и Р-слоев. Инвариантные остатки формируют единый мотив, общий для молекул МНС этого типа у млекопитающих.

Идентификация единого мотива молекул МНС класса I позволила обнаружить участок, в котором имеется структурное сходство между молекулами МНС классов I и II. Этот участок, локализованный в районе аномальной укладки а-спирали аг-домена молекул МНС класса I и Р-цепей молекул МНС класса II, может играть роль "якоря" для взаимодействия с Т-клеточным рецептором.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю свою глубокую признательность своему первому учителю -Нелли Георгиевне Арцимовнч, ставшей моим первым проводником в мире иммунологии и людей науки, чьи благожелательные и мудрые уроки я никогда не забуду. Я глубоко благодарен Александру Андреевичу Ведерникову, который открыл мне мир иммуногенетики, ключевые положения и история Которой во многом способствовали становлению идейных основ этой работы. Я преклоняюсь перед светлой памятью Бориса Давидовича Бропдза, обучившего меня уникальным методам работы с Т-лимфоцитами и глубокому пониманию их биологии, чьи взгляды, научный опыт и гениальные прозрения стали фундаментом, на котором построена эта работа. Хочу также выразить свою глубокую признательность Александру Александровичу Ярилину - моему консультанту - за многолетнюю благожелательную поддержку и ценную помощь в совершенствовании диссертации. Я никогда не забуду исключительную благожелательность и добросовестность рецензентов этой работы - Николая Николаевича Туппцппа и Глены Григорьевны Славиной, чьи замечания оказали автору бесценную помощь в совершенствовании формы и содержания данной работы. Я выражаю свою глубочайшую благодарность Александру Викторовичу Червонскому за последовательную и, порой, яростную критику при разработке ключевых положений этой работы, без которой ее доказательная база не была бы столь основательной. Я никогда не забуду его неоценимую методическую помощь и поддержку, которые помогли лаборатории выстоять и продолжать работать в очень трудные для российской науки годы. Мой глубокий поклон Гарри Израилевичу Абелеву за его мудрые советы, благожелательную критику данной работы и поддержку лаборатории на всех этапах ее существования. Я также хочу выразить искреннюю признательность всем научным сотрудникам лаборатории -Татьяне Владимировне Анфаловой и Людмиле Менделевне Хромых и, в особенности, Леониду Александровичу и Елене Леонидовне Побезинским, чьи редкостные способности, трудолюбие и креативность внесли неоценимый вклад как в успех этой работы, так и в совершенствование методической базы лаборатории в целом. Эта работа не могла бы состояться без самоотверженных усилий и добросовестной работы Тамиллы Мусасвпы Эфсндпевоп, обеспечившей выполнение работы всем необходимым и ставшей настоящей «правой рукой» автора, давшей ему возможность сосредоточиться па решении чисто научных задач. Считаю также своим долгом поблагодарить всех других бывших и нынешних сотрудников лаборатории, внесших свой вклад в создание этой работы па разных ее этапах - Наталью Аносову, Ольгу Ажииу, Анну Чернышеву, Римму Бойко, Леонида Айзенберга, Валентина Петрищева, Дмитрия Лима, Юлию Силаеву, Татьяну Гриненко, Екатерину Звездову и Ирппу Батурину. Свою особую благодарность я хочу выразить бывшим и нынешним техническим сотрудникам лаборатории - Людмиле Дмитриевне Мезенцевой, Наталии Ивановне Китаевои, Светлане Вячеславовне Поспеловой, без добросовестного и самоотверженного труда которых эта работа не могла бы состояться.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Актуальность данной работы определяется тем, что иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей в эксперименте является одним из немногих примеров успешного распознавания опухолевых клеток иммунной системой хозяина и их последующего отторжения. Идентификация механизма распознавания молекул главного комплекса гистосовместимости аллогенных опухолей и субпопуляций клеток, участвующих в ответе, способна дать важную информацию об особенностях этого типа иммунного ответа, отличающих его от иммунного ответа на аутологичные опухоли. Понимание механизмов, лежащих в основе его высокой эффективности, может быть важным для разработки новых подходов к иммунотерапии опухолей в клинике.

В этой работе впервые показано, что адаптивный иммунный ответ на клетки аллогенных опухолей выражается в селективной экспансии Т-клеток CD8+. Впервые получены доказательства, что ведущим механизмом распознавания ими чужеродных молекул МНС является прямое аллогенное распознавание. Впервые показано, что в ответ на иммунизацию клетками аллогенных опухолей в селезенке реципиентов накапливается особая популяция нейтрофилов, экспрессирующих CD80 и молекулы МНС класса II. Эта реакция зависит от распознавания молекул МНС класса I Т-лимфоцитами CD8+ и имеет место у животных, с нокаутированными генами CD40 и CD4, что может свидетельствовать о ее независимости от профессиональных АПК реципиента.

Разработан метод селективного тестирования клеток памяти CD8+ по пролиферации в ответ на стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку. Впервые показано, что роль профессиональных АПК реципиента в пролиферативном ответе клеток памяти CD8+ на аллоантигены опухолевых клеток пассивна и сводится к предоставлению спектра костимуляторных сигналов, необходимых для пролиферации Т-клеток. Показана способность клеток памяти подавлять ответы наивных Т-клеток на тот же антиген in vitro и in vivo. Получен долгоживущий клон Т-клеток памяти CD8+, охарактеризована его специфичность, определен спектр продуцируемых цитокинов и первичная структура реаранжированных регионов цепей Т-клеточного рецептора. Анализ специфичности Т-клеточных гибридом, полученных из клеток памяти CD8+, показал, что их реакция на иммунизирующий аллоантиген подавляется антителами к этому аллоантигену, но не к молекулам МНС класса I реципиента. Этот факт свидетельствует о прямом распознавании аллоантигена Т-клетками памяти и противоречит как гипотезе о непрямом примировании аллореактивных

Т-клеток, так и их кросс-реактивности со «своим». С использованием реакции на ф стимуляторы мышей, нокаутированных по генам ТАР и р2-микроглобулина, показано, что распознавание аллогенных молекул МНС клетками памяти CD8+ требует наличия интактных молекул МНС на поверхности аллогенных клеток. Таким образом, распознавание молекул МНС является прямым и зависимым от пептидов. Впервые обнаружен мотив в первичной структуре классических молекул МНС класса I млекопитающих и охарактеризована вариабельность аминокислотных остатков доменов ai и а2. В регионе аномальной укладки ос-спирали домена а2 обнаружен участок максимального сходства с молекулами МНС класса II. Синтез этой последовательности в виде древовидных пептидов ® позволил получить конструкции, способные активировать Т-клетки CD4+ in vivo и усиливать ответы Т-лимфоцитов реципиентов на слабо иммуногенные • аллельные формы молекул МНС класса I. Подкожная иммунизация тетрамерами АА158-175 молекул МНС класса I приводит к достоверному продлению жизни реципиентов bml (KbmlIbDb), получивших летальную дозу клеток тимомы EL4. С использованием органных культур эмбрионального тимуса показана способность синтезированных конструкций стимулировать образование однопозитивных Т-клеток, экспрессирующих TCR и, таким образом, влиять на процессы внутритимусной селекции и дифференцировки Т-лимфоцитов. Отсутствие МНС-рестрикции действия тетрамеров свидетельствует о возможности их использования как адыовантов для стимуляции ответа на слабо иммуногенные антигены.