Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль печени в процессах периферической селекции антиген-реактивных клонов Т-лимфоцитов

1 »по

г \ ь*

На правах рукописи

ЧЕРНЫШЕВА Анна Дмитриевна

РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ПРОЦЕССАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ АНТИГЕН-РЕАКТИВНЫХ КЛОНОВ Т-ЛИМФОЦИТОВ

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте Канцерогенеза Онкологического Научного Центра Российской Академии Медицинских наук.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Б.Д. БРОНДЗ кандидат биологических наук Д.Б. КАЗАНСКИЙ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Ё.Г. СЛАВИНА доктор биологических наук, профессор В.Г.ГАЛАКТИОНОВ

Ведущая организация: Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских наук

—

Защита состоится " /9 " СС,0/( -У 1997 г. в "/3 " _час.

на заседании специализированного Ученого Совета (К.001.17.01) Онкологического научного центра РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе д.24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического Научного Центра Российской Академии Медицинских наук.

Автореферат разослан »<2 ?» ¿¿Cifl ГС/ 1997 г. Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета,

доктор медицинских наук, профессор B.C. Турусов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Исследование механизмов формирования антиген-распознающего репертуара Т-клеток памяти является одной из важнейших иммунологических проблем, так как этим клеткам принадлежит ведущая роль в защите организма от вторичного поражения патогеном, эффективность такой защиты обусловлена рядом свойств Т-клеток памяти, отличающих их от "наивных" лимфоцитов: 1) способностью к более быстрому достижению пика иммунного ответа при вторичном контакте с антигеном (Gray D., 1993; Bruno L., 1995); 2) простыми условиями их активации, что выражается в меньшей зависимости от функции костимулирующих молекул (Morokata T. et al., 1395); 3) высокой аффинностью их рецепторов и независимостью от корецепторных молекул (Sprent J., 1994). Не все из этих свойств клеток памяти могут быть объяснены простой экспансией антиген-реактивных клонов в первичном ответе, что ставит вопрос о существовании механизмов их периферической селекции.

Ряд данных литературы указывает на то, что возможным сайтом селекции и формирования специфичности Т-лимфоцитов памяти в организме является печень (Ohteki T. et al., 1992; Seki S. et al., 1994). В литературе описан феномен снижения экспрессии корецепторных молекул CD4 и CD8 Т-лимфоцитами печени, а также активно протекающий в печени процесс апоптоза Т-клеток, что может быть обусловлено различными элементами микроокружения, в том числе и факторами печени. Проведенные ранее исследования (Kazansky D.B. et al., 1994) показали, что иммунорегуляторный фактор ISFnp, продуцируемый перипортальными гепатоцитами печени, вызывает гибель клеток тимомы EL4 in vitro по механизму апоптоза. В последние годы выяснению механизмов и роли апоптоза уделяется большое внимание, так как он вовлечен в целый ряд процессов нормального развития организма и, в частности, в становление антиген-распознающего репертуара путем селекции клонов Т и В-лимфоцитов. Таким образом, представляло большой интерес выяснить, участвует ли ISFnp в процессе клональной селекции в печени.

Роль печени в формировании иммунной системы в эмбриогенезе исследована подробно, но о функционировании печени как органа иммунной системы взрослого организма известно крайне мало. Данные о происхождении и функциях Т-лимфоцитов печени, находящихся в этом

органе в тесном контакте с клетками Купфера и эндотелием синусоидов, крайне противоречивы. При этом почти ничего неизвестно об их специфичности и механизмах рестрикции. Поэтому определение фуккцйоиальных и фенотипических характеристик Т-клеток печени, а также выяснение их роли в развитии первичного и вторичного аллогенного ответа на антигены МНС I и II класса in vivo и in vitro весьма актуальны.

Цель и задачи исследования: Целью настоящего исследования является изучение роли иммуносупрессорного фактора ISFnp в иммунорегуляции и клональной селекции, определение функциональных и фенотипических характеристик Т-лимфоцитов печени, а также поиск экспериментальных оснований для гипотезы о возможности протекания процессов селекции Т-клеток памяти в печени.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи-.

1. Исследовать влияние ISFnp на специфичность вторичного аллогенного ответа in vitro.

2. Исследовать аллогенный ответ Т-лимфоцитов печени на мутантные молекулы МНС I и II класса in vitro, что позволило бы существенно прояснить происхождение и функции этих клеток.

3. Исследовать роль лимфоцитов печени в первичном и вторичном аллогенном ответе in vivo.

4. Разработать систему для функционального тестирования клеток памяти.

5. Выяснить, существуют ли различия в эпигопной специфичности Т-клеток памяти, выделенных из периферических лимфоидных органов и из печени.

Научная новизна

В работе получены экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу существования селекции Т-клеток памяти в печени.

Впервые показан эффект иммуносупрессорного фактора печени ISFnp на первичный и вторичный аллогенный ответ Т-лимфоцитов in vitro. Выявлено дозозависимое подавление фактором ISFnp пролиферации аллареактивных клонов Т-лимфоцитов. Показано, что воздействие ISFnp на активированные аллореактивные Т-лимфоциты in vitro приводит к усилению и возрастанию специфичности вторичного аллогенного ответа.

Проведено исследование функциональных и фенотипических

характеристик Т-лимфоцитов печени - наименее изученной популяции Т-клеток. Впервые демонстрируется их роль в развитии первичного и вторичного аллогенного ответа на антигены I и II класса МНС in vivo и in vitro. Принципиально новыми являются следующие факты.

Т-лимфоциты печени функциональны и подчиняются общим закономерностям МНС-рестриктированного распознавания антигенов; в популяции аллореактявных Т-лимфоцитов печени не выявляются Т-клетки с нарушенной комбинацией специфичностей Т-клеточного рецептора и корецепторной молекулы. Эти данные свидетельствуют о тимусном происхождении аллореактивных Т-лимфоцитов печени.

Впервые показано, что в отличие от других периферических Т-лимфоцитов Т-лимфоциты печени с фенотипом CD4 CD8 содержат клетки, пролиферирующие в ответе на аллогенные молекулы МНС I и II класса, т.е. получены дополнительные сведения, подтверждающие различные пути дифференцировки Т-клеток, приводящие к DN фенотипу, и разные функции этих клеток в лимфоидных органах.

Впервые in vivo показано обогащение популяции лимфоцитов печени функциональными аллоантигенспецифическнми эффекторными клетками (первичными CTL и супрессорами). Впервые показано, что популяция лимфоцитов печени мышей, примированных аллоантигеном, содержит Т-клетки памяти, отличающиеся по тонкой эпитопной специфичности от других периферических Т-клеток памяти, что может быть следствием селекционных процессов, которым подвергаются Т-лимфоциты памяти в печени.

Практическая значимость:

Полученные результаты проясняют вопрос о возможной физиологической роли ИСФнп, заключающейся в супрессии аутореактивных клонов Т-лимфоцитов, а также вучастии фактора в периферической селекции антигенреактивных клонов Т-лимфоцитов.

Получены данные, позволяющие составить достаточно полное представление о Т-лимфоцитах печени, их происхождении и функциях, а также позволяющие выдвинуть новую гипотезу о возможности протекания в печени селекции клонов Т-клеток памяти.

Разработана модель функционального тестирования Т-клеток памяти, т. е. подобраны оптимальные условия проведения реакции в MLC и определены сроки, при которых наблюдается максимальный и наиболее стабильный пролиферативный ответ Т-клеток памяти. Данный раздел работы имеет несомненную практическую ценность.

Апробация работы:

Апробация работы состоялась 16 декабря 1Э9В г. на объединенной научной конференции лабораторий: Механизмов регуляция «кмунхтота, иммунохимии опухолей, Противоопухолевого иммунитета.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе статьи в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения; главы, посвященной описанию материалов и методов исследования; 4 глав собственных исследований, каждая из которых состоит из обзора литературы, собственных результатов и их обсуждения; заключения и выводов. Библиография включает 134 источника. Работа содержит 8 таблиц и 11 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Лабораторные животные.

Использованные в работе линии мышей, получены из отдела разведения вивария ОНЦ РАМН и Научно-исследовательской лаборатории экспериментальных биологических моделей АМН питомника «Светлые горы». Гаплотипы использованных линий приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Линия мышей Аллели районов МНС

К Аа Тф Е/3 Еа

С57ВЬ/6 - (Вб) Ь Ь Ъ Ь ь ь

В6.С-Н-2Ьт12- (Ьт12) ь Ь Ьт12 ь ь ь

В10.02 (Л101) С1 й а а (3 ь

B10.BR к к к к к к

Ът1 Ьш1 Ь Ь ь Ь Ь

ЬтЗ ЬтЗ Ь ь ъ ь ь

Ът4 Ьт4 Ь ъ ь ь ь

В работе были использованы мутанты линии мышей С57ВЬ/б по молекуле МНС II класса - Ьт12, отличающиеся от дикого типа тремя

аминокислотными заменами в положениях 67, 70, 71 А„- цепи, и

р

мутанты по молекуле МНС I класса (Ьт1, ЬтЗ, Ьт4) . Вт1 имеет 3 аминокислотные замены в положениях 152, 155, 156-, ЬшЗ и Ьт4 несут по 2 аминокислотные замены - в положениях 77, 89 и 173, 174,

s

соответственно.

Выделение иииуносупрессорного фактора ISFnp.

Метод выделения фактора ISFnp детально описан ранее (Казанский Л. Б. , 1994).

Клеточные линии.

Клеточные линии тиком EL-4, BW 5147 и саркомы MX-11 культивировали in vitro при концентрациях клеток в суспензии 0, 1 -1 млн/мл в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в пластиковых флаконах (Costar) в С02" инкубаторе.

Выделение лимфоцитов печени.

Лимфоциты печени выделяли на градиенте 35Х-ного перколла методом, описанным ранее {Sekl S. et al., 1994). Печень каждого донора перфузировали через воротную вену 10 мл раствора PBS, измельчали ножницами на холоду, и клетки осторожно выдавливали из стромы в стеклянном гомогенизаторе Поттера. После осаждения суспензию клеток при комнатной температуре ресуспендировали в отмывочной среде (среда Игла с 10% сыворотки быка), добавляли гепарин ( 100 ед/мл) и перемешивали с изотоническим раствором перколла, добавленного до конечной концентрации 35 У. по объему. После центрифугирования (1000 д, 10 мин) супернатант удаляли, клеточный осадок дважды отмывали и определяли количество жизнеспособных клеток. Из печени каждого донора получали от 5 до 15 млн. лимфоцитов.

Смешанная культура лимфоцитов (MLC).

Для оценки пролиферации аллореактивных Т-лимфоцитов

использовали микровариант однонаправленной MLC (Brondz B.D. et al.,

1981). Облученные (2500 Рад) стимуляторы (18 млн/мл, 0,05 мл)

смешивали с респондерами (6 млн/мл, 0,05 мл) в объеме О, 15 мл

полной ростовой среды (RPMI-1640 с 5'/. прогретой (56°, 30 мин)

человеческой сыворотки и стандартными добавками, включающими 100

- 5

ед/мл гентамицина, 4 мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES и 5 х 10 М 2- меркаптоэтанола) в лунке круглодонной 96-луночной пластинки. Каждый вариант ставили в трех-четырех повторах. После 4 дней инкубации при 37°С в атмосфере с 5% С02 добавляли [3Н] тимидин (1 мкКи на лунку), и через 16 ч клетки переносили на фильтры из стекловолокна, отмывали от невключившегося радиоактивного предшественника с помощью прибора "Harvester" ("Flow Laboratories",

Англия), высушивали и определяли интенсивность пролиферации подсчетом /З-эмиссии (срт) в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Смешанная культура лимфоцитов с опухолевыми клетками (MLTg).

Для оценки пролиферации аллореактивнчх Т-.1:::;фо««тоь ианнти прогретые при 45°С в течение 30 мин на водяной бане стимуляторы -

4

опухолевые клетки (z х 10 /мл, 0,1 мл) - смешивали с респондерами

п

( 1 х 10 /мл, О, 1 мл) в объеме 0,2 мл полной ростовой среды и инкубировали 4 дня ( 37°С;5% С02). Пролиферацию оценивали по 16 -часовому включению 3Н-тимидина в культуры.

Вторичная MLC с добавлением фактора ISFnp.

Для постановки вторичной MLC 40 млн. респондеров смешивали со 120 млн. облученных (2500 рад) стимуляторов и инкубировали в конечном объеме 20 мл во флаконах емкостью SO мл (Costar). В начале культивирования в экспериментальные пробы добавляли фактор в конечной концентрации 300 нг/кл и через 4 суток культивирования в С02-инкубаторе контрольные и экспериментальные пробы трижды отмывали центрифугированием и ресуспендировали в 20 мл полной среды. Через 10 суток культивирования клетки собирали, отмывали и определяли их жизнеспособность окрашиванием смесью трипановый синий - эозин. Для постановки вторичной реакции MLC 3, 12 и 48 тыс. жизнеспособных клеток в объеме О, 1мл смешивали с сингенными и аллогенными облученными стимуляторами (10 млн/мл, О, 1 мл) в лунках 96-луночных плоскодонных планшет (Linbro). После 3-х суток культивирования оценивали пролиферацию по включению 3Н-тимидина.

Моноклональные антитела.

В качестве источника ионоклональных антител к мышиным Т-клеточным антигенам CD4 и CD8 использовали супернатанты гибридом GK 1.5 (IgG2a) (клеточная линия GK 1.5 любезно предоставлена А. В.Червонским, Yale University School of Medicine) и 3.168 (IgG2a) соответственно.

Комплементзависимый цитолиз.

Субпопуляции Т-клеток CD4+ и CD8+ разделяли с помощью метода комгшекентзависимого цитолиза. Для этого исходную популяцию клеток (50 млн. /мл) ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 0,2'/. бычьего сывороточного альбумина ("Sigma"), добавляли супернатант гибридомы (в конечном разведении 1/5) и комплемент кролика, отобранный на низкую спонтанную литическую активность в конечном разведении 1/20. После 40 мин. инкубации при 37°С клетки отмывали и

определяли их жизнеспособность окрашиванием смесью трипанового синего с эозином.

Индукция первичных аллоспецифических CTL in vivo.

Рекомбинантную линию мышей R101 (K^l'V3) иммунизировали клетками тимомы EL 4, происходящей из линии мышей C57BL/6. Для этого внутрибрюшинно вводили мышам R101 2,5 х ю клеток тимомы EL 4 в объеме 1 мл бессывороточной среды (Игла, 100 ед/мл гентамицина). При этой схеме иммунизации аллогенный ответ направлен только на одну молекулу главного комплекса гистосовместимости -К13-молекулу. У мышей развивается сильный аллогенный ответ, приводящий к возникновению первичных цитотоксических Т-лимфоцитов ¡CTL). На 8-12 дни после такой иммунизации наблюдается пик активности первичных киллеров, которую можно измерить по лизису меченных Сг-51 аллогенных макрофагов, экспрессирующих молекулу К*3.

Индукция предшественников вторичных аллоспецифических CTL in vivo (CTLp-2).

Клетки памяти (CTLp-2) CD8+ получали из селезенок мышей R101 через 2 месяца после иммунизации клетками EL4 (Н-2Ь) в дозе 25 х Ю6 внутрибрюшинно.

51

Получение меченных Сг перитонеальных макрофагов.

Через 2 суток после внутрибрюшинной инъекции 5 мл свежеприготовленного 3 7. пептона мышь забивали, вводили через бедро внутрибрюшинно 10 мл охлажденной среды для взятия макрофагов (Игла, гентамицин, 25 - 50 ед/мл гепарина, 10 % бычьей сыворотки), зажимали брюшину зажимок ¡Сохера, массировали 2 минуты и шприцем отбирали жидкость в центрифужную пробирку, стоящую на льду. Взятые макрофаги осаждали центрифугированием (1000 об/мин; 5 мин). Осадок ресуспендировали в среде для мечения (RPMI, гентамицин, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, V/. гепарина, 1 У. HEPES, V/. L-глутамина, 30 мкКи/мл 51Сг). Макрофаги метили 1,5 часа на водяной бане при 37°, после чего 3 раза отмывали, ресуспендировали в полной ростовой среде в концентрации 0,6 млн/мл и разливали по 96-луночным плоскодонным планшетам по 100 мкл/на лунку . Планшет помещали в СО - инкубатор (5% СО , 37°) на 2 - 3 суток.

51

Цитотоксический тест на макрофагах, меченных Сг.

После инкубации в течение 2 сут образовавшиеся монослои меченых макрофагов (аллогенных и сингенных) отмывали подогретой до 37°С средой Игла и использовали для определения активности CTL по

лизису МФ, меченных 51Сг в 16-часовом цитотоксическок тесте. Цитотоксические индексы (ЦИ) подсчитывали по формуле: [(Ъ-с)/(а-с)] х 100%, где а - полный выход 51Сг в среду (в присутствии 2%

51

додецилсульфата натрия!. *> - Сх. в прооах, содержащих

иммунные лимфоциты, с - спонтанный выход 51 Сг в среду.

Индукция аллоантигенспецифических Т-супрессоров in vivo.

Антигенспецифические Т-супрессоры индуцировали in vivo внутривенной иммунизацией мышей-реципиентов аллогенными

облученными {2500 рад) спленоцитами (1 х Ю8клеток/мл).

Супрессорный тест.

Супрессорную активность Т-лимфоцитов оценивали по подавлению пролиферации в MLС в ответе на стимуляторы донора. Через 4 дня после иммунизации спленоциты иммунных (в контроле - интактных) животных обрабатывали митомицином С (МС, 25 мкг/кл ("Sigma") 30 мин при 37°С, трижды промывали, и добавляли в различных концентрациях в MLC, Содержащую в качестве отвечающих клеток лимфоциты из лимфатических узлов интактных мышей той же линии, что и доноры супрессоров, а в качестве стимуляторов - облученные (2500 Рад) спленоциты линии мышей, использованной для индукции супрессоров (аллогенные стимуляторы), а также спленоциты сингенной и посторонней линий (контроли). Культуры инкубировали в течение 5 дней при 37°С в U-образных 96-луночных планшетах в объеме 150 икл. Супрессоры добавляли в концентрации 2,4,8 мпн/мл в объеме 50 мкл при соотношении отвечающих и стимулирующих клеток - 1:3. Концентрация отвечающих лимфоцитов - 6x10^ млн/мл, стимулирующих -18x10^ млн/мл. Последние 16 ч инкубации проводили с [3Н]-тимидином (1 мкКи на лунку). Индекс супрессии (ИС) опреляли по формуле:

(a-cl)-(Ь-с2) х 100%_ a-cl

3

где а и Ь - включения Н-тимидина (срт) при добавлении в аллогенную MLC соответственно нормальных и иммунных супрессоров, a el и с2 -включение метки в сингенной MLC при добавлении тех же клеток. Специфичность супрессоров определяли при использовании в MLC посторонних стимуляторов, отличающихся по различным аллелям МНС.

Достоверность полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты работы

Влияние 1БРпр на пролиферацию в аллогенной МЬС в ответе на мутантные молекулы МНС I и II класса.

Для оценки воздействия фактора на пролиферацию Т-лимфоцитов в аллогенной системе ВЬ/6 -анти- Ьш12 была использована однонаправленная МЬС, а которой к отвечающим клеткам лимфатических узлов мышей ВЪ/б добавляли облученные спленоциты Ьт12 (аллогенные стимуляторы) и ВЬ/6 (сингенные стимуляторы). 1ЭРпр добавляли в МЬС в различных концентрациях. Пролиферативный ответ респондеров оценивали в трех независимых экспериментах.

Изучение влияния фактора на способность Т-лимфоцитов пролиферировать в ответе на мутантную молекулу МНС 2 класса показало (Табл.1), что фактор в концентрациях 0,5-2 мкг/мл практически полностью блокирует синтез ДНК в МЬС. При этом на 4-й день в культурах отсутствуют бласты.

Сходные результаты были получены при изучении влияния фактора на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на мутантную молекулу МНС I класса. Интересно отметить, что 1ЭРпр в низких концентрациях подавляет сингенную МЬС более эффективно, чем аллогенную.

Таблица 1.

Влияние 1БРпр на пролиферацию в аллогенной МЬС в ответе на мутантную молекулу 2 класса.

Концентрация 18Рпр (мкг/мл) СРМ Индекс стимуляции

Стимуляторы ВЬ/6 Стимуляторы Ьт12

0 8747 37174 4, 25

2 665 (94,5) 513 (98,6) 0,77

1 484 (94,5) 587 (98,4) 1,21

0,5 801 (90,8) 1112 (97,0) 1,39

0, 25 559 (93,6) 2447 (93,4) 4, 38

0,125 1699 (80,6) 12622 (65,9) 7,43

0,063 5005 (42,8) 29925 (19,5) 5, 98

0, 031 10921 (0) 28224 (24,1) 2, 58

Пролиферативный ответ клеток лимфатических узлов мышей С57ВЬ/6 на сингенные и аллогенные стимуляторы в присутствии различных концентраций 13Рпр оценивали в трех независимых экспериментах. Представлены воспроизводимые данные. Средняя ошибка для каждого значения не превышала 10% от среднего арифметического. В скобках-процент подавления пролиферации фактором по отношению к контролю.

Влияние 1БГпр, добавленного в первичную МЬС на пике пролиферативного ответа, на специфичность вторичного аллогенного ответа на мутантную молекулу МНС I класса.

Отвечающие клетки лимфоузлов мышей C57BL/6 (40 млн) инкубйровали 4 суток с облученными спленоцитами bml (120 млн). ISFnp добавляли в первичную MLC на 4-й день инкубации в конечной концентрации 0,5 мкг/мл (в контроле - без добавления фактора). После 4-х суток инкубации с ISFnp культуры отмывали центрифугированием, ресуспендировали в свежей среде и инкубировали еще 3-е суток. Затем клетки отмывали, и тестировали вторичный пролиферативный ответ их различных доз в MLC на стимуляторы BL/6 (сингенный ответ), bml (аллогенный ответ на I класс) и ЬтЗ (ответ на посторонние стимуляторы). Пролиферацию оценивали по 16-часовому включению [3Н]-тимидина. Специфичность ответа оценивали с помощью индекса специфичности, который определяли как отношение срт в ответе на аллогенный стимулятор к срт в ответе на посторонний стимулятор.

Добавление ISFnp в первичную MLC на пике пролиферативного ответа приводит к возрастанию специфичности вторичного ответа на мутантную молекулу МНС I класса отвечающих лимфоцитов из обработанных фактором культур по сравнению с контрольными (не обработанными).

Таким образом, данные, полученные в аллогенной системе при изучении воздействия фактора ISFnp на нормальные Т-лимфоциты позволяют сделать предположение о физиологической роли ISFnp, заключающейся в супрессии аутореактивных клонов Т-лимфоцитов, а также о возможной вовлеченности фактора в периферическую селекцию антигенреактивных клонов Т-лимфоцитов.

Аллогенный ответ периферических Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов печени на иутантные молекулы МНС I и II класса.

Чтобы получить ответ на вопрос о функциональной полноценности лимфоцитов печени, мы сравнивали первичный пролиферативный ответ лимфоцитов печени и спленоцитов мышей C57BL/6 на аллогенные стимуляторы bml и bml2 (мутанты по молекулам МНС I и II класса, соотв.). Для этого отвечающие лимфоциты печени или селезенки мышей CS7BL/6 и облученные стимулирующие спленоциты аллогенных линий мышей bml и bml2 (в контроле - сингенные спленоциты) смешивали в MLC и культивировали в течении 4 дней. Пролиферативный ответ В6 анти-bml и В6 анти-Ьт12 исследуемых популяций лимфоцитов оценивали

з

по включению [ Н]-тимидина в культуры (срм) на 5-й день

культивирования.

На Рис.1 показано, что лимфоциты печени так же, как и периферические лимфоциты (спленоцигы), отвечают в первичной аллогенной ML С на стимуляторы bml и Ьт12, т.е. способны к распознаванию мутантных молекул МНС I и II класса. При этом величины пролиферативного ответа этих двух популяций достоверно не различаются.

Аллогенный ответ субпопуляций периферических Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов печени на мутантные молекулы МНС I и II класса.

С целью выяснения соответствия специфичности рецепторов и

экспрессируемых лимфоцитами печени корецепторных молекул получали

субпопуляции печеночных и периферических Т-лимфоцитов CD4 (CD8+),

CD8 (CD4 + ) , и CD4~CD8~ мышей C57BL/6 методом комплементзависимого

цитолиза. Для этого исходную популяцию клеток (лимфоцитов печени

или периферических лимфоцитов) обрабатывали супернатантами гибридом

(GK 1.5 (IgG2a) - для получения CD4~ клеток и 3.16S (IgG2a) - для

получения CD8~ клеток) и комплементом кролика, отобранным на низкую

спонтанную и высокую специфическую литическую активность в конечном

разведении 1/20. Полученные CD4 + , CD8+, и CD4~CD8~ субпопуляции

печеночных и периферических Т-лимфоцитов мышей C57BL/6 исследовали

в первичном пролиферативном ответе на аллогенные стимуляторы bml и

Ьш12. Для этого отвечающие клетки различных субпопуляций (контроль,

CD4 , CD8~, CD4 ~CD8~) периферических Т-лимфоцитов или Т-лимфоцитов

печени инкубировали с облученными стимулирующими спленоцитами мышей

линий bml и bml2 в течении 4 дней. Пролиферацию оценивали по

з

16-часовому включению [ HJ-тимидина.

На Рис. 2 показаны объединенные результаты четырех независимых опытов. В первичной MLC Т-лимфоциты печени CD4+ отвечают на стимуляторы bml2, но не bml, a CD8+ - на стимуляторы bml, но не bml2. Таким образом, как и периферические лимфоциты, лимфоциты печени CD4+ распознают мутантную молекулу МНС II, но не I класса, а CD8+ - мутантную молекулу I, но не II класса. Нам не удалось выявить ответа субпопуляции CD4 CD8" Т-лимфоцитов селезенки ни на стимуляторы bml, ни на стимуляторы bml2. Однако, удаление клеток CD4+ и CD8 + из популяции лимфоцитов печени не приводило к полному устранению ответа (Рис.2, белые столбики). Таким образом, в отличие от спленоцитов субпопуляция Т-лимфоцитов печени с фенотипом

С57ВЬ/6

Ьт1

Ьп\12

□спл йлп

РИС. 1. Аллогенная реакция периферических Т-клеток и Т-лимфоцитов печени на мутантные молекулы МНС I и II класса. Отвечающие лимфоциты печени (заштрихованные столбики) или селезенки (светлые столбики) мышей С57ВЬ/6 и облученные стимулирующие спленоциты линий мышей, указанных по оси абсцисс, смешивали и культивировали в

з

течении 4 дней. По оси ординат - включение [ Н]-тимидина в культуры (СРМ) на 5-й день культивирования.

150

100

50

Щ Контроль ЩсОв-

П СР4 -СЕ>8-

РИС. 2. Селективное распознавание мутантных молекул МНС I и II класса субпопуляциями периферических Т-лимфоцитов печени. Полученные методом комплементзависимого цитолиза отвечающие клетки различных субпопуляций (указаны в легенде на рисунке) периферических Т-лимфоцитов (серии 1 и 2 по оси абсцисс) или Т-лимфоцитов печени (серии 3 и 4) инкубировали с 9x10 облученными стимулирующими спленоцитами мышей линий Ът1 (серии 1 и 3 ) и Ьт12 (серия 2 и 4) в течении 4 дней. Пролиферацию оценивали по

3

16-часовому включению [ Н]-тимидина. По оси ординат интенсивность пролиферации по отношению к контролю в %, вычисленная по формуле (а-Ь) / (с-сЗ) х 100%, где а - аллогенный ответ субпопуляции, Ь -сингенный ответ субпопуляции, с - аллогенный ответ исходной (необработанной) популяции, й - сингенный ответ исходной (необработанной) популяции.

CD4"CD8 ~ содержит в своем составе функциональные аллореактивные Т-лимфоциты, прошедшие отбор на способность к распознаванию классических молекул ННС.

Таким образом, исследование аллогенного ответа лимфоцитов печени на мутантные формы молекул МНС I и II класса in vicro с помощью MLC показало, что Т-лимфоциты печени функциональны и подобно периферическим Т-клеткам распознают мутантные молекулы МНС I и II класса. С помощью метода комплемент-зависимого цитолиза, а также при использовании моноклональных антител к корецепторным молекулам CD4 и CD8 показано, что Т-лимфоциты печени подчиняются общим закономерностям МНС-рестриктированного распознавания антигенов; в популяции аллореактивных Т-лимфоцитов печени не выявляются Т-клетки с нарушенной комбинацией специфичностей Т-клеточного рецептора и корецепторной молекулы. Эти данные свидетельствуют о тимусном происхождении аллореактивных Т-лимфоцитов печени. В отличие от других периферических Т-лимфоцитов Т-лимфоциты печени с фенотипом CD4CD8' содержат клетки, пролиферирующие в ответе на аллогенные молекулы МНС, что свидетельствует о вторичном снижении экспрессии корецепторных молекул на их поверхности.

Сравнительное изучение активности первичных аллоспецифических CTL, выделенных из периферических лимфоидных органов и печени.

Чтобы выяснить, участвует ли печень з иммунном ответе in vivo, мы индуцировали антигенспецифические киллеры в аллогенной системе in vivo и сравнивали их активность в популяциях лимфоцитов печени и периферических лимфоцитов.

Для получения первичных аллоспецифических CTL мы иммунизировали рекомбинантную линию мышей R101 клетками

тимомы EL 4 (KbDb), происходящей из линии мышей C57BL/6 (К^А)13). На 10-11 день после иммунизации от иммунных (в контроле -интактных) мышей R101 получали лимфоциты селезенки и печени, и исследовали их на наличие первичных CTL, специфичных к К*5 молекуле в цитотоксическом тесте при различных соотношениях эффекторов и мишеней. В качестве кишеней использовали меченные Сг-51 аллогенные макрофаги от мышей C57BL/6, экспрессирующие молекулу КЬ. Для оценки неспецифической цитолитической активности в контроле использовали сингенные макрофаги от мышей R101.

На Рис. 3 представлены результаты сравнительного изучения активности первичных аллоспецифических CTL, выделенных из селезенки и печени. Хорошо видно, что CTL, выделенные из печени, более активно лизируют клетки мишени, чек CTL, выделенные из лимфоидного органа. киллеры из обеих популяций специфичны и не лизируют сингенные макрофаги. Ход кривых раститровки позволяет полагать, что популяция лимфоцитов печени содержит в 2-4 раза больше специфических эффекторных клеток с цитолитической функцией, чем популяция спленоцитов.

Сравнительное изучение активности аллоантиген-специфических

супрессоров в периферических лимфоидных органах и печени.

Для индукции антигенспецифических Т-супрессоров мышей R101 иммунизировали аллогенными облученными (2500 рад) спленоцитами (1 х Ю8клеток/мл) C57BL/6. Через 4 дня супрессорную активность Т-лимфоцитов печени и селезенки иммунных мышей R101 оценивали по

подавлению пролиферации в MLC в ответе на донорские стимуляторы

Ь к

C57BL/6 (Н-2 } и посторонние B10.BR (Н-2 ). Лимфоциты печени и

спленоциты иммунных (в контроле - интактных) мышей R101,

обработанные митомицином С, добавляли в различных концентрациях в

MLC, содержащую в качестве респондеров лимфоциты из лимфатических

узлов интактных мышей R101, а в качестве стимуляторов- облученные

(2500Рад) аллогенные спленоциты C57BL/6, спленоциты R101 (сингенный

контроль), спленоциты посторонней линии B10.BR (контроль на

специфичность). Пролиферацию оценивали по 16-часовому включению

3

[ Н]-тимидина. Активность супрессоров оценивали с помощью индекса супрессии (ИС).

На Рис.4 показано, что супрессорные Т-лимфоциты печени подавляют реакцию респондеров на аллогенные стимуляторы C57BL/6 более эффективно, чем Т-супрессоры в селезенке. Эффект подавления аллогенной реакции супрессорными Т-лимфоцитами печени и селезенки является дозо-эависимым и специфическим (отсутствует активность супрессоров при ответе на посторонний стимулятор).

Таким образом, при изучении первичного аллогенного ответа Т-лимфоцитов печени in vivo получены данные, свидетельствующие об обогащении популяции лимфоцитов печени функциональными аллоантигенспецифическими эффекторными клетками (первичными CTL и супрессорами). Этот результат показывает, что печень, возможно,

0.5:1 1.5:1 5:1 15:1

Отношение эффектор: мишень

МФ В6

-х-СПЛ, МФ Я101

-•-'лп, МФ В6

— лп,. МФЯ101

РИС. 3. Первичные аллоспецифические СТЬ в селезенке и в печени.

Мышей линии Л101 (К<11''Оь) иммунизировали внугрибрюшинно клетками тимомы ЕЬ-4 (КЬЕ)Ь) (2.5 х 107). Через 10-11 дней лимфоциты селезенки (Ж, пунктирная линия) и печени (•, сплошная линия) иммунизированных мышей Ш01 инкубировали на меченных 31Сг аллогенных (С'57ВЬ/6, Н-2Ь) макрофагах (6 х 104/ лунку) при различных соотношениях эффекторов и мишеней. Меченные яСг сингенные макрофаш Я101 использовали для установления неспецифической цитотоксической активности лимфоцитов печени (X, сплошная линия) и спленоцитов ( *, пунктирная линия). По оси абсцисс - соотношение эффектор-мишень. По оси ординат -специфический лизис, %. Спонтанный лизис не превышал 15% от общего лизиса.

Количество супрессорных клеток на лунку (х 10 )

Ст.С57В1-/6

Ст.ВЮВВ

лп. Ст.С57Вив

лп Ст.ВЮВВ

РИС. 4. Аллоантигенспецифические Т-супрессоры в селезенке и в печени. Мышей линии иммунизировали аллогенными облученными (2500 рад)

спленоцитами (1х108 клеток/мл) С57В1У6 (Н-21). Через 4 дня супрессорную активность лимфоцитов селезенки (А) и печени (О) иммунизированных мышей Ш01 оценивали в супрессорном тесте по подавлению пролиферации в ответе на донорские стимуляторы С57ВЬ/б (сплошная линия) и посторонние стимуляторы (пунктнрная линия). Пролиферацию измеряли на 5-й день МЬС. По оси абсцисс - концентрация Т-супрессоров (млн/мл). По оси ординат - индекс супрессии. Индекс супрессии вычисляли по формуле: [(а-с1)-(Ь-с2): (а-с!)] х 100%, где а и Ь - включения ''Н-тимпдина при добавлении в аллогенную МЬС лимфоцитов от интактных и иммунизированных мышей, соотв.; а с1 и с2 - включения Н- тимидина при добавлении в сингенную МЬС тех же клеток.

является сайтом преимущественной миграции аллореактивных Т-лимфоцитов, активированных в первичном ответе.

Тестирование клеток памяти в популяции лимфоцитов печени мышей, примированных аллоантигеном, в ответе на прогретые

аллогенные спленоциты. Для того, чтобы ответить на вопрос, содержит ли популяция лимфоцитов печени Т-клетки памяти, мы провели сравнительный анализ вторичного аллогенного ответа лимфоцитов печени и спленоцитов.

Для индукции клеток памяти мышей R101 иммунизировали клетками EL4 (Н-2Ь) в дозе 25 х 106 внутрибрюшинно. Через 2 месяца после иммунизации ставили MLC, в которой в качестве отвечающих клеток использовали спленоциты и лимфоциты печени иммунных мышей R101 (в контроле - интактных), а в качестве стимуляторов - прогретые в течение 1 часа при 45°С аллогенные спленоциты C57BL/6 (в контроле -сингенные R101). Клетки инкубировали в течении 4 дней. Пролиферацию

3

оценивали по 16-часовому включению [ Н]-тимидина.

На Рис.5 показано, что наивные лимфоциты из селезенки и печени не пролиферируют в ответе на стимуляторы, убитые прогреванием, тогда как обе популяции клеток примированных мышей дают выраженный аллогенный ответ. Таким образом, лимфоциты печени содержат в своем составе клетки памяти, пролиферирующие в ответе на аллоантиген.

Тестирование клеток памяти в популяции лимфоцитов печени мышей, примированных аллоантигеном, в ответе на прогретые аллогенные

опухолевые клетки. Для индукции клеток памяти мышей R101 dA'V1) иммунизировали клетками EL4 (Н-2Ь) в дозе 25 х 106 внутрибрюшинно. Через 2 месяца после иммунизации ставили MLTC, в которой в качестве отвечающих клеток использовали спленоциты и лимфоциты печени иммунизированных (в контроле - интактных) мышей R101 (1 х 107/мл, 0.1 мл), а в качестве стимуляторов - прогретые в течение 1 часа при 45°С клетки следующих опухолевых линий: тимомы EL-4 (Н-2Ь), саркомы МХ-11 (Н-2Ь), тимомы BW5147 <Н-2к) (2 х 104/мл, 0.1 мл). В качестве сингенного контроля использовали прогретые спленоциты R101 Клетки инкубировали в течении 4 дней. Пролиферацию

3

оценивали по 16-часовому включению [ Н]-тимидина.

На Рис.6 показано, что лимфоциты из селезенки и печени

6-

¿13-

I

пнтактные мыши

ад:

р I

I

X

спл лп спл

Респондеры

иммунные мыши

I

□2

ЛП

Стимуляторы Э С57В1./6

РИС. 5. Клетки памяти в популяции лимфоцитов печени мышей, примированных аллоантигеном, в ответе на прогретые аллогенные спленоциты.

Клетки памяти индуцировали внутрибрюшинной иммунизацией мышей КЮ1 (К<11'1ВЬ) клетками тимомы EL-4 (КьОь) в дозе 2.5 х 107. Через 2 месяца спленоциты и лимфоциты печени иммунизированных (в контроле - интактных) мышей К101 инкубировали с прогретыми в течение одного часа при 45°С сингенными Ю01 (белые столбики) и аллогенными (заштрихованные столбики) С57ВЬ/6 (Н-2Ь) спленоцитами в течение 4 дней. Пролиферацию оценивали по 16 - часовому включению :'Н-тимидина. По оси ординат - включение 3Н-тимидина в культуры (СРМ).

Ш R101 ЙЕЬ-4

Шмх-и

□ BW5147

РИС. 6. Клетки памяти в популяции лимфоцитов печени мышей, примированных аллоантигеног» в ответе на прогретые аллогенные опухолевые клетки.

Клетки памяти индуцировали внугрибрюшинной иммунизацией мышей R101 (KYd") клеткам тимомы EL-4 (KbDb) в дозе 2.5 х 107. Через 2 месяца сппеноциты и лимфоциты печен иммунизированных (в контроле - интактных) мышей R101 (1 х 107 /мл, 0.1 мл) инкубировали прогретыми в течение одного часа при 45°С клетками (2 х 104/мл, 0.1 мл) опухолевых лини (указаны в легенде на рисунке) в течение 4-ех дней. В качестве сингенного контроля использовал прогретые спленоциты RIOL Пролиферацию оценивали по 16 - часовому включению 3Н-тимидинг По оси ординат - включение 3Н-тимидина в культуры (СРМ).

интактных мышей не отвечают на опухолевые клетки, убитые прогреванием, тогда как обе популяции клеток примированных мышей пролиферируют в ответ на опухолевые клетки-мишени, экспрессирующие аллогенную молекулу I класса (К*5) МНС. Ответ является антиген-специфическим, так как отвечающие клетки реагируют только на прогретые опухолевые клетки тимомы ЕЬ-4 (Н-2Ь) и саркомы МХ-11

(Н-2Ь), несущие аллогенную КЬ молекулу, но не на клетки посторонней

ь

опухолевой линии - тимомы ВР?5147 (Н-2 )

Определение различий в эпитопной специфичности Т-клеток памяти,

выделенных из печени и периферических лимфоидных органов.

Для индукции клеток памяти мышей К.101 иммунизировали клетками

ЕЬ4 (Н-2Ь) в дозе 25 х 106 внутрибрюшинно. Через 2 месяца после

иммунизации ставили МЬС, в которой в качестве отвечающих клеток

использовали спленоциты и лимфоциты печени иммунных мышей Я101 (в

контроле - интактных), а в качестве стимуляторов - прогретые в

течение 1 часа при 45°С аллогенные спленоциты С57ВЬ/б, сингенные

спленоциты 1*101, а также спленоциты Ьт12 (линия мышей, несущих

мутантные в А/3 цепи молекулы II класса МНС) и спленоциты Ьт1, ЬтЗ,

Ьт4 (линии мышей, мутантных по I классу МНС). Клетки инкубировали в

течении 4 дней. Пролиферацию оценивали по 16-часовому включению з

[ Н]-тимидина. Индекс стимуляции определяли по

формуле: срш(а119)-сРя1(вуп)

* 100%, где

срт(ВЬ/6)-срш(зуп)

срт(а11о) - срт в ответе на аллогенный стимулятор; срт(Буп) - ерш в ответе на сингенный стимулятор; срш(ВЬ/6) - ерш в ответе на стимулятор С57ВЬ/6.

Нам не удалось выявить определенную закономерность в распознавании различных эпитопов Т-лимфоцитами памяти из периферических лимфоидных органов и печени в процессе формирования иммунологической памяти. Однако, в каждом конкретном эксперименте клетки памяти (из печени и из периферических лимфоидных органов) неодинаково реагируют на одни и те же стимуляторы. Таким образом, в процессе формирования иммунологической памяти в печени и периферических лимфоидных органах образуются Т-клетки памяти с различной тонкой эпитопной специфичностью. По всей видимости это связано с тем, что у каждого индивидуума происходит независимое

формирование репертуара Т-клеток, т. е. спектр специфичностей, распознаваемых Т-лимфоцитами, индивидуален для каждого отдельно взятого организма. Для аллогенного ответа характерен относительно узкий репертуар специфичностей, распознаваемых олигоклональной популяцией аллореактивных Т-лимфоцитов, т.е. набор аллогенных детерминант, распознаваемых аллореактивными Т-клетками одного реципиента, может быть не всегда идентичен набору детерминант, на которые могут реагировать Т-клетки другого реципиента. Это обстоятельство указывает нанеобходимость поиска экспериментальных подходов с использованием лонгитудинальных исследований специфичности клеток памяти у каждого, отдельно взятого организма.

Таким образок, исследование вторичного аллогенного ответа Т-лимфоцитов печени показало, что: а) популяция лимфоцитов печени мышей, примированных аллоантигеном, содержит клетки памяти, реагирующие в MLTC на прогретые аллогенные опухолевые клетки; б) через 2 месяца после аллогенной иммунизации в печени мышей обнаруживаются Т-клетки памяти, отличающиеся по тонкой эпитопной специфичности от других периферических Т-клеток памяти, что может быть следствием селекционных процессов, которым подвергаются Т-лимфоциты памяти в печени.

Таким образом, результаты исследования влияния фактора ИСФнп на аллогенный пролиферативный ответ, а также данные, полученные при исследовании популяции лимфоцитов печени, свидетельствуют о том, что эффекторные кпетки, попадающие в печень подвергаются иным закономерностям селекции, чем клетки, которые попадают в селезенку и другие периферические органы. Полученные результаты подтверждают гипотезу о возможности протекания в печени селекции клонов Т-клеток памяти. По всей видимости, эта селекция направлена на отбор клонов с высокоаффинным рецептором, не требующим стабилизирующего действия корецепторных молекул CD4 и CD8.

ВЫВОДЫ

1. Иммуносупрессорный фактор печени ISFnp дозозависимо подавляет пролиферацию аллореактивных клонов Т-лимфоцитов, не вызывая их гибели.

2. Воздействие ISFnp на активированные аллореактивные Т-лимфоциты in vitro приводит к . усилению и возрастанию специфичности вторичного аллогенного ответа.

3. Т-лимфоциты печени функциональны и подчиняются общим

закономерностям МНС-рестриктированного распознавания антигенов.

4. В процессе аплогенного ответа in vivo популяция лимфоцитов печени обогащается функциональными аллоантигенспецифическими эффекторными клетками.

5. Через 2 месяца после алпогенной иммунизации в печени мышей обнаруживаются Т-клетки памяти, отличающиеся по тонкой эпитопной специфичности от других периферических Т-клеток памяти.

6. Полученные результаты, а также данные литературы последних лет позволяют выдвинуть новую гипотезу о возможности протекания в печени селекции клонов Т-клеток памяти, направленной на отбор клонов с высокоаффинным рецептором, не требующим стабилизирующего действия корецепторных молекул CD4 и CD8.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Д .Б .Казанский, И.М.Агранович, А. А. Штиль, О. Я. Ажипа, А.Д.Чернышева, С.Г.Апасов, Б.Д.Брондз. Выделение,

изучение биологической активности и физико-химическая характеристика иммуносупрессорного фактора печени,

вызывающего апоптоз клеток тимомы EL-4 in vitro. Мол. биол. , 1995, 29(1) 170-181

2. Kazansky D.B., Agranovitch. I.M., Azhipa O.Y., Shtil A.A., Anosova N.G., Chernishova A.D., Brondz B.D.

Immunosuppressive factor from liver induces apoptosis in thymoma EL-4 cells but not normal MHC class II specific T lymphocytes. Immunol. Lett., 1995, 45, 5-11.

3. A.D. Chernyshova, B.D. Brondz, N.G. Anosova, R.Z. Boiko, L.V. Aizenberg & D.B. Kazanskii. Functional characteristics of liver T-lymphocytes in allogenic response to mutant class I and II MHC molecules. Molecular Biology, 1996, 30 (3)., 429-433.

4. Kazansky D.B., Chernysheva A.D., Agranovich I.M., Shtil A.A., Anosova N.G.,Azhipa O.Y., Brondz B.D. Immunosuppressive factor from liver: implication in peripheral selection of T-cells. European Cytokine Network, 1996, V.7, N.3, P.588.