Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Противовоспалительные свойства нового растительного препарата артрофлекс и анализ механизма его действия

□030Б4440

На правах рукописи

РЫДЛОВСКАЯ АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА НОВОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА АРТРОФЛЕКС И АНАЛИЗ МЕХАНИЗМА ЕГО ДЕЙСТВИЯ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1 6 А В Г 2007 2007

003064440

Диссертационная работа выполнена в Межрегиональном Центре "Адаптоген"

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Макаров Валерий Геннадиевич Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Лесиовская Елена Евгеньевна доктор медицинских наук, профессор Дьячук Георгий Иванович

Ведущая организация НИИ экспериментальной медицины РАМН

Защита состоится «_»_2007 г в _ часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208 030 01 при Институте токсикологии ФМБА России (193019, Санкт-Петербург, ул Бехтерева 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке по адресу Санкт-Петербург, ул Бехтерева 1

Автореферат разослан «_»_2007г

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Саватеева-Любимова Т Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Социальная значимость воспалительных заболеваний растет во всем мире Это определяет необходимость разработки новых противовоспалительных препаратов Сложность разработки эффективных и в то же время безопасных средств для лечения воспаления заключается в том, что это поливалентный, весьма динамичный процесс с множеством альтернативных и перекрещивающихся путей, существующих как на уровне внутриклеточных взаимодействий сигнальных каскадов, так и на уровне регуляции продукции медиаторов воспаления (Черешнев, 2002, Руднов, 2006) В соответствие с этим, влияние только на одну мишень патогенеза либо не сопровождается достаточным фармакологическим эффектом, либо вызывает ряд побочных явлений (Schmid-Schonbein, 2006)

На основании вышесказанного современная медицинская наука постулирует необходимость создания новых препаратов, способных регулировать функциональную активность не одной, а многих молекул, участвующих в воспалении (Krakauer, 2004)

Проблемой, стоящей перед фармакологами, является отсутствие на сегодняшний день полного представления о работе всех звеньев сигнальных каскадов, а также функционального значения многих регуляторных молекул, обеспечивающих воспаление Это создает трудности при выборе потенциальных мишеней для новых синтетических субстанций (Aderem, Smith, 2004)

В связи с этим хорошие перспективы имеют препараты, созданные на основе растительного сырья (Пастушенков, Лесиовская, 1995, Darshan, Doreswamy, 2004) Современной науке известно не менее 1200 видов растений, обладающих выраженной фармакологической активностью (Болотина, 2007) Их терапевтическая ценность доказана тысячелетней историей применения и научно обоснована результатами доклинических (Krieglstein et al, 2001, Camacho-Barquero et al, 2007, Kump et al, 2007) и клинических исследований (Саратиков, Краснов, 2004, Deodhar et al, 1980, Gupta et al, 2001) Анализ механизмов действия некоторых субстанций растительного происхождения показал, что фармакологическая активность природных соединений обусловлена их способностью воздействовать комплексно и изменять активность многих регуляторных белков (Aggarwal et al, 2006) В соответствие с этим определение механизмов действия компонентов растительных препаратов может оказаться полезным не только для их грамотного применения в клинике, но и для раскрытия ключевых регуляторных молекул воспаления

Однако определение фармакологических мишеней действия препаратов растительного происхождения, как правило, сопровождается трудностями, связанными с их фармакокинетикой и особенно метаболической трансформацией действующих веществ в организме В результате, изучение механизмов действия природных субстанций in vitro зачастую не дает

корректных результатов и делает актуальным совершенствование методических подходов

В настоящей работе предприняты попытки определения противовоспалительных свойств и анализа механизма действия нового оригинального растительного препарата артрофлекс Выбор лекарственного средства в качестве объекта исследования обусловлен несколькими предпосылками Во-первых, артрофлекс является комбинированным препаратом, включающим три широко известных в мировой фитомедицине компонента экстракт смолы ладанного дерева (Boswellia serrata), экстракт корней куркумы (Curcuma longa) и экстракт семян сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica) (Александрова и др, 2004) Это дает основание предполагать наличие у артрофлекса множественности механизмов действия Во-вторых, предварительные исследования компонентов артрофлекса выявили их высокую фармакологическую активность, в частности, выраженные противовоспалительные свойства (Shikov et al, 2005) В-третьих, основные действующие вещества артрофлекса обладают выраженной гидрофобностыо и тем самым затрудняют изучение механизмов действия препарата по общепринятым методикам т vitro

Все эти предпосылки с одной стороны позволяют ожидать выраженную фармакологическую активность нового препарата, с другой, говорят о необходимости подбора методов для изучения механизмов его действия

Цель исследования

Оценка противовоспалительных свойств нового растительного препарата артрофлекс и определение основных механизмов его действия

Задачи исследования:

1 Оценить противовоспалительные свойства препарата артрофлекс на моделях острого (каррагениновый отек), подострого (формалиновый отек) и хронического (адьювантный артрит) воспаления у крыс

2 Провести сравнительный анализ эффективности артрофлекса с синтетическими препаратами стероидной (преднизолон) и нестероидной (диклофенак, бутадион) природы

3 Изучить механизмы противовоспалительного действия препарата артрофлекс

а Разработать метод корректной пробоподготовки препарата с целью

тестирования его активности в культуре клеток b Определить влияние на ЛПС-индуцированную продукцию провоспалительных цитокинов фактора некроза опухолей-a (TNFa), интерлейкина-lß (IL-lß) и интерлейкина-6 (IL-6) in vitro с Подтвердить влияние на ЛПС-индуцированную продукцию TNFa и простагландина Е2 (ex vivo) в крови крыс при однократном пероральном введении препарата (300 мг/кг) животным с оценкой динамики проявления противовоспалительного действия d Определить влияние на TN Fa-индуцированную активацию ядерного

фактора АВ и ЛПС-иидуцированную активацию митоген-активированных (MAP) протеинкиназ (р38, JNK1/2, ERK1/2) т vitro е Адаптировать метод оценки активации МАР-киназ р38, JNK.1/2, ERK1/2 в органах животных для определения механизма действия растительного препарата т vivo Изучить влияние артрофлекса (300 мг/кг, т vivó) на изменение уровня ЛПС-индуцированной активации МАР-киназ р38, JNK1/2, ERK1/2 в легком, селезенке и костном мозге, а также продукцию TNFa в крови крыс

4 Определить возможность проявления побочного (ульцерогенного и иммуносупрессорного) действия артрофлекса

5 Подготовить материалы по изучению противовоспалительных свойств препарата артрофлекс для представления в фармакологический комитет с целью получения разрешения на проведение клинических испытаний

Научная новизна исследования

С использованием современных методов фармакологии и молекулярной биологии впервые проведено комплексное изучение противовоспалительных свойств нового отечественного растительного препарата артрофлекс в сравнении с известными синтетическими средствами стероидной и нестероидной природы Установлено, что артрофлекс оказывает антиэксудативное, анальгетическое и жаропонижающее действие при остром и подостром воспалениях, а также предотвращает деструкцию хрящевой и костной тканей сустава при хроническом воспалении

Впервые установлено, что противовоспалительное действие проявляется через 0 5 и 4-8 часов после перорального введения препарата крысам

Впервые проведена оценка побочных действий Показано наличие слабовыраженного ульцерогенного эффекта и отсутствие иммуносупрессорного действия, что позволяет говорить о преимуществе исследуемого препарата перед синтетическими противовоспалительными средствами

Впервые проведен анализ механизмов противовоспалительного действия артрофлекса Учитывая высокую гидрофобность действующих веществ, разработан метод по подготовке препарата для тестирования его активности в культуре клеток Метод оценки активации МАР-киназ р38, JNK1/2, ERK.1/2 в органах животных адаптирован для определения механизма противовоспалительного действия растительного препарата

В результате исследований in vitro и in vivo получены данные о том, что противовоспалительное действие артрофлекса связано с подавлением индуцированной продукции TNFa, IL-6, IL-ip и PGE2, ингибированием транскрипционной активности ядерного фактора АВ и снижением активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2

Научно-практическая значимость

Проведены доклинические испытания, выявившие

противовоспалительные свойства и раскрывающие механизм действия нового отечественного препарата растительного происхождения артрофлекс

Результаты настоящего исследования послужили основанием для подготовки и предоставления материалов по новому отечественному препарату артрофлекс для регистрации в ФГУ "НЦЭСМП" Росздравнадзора МЗ и CP РФ

Модифицированный и апробированный нами метод определения влияния препаратов природного происхождения на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK.1/2 в органах крыс при их пероралыюм введении используется при изучении механизмов действия целого ряда других фармакологических субстанций

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Артрофлекс оказывает выраженное противовоспалительное действие в дозе 250-300 мг/кг у крыс По эффективности противовоспалительное действие артрофлекса сопоставимо с таковым синтетических стероидных (преднизолон, 10 мг/кг) и нестероидных (бутадион (56 мг/кг), диклофенак натрия (8 мг/кг)) противовоспалительных препаратов При этом он оказывает менее выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет иммуносупрессорного действия

2 В исследованиях ш vitro, ex vivo и in vivo показано, что механизм противовоспалительного действия артрофлекса связан с ингибированием ЛПС-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов TNFa, IL-6 и IL-lß и метаболита арахидоновой кислоты PGE2

3 Противовоспалительное действие артрофлекса реализуется через регуляцию активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK.1/2, а также ядерного фактора kB

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на международной конференции «Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию» (Химки, 2006), X Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященных памяти профессора Н Н Кеворкова «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006), 54th annual congress on medical plant research (Helsinki, Finland, 2006), Oxygen club of California «Oxidants and antioxidants m biology» (Santa Barbara, California, 2006), «Политехническом симпозиуме Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), Nordic Natural Products Conference (Sankt

Helene, Denmark, 2007), VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав, содержащих результаты экспериментальных исследований и их обсуждение, заключение, выводов, списка литературы и двух приложений Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами, схемами и рисунками Список литературы включает 225 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования по определению

противовоспалительных свойств артрофлекса in vivo.

Оценка противовоспалительного действия препарата артрофлекс производилась на моделях острого (каррагениновый отек), подострого (формалиновый отек) и хронического (адьювантный артрит) воспалений Исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар (массой 180-200 г) по 10 штук в группе

На моделях каррагенинового и формалинового отеков введение артрофлекса per os (125, 250 и 500 мг/кг) проводилось по профилактической и лечебно-профилактической схемам, соответственно Препараты сравнения бутадион (56 мг/кг) и диклофенак натрия (8 мг/кг) вводили аналогично Оценка действия артрофлекса производилась в динамике каждые 3-5 дней и включала противоотечную, анальгезирующую и гипотермическую активности (Руководство , 2005) Унифицированными биохимическими и гематологическими методами оценивались СОЭ и содержание лейкоцитов, а также уровни лейкотриена В4 и простагландина Е2 (на модели формалинового отека) в крови опытных животных (Лаборат ,1987, Справ ,1970)

На модели адьювантного артрита введение артрофлекса per os (100, 300 и 900 мг/кг) проводилось по лечебной схеме Препаратом сравнения служил преднизолон (10 мг/кг) Определяли влияние препарата на патологические изменения костной и хрящевой тканей сустава пораженной конечности животных, а также наличие побочного действия в отношении слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и морфо-функционалыюго состояния центрального (тимус) и периферического (селезенка) органов лимфоидной системы (Caí et al, 2005)

Для проведения исследования фармакологической активности артрофлекса in vitro был разработан метод по подготовке препарата с целью увеличения его биодоступности в культуре клеток Определение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию IL-lß, IL-6 и TNFa проводили на человеческой моноцитарно/макрофагальной клеточной линии ТНР1 (АССТ) Клетки инкубировали с артрофлексом в изучаемых концентрациях и через 4 часа стимулировали ЛПС (10 нг/мл) в течение 24 часов Все инкубации проводились при 37°С с 5% СОг Концентрация цитокинов определялась методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) Анализ проводился в соответствии с инструкцией производителя тест-систем (ООО "Цитокин", Россия)

Подтверждение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию TNFa, а также PGE2 при его пероральном введении животным проводилось на крысах линии Вистар Животных выдерживали без пищи сутки и однократно перорально вводили артрофлекс или кукурузное масло (плацебо) в дозе 300 мг/кг Через 0 5, 1, 2, 4 и 8 часов животных подвергали эвтаназии и отбирали кровь Кровь разводили культуральной средой RPMI-1640 (Sigma-Aldnch) в соотношении 1 5 и инкубировали с ЛПС в течение 24 часов Концентрацию TNFa и PGE2 в культуральных супернатантах определяли методом ИФА с использованием тест-систем (BD Biosciences, USA, Cayman Chemical, USA)

Определение влияния артрофлекса на транскрипционную активность NF-кВ проводилось на клеточной линии НЕК293 (привезенной из Каролинского Института, Стокгольм, Швеция) методом репортерного гена люциферазы Репортерный ген люциферазы, находящийся под контролем промотора NF-Ш (pNF-kB-LUC, Stratagene, USA) с использованием реагента TransFast (Promega, США) трансфецировали в клетки НЕК293 Для определения количества трансфецированных клеток параллельно проводили трансфекцию плазмиды pSV-ß-galactosidase control vector (Promega, USA) Индуктором активации NF-kB служил TNFa (100 нг/мл) По уровню экспрессии гена люциферазы судили о функциональной активности NF-kB

Уровень экспрессии гена люциферазы измеряли на люминометре (DLReady™) при добавлении в клеточный лизат раствора субстрата Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega) Уровень экспрессии гена ß-галактозидазы определяли по ферментативной активности ß-галактозидазы при добавлении к лизату субстрата о-нитрофенил^-О-галактозида (Sigma) Интенсивность реакции определяли на спектрофотометре и активность ß-галактоидазы вычисляли по формуле OD420 - 1 75xOD550 Полученный результат (в оптических единицах) принимался за условную активность ß-галактоидазы Окончательным количественным результатом определения уровня активности NF-kB являлось отношение уровня активности люциферазы к условной активности ß-галактоидазы

Определение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ проводилось m vitro и in vivo

Активация МАР-киназ оценивалась методом иммуноблота по количеству фосфорилированных форм белков Для этого использовали поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированных по триптофану и тирозину (Thr202/Tyr204) ERKI/2, (Thrl83/Tyrl85) SAPK/JNK, (Thrl80/Tyrl82) p38 (Cell Signaling Technology, США) В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США)

Исследования т vitro проводились на перевиваемой клеточной линии моноцитов человека U937, полученной из Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН Клетки инкубировали с препаратом в течение 16 часов и обрабатывали ЛПС (1 мкг/мл, 1 час)

Исследование in vivo проводилось на крысах линии Вистар и учитывало активацию МАР-киназ в легком, селезенке и костном мозге бедренной кости, а также продукцию TNFa в крови животных Артрофлекс (300 мг/кг) вводили крысам пероралыю за 49, 25 и 1 час до инъекции ЛПС ЛПС (4 мг/кг) вводили в хвостовую вену голодавшим в течение 12 часов животным Через 1 и 4 часа после введения ЛПС осуществлялась эвтаназия животных в С02-камере, забор крови и отбор биоптатов исследуемых органов

Статистический анализ результатов проводили с помощью пакетов программ ЕхсеГ97 и SPSS 12 Для статистической обработки и определения различий между независимыми группами нормально распределенных данных использовали t критерий Стыодента Во всех экспериментах различие между контролем и опытом считалось статистически достоверным только при р<0 05

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оценка противовоспалительного действия препарата артрофлекс

проводилось на моделях каррагенинового и формалинового отеков лапы крыс, характеризующих острое и подострое воспаления, соответственно Проведенное исследование позволило установить, что прием артрофлекса оказывает выраженное превентивное и лечебное действие в отношении острого и подострого воспалений у крыс На модели каррагенинового отека в дозах 125 и 500 мг/кг артрофлекс оказывал антиэксудативное, анальгетическое и антипирогенное действия по силе сопоставимые с таковыми диклофенака Ыа (8 мг/кг) и бутадиона (56 мг/кг), а в дозе 250 мг/кг превосходил их В частности через 3 часа после введения каррагенина артрофлекс (250 мг/кг) снижал объем и температуру воспаленной конечности животных на 56% и 72%, а порог болевой чувствительности увеличивал на 259%, соответственно На сроке 12 ч индукции воспаления действие артрофлекса усилилось, на сроке 24 ч оцениваемые показатели под влиянием препарата достигли значений нормы (рис 1)

I 2

I I

4

Рис, 1. Показатели активности воспалительного процесса в динамике течения каррагенинового отека у крыс на фоне применения препаратов, Здесь и далее:

Белые столбцы - 3 ч после введения каррагенина; Серые столбцы - 12 ч после введений каррагенина; Черные столбцы 24 ч после введения каррагенина. Цифрами 1-7 обозначены экспериментальны^ группы:

1 — интактные;

2 - плацебо;

3 - бутадиен, 56 мг/кг;

4 дикдофенак, 8 мг/кг;

5 арi рофлекс, 125 mi/кг;

6 -артрофлекс, 250 Мг/кг;

7 артрофлекс, 500 мг/кг.

Анализ йереферйчеекой крови животных подтвердил выраженное противовоспалительное действие артрофлексЗ в дозе 250 мг/кг. Уже через 3 часа после введения каррагенина крысам, артрофлекс снижал повышенные СО О и содержание лейкоцитов к крови на 69% и 68%, соотиетсвспно (рис. 2).

Рис. 2. Показатели кропи, характеризующие воспалительны й процесс и динамике течения

карра] спинового отека у крыс на фойе применения препаратов. Примечания:

Белые, серые, черные столбцы 3, 12, 24 ч после введения кнрр;и ем ила.

Цифрами 1-7 обозначены экспериментальные группы:

1 - иитактные;

2 плацебо;

3 буталион, 56 мг/кг;

4 - диклофенак, К мг /кг*;

5 артрофлскс, 125 мг/кг;

6 арфофлекс, 250 мг/кг;

7 арфофлеке, 500 мг/кг.

Результаты исследования на модели формалинового отека подтвердили выраженное противовоспалительное действие арфофлекса и его наибольшую эффективность в дозе 250 мг/кг. 11а 4-ые сутки развитая воспаления артрофлскс (250 мг/кг) снижал объем и температуру воспаленной конечности па 67 и 70%, соответственно, а порог болевой чувствительности увеличивал па 104%. Па 8-ые сутки развития воспаления артрофлскс изменял указанные параметры па 89, 83 и 38%, соответственно. При этом по эффективности артрофлскс (250 мг/кг) значительно превосходил действие бутадиона (56 мг/кг) и соответствовал паковому диклофенака (8 мг/кг).

Измерение уровней проста! ландима Е? (PG-Ег) и лейкогриеиа Hj (LTB4) п крови экспериментальных животных па 4 и 8 сутки после введения формалина показало, что а отличие от классического неспецифИческого ингибитора циклооксиганазы-1/2 диклофенака Na, действие которого в основном было направлено на продукцию РОЕ2 (снижал ira 63,3-68.4%) и лишь дезначителыю отражалось на продукции LTB4 (снижал на 11.5-35.4%), артрофлскс (250 мг/кг) эффективно подавлял продукцию обоих метаболитов арахидоновой кислоты (па 76.3-76.4% и 42.3-54.2%, соответственно) (табл. I).

Полученные результаты, а также подтверждающие их литературные данные о механизмах действия куркум и на (I long et al, 2004) и ацетил-11-кето-р-босвелиевой кислоты (Sailer, 1998), позволили предположить, что артрофлекё влияет на оба (на циклоксигепазпый и лшкжеигепа зпый) пути

метаболизма арахидоновой кислоты, что дает преимущество природному препарату перед синтетическими НПВП

Таблица 1

Уровни медиаторов воспаления в крови экспериментальных животных в динамике течения адъювантного артрита на фоне применения препаратов на 4 и

8 сутки, пг/мл (М±ш)

Экспериментальная группа PG-E, LTB4

4 день 8 день 4 день 8 день

Интактная 500±40 520±60 900±70 910±60

Плацебо 3800±150 2750±200 5200±400 4800±300

Бутадион, 56 мг/кг 2500±240* 1100±180* 3600±250* 2900±160*

Диклофенак, 8 мг/кг 1200±300* 1010±260* 4600±450* 3100±170*

Артрофлекс, 500 мг/кг 1100±120* 900±100* 3200±200* 3000±180*

Артрофлекс, 250 мг/кг 900±70* 650±50* 3000±150* 2200±200*

Артрофлекс, 125 мг/кг 900±60* 700±70* 3200±200* 2500±250*

* - достоверные отличия от группы плацебо (р < 0 05)

Следующей моделью, поставленной для оценки эффективности нового препарата при развитии хронического иммунного воспаления, служил "адьювантный артрит" у крыс Артрофлекс вводили в дозах 100, 300 и 900 мг/кг по лечебной схеме

Учитывая, что наиболее информативными показателями развития адьювантного артрита являются патологические изменения хрящевой и костной ткани пораженной конечности животных, характеристике этих тканей мы уделили особое внимание Результаты рентгенологического исследования показали, что введение артрофлекса крысам выражено снижает развитие патологических изменений костной ткани (утолщение и разволокнение кортикальных слоев плюсневых костей (рис 3)) В частности, среди животных, получавших артрофлекс, большая часть не имела патологических изменений и только у 20-40% были отмечены слабовыраженные изменений Тогда как среди крыс, получавших плацебо и преднизолон, большая часть имела утолщение и разволокнение кортикальных слоев плюсневых костей, причем не только слабо-, но и сильновыраженные (табл 2) Морфометрическое исследование хрящевой ткани сустава пораженной конечности позволило установить, что артрофлекс предотвращает резорбцию гиалинового хряща, причем делает это эффективнее препарата сравнения преднизолона

Рис. 3. Рентгеновский снимок конечностей крысы (адыовантный артрит, 24-с сутки). Л} патологический изменения отсутствуют; Б) патологические изменения слабо выражены; В) [) это логические изменения сильно выражены.

Стрелка указывает на утолщение и разволокнение кортнкальлых слоев плюсневых костей.

Та блнна 2

Состояние костной и хрящевой тканей пораженной конечности крыс на фоне адыовантногф артрита и применения исследуемых препаратов

Изменения костной ткани (п=10) Толщина суставного хряща (п=6)

Группа Сильно выражены Слабо выражены Отсутствуют Значение (Mini, мкм)

Пптактиая 0 0 ]() 9l.3±7.4

Плацебо 3 4 3 37.4^6. Г

Преднизолон, 10 мг/кг 1 6 3 49.816.2*

Ар трофлекс, 100 мг/кг 0 3 7 57.2i3.6-

Артрофлекс, 300 мг/кг 0 2 8 61.2±8.5"-»

Артрофлекс, 900 мг/кг 0 4 6 57.3±3.8*-*

- различия статистически значимы по сравнений с интактной группой <р<0.05) .. - различия статистически значимы но сравнению с группой плацебо (р<0.05)

Учитывая возможность проявления побочных эффектов аргрофлекса, па модели адыовантнбго артрита мы онегшли наличие иммуносупрсссорнйго и ульцерогенного действия препарата.

Исследован не показало, что в отличие от преднизолона природный препарат не оказывает (Шмунбсупрс сборного действия. В частности, но снижает вес тимуса и толщину его коркового слоя. Более того, в дозе 300 мг/кг артрофлекс предотвращал сгресс-ивдуцированиую инволюцию коркового вещества тимуса, что подтвердило выраженные противовоспалительные свойства изучаемого препарата (табл. 3).

Таблица 3

Состояние первичных и вторичных лимфоидных органов у крыс на фоне адыовантиого артрита и применения исследуемых препаратов_

Состояние первичных и вторичных лимфоидных органов

Группа Относительный вес селезенки (мг/100 г. крысы) (п=10) Относительный вес тимуса (мг/100 г. крысы) (п=10) Толщина коркового слоя тимуса(мкм) (П=6)

Интактная 402.5*2 1.8 152.ОН 1.4 386.0*7.0

11ладебо 437.9±29.Ц 130.9*9.9 203.4*1 1.9*

11реднизолон, !0 мг/кг 398.64 18.8 69.8*5.7% 74,7*7.4*..

Артрофлекс, 100 мг/кг 467.8*27.3 116.4*6.8* 279.4* 16.7*«

Артрофлекс, 300 мг/кг 471.3*30.0 126.9±1 1.3 3 19,6*7,3*..

Артрофлекс, 900 мг/кг 471.8*27.7 122.9*9.6 359.7*10.6..

---------------

различия статистически значимы по сравнению с йнтактноЙ группой (р<0.05) »« различия статистически значимы по сравнению с группой плацебо (р<0.05)

Вскрытие желудков крыс и визуальный осмотр их слизистой оболочки показал, что и артрофлекс и преднизолон оказывают ульцерогсипое действие. Однако если в случае приема артрофлскса повреждения слизистой носили слабо вы ражённый характер в виде кровоизлияний и проявлялись только у 40% животных, то при введении крысам преднизалона нарушения морфологии слизистой оболочки желудка наблюдались у всех вошедших в исследование крыс и включали пе только кровоизлияния, но и наличие множественных язв (рис. 4)

Рис. 4. Состояние слизистой оболочки крыс па фоне идыовап пюго артрита и применения препаратов.

Примечание: белый сектор отсутствие патологических изменений; светло-серый сектор - гиперемия: темно-серый сектор кровоизлияния; черный сектор - язвы.

Изучение механизмов противовес палите л ьн ого действия фитопрепарат артрофлекс начали с определения влияния препарата на ЛПС-индуцишванную продукцию ключевых провоспалительных цитокинов ll.-lfi, iL-6 и TNF«. Исследование проводилось па перевиваемой культуре моноцитов человека линии ТИР-1 и выявило ингибируюшее влияние артрофлекса в Отношении продукции всех оцениваемых белков. 11аиболее выражен но препарат снижал продукцию JL-6 (максимально па 76%), менее выражении -продукцию TNFa (максимально па 32%), самое слабое действие оказывал в отношении продукции li.-lfi (максимум шиибиронапня составил 8.6%) (рис. 5).

Артрофлекс (мкг/мл)

Рис. 5. Влияние аргрофлекса па ЛПОиидуцироваипую продукцию провоспгрите льнык цитокинов 1L-I(i, IL-6 и TNFa в культуре моноцитов человека линии ТНР-!,

Примечание: * - р<0.05 при сравнении с контролем.

Однако результату, полученные in vitro, не всегда отражают реальную активность препарата in vivo, особенно, когда речь идет о комплексном препарате, который назначается пероральио.

Чтобы убедиться в корректности полученных данных мы предложили модель, позволяющую оцепить механизм действия препарата ex vivo. Модель построена па том. что после перорального введения препарата, его биологически активные компоненты (как в нативном «иле, так и их метаболиты) поступают в кровь и оказывают свое действие. В соответствии с этим последовательный (повременный) забор крови у животного и индукция в ней реакции воспаления позволяет установить силу и время биологического действия препарата. Оценку ййслалеиия мы проводили по определению в крови уровня продукции фактора некроза опухолей a и простаглапдшш U2.

16

Результаты определения влияния гтероральногр введения артрофлекса крысам па ЛПС-индуцированную продукцию TNF« и PGE: в крови животных подтвердили, что противовоспалительное действие препарата связано с подавлением ЛПС-индуцированной продукции продаспалнтельного цитокина TN Fit и показали, что препарат также ингибирует Л ПС- и иду ци. рокаину ш продукцию метаболита арахидоновой кислоты Р0Е2 (рис. 6).

Измерение продукции факторов воспаления клетками кропи в динамике после введения артрофлекса крысам позволило установить, что препарат оказывает выраженное противовоспалительное действие через 30 минут (продукция TNFtt снизилась на 61%), а также через 4 (продукция TN ¡-'и и 1Ч1Е2 снизилась на 65 и 82%, соответсвепно) и 8 часов (продукция TNFa снизилась? на 44%) после введения в организм. Временные сроки проявления артрофлсксом Противовоспалительного действия совпадали с достижением максимальной концентрации в плазме крови метаболита I кур кум и на и ацетил! 1 -кето-р-бос вел невой кислоты (через 30 мин и 4 часа после введения препарата крысам, соответственно) (Карлина и coaRT., 2007), что дало основание предполагать связь эффекта с определенными соединениями (рис. й).

Н!^ TNFa

Î=1PGE2

—Меш^рлит куркумина 1

-s—ацетил-1 1-кето-р-босб; кислота

0.5ч IЧ 2ч 4ч Ш Время набора крови

Рис. 6. Влияние аргрофлекса на Л ПС-индуцированную продукцию TNFtt и PCiF.2 в кропи крыс при введении препарата per os. Сравнительный анализ Сроков проявления противовоспалительного действия артрофлекса е концентрацией метаболитов я компонентов артрофлекса а крови крыс.

Примечание; * - р<0.05 при сравнении с контролем.

Наличие сходного влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию IL-6, TNFct и IL-1 [( in vitro позволило предположить единый механизм действия препарата па продукцию цитокииов. На основании того, что главным регулятором при запуске синтеза IL-6, TNF-rï и il--1(3 является

140

120

ы

о s 100

Cl, о

il h. S. e. Q KO

h--3 "J r- o 60

£ >> s 40

20

л

■ 2,5?

2 ° Ь - = м

— il H .0-

I Р

X

и

О-

щ

ядерный транскрипционный фактор kli (NF-kB), было проведено определение влияния артрофлекса на TNFct-инДуцирОванную активацию данного фактора.

Результаты исследования показали, Что артрофлещ способен подавлять TNFa-HH.iym:poBaHHyi<) активность NF-kB in vitro (на 20-23% в дозах Q.01-0.1 мкг/мл и на 65% в дозе 125 мкг/мл) (рис. 7). Однако экстремальней характер Зависимости "доза препарата эффект" дали основание предполагать, что артрофлекс действует не на сам ядерный фактор кВ, а па другие регуляторные молекулы, напрямую или косвенно влияющие на его активацию.

Рис. 7. Влияние препарата артрофлекс па TN Гаи иду цирова иную активность NF-kii.

Примечание: * - р<0.05 при сравнении контролем.

В качество возможных Мйшеней действия артрофлекса были предложены митоген-активированные (MAP) протеинкиназы р38, JNKI/2 и BRK1/2. По данным многочисленных исследований МАР-кинаЗы JNKI/2, р38 и ERK1/2 играют одну из ключевых ролей в развитии воспаления. Во-первых, они фосфорилируют и, таким образом, активирую! мпогие факторы транскрипции, в числе которых NF-kB (Kyriakis el аI,, 2001; Saklatvala el al,, 2004), во-вторых, МАР-кипазы обеспечивают иостграпекригщноппую регуляцию синтеза некоторых провоспадительпых цитокипои: повышают стабильность мРНК (Ming et al., 1998; Winzen el al., 1999) и регулируют ее транспорт из ядра в цитоплазму (Dumilru et al., 2000),

Определение влияния артрофлекса на ЛПС-ипдуцировлппую активацию МАР-книаз р38, .INK 1/2 и ERKI/2 в перевиваемой клеточной культуре моноцитов человека U'J37 не дало значимых результатов, за исключением установленного действия препарата в отношении активации JNK1/2. В результате этого нами была предложена модель, позволяющая определить влияние препарата па ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ р38, JNK1/2 и FRKI/2 а тканях животных. Предложенный метод включал внутривенное введение крысам ЛИС, забор крови и отбор биоптатов легкого, селезенки и костного мозга бедреппой кости. В крови определяли уровень

110

О 0,01 0,1 1,3 12,5 125 Артрофлекс (мкг/мл)

lipo воспалительно го шпокмна TN Fa, is органах активацию МЛ Р-кпназ JNKI/2, р38 и HRK.I/2.

Реализованная модель являлась инновационной. Анализ отечественной научной литературы не выявил наличие подобных исследовании в России, а обзор мировой литературы показал, что число опубликованных работ, использовавших данный подход, не превышает 20.

Проведенное исследование показало, что дероральное введение препарата крысам ингибирует Ш Ю-индуцированную активацию МАР-киназ р38, JNK.I/2 и FRKI/2 в селезенке, а также р38 и FRKI/2 в легком и костном мозге на сроках I и/или 4 часа индукции воспаления (рис. 8-9). Таким образом, па основании полученных данных можно сделать вывод, что одним из механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является inn пбировапис активации МАР-киназ р38, J N К1 /2 и LiRKl/2.

Отсутствие влияния артрофлекса па активацию JNKI /2 в легком и костном мозге может быть связано с проявлением действия препарата в другие, отличные от ! и 4 часов, сроки индукций воспаления п особенностями его фармакокинетики; К тому же артрофлекс подавлял активацию .INK 1/2 in vitro.

Важно отмстить, что во всех исследуемых Органах артрофлекс снижал количество фоефорнлироианпых форм МАР-кипазы р38 до уровня ннтактпых животных или более. Учитывая, что р38 является стрсссорной МАР-кииазой, в норме неактивной, полученные результаты можно объяснить проявлением действия артрофлекса не только в процессе развития воспаления у жпвошых, по и при заборе биоптатов тканей. То есть, предполагается, что препарат способен подавлять передачу сигнала, как от факторов воспаления, так и от с трессов окружающей среды.

Селезенка

Рис. 8, Влияние препарата артрофлекс (300 мг/кг, per os) па активацию МАР-киназ JNKI/2, р38 и ERKI/2 в селезенке крыс через I и 4 часа после внутривенного введения им ЛПС, * - р<0.05 при сравнении с контролем (плацебо)

Легкое

4ч Л ПС

ERK1/2

й Плацебо ■ Артрофлеке

Костный моя

.100 -1——1--

Рис. 9. Влияние препарата артрофлекс (300 мг/кг, per ок) па активацию МЛ!1-киназ JNKI/2, р38 и ERKI/2 в легком и костном мозге крыс через I и 4 часа после внутривенного введения им ЙПС. Примечание: * - р<0 ()5 при сравнении е контролем (плацебо)

Определение влияния перорального введения артрофлекса крысам па ЛПС-индуцированное повышение уровня TNRt в крови жи вот пых доказало

способность препарата ингибировать продукцию провоспалителыюго цитокина т vivo На сроке 1 час индукции воспаления артрофлекс снижал концентрацию TNFa в плазме крови до <5%, на сроке 4 часа - до 42% от таковой животных из группы плацебо (табл 4)

Таблица 4

Уровень ТЫРа в плазме крови крыс на фоне внутривенного введения ЛПС и _перорального приема препарата артрофлекс (300 мг/кг)_

Группа(п=7) Уровень TNFa в плазме крови крыс (пг/мл)

через 1 ч после введения ЛПС через 4 ч после введения ЛПС

Интактные <31 <31

Плацебо 608 8±202 Г 1243 2±205 9*

Артрофлекс (300 мг/кг) <31%. 510 4±78 9%.

- различия статистически значимы (р<0 05) по сравнению с группой интактных животных, «• - различия статистически значимы (р<0 05) по сравнению с группой плацебо

Полученные данные позволяют заключить, что установленная ранее способность артрофлекса ингибировать ЛПС-индуцированную продукцию ключевого провоспалителыюго цитокина TNFa в условиях in vitro и ex vivo подтвердилась на уровне in vivo при пероральном введении препарата животным На основании этого можно утверждать, что одним из механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование им продукции фактора некроза опухолей-a

Суммируя результаты изучения специфической фармакологической активности препарата артрофлекс, можно заключить, что препарат оказывает выраженное противовоспалительное действие по силе не уступающее синтетическим стероидным и нестероидным лекарственным средствам Артрофлекс обладает противоотечной, анальгезирующей и антипиретической активностями, предотвращает индуцированные хроническим воспалением деструкцию хряща и патологические изменения костной ткани

Механизм действия артрофлекса выражается в снижении повышенной продукции провоспалительных цитокинов TNFa, 1L-6 и IL-ip, а также метаболитов арахидоновой кислоты простагландина Е2 и лейкотриена В4 Оказываемое действие проявляется за счет регулирования активации МАР-киназ (р38, JNK1/2, ERK1/2) и ядерного транскрипционного фактора кВ

ВЫВОДЫ

1 В ходе комплексного исследования с использованием трех экспериментальных моделей острого, подострого и хронического воспалений у крыс установлено, что новый отечественный препарат растительного

происхождения артрофлекс обладает выраженными противовоспалительными свойствами в дозе 250-300 мг/кг

2 При остром и подостром воспалениях артрофлекс оказывает антиэксудативное, анальгезирующее и жаропонижающее действие, нормализует СОЭ и лейкоцитоз, а также снижает уровень простагландина Е2 и лейкотриена В4 в периферической крови экспериментальных животных При хроническом воспалении суставов артрофлекс предотвращает деструкцию хряща и патологические изменения костной ткани

3 По эффективности противовоспалительного действия артрофлекс (250-300 мг/кг) соответствует или превосходит стероидные (преднизолон (10 мг/кг)) и нестероидные (бутадион (56 мг/кг), диклофенак Ыа (8 мг/кг)) противовоспалительные препараты, при этом оказывает значительно менее выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет иммуносупрессорных свойств

4 С использованием современных методов молекулярной биологии, адаптированных для изучения препаратов растительного происхождения, проведен анализ ряда механизмов противовоспалительного действия артрофлекса В частности, установлено, что артрофлекс подавляет ЛПС-индуцированную продукцию факторов воспаления ТЫ Ра, 1Ь-6,1Ь-1() и РОЕ2

5 Адаптирован метод определения влияния растительного препарата на активацию МАР-киназ р38, ЖК1/2 и Е11К1/2 в органах крыс при его пероралыюм введении животным Установлено, что одним из механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование активации МАР-киназ р38, ЛЧК1/2 и ЕЯК1/2 и снижение транскрипционной активности ядерного фактора кВ

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Rydlovskaya А V, Makarova М N, Makarov V G, Tikhonov V Р Investigation of anti-inflammatory activity of complex herbal oil extract in vitro and in vivo// Abstr Book of Oxygen club of California «Oxidants and antioxidants m biology», 15-18 March 2006 - Santa Barbara, California, 2006 -P 107

2 Рыдловская А В, Макаров В Г К механизмам противовоспалительного действия босвеллиевых кислот // Материалы X междунар Съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», 22-25 июня 2006 - СПб, Россия, 2006 -С 754-759

3 Рыдловская А В, Макарова М Н, Макаров В Г Оценка противовоспалительного действия комбинированного фитопрепарата артрофлекс и его компонентов на модели адыовантного артрита у крыс // Материалы X междунар съезда «Актуальные проблемы создания новых

лекарственных препаратов природного происхождения», 22-25 июня 2006

- СПб, Россия, 2006 - С 754-759

4 Rydlovskaya А, Makarov V , Makarova М , Pozhantskaya О , Tikhonov V Investigation of anti-inflammatory activity of complex herbal oil extract in vitro and in vivo// J Planta Medica (54th annual congress on medical plant research, 29 August - 2 September, Helsinki, Finland, 2006) - 2006 - Vol 72 - P 1007-1008

5 Рыдловская А В, Макаров В Г Механизмы противовоспалительного и иммуномодулирующего действий диферулоилметана// Вестник Уральской медицинской академии наук -2006 -ТЗ, №1 -С 208-210

6 Рыдловская А В , Макарова М Н , Тесакова С В , Столащук Н В , Макаров В Г Оценка эффективности нового нестероидного противовоспалительного препарата растительного происхождения// «Политехнический симпозиум Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона», 8 декабря 2006 - СПб, Россия, 2006 - С 202

7 Рыдловская А В , Макарова М Н, Макаров В Г, Иванова С А, Пожарицкая О Н , Тихонов В П Оценка противовоспалительного действия комбинированного препарата артрофлекс на модели каррагенинового отека у крыс линии Вистар// Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им ИИ Мечникова -2006 -№3(7) - С 138-141

8 Рыдловская А В , Макарова М И , Макаров В Г , Тесакова С В , Иванова С А , Пожарицкая О Н , Тихонов В П Противовоспалительная активность и механизм действия препарата "Артро-актив'7/Фармация -2007 - №1 -С 38-41

9 Рыдловская А В , Гончар И В , Тесакова С В , Столащук И В , Гущин В А, Макаров В Г Определение влияния противовоспалительного комбинированного растительного препарата артрофлекс на сигналинг МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 и ядерного фактора кВ// Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 5-7 июня 2007

- Пущино, Россия, 2007 - С 333-335

10 Rydlovskaya А V, Gonchar IV, Gushchin VA, Tesakova SV, Stolashuk N V , Makarov V G , Tikhonov V P Study of mechanisms of action of a new non-steroidal anti-inflammatory remedy of plant origin// Abstr Book of Nordic Natural Products Conference, - June 13-15 2007 - Sankt Helene, Denmark, 2007 -P 57

11 Рыдловская А В , Гончар И В , Гущин В А , Тесакова С В , Столащук Н В , Макаров В Г Влияние нового нестероидного противовоспалительного препарата растительного происхождения на ЛПС-индуцированную продукцию TNFa и активацию МАР-киназ JNK1/2, р38 и ERK1/2 in vivo// Российский аллергологический журнал (VIII Конгресс "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 27-29 июня - Москва, Россия, 2007) - 2007 - №3, приложение 1 - С 34

12 Макаров В Г, Макарова М Н, Рыдловская А В , Тесакова С В Нутриметаболомика с позиций системной оценки функционирования метаболических комплексов//Ж вопросы питания -2007 -№3 -С 4-10

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 18 07 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел иеч л 1,0 Тираж 100 Заказ 1789Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Актуальность темы

Социальная значимость воспалительных заболеваний растет во всем мире. Это определяет необходимость разработки новых противовоспалительных препаратов. Сложность разработки эффективных и в то же время безопасных средств для лечения воспаления заключается в том, что это поливалентный, весьма динамичный процесс с множеством альтернативных и перекрещивающихся путей, существующих как на уровне внутриклеточных взаимодействий сигнальных каскадов, так и на уровне регуляции продукции медиаторов воспаления (Черешнев, 2002; Руднов, 2006). В соответствие с этим, влияние только на одну мишень патогенеза либо не сопровождается достаточным фармакологическим эффектом, либо вызывает ряд побочных явлений (Schmid-Schonbein, 2006).

• На основании вышесказанного современная медицинская наука постулирует необходимость создания новых препаратов, способных регулировать функциональную активность не одной, а многих молекул, участвующих в воспалении (Krakauer, 2004).

Проблемой, стоящей перед фармакологами, является отсутствие на сегодняшний день полного представления о работе всех звеньев сигнальных каскадов, а также функционального значения многих регуляторных молекул, обеспечивающих воспаление. Это создает трудности при' выборе потенциальных мишеней для новых синтетических субстанций (Aderem, Smith, 2004).

В связи с этим хорошие перспективы имеют препараты, созданные на основе растительного сырья (Пастушенков, Лесиовская, 1995; Darshan, Doreswamy, 2004). Современной науке известно не менее 1200 видов растений, обладающих выраженной фармакологической активностью (Болотина, 2007). Их терапевтическая ценность доказана тысячелетней историей применения и научно обоснована результатами доклинических

Krieglstein et al., 2001; Camacho-Barquero et al., 2007; Kurup et al., 2007) и клинических исследований (Саратиков, Краснов, 2004; Deodhar et al., 1980; Gupta et al., 2001). Анализ механизмов действия некоторых субстанций растительного происхождения показал, что фармакологическая активность природных соединений обусловлена их способностью воздействовать комплексно и изменять активность многих регуляторных белков (Aggarwal et al., 2006). В соответствие с этим определение механизмов действия компонентов растительных препаратов может оказаться полезным не только для их грамотного применения в клинике, но и для раскрытия ключевых регуляторных молекул воспаления.

Однако определение фармакологических мишеней действия препаратов растительного происхождения, как правило, сопровождается трудностями, связанными с их фармакокинетикой и особенно метаболической трансформацией действующих веществ в организме. В результате, изучение механизмов действия природных субстанций in vitro зачастую не дает корректных результатов и делает актуальным совершенствование методических подходов.

В настоящей работе предприняты попытки определения* противовоспалительных свойств и анализа механизма действия нового оригинального растительного препарата артрофлекс. Выбор лекарственного средства в качестве объекта исследования! обусловлен несколькими предпосылками. Во-первых, артрофлекс является комбинированным препаратом, включающим три широко известных в; мировой фитомедицине компонента: экстракт смолы ладанного дерева (Boswellia serrata), экстракт корней куркумы (Curcuma longa) и экстракт семян сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica) (Александрова и др., 2004) Это дает основание предполагать наличие у артрофлекса множественности механизмов действия. Во-вторых, предварительные исследования компонентов артрофлекса выявили их высокую фармакологическую активность, в частности, выраженные противовоспалительные свойства (Shikov et al., 2005). В-третьих, основные действующие вещества артрофлекса обладают выраженной гидрофобностью и тем самым затрудняют изучение механизмов действия препарата по общепринятым методикам in vitro.

Все эти предпосылки с одной стороны позволяют ожидать выраженную фармакологическую активность нового препарата, с другой, говорят о необходимости подбора методов для изучения механизмов его действия.

Цель исследования

Оценка противовоспалительных свойств нового растительного препарата артрофлекс и определение основных механизмов его действия. Задачи исследования:

1. Оценить противовоспалительные свойства препарата артрофлекс на моделях острого (каррагениновый отек), подострого (формалиновый отек) и хронического (адьювантный артрит) воспаления у крыс.

2. Провести сравнительный анализ эффективности артрофлекса с синтетическими препаратами стероидной (преднизолон) и нестероидной (диклофенак, бутадион) природы.

3. Изучить механизмы противовоспалительного действия препарата артрофлекс. a. Разработать метод корректной пробоподготовки препарата с целью тестирования его активности в культуре клеток. b. Определить влияние на ЛПС-индуцированную продукцию провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей-а (TNFa), интерлейкина-1 (3 (IL-lp) и интерлейкина-6 (IL-6) in vitro. c. Подтвердить влияние на ЛПС-индуцированную продукцию TNFa и простагландина Е2 (ex vivo) в крови крыс при однократном пероральном введении препарата (300 мг/кг) животным с оценкой динамики проявления противовоспалительного действия. d. Определить влияние на TNFa-индуцированную активацию ядерного фактора kB и ЛПС-индуцированную активацию митоген-активированных (MAP) протеинкиназ (р38, JNK1/2, ERK1/2) in vitro. е. Адаптировать метод оценки активации МАР-киназ р38, JNK1/2, ERK1/2 в органах животных для определения механизма действия растительного препарата in vivo. Изучить влияние артрофлекса (300 мг/кг; in vivo) на изменение уровня ЛПС-индуцированной активации МАР-киназ р38, JNK1/2, ERK1/2 в легком, селезенке и костном мозге, а также продукцию TNFa в крови крыс.

4. Определить возможность проявления побочного (ульцерогенного и иммуносупрессорного) действия артрофлекса.

5. Подготовить материалы по изучению' противовоспалительных свойств препарата артрофлекс для представления в фармакологический комитет с целью получения разрешения на проведение клинических испытаний.

Научная новизна исследования

С использованием современных методов фармакологии и молекулярной биологии впервые проведено комплексное изучение противовоспалительных свойств нового отечественного растительного препарата артрофлекс в сравнении с известными синтетическими средствами стероидной и нестероидной природы. Установлено, что артрофлекс оказывает антиэксудативное, анальгетическое и жаропонижающее действие при остром и подостром воспалениях, а также предотвращает деструкцию хрящевой и костной тканей сустава при хроническом воспалении.

Впервые установлено, что противовоспалительное действие максимально через 0.5 и 4-8 часов после перорального введения препарата крысам.

Впервые проведена оценка побочных действий. Показано наличие слабовыраженного ульцерогенного эффекта и отсутствие иммуносупрессорного действия, что позволяет говорить о преимуществе исследуемого препарата перед синтетическими противовоспалительными средствами.

Впервые проведен анализ механизмов противовоспалительного действия артрофлекса. Учитывая высокую гидрофобность действующих веществ, разработан метод по подготовке препарата для тестирования его активности в культуре клеток. Метод оценки активации МАР-киназ р38, JNK1/2, ERK1/2 в органах животных адаптирован для определения механизма противовоспалительного действия растительного препарата.

В результате исследований in vitro и in vivo получены данные о том, что противовоспалительное действие артрофлекса связано с подавлением индуцированной продукции TNFa, IL-6, IL-ip и PGE2, ингибированием транскрипционной активности ядерного фактора кВ и снижением активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2.

Научно-практическая значимость

Проведены доклинические испытания, выявившие противовоспалительные свойства и раскрывающие механизм действия нового отечественного препарата растительного происхождения артрофлекс.

Результаты настоящего исследования послужили основанием для подготовки и предоставления материалов по новому отечественному препарату артрофлекс для регистрации в ФГУ "НЦЭСМП" Росздравнадзора МЗ и CP РФ (акт о внедрении от 23.05.2007).

Модифицированный и апробированный нами метод определения влияния препаратов природного происхождения на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 в органах крыс при их пероральном введении используется при изучении механизмов действия целого ряда других фармакологических субстанций (акт о внедрении от 30.07.2007).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Артрофлекс оказывает выраженное противовоспалительное действие в дозе 250-300 мг/кг у крыс. По эффективности противовоспалительное действие артрофлекса сопоставимо с таковым синтетических стероидных (преднизолон, 10 мг/кг) и нестероидных (бутадион (56 мг/кг), диклофенак натрия (8 мг/кг)) противовоспалительных препаратов. При этом он оказывает менее выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет иммуносупрессорного действия.

2. В исследованиях in vitro, ex vivo и in vivo показано, что механизм противовоспалительного действия препарата связан с ингибированием ЛПС-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов TNFa, IL-6 и IL-ip и метаболита арахидоновой кислоты PGE2.

3. Противовоспалительное действие артрофлекса реализуется через регуляцию активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2; а также-ядерного фактора кВ.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на международной конференции «Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения. Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию» (Химки, 2006); X Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов, природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященных памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006); 54th annual congress on medical plant research (Helsinki, Finland; 2006); Oxygen club of California «Oxidants and antioxidants in biology» (Santa Barbara, California, 2006); «Политехническом симпозиуме: Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007); Nordic Natural Products Conference (Sankt Helene, Denmark, 2007); VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав, содержащих результаты экспериментальных исследований и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами, схемами и рисунками. Список литературы включает 225 источников.

ВЫВОДЫ

1. В ходе комплексного исследования с использованием трех экспериментальных моделей острого, подострого и хронического воспалений у крыс установлено, что новый отечественный препарат растительного происхождения артрофлекс обладает выраженными противовоспалительными свойствами в дозе 250-300 мг/кг.

2. При остром и подостром воспалениях артрофлекс оказывает антиэксудативное, анальгезирующее и жаропонижающее действие, нормализует СОЭ и лейкоцитоз, а также снижает уровень простагландина Е2 и лейкотриена В4 в периферической крови экспериментальных животных. При хроническом воспалении суставов артрофлекс предотвращает деструкцию хряща и патологические изменения костной ткани.

3. По эффективности противовоспалительного действия артрофлекс (250-300 мг/кг) соответствует или превосходит стероидные (преднизолон (10 мг/кг)) и нестероидные (бутадион (56 мг/кг), диклофенак Na (8 мг/кг)) противовоспалительные препараты, при этом оказывает значительно менее выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет иммуносупрессорных свойств.

4. С использованием современных методов молекулярной биологии, адаптированных для изучения препаратов растительного происхождения, проведен анализ ряда механизмов противовоспалительного действия артрофлекса. В частности, установлено, что артрофлекс подавляет ЛПС-индуцированную продукцию факторов воспаления: TNFa, IL-6, IL-1|3 и PGE2.

5. Адаптирован метод определения влияния растительного препарата на активацию МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 в органах крыс при его пероральном введении животным. Установлено, что одним из механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 и снижение транскрипционной активности ядерного фактора kB.