Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование химического состава, оценка биологической активности пчелиного расплода и получение на его основе лекарственных препаратов

На правах рукописи

ЛАЗАРЯН ДЖОНИК СЕДРАКОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА, ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПЧЕЛИНОГО РАСПЛОДА И . ПОЛУЧЕНИЕ НА ЕГО ОСНОВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

15.00.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

На правах рукописи

ЛАЗАРЯН ДЖОНИК СЕДРАКОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА, ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПЧЕЛИНОГО РАСПЛОДА И ПОЛУЧЕНИЕ НА ЕГО ОСНОВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

15.00.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ПЯТИГОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ: доктор фармацевтических наук,

профессор Е.В. Компанцева

доктор фармацевтических наук, профессор Евтушенко Н.С.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор фармацевтических наук профессор Муравьева Д.А.

доктор медицинских наук, профессор Гринзайд Ю.М.

доктор химических наук, профессор Озеров А.А.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Пермская государственная фармацевтическая академия (г.Пермь)

Защита состоится «10» сентября 2002 г, в «9-00» часов на заседании диссертационного совета Д.208.069.01 по защитам диссертаций при Пятигорской государственной фармацевтической академии (357533, Пятигорск, пр. Калинина,! 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии (пр. Калинина, 11)

Автореферат разослан «25 » июля 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

профессор Э.Ф. Степанова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем фармации является создание лекарственных средств на основе веществ природного происхождения, среди которых особое место занимают продукты пчеловодства.

Пчелопродукты представляют собой комплекс биологически активных веществ, обладающих ценными лечебными свойствами. На их основе разработаны и используются во многих странах более 400 лекарственных препаратов. В нашей стране их число ограничивается несколькими наименованиями.

Из всех продуктов пчеловодства важное значение для медицины имеет маточное молочко благодаря своему уникальному составу и высокой биологической активности. Однако в России в настоящее время производство и переработка маточного молочка ограничены, что связано в основном трудоемкостью его получения и высокой стоимостью.

В связи с этим, несомненный интерес представляет собой новый нетрадиционный продукт пчеловодства - пчелиный расплод. Один из видов расплода - трутневые личинки, согласно литературным данным и собственным исследованиям, близок по некоторым физико-химическим свойствам и составу к маточному молочку. На основе трутневых личинок в некоторых зарубежных странах запатентованы и применяются лекарственные средства, эффективные при лечении ряда заболеваний.

Исходя из разрозненных литературных данных по изучению состава трутневых личинок можно предположить, что расплод пчел будет проявлять актопротекторное, анаболическое, иммуногропное действие при внутреннем применении, противовоспалительное и ранозаживляющее - при наружном применении.

Перспективность применения расплода пчел обусловлена наличием доступной и дешевой сырьевой базы, простой и нетрудоемкой схемой получения. Так, в активный пчеловодческий сезон от 1 пчелиной семьи мож-

но отбирать до 2 кг трутневых.и ЗООг маточных: личинок без ущерба для семьи и снижения продуктивности пасеки. При целенаправленном получении количество:трутневого ¡расплода может.быть увеличено до 10 кг. Следует отметить, что стоимость расплода .пчел ¡при этом-будет в 16 раз меньше стоимости маточного молочка.! ~ •;-?, !»,.".,.. ......

Таким образом, пчелиный расплод после изучения химического состава и фармакологической активности может стать перспективным, доступным потенциальным сырьевым источником получения лекарственных препаратов.

Исходя из вышеизложенного, актуальным является систематическое исследование всех видов пчелиного расплода в сравнении с маточным молочком с целью оценки их физико-химических показателей, химического состава и фармакологической активности, а также изучения стабильности, стандартизации сырья и лекарственных препаратов, полученных на их основе.

Цель и основные задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось теоретическое и экспериментальное обоснование возможности использования пчелиного расплода для создания и стандартизации лекарственных препаратов на его основе.

Для реализации данной цели необходимо было решить следующие задачи:

- обоснование способов получения и стабилизация гомогенатов пчелиного расплода;

- сравнительное изучение физико-химических показателей полученных стабильных образцов пчелиного расплода и маточного молочка;

- сравнительное определение качественного и количественного состава биологически активных компонентов образцов пчелиного расплода и маточного молочка;

- изучение зависимости физико-химических показателей и количественного состава биологически активных веществ пчелиного расплода от

породы пчел, географического расположения и климатических условий с целью стандартизации наиболее перспективных образцов;

- прогнозирование и проведение направленного сравнительного изучения фармакологической активности субстанций пчелиного расплода и маточного молочка;

- разработка составов лекарственных и косметических средств на основе наиболее перспективных субстанций пчелиного расплода, изучение их фармакологической активности;

- разработка нормативной документации для оценки качества перспективных видов пчелиного расплода и лекарственных препаратов на их основе, представление пакета документов на лекарственные средства в Департамент государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ России.

Поставленные задачи решались путем обобщения и критического анализа отечественной и зарубежной литературы, а также на основании собственных исследований.

Научная новизна. На основании систематических исследований теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования наиболее перспективных видов расплода пчел (маточных личинок, трутневого расплода - смеси трутневых личинок и предкуколок) для получения лекарственных и лечебно-профилактических средств. Доказано, что по своим физико-химическим показателям и химическому составу трутневые предкуколки близки к трутневым личинкам, а 3-х дневные маточные личинки имеют такой же химический состав, что и остальные виды расплода в возрасте от 6 до 14 дней. Проведено исследование по получению стабильных образцов маточных личинок, трутневого расплода и маточного молочка. Впервые проведено сравнительное изучение химического состава, физико-химических показателей пчелиного расплода (маточных личинок, личинок рабочих пчел, трутневых личинок, предкуколок и куколок) в сравнении с маточным молочком. Установлено, что пчелиный

расплод содержит значительное количество белка (до 45%). Определено содержание сульфгидрильных групп белка, количество которых у всех видов расплода в различной степени оказалось выше, чем в маточном молочке, что может свидетельствовать о большей биологической активности пчелиного расплода. Изучен: аминокислотный состав пчелиного расплода. Установлено, что все образцы расплода, как и маточное молочко, содержат один и тот же набор из 20 аминокислот, в том числе 10 незаменимых аминокислот.

Впервые изучен ферментный состав пчелиного расплода. Установлено, что по активности ферментов (уреазы, липазы, амилазы, катепсинов, фосфотаз, протеаз) пчелиный расплод превосходит маточное молочко, а обнаруженный в расплоде фермент дегидрогеназа в молочке отсутствует. Впервые определено высокое содержание нуклеиновых кислот, причем количество ДНК в 3 раза превышает РНК. С помощью хромато-масс-спектрометрии в липидной фракции расплода пчел определено содержание более 100 соединений различных классов, принимающих участие как в синтезе эндогенных биологически активных веществ, так и вносящих определенный вклад в биологическую активность пчелиного расплода. Изу-

чен гормональный состав расплода пчел, идентифицированы жиро- и водорастворимые витамины. Установлено высокое содержание ценных микроэлементов (железа, цинка, меди, марганца и др.).

Впервые доказано, что порода пчел, географическое расположение, климатические условия оказывают незначительное влияние на физико-химические показатели и химический состав расплода пчел. Данный факт позволил разработать нормы и критерии оценки качества наиболее перспективных образцов пчелиного расплода. На основании полученных результатов исследования химического состава пчелиного расплода была спрогнозирована вероятная фармакологическая активность, доказанная затем экспериментально. Доказано, что субстанции расплода пчел являются практически нетоксичными, не обладают аллергизирующими свойст-

вами, оказывают выраженную анаболическую, актопротекторную и имму-нотропную активность при внутреннем и противовоспалительную, раноза-живляющую активность при наружном применении.

Получены приоритетные справки на способ получения мази «Апи-лар-Г», обладающей противовоспалительным действием; способ получения косметической лечебно-профилактической крем-маски с трутневым расплодом и маточным молочком, обладающей противовоспалительным и ранозаживляющим действием; способ получения косметического лечебно-профилактического крема с трутневым расплодом, обладающего противовоспалительным действием, способ стабилизации гомогенатов трутневых личинок, предкуколок, маточных личинок.

Практическая значимость работы. Предложены способы стабилизации гомогенатов пчелиного расплода, что позволит получать образцы, стойкие в процессе транспортировки, хранении и удобные при получении лекарственных форм. Разработаны унифицированные методики определения подлинности пчелиного расплода и количественного содержания в них основных биологически активных компонентов.

Результаты исследования физико-химических показателей, химического состава и фармакологической активности пчелиного расплода позволили предложить составы лекарственных и лечебно-профилактических средств на его основе.

Обоснован состав лекарственных и лечебно-профилактических средств, содержащих расплод пчел и традиционные продукты пчеловодства. Получены лекарственные препараты, содержащие как пчелиный расплод, так и его композиции с традиционными продуктами пчеловодства: мази «Апилар-Г», «Апилар-проп», крема «Апилар», «Апилармил», крем-маска «Виталар», суппозитории «Простопин», «Апипрост», «Апикаленд», таблетки «Апилар», «Апилармил» и проведена их стандартизация. Установлена противовоспалительная, ранозаживляющая и противоожоговая активность мазей, противовоспалительная активность кремов, суппозито-

рий, анаболическая, актопротекторная и иммунотропная активность разработанных таблеток. Выбраны критерии, по которым оказалось возможным определить оптимальные условия и сроки хранения пчелиного расплода и разработанных лекарственных и лечебно-профилактических средств на их основе. ........, .......,.........: • ; .....................

На основе изучения физико-химических показателей и состава исследуемых объектов был выбран методологический подход для стандартизации сырья и лекарственных препаратов, включающий в себя выбор стабильных и нестабильных показателей, характеризующих как постоянство состава, так и сохранность изучаемых образцов в процессе получения и хранения.

Установлены сроки и условия хранения стабильных образцов трутневого расплода и маточных личинок и разработанных лекарственных и лечебно-профилактических средств на их основе.

Результаты экспериментальных исследований использованы в подготовке нормативной документации на разработанные лекарственные препараты и лечебно-профилактические средства.

Внедрение результатов исследования в практику. Разработаны и утверждены Временная Фармакопейная статья на суппозитории «Просто-пин» (ВФС 42-3453-99), пусковой регламент на производство суппозиториев «Простопин» (Инв. № 99/131 от 29.12.99).

Руководством фармацевтических предприятий рассмотрены актуальность и возможность внедрения разработанных лекарственных препаратов, позволяющих использовать дешевое отечественное сырье и расширить ассортимент выпускаемой продукции, повысить рентабельность производства и пчеловодческих хозяйств (акты апробации и внедрения).

Подготовлены для рассмотрения в Департаменте государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ России проекты ФСП для ЗАО «Алтайвитамины», ФГУП «Тюменский ХФЗ», Пятигорской фармацевтической фабрики на гомогенат трутневого расплода

«Апилар», гомогенат маточных личинок «Апилармил», суппозитории «Апипрост», «Апикаленд», таблетки «Апилар», «Апилармил», мази «Апи-лар-Г», «Апилар-проп». Подготовлены отчеты по изучению острой и по-дострой токсичности гомогената трутневого расплода («Апилара»), специфической активности таблеток «Апилар», «Апилармил», мазей «Апилар-Г», «Апилар-проп», суппозиториев «Апипрост», «Апикаленд».

Разработанные лечебно-профилактические косметические препара-

I

ты показали высокую фармакологическую активность.

Предложены и утверждены на региональном уровне НД на гомогенат, лиофилизат трутневых личинок и лечебно-косметические и лекарственные препараты: ТУ 9882-039-01962942-2001 на «Апилар» (гомогенат трутневого расплода), ТУ 9882-041-01962942-2001 на «Лиофилизирован-ный апилар», ТУ 9882-040-01962942-2001 на «Апилармил» (гомогенат маточных личинок), ТУ 9158-042-01962942-2001 на ««Крем-маску «Вита-лар»», ТУ 9158-043-01962942-2001 на «Крем косметический «Апилар», ТУ 9158-044-01962942-2001 на мазь «Апилар-Г».

Лечебно-профилактические средства апробированы и внедрены в производство НПО «Пульс» г.Ставрополя в соответствии с разработанной и утвержденной НД (акты апробации и внедрения).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на 1-й региональной научно-практической конференции научных санаторно-курортных учреждений Кавказских Минеральных Вод (г.Ессентуки, 1996г.), региональных научно-практических конференциях по фармакологии, фармации и подготовке кадров (г. Пятигорск, 1996-2002г.).

По материалам диссертации опубликовано учебное пособие «Перспективы использования расплода пчел в медицинской практике», рекомендованное ГОУ ВУНМ Центром МЗ Российской Федерации и 45 научных работ.

Получено три положительных решения о выдаче патентов: на способ

стабилизации маточного молочка и споообы получения двух мазей.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа ¡ выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятЕФА (номер государственной регистрации 01200204765) в рамках проблемы «Фармация» секции № 38 Ученого совета МЗ РФ. :

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 288 страницах машинописного текста, содержит 83 таблицы, 16 рисунков, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы, включающего 300 источников, в том числе 48 иностранных.

В первой главе диссертации обобщены сведения по общей характеристике, химическому составу, фармакологической активности, применению в медицине, стандартизации, хранению традиционных продуктов пчеловодства. Приведены данные по химическому составу, получению, применению и биологической активности расплода пчел.

Во второй главе представлены результаты сравнительного исследования физико-химических показателей и приведены качественные реакции подлинности пчелиного расплода разных лет сбора, пород и регионов страны. Полученные данные использованы для стандартизации образцов пчелиного расплода.

В третьей главе приводятся данные по содержанию основных биологически активных веществ в гомогенате и лиофилизате пчелиного расплода, представлены результаты определения количественного содержания «сырого» протеина, истинного, водорастворимого белка, аминокислот, сульфгидрильных групп. Изучен состав белковой фракции и ферментный состав расплода пчел.

Четвертая глава посвящена изучению биологически активных веществ небелковой природы в пчелином расплоде. Определены массовые доли эфирорастворимой фракции липидов, качественный и количествен-

ный состав липидной фракции, содержание липидного фосфора и фосфо-липидов. Приведены результаты количественного определения гормонов, нуклеиновых кислот, углеводов, витаминов, макро- и микроэлементов. Предложены методы стандартизации, определены сроки и условия хранения наиболее перспективных'видов расплода пчел.

Пятая глава посвящена сравнительному изучению фармакологической активности пчелиного расплода, маточного молочка и лекарственных препаратов на их основе. Изучены острая, хроническая токсичность, аллер-гизирующие свойства, иммунотропная, анаболическая, актопротекторная активность трутневого расплода, маточных личинок и таблеток на их основе. Представлены результаты изучения фармакологической активности разработанных мазей, кремов, суппозиториев, содержащих пчелиный расплод и другие традиционные продукты пчеловодства.

В шестой главе приводятся результаты исследований по выбору составов, стандартизации и изучению стабильности лекарственных и лечебно-профилактических средств, содержащих как пчелиный расплод (таблетки «Апилар», «Апилармил», кремы «Апилар», «Апилармил»), так и его композиции с другими пчелопродуктами (крем-маска «Виталар», мази «Апилар-Г», «Апилар-проп», суппозитории «Простопин», «Апикаленд», «Апипрост»).

Работа выполнена в Пятигорской государственной фармацевтической академии на кафедре токсикологической химии (зав.кафедрой доцент, канд.фарм.наук, Вергейчик Т.Х.). Отдельные фрагменты работы выполнены совместно с сотрудниками кафедр фармакологии, биохимии и микробиологии, физиологии, патологии и биологии, технологии лекарств ПятГФА.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам этих кафедр.

На защиту выносятся следующие положения:

-теоретическое обоснование возможности применения пчелиного

расплода для ^получения, лекарственных 1 и ./лечебно-профилактических средств; ПрОт- „-;• . .. , »,..-с срсдстч;-. Су1Н!о;!1Г0р::'

... - результатыл0лучения£забильнь1хвбр^0в^1шёли|10т.расш10да;......

- результаты. сравнительного изучения основных показателей качества и химического состава образцов.пчелиного ^расплода в зависимости от . некоторых факторов (породы пчел, географического ¿расположения и климатических условий) в сравнении с маточным молочком;

- результаты стандартизации, изучения условий и сроков хранения стабильных образцов пчелиного расплода;

-результаты исследования фармакологической активности образцов пчелиного расплода и маточного молочка;

-результаты исследования по разработке составов лекарственных препаратов на основе наиболее перспективных видов расплода пчел, проведение их фармакологической оценки;

-результаты стандартизации лекарственных препаратов, содержащих пчелиный расплод и другие пчелопродукты, изучения условий и сроков их хранения.

Основное содержание работы

Вероятность использования пчелиного расплода подтверждает уже имеющийся опыт применения в качестве лекарственного средства одного из его видов - трутневых личинок. Как показали литературные данные, трутневые личинки оказались эффективными при лечении психических и нервных заболеваниях, пищеварительных дисфункциях, физической и половой астении и др. Перспективность применения расплода пчел обусловлена наличием доступной сырьевой базой, низкой себестоимостью, простой схемой и низкой трудоемкостью получения.

В связи с тем, что пчелиный расплод является живым организмом в стадии ускоренного развития, то в нем, несомненно, присутствуют в сбалансированном виде ферменты, нуклеиновые кислоты, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, заменимые и незаменимые

аминокислоты.

Как и маточное молочко, пчелиный расплод, возможно, обладает специфическими фармакологическими свойствами и может быть использован для лечения и профилактики некоторых заболеваний.

Получение стабильных образцов пчелиного расплода и изучение их физико-химических показателей

Объектами исследований явились образцы маточного молочка и пчелиного расплода (трутневые личинки, предкуколки, куколки, маточные личинки, личинки рабочих пчел) карпатской, среднерусской, итальянской и кавказской серой горной пород, получаемые ежегодно в течение 6 лет (с 1996 по 2001 г) в Ставропольском, Краснодарском краях, Ростовской и Иркутской областях.

На основе методологического подхода к созданию лекарственных препаратов и лечебно-профилактических средств, содержащих пчелиный расплод, поставлена задача - изучение возможности стабилизации сырья. Необходимость стабилизации гомогената пчелиного расплода связана с содержанием в нем до 78% влаги, нейтральным значением рН среды, низким содержанием деценовых кислот, что создает благоприятные условия для гидролитического расщепления ряда биологически активных компонентов, роста и размножения микроорганизмов и грибков.

Нами были использованы несколько вариантов стабилизации пчелиного расплода: консервирование гомогената, получение лиофшшзата и адсорбированного гомогената.

В результате исследований по выбору оптимальных консервантов, обладающих антимикробным и антигрибковым действием, было установлено, что гомогенат пчелиного расплода, используемый для разработки наружных лекарственных препаратов, следует консервировать смесью ни-пагин-нипазол, а для пероральных лекарственных препаратов - смесью сорбиновой и лимонной кислот. По аналогии с маточным молочком, для стабилизации пчелиного расплода был получен его лиофилизат и адсорби-

рованный гомогенат. В:: последнем случаебьигподобрансостав адсорбента,::: позволяющий! при минимальномесоотнсшенитсгомогенат-адсорбент (1:3) получить порошок.Для.лштоадого^ололказтасоо,тношение составило 1:2. Все полученные образцы, кроме трутневых куколок, оказались стабильными при хранении, удобными длялроизводства лекарственных форм. Так, -консервированный гомогенат и лиофилизат'могут "бьгеь использованы для получения лекарственных форм как наружного так и внутреннего применения, адсорбированный гомогенат является полуфабрикатом для твердых дозированных лекарственных форм.

С целью выбора критериев для стандартизации изучаемых образцов пчелиного расплода определены: органолептические свойства, растворимость, значение рН среды, массовые доли влаги, общей золы. По органо-лептическим свойствам гомогенаты всех видов пчелиного расплода представляют собой густую массу, лиофилизат и адсорбент - порошки от кремового до желтого цвета с характерным запахом и вкусом, мало растворимы в воде, практически не растворимы в органических растворителях.

Числовые физико-химические показатели представлены в табл.1.

Таблица 1

Основные физико-химические показатели гомогената пчелиного

расплода

Пчелиный расплод рН Влага, % Общая зо-

ла,%

гомогенат:

трутневые личинки 6,6-7,1 75,4 - 76,8 2,1-3,4

трутневые предкуколки 6,9-7,2 75,4 - 76,3 2,2 - 3,3

трутневые куколки 6,8-7,4 75,1 -76,5 2,1 - 3,5

личинки рабочих пчел 5,8 - 6,5 78,1 -78,3 2,0- 3,5

маточные личинки 6,4-7,2 76,1 -77,5 1,5-3,3

маточное молочко 4,0-4,3 65,7-66,1 2,9-3,0

консервированный гомо-

генат трутневых 4,3-4,6 75,4-76,8 2,2-3,3

личинок

лиофилизат трутневых 6,5-7,1 1,0-3,0 -

личинок

адсорбированный гомо- 5,2-5,9 1,0-3,5 -

генат трутневых

личинок

Как следует из табл.1, для гомогената и лиофилизата пчелиного расплода значение рН среды находится в пределах 5,8-7,4, для маточного молочка и консервированного гомогената - 4,2-4,6, а для адсорбированного гомогената - 5,2-5,9. Содержание влаги в нативном расплоде составило 74,1-78,3%, в лиофилизате и адсорбированном гомогенате - 1,0-3,5%. Массовая доля общей золы во всех образцах пчелиного расплода составила 1,6-3,5%. Пчелиный расплод отличается от маточного молочка по содержанию влаги, значению рН среды и близок по содержанию общей золы.

Установлено, что указанные показатели незначительно отличаются в образцах в зависимости от породы пчел, географического расположения и климатических условий, что позволяет использовать их для стандартизации пчелиного расплода как источника получения лекарственных и лечебно-профилактических средств.

Исследование химического состава пчелиного расплода

Изучение химического состава пчелиного расплода с одной стороны, позволяет оценить качество объекта, с другой стороны, является предпосылкой для исследования фармакологической активности и создания лекарственных средств на его основе.

Одним из показателей качества пчелиного расплода, определяющим его питательную ценность и в определенной степени биологическую активность, является уровень содержания белка. Поскольку количество "сырого" протеина в определенной степени характеризует содержание "истинного" белка, нами найдено содержание данных белков в пчелином расплоде.

Определение содержания "истинного" белка проводили рассчетным способом по содержанию суммы аминокислот и по количеству белкового азота в пересчете на сухое вещество. Количество "сырого" протеина определяли методом Кьельдаля по общему азоту. Результаты исследования представлены в табл.2.

Т:;*:!« образом, пчелиный растит. Таблица2 Содержание "сырого" протеина и "истинного" белка в трутневых ли..............чинках........1.........:

- Пчелиный расгшод-... . г"сырой"-про-г теин,% и 1-1 II 1 11(1*^41 и ... —'^истинный" белок,%.....

по белковому азоту по сумме ' аминокислот

трутневые личинки трутневые предкуколки трутневые куколки личинки рабочих пчел маточные личинки маточное молочко " 443 - 48,5 ' 45,8-47,1 49,9 - 57,4. 44,7-45,0 45,0-47,2 - 39,3 ~ 38,4 -'42,3 40,4 - 42,2 45,4 - 55,9 39,6-42,1 34,5-35,1 33,2-37,6 30,8 - 30,8 31,1-37,6 33,0-35,0

Таким образом, пчелиный расплод является объектом, содержащим,

как и маточное молочко, значительные количества белка (до 57,0%), причем по содержанию «сырого» протеина и «истинного» белка они близки между собой.

Установлено, что трутневые личинки, предкуколки и куколки по данным показателям незначительно отличаются. Количество «истинного» белка меньше в среднем на 9,6% содержания «сырого» протеина, и эта разница прослеживается во всех исследуемых образцах. В связи с этим, можно констатировать, что «сырой» протеин в определенной степени отражает уровень содержания «истинного» белка. Учитывая это, а также сложность определения «истинного» белка, для определения качества пчелиного расплода как сырья целесообразнее использовать определение «сырого» протеина, а по содержанию «истинного» белка оценивать питательную и биологическую активность исследуемых объектов.

С помощью фотоколориметрического метода установлено, что в пчелином расплоде значительная часть белка является водорастворимой (примерно 60%), а методика его определения отличается простотой, экс-прессностью, воспроизводимостью; В связи с этим, данный показатель предложено использовать для стандартизации предполагаемых лекарственных препаратов на основе пчелиного расплода.

Для качественной характеристики белка нами изучены фракции белков методом электрофореза в полиакриламидном геле и определены их

16

молекулярные массы.

Установлено в белках пчелиного расплода и маточного молочка 8 основных фракций, представленных преимущественно альбуминами и глобулинами. Данная методика позволяет определять степень денатурации белка.

Для оценки активности белка нами было определено содержание сульфгидрильных групп. Определение проводили фотоколориметрическим методом, основанным на реакции взаимодействия реактива Эллмана (5,5 -дитиобис(2)-нитробензойной кислоты) со свободными SH-группами белков. Содержание SH-групп белка в пчелином расплоде составило 4,1-4,6МУ105г белка, что примерно в 3,5 раза выше, чем в маточном молочке.

Поскольку аминокислоты вносят значительный вклад в биологическую активность белоксодержащих веществ, нами установлен аминокислотный состав гомогената пчелиного расплода с помощью аминокислотного анализатора фирмы «Hitachi» (Япония). Содержание свободных и суммы свободных и связанных аминокислот приведено в табл. 3.

Полученные данные по аминокислотному составу свидетельствуют о том, что все образцы расплода пчел, как и маточное молочко, содержат один и тот же набор из 20-ти аминокислот, в том числе 10 незаменимых. Суммарное содержание незаменимых аминокислот в гомогенате пчелиного расплода и маточного молочка составило 39,7-54,8% от общего количества аминокислот, что свидетельствует о высокой питательной ценности и биологической активности пчелиного расплода. Определены сравнительно большие количества таких аминокислот, как пролин, лизин, глицин, участвующих в образовании коллагена. В связи с этим, при применении в косметических целях пчелиный расплод будет характеризоваться питательным, смягчающим действием, способствовать синтезу коллагена и протеинов в коже и, следовательно, разглаживать морщины.

"; Таблица 3

Аминокислотный состав пчелиного расплода в пересчете на сухую _- " массу, в% (п=5) —I---------

аминокислоты ...... Содержание, %

трутне- маточные личинки маточ-

вые ли- личинки рабочих ное

чинки пчел молочко

Аспарагиновая кислота 3,52-3,61 4,14-4,78 3,20-3,24 6,47-7,60

Треонин 1,56-1,69 1,58-1,72 1,50-1,53 1,49-2,61

Серин 1,66-1,83 1,86-2,23 1,54-1,58 2,02-4,00

Глутаминовая кислота 5,99-6,85 3,46-5,10 5,34-5,44 3,27-4,94

Пролин 3,30-3,56 1,83-2,39 3,31-3,35 1,85-2,36

Глицин 1,59-1,82 1,17-1,53 1,51-1,57 1,18-1,51

Алании 1,86-2,38 1,71-1,85 1,85-1,92 1,12-1,41

Цистин 0,18-0,26 0,44-0,49 0,21-0,24 0,64-1,15

Валин 1,89-2,61 2,31-2,38 2,05-2,08 1,81-2,33

Метионин 0,64-0,82 0,49-0,62 0,70-0,78 0,87-1,03

Изолейцин 1,59-1,86 1,65-1,76 1,64-1,69 1,41-2,36

Лейцин 3,34-3,98 2,55-3,37 2,94-2,99 2,42-3,20

Тирозин 1,79-2,38 1,54-1,67 1,56-1,60 1,55-1,82

Фенилаланин 1,45-1,76 1,52-1,63 1,32-1,35 1,62-1,82

Лизин 2,41-3,23 3,97-4,12 2,56-2,58 2,44-2,71

Гистидин 0,70-1,06 0,91-1,05 1,75-1,78 0,82-1,01

Аргинин -ТЧч. _________ 1,85-2,14. 2,22-2,61 1,93-1,95 1,19-2,33 П 1 п п щ

Таурин - 0,1У-и,2У

Фосфосерин - 0,21-0,38

Триптофан 0,35-0,47 035-0,45 0,37-0,39 0,37-0,49

Сумма ам.к,% 37,57-40,57 35,06-38,42 35,61-35,71 38,28-39,79

Сумма незам.ам.к.% 15,45-16,28 18,92-19,92 15,95-16,96 14,47-17,91

Сод. незам. ам.к. от 39,73-42,77 51,25-54,79 44,74-47,50 41,07-45,05

общей суммы ам.к.%

В пчелином расплоде в сравнении с маточным молочком изучен ферментный состав, определяющий как биологическую активность, так и сохранность изучаемых объектов в процессе хранения. Определена активность уреазы, липаз, дегидрогеназ, фосфотаз, амилазы, катепсинов, проте-аз. Установлено, что по ферментной активности пчелиный расплод превосходит маточное молочко и, кроме того, в отличие от молочка содержит фермент дегидрогеназу. Качественная реакция на этот фермент использована нами для установления подлинности образцов пчелиного расплода.

18

Липидная фракция вносит значительный вклад в фармакологическую активность исследуемого объекта. Нами определена массовая доля липидной фракции, выделенной из пчелиного расплода экстракцией эфиром, которая составила 5,5-8,2%. Содержание липидного фосфора с последующим определением фосфолипидов получено фотоколориметрическим методом по реакции органического фосфора с молибдатом аммония. Содержание фосфолипидов в гомогенате и лиофилизате пчелиного расплода составило 1,2-1,7%.

Поскольку липидная фракция представлена большим многообразием органических соединений, мы сочли необходимым провести исследование качественного и количественного состава данной фракции изучаемого объекта с помощью хромато-масс-спектрометрии. Были идентифицировны и количественно определены свободные жирные кислоты (рис. 1).

Содержание жирных кислот в пчелином расплоде

1-лигноцириновая, 2-декановая, 3-тетрадеценовая, 4-бегеновая, 5-арахиновая, 6-додекановая, 7-стеариновая, 8-дикарбон. к-та неидентиф, 9-пальмитоолеиновая, 10-миристиновая, 11-пальмитиновая, 12-олеиновая кислоты

Рис.1

Наибольшее количество жирных кислот находится в маточных личинках; в трутневых личинках и личинках рабочих пчел их содержание

19

приблизительно одинаковое.; Всего определено 12 жирных кислот, в том числе ненасыщенные (тетрадеценовая, олеиновая, пальмитолеиновая), количество которых составило 52% в маточных личинках и примерно по 46% в трутневых личинках и личинках рабочих пчел.

В образце маточных личинок, в отличие от других объектов, содержатся значительные количества пальмитолеиновой, пальмитиновой и олеиновой кислот. -

В составе фракции пчелиного расплода, полученной экстракцией смесью хлороформ-метанол (1:1), определены органические соединения различных классов: алкены, спирты, альдегиды, кетоны, ароматические соединения, насыщенные, ненасыщенные жирные кислоты (дикарбоновые, moho-, ди- и триоксикислоты), сложные эфиры жирные кислоты (глицери-ды, фосфоглицериды), стерины, аминокислоты, углеводы (моносахариды и дисахариды) и др. Многие вещества, обнаруженные в расплоде пчел (аминокислоты, ненасыщенные жирные кислоты, стерины и т.д.), являются предшественниками гормонов, простогландинов, витаминов.

С помощью радиоиммунного метода был изучен гормональный состав пчелиного расплода и маточного молочка. Были определены стероидные гормоны (зстрадиол, прогестерон, тестостерон), гормоны надпочечников (кортизол), гормоны-йодтиронины (трийодтиронин, тироксин). Установлено, что содержание тестостерона и кортизола во всех видах расплода и в маточном молочке примерно одинаковое. Содержание тироксина и прогестерона в трутневых личинках и личинках рабочих пчел выше, а трийод-тиронина наоборот меньше, чем в маточных личинках и молочке. Во всех исследуемых объектах, в том числе маточном молочке, из стероидных гормонов больше всего содержится эстрадиола.

Важными компонентами пчелиного расплода, как живых организмов, являются нуклеиновые кислоты. Сумму нуклеиновых кислот определили спектрофотометрическим методом. Определено содержание рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот, количество которых со-

ставило в пчелином расплоде 1,1-1,3%, а в маточном молочке - 0,3-0,5%, что в среднем в 3 раза меньше, чем в расплоде.

Содержание ДНК в образцах расплода пчел в среднем в 3 раза превышает количество РНК, в то время как в маточном молочке наблюдается обратная зависимость.

Далее нами был установлен качественный и количественный углеводный состав органической фракции с помощью метода хромато-масс-спектрометрии. Полученные данные приведены в табл.4.

Таблица 4

Результаты исследования углеводного состава органической фракции _ пчелиного расплода_

Углеводы Содержание в пчелином расплоде, нг/кг

маточные личинки трутневые личинки личинки рабочих пчел

Ацетиламиноманоза Глюкоза Галактоза Галактофураноза 6-дезоксигалакто-фураноза Маннопираноза Мальтоза Сорбоза Талоза Фруктоза Дисахарид(неидент.) Сахарид (неидент.) 31,5710,05 380,40+2,71 613,61+5,13 80,20±1,11 0 0 6,33±0,05 68,77±1,27 0 1439,4919,11 71,6312,21 286,1815,22 0 1081,10117,2 0 1979,8919,65 0 1821,55+5,88 0 1315,1015,11 5284,2015,45 9119,06+7,12 79,39+2,01 88,0912,43 29,37+0,07 2724,4414,11 0 3768,5412,85 20,2011,00 142,7411,23 0 883,39+4,28 12855,74110,21 13980,781 118.1711.25 220.3317.26

Углеводный состав представлен моно- и дисахарами, причем основными углеводами пчелиного расплода являются фруктоза, глюкоза, галак-тофураноза.

Для количественной оценки основного углевода - фруктозы, вносящей определенный вклад в биологическую активность и обусловливающей питательную ценность пчелиного расплода, нами был использован спектрофотометрический метод, основанный на реакции продукта окисления фруктозы - оксиметилфурфурола с резорцином.

21

Установлено, что больше всего фруктозы содержится в личинках рабочих пчел (14,9-15,8), а меньше всего - в маточных личинках (7,3-7,8), что согласуется с данными, полученными методом хромато-масс-спектрометрии. •

В связи с тем, что фруктоза представлена в значительных количествах, а методика её определения достаточно хорошо воспроизводима, нами для установления сроков годности расплода предложено определять количество данного углевода.

В пчелином расплоде и маточном молочке идентифицированы и полуколичественно определены с помощью метода ТСХ водо- и жирорастворимые витамины, используя растворы стандартных образцов соответствующих витаминов. Найдены витамины А, Д, Е, тиамин, никотиновая, пантотеновая, фолиевая кислоты, повышающие ценность пчелиного расплода. Кроме того, обнаружено специфическое птеридиновое производное - биоптерин - предшественник фолиевой кислоты. Способность последнего флуоресцировать в УФ-свете была использована нами для определения подлинности изучаемых объектов.

Следует отметить, что в пчелином расплоде, в отличие от маточного молочка, содержится витамин Е, являющийся антиоксидантом и характеризующийся рядом фармакологических свойств.

Как и в маточном молочке, в изучаемых объектах содержатся витамины А, Д, являющиеся прооксидантами. Присутствующие и антиокси-данты и прооксиданты при применении пчелиного расплода могут оказывать нивелирующее воздействие на перекисное окисление липидов в организме.

Минеральный состав пчелиного расплода был определен методом атомно-абсорбционной спектрометрии. Содержание основных микроэлементов представлено в табл.5.

Таблица 5

Минеральный состав (мг/кг) гомогената расплода пчел

Элемент Содержание, мг/кг, Х+Лх

трутневые личинки личинки рабочих пчел маточные личинки маточное молочко (литерат. данные)

натрий 430-410 400-410 380-400 380-430

калий 9300-9350 9290-9420 9340-9400 9710-10700

кальций 175-181 177-195 160-179 194-219

магний 940-1000 950-990 960-1050 1250-1320

железо 4,03-4,22 5,21-5,33 12,31-12,55 28,4-37,5

марганец 0,24-0,26 0,24-0,27 0,52-0,56 1,82-2,38

медь 4,19-4,55 4,25-4,39 4,51-4,63 14,8-19,7

никель 0,020-0,022 0,031-0,033 0,060-0,065

кобальт 0,09-0,11 0,10-0,13 2,10-2,23 0,17-0,28

цинк 2,08-2,25 15,0715,42 32,02-32,88 61,3-73,2

фосфор 11,2-12,4 11,3-12,8 11,4-12,5 4,1-7,8

кадмий 0,03-0,04 0,06-0,07 0,51-0,55

свинец 0,00920,0102 0,00650,0068 0,00520,0055

ртуть Не обнаружены

мышьяк

Как следует из табл.5, в гомогенате расплода пчел установлено высокое содержание биологически ценных микроэлементов: магния, железа, марганца, меди, никеля, кобальта, цинка. Токсичные элементы (свинец, кадмий) не превышают установленных норм и их концентрации находятся на уровне фоновых, а ртуть и мышьяк не обнаружены. Наибольшее количество микроэлементов представлено железом, медью, цинком, что позволяет предположить эффективность применения пчелиного расплода при нарушениях процессов кроветворения, которые связаны с недостаточностью поступления в организм данных элементов. Биологическая ценность мно-

гих микроэлементов связана с кофакторной их ролью (способностью вступать во взаимодействие с ферментами и витаминами).

В результате проведенного исследования можно было установлено, что физико-химические показатели и количественный состав биологически активных компонентов пчелиного расплода практически не зависят от влияния изучаемых факторов - породы пчел, географического расположения и климатических условий, в отличие от маточного молочка.

Таким образом, в результате проведенного исследования можно сделать вывод, что пчелиный расплод близок к маточному молочку по содержанию белка, аминокислот, углеводов, микроэлементов и некоторых других соединений (табл.6).

Таблица 6

Биологически активные вещества пчелиного расплода и маточного молочка (в пересчете на сухое вещество)

БАВ Пчелиный расплод Маточное молочко

1 2 3

Белок -сырой протеин, % 43,2-44,5 38,0-44,0

-истинный белок, % -водорастворимый белок,% 22,0-29,0

Аминокислоты, % Незаменимые аминокислоты, от общей суммы % 37.6-40,6 39.7-42,8 38,3-39,8 41,7-45,0

Сульфгидрильные группы белка, М/105г белка 4,4-4,7 1,7-1,8

Протеазы, мг ам.азота/г 9,5-9,7 7,6-8,0

Гормоны -эстрадиол, нмоль/л -тестостерон, нмоль/л -кортизол, нмоль/л -пролактин, МЕ/л -трийодтиронин, нмоль/л -тироксин, нмоль/л -прогестерон, нмоль/л 883,8-2257,7 24,5-26,7 278,7-386,5 5,6-251,7 3,3-12,0 42,0-78,4 4,5-144,9 1616,0 24,5 326,6 4,4 11,7 48,3 4,1

1 2 3

Сумма нуклеиновых

кислот, % 1,1-1,3 0,41-0,56

ДНК,% 0,2-0,3 0,41-0,48

РНК,% 0,7-0,9 0,02-0,03

Фруктоза, % 11,4-12,5 -

Жирные кислоты, % 5,0-6,3 5,2-8,9

Ненасыщенные жирные

кислоты, от общего

количества% 40,2-42,3 41,5-44,4

Фосфолипиды, % 1,16-1,50 0,8-3,0

Как следует из табл. 6, в пчелином расплоде содержится больше ферментов, нуклеиновых кислот, фосфолипидов, сульфгидрильных групп белка, чем в маточном молочке.

Стандартизация и изучение стабильности пчелиного расплода

При изучении основных физико-химических констант, химического состава, а также исходя из экономических показателей, наличия сырьевой базы сделан вывод о нецелесообразности использования личинок рабочих пчел в качестве сырья для получения лекарственных и лечебно-профилактических средств. Трутневые куколки не стабильны в процессе хранения (гомогенат быстро чернеет даже при минусовых температурах).

Наиболее перспективными для применения в медицине, косметической и пищевой промышленности оказались трутневые личинки, предку-колки и маточные личинки.

Перспективным является также использование трутневого расплода (смеси трутневых личинок и предкуколок), так как это упрощает получение их на пасеке, повышает выход сырья, и кроме того эти стазы, согласно полученным нами данным, практически не отличаются по своим физико-химическим показателям и химическому составу.

На основе изучения физико-химических показателей и химического состава исследуемых объектов, нами был выбран методический подход для стандартизации сырья на основе стабильных показателей, характеризую-

25

щих постоянство состава и нестабильных, характеризующих сохранность изучаемых образцов в процессе получения и хранения. Оценку качества пчелиного расплода проводили с учетом требований действующего отраслевого стандарта.

Для установления норм качества данные показатели определяли на серии образцов пчелиного расплода, собранных из 4-х регионов страны в течение 3-х лет. Показатели и нормы качества пчелиного расплода приведены в табл. 7.

Таблица 7

Показатели качества гомогената, лиофилизата и адсорбированного гомогената расплода пчел

Показатель Нормы качества

гомогенат лиофилизат адсорбированный гомогенат

трут-невый расплод маточ ные личинки трут-невый расплод маточ ные личинки трут-невый расплод маточ ные личинки

1 2 3 4 5 6 7

описание густая смета- аморжный по- рассыпчатый

нообразная жидкость, желтого цвета характерного запаха рошок от бежевого до желтого цвета с характерным запахом гранулят от кремового до светло-бурого цвета характерного запаха

растворимость мало растворим в воде и спирте, практически не растворим в эфире

подлинность -белки -сахара -биоптерин -дегидрогеназа -реакция с биуретовым реактивом -реакция с реактивом Фелинга -флуоресценуия -реакция образования формазана

рН среды 5,5-7,5 4,5-6,5 3,5-5,5

влага, не более% 78,5 3,5 3,5

общая зола, не более % 3,0 - -

белок (метод Кьельдаля), не * менее % 38,5 51,5 38,5 51,5 - -

1 2 3 4 5 6 7

водорастворимый белок, не * менее % 1,3

фруктоза, не ме-* нее% 11,0 7,0 10,5 7,0

липиды, не ме-* нее % 5,5 5,5 6,0 6,0 -

- Нормы качества даны в пересчете на сухое вещество

Таким образом, для стандартизации оценку подлинности гомогената, лиофилизата и адсорбированного гомогената пчелиного расплода предложено определять по некоторым компонентам, содержащимся в пересчете на сухое вещество сравнительно в больших количествах (белки, сахара) и по веществам, характерным для данных объектов (биоптерин, дегидрогена-за). Для оценки качества нами предложено определять значение рН среды, массовые доли влаги, общей золы. Для количественного определения нами предлагается использовать наиболее объективно оценивающие качество показатели - содержание «сырого» протеина или водорастворимого белка, фруктозы, эфирорастворимых липидов.

Ряд показателей, используемых для стандартизации гомогената и лиофилизата (массовая доля общей золы, общего белка, фруктозы и эфирорастворимых липидов), оказались не приемлемыми для стандартизации адсорбированного гомогената, поскольку наличие в нем большого количества вспомогательных веществ (пектина и лактозы) оказывает мешающее влияние на анализ.

Разработанные нами методики стандартизации были использованы для изучения условия хранения и сроков годности пчелиного расплода. Было установлено, что при хранении в режиме естественных условий пчелиного расплода происходит изменение некоторых показателей его качества (снижение рН среды, уменьшение содержания фруктозы, выходящие за пределы норм качества у гомогената - после 1 года, а у лиофилизата и адсорбированного гомогената- после 2 лет хранения).

27

Таким образом, иа основании данных об изменении физико-химических показателей и химического состава установлено, что срок годности гомогената при температуре от 0 до -10°С составляет 1 год со дня получения на пасеке, лиофилизата и адсорбированного гомогената - 2 года при хранении при температуре не более +10°С.

Разработка составов, стандартизация лекарственных препаратов на основе пчелиного расплода и оценка их фармакологической

активности

В результате систематических исследований нами изучен химический состав пчелиного расплода. Каждый из компонентов пчелиного расплода (белки, аминокислоты, липиды, фосфолипиды, жирные кислоты, гормоны, витамины, углеводы, минеральные соединения и т.д.) будет вносить определенный вклад в фармакологическую активность расплода, а выраженность действия будет зависеть от их количественного соотношения. Кроме того, биологически активные компоненты пчелиного расплода могут взаимопотенцировать действие друг друга.

Полученные данные по химическому составу пчелиного расплода дают нам

возможность спрогнозировать его фармакологическое действие (табл. 8).—

Таблица 8

Прогнозирование фармакологической активности пчелиного расплода

Наличие БАВ Фармакологическое действие

белки, аминокислоты, гормоны, нуклеиновые кислоты, минеральные компоненты, ферменты, витамины ранозаживляющее действие

кортизол, фосфолипиды, витамин Е, микроэлементы противовоспалительное действие

стероидные гормоны (андроген-ные), аминокислоты, ферменты, микроэлементы, витамины группы В, витамины А,Д анаболическое действие

глицин, глютаминовая, аспараги-новая кислоты актопротекторное действие

комплекс БАВ иммунотропное действие

Таким образом, пчелиный расплод при внутреннем применении может оказать анаболическое, актопротекторное, иммунотропное действие, а при наружном применении - противовоспалительное и. ранозаживляющее.. ,

В связи с вышеизложенным, нами были проведены исследования по разработке составов лекарственных форм для внутреннего и наружного применения. Предварительно были исследованы острая и хроническая токсичность, а также аллергизирующие свойства. Установлено, что изучаемые объекты относятся к практически нетоксичным веществам и не обладают аллергизирующими свойствами в концентрациях, рекомендуемых нами в лекарственных формах.

Поскольку в пчелином расплоде содержатся вещества, подверженные разрушению под действием ферментов и соляной кислоты желудочного сока, наиболее оптимальными лекарственными средствами на основе пчелиного расплода для внутреннего применения могут быть: кишечнора-створимые и сублингвальные таблетки, капсулы, драже. Для получения дозированных твердых лекарственных форм предложены лиофилизат и адсорбированный гомогенат, причем последняя субстанция является готовым полуфабрикатом для получения этих средств. Для наружного применения наиболее перспективно получение мазей и кремов на основе, как пчелиного расплода, так и композиций пчелиного расплода с другими пче-лопродуктами в связи с их взаимопотенцирующим действием. Кроме того, введение прополиса и маточного молочка в лекарственный препарат будет обеспечивать консервирующее действие.

Поскольку в нашей стране нет ректальных форм на основе комплекса биологически активных пчелопродуктов для лечения заболеваний прямой кишки воспалительного характера и простатита, нами проведены исследования по разработке отечественных препаратов - суппозиториев на основе, как пчелиного расплода, так и традиционных пчелопродуктов (меда, маточного молочка, перги, пыльцы, прополиса, воска) и экстрактов из растений. Вначале нами был разработан состав ректальной лекарственной

формы - суппозиториев «Простопии» (табл.9) на импортной основе, в который входят традиционные продукты пчеловодства, по аналогии с импортным препаратом «Мипропол Р». Затем с целью расширения возможностей производства предложены аналогичные суппозитории и на отечественных, дешевых и доступных основах - «Апипрост», «Апикаленд», содержащие субстанции пчелиного расплода, апилак, мед, прополис, пергу и настойку календулы.

Таким образом, в результате теоретических и экспериментальных исследований обоснованы составы ряда лекарственных препаратов и ле-

чебно-профилактических средств, приведенные в табл.9.

Таблица 9

Составы разработанных лекарственных средств

Наименование лекарственного препарата Активный компонент

Таблетки «Апилар» адсорбированный гомогенат трутневого расплода

Таблетки «Апилармил» адсорбированный гомогенат маточных личинок

Суппозитории «Простопин» мед, маточное молочко, пыльца, перга, прополис, воск пчелиный

Суппозитории «Апипрост» мед, гомогенат или лиофилизат трутневого расплода, перга, прополис, вос5к пчелиный, настойка календулы

Суппозитории «Апикаленд» мед, маточное молочко, перга, прополис, вос5к пчелиный, настойка календулы

Мазь «Апилар» гомогенат или лиофилизат трутневого расплода

Мазь «Апилар-проп» гомогенат или лиофилизат трутневого расплода, прополис

Крем «Апилар» гомогенат или лиофилизат трутневого расплода

Крем «Апилармил» гомогенат или лиофилизат маточных личинок

Крем-маска «Виталар» гомогенат или лиофилизат трутневого расплода, маточное молочко

Для подтверждения спрогнозированной фармакологической активности пчелиного расплода и лекарственных препаратов на его основе были

проведены экспериментальные исследования (табл. 10)..----- -------------

Таблица 10

Фармакологическая активность пчелиного расплода и лекарственных

форм на его основе

Изучаемый объект Метод Действие Прототип

1 2 3 4

пчелиный расплод определение ГЗТ иммунотропное апилак

пчелиный расплод определение АОК иммунотропное апилак

пчелиный расплод, таблетки контроль массы тела животных анаболическое апилак

пчелиный расплод, таблетки открытое поле актопротек-торное апилак

пчелиный расплод, таблетки экстраполяци-онное избавление актопротек-торное апилак

мази, кремы онкометрия противовоспалительное 5% мазь бутадиона

мази термический ожог ранозажив-ляющее 10% мазь метилурац ила

мази химический ожог ранозажив-ляющее 10% мазь метилурац ила

мази открытые раны ранозажив-ляющее 10% мазь метилурац ила

суппозитории вшивание шариков в подкожную клетчатку противовоспалительное суппозитории «Просто-пин»

Экспериментально установлено, что пчелиный расплод и таблетки на его основе обладают анаболическим действием, причем трутневый рас-

31

плод и таблетки «Апилар» действуют на уровне апилака.

Проведенные исследования показали также, что расплод пчел и таблетки «Апилар», «Апилармил» обладают актопротекторным действием, и могут быть предложены в качестве общетонизирующих и анаболических средств в педиатрической и гериатрической практике.

Установлено, что пчелиный расплод обладает иммунотропным действием: на клеточный иммунитет оказывает снижающее действие, на гуморальное звено иммунитета - иммуностимулирующее.

Противовоспалительная активность полученных мазей и кремов была изучена методом онкометрии. Установлено, что по способности подавлять воспаление мази и крема превышают 5% мазь бутадиона. Следует отметить, что предлагаемые мази, в отличие от бутадиона, не оказывают токсического действия на организм.

Репаративную активность мазей изучали на модели открытых резанных ран, а также химического и термического ожога.

Экспериментально установлено, что мази с трутневым расплодом стимулируют репаративную регенерацию кожи при термических, химических ижо!ал, о 1 крытых ранах-и-по активности-превосходят дейетвие-пре--парата сравнения - 10% мази метилурацила примерно в 2 раза.

Изучение противовоспалительного действия суппозиторий проводили методом вшивания шариков в подкожную клетчатку. Установлено, что суппозитории обладают довольно выраженной противовоспалительной активностью.

Таким образом, пчелиный расплод и лекарственные формы на его основе обладают высокой фармакологической активностью, превышающей активность препаратов сравнения (апилака, 5% мази бутадиона, 10% мази метилурацила).

Проведенные исследования позволяют нам рекомендовать предложенные таблетки в качестве анаболических, актопротекторных и иммуно-тропных средств, мази - как противовоспалительные, ранозаживляющие и

противоожоговые средства, а крема - как питательные, тонизирующие и противовоспалительные средства. Суппозитории могут быть использованы

для лечения воспалительных заболеваний прямой кишки и предстательной__________

железы. ■ ■ •

Разработанные лекарственные средства после подтверждения их высокой активности были стандартизированы по следующим показателям.-'

таблетки: описание, значение рН среды (3,8-4,4), подлинность (качественные реакции на сахара, белки, биоптерин), массовая доля водорастворимого белка (не менее 6,5мг в 1 таблетке), микробиологическая чистота;

мази и крема: описание, подлинность (качественные реакции на сахара, белки, биоптерин), значение рН среды (4,5-6,0), термостабильность, коллоидная стабильность, содержание водорастворимого белка (не менее 0,5% - для мазей и не менее 0,2% для кремов), микробиологическая чистота; - суппозитории: описание, подлинность (качественные реакции на сахара, белки, биоптерин, фенольные соединения, флавонои-ды), содержание, флавоноидов (не менее 26,0мг в 1 суппозитории), содержание фенольных соединений (не менее 35мг в 1 суппозитории), содержание органических кислот (не менее 0,2мг в одном суппозитории для «Апипроста» и 0,5мг - для «Простопина» и «Апикаленда»).

Были изучены условия и сроки хранения разработанных лекарственных и лечебно-профилактических средств. Установлено, что срок годности таблеток, мазей, кремов и суппозиториев составляет 2 года при температуре не выше 10°С.

Таким образом, с целью расширения номенклатуры лекарственных средств на основе продуктов пчеловодства теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность применения в медицине нового

нетрадиционного пчелопродукта - пчелиного расплода. Изучен химический состав, физико-химические показатели пчелиного расплода, разработаны лекарственные и лечебно-профилактические средства на его основе для -наружного и внутреннего применения, целенаправленно проведена оценка их фармакологической активности. На основании проведенных исследований предложены способы стандартизации пчелиного расплода, изучены сроки и условия их хранения.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. В результате системного исследования обоснована целесообразность использования пчелиного расплода (трутневого расплода и маточных личинок), как нового источника комплекса биологически активных веществ.

2. Предложены способы получения гомогената, консервированного гомогената пчелиного расплода и маточного молочка, определены их основные физико-химические показатели: описание, растворимость, значение рН среды, массовые доли влаги и общей золы.

3. Изучен с помощью современных методов анализа химический со-

■ став пчелиного расплода. Установлено-еодержание-оеновных-био-логически активных компонентов: «сырого» протеина, «истинного» белка, аминокислот, липидов, фосфолипидов, гормонов, углеводов, витаминов, микро- и макроэлементов и других соединений.

4. Установлено, что различные виды расплода по физико-химическим показателям и химическому составу близки между собой, по ряду показателей (содержанию белков, аминокислот, стероидных гормонов, фософлипидов, углеводов) - с маточным молочком, а по содержанию нуклеиновых кислот, ферментов, сульфгидрильных групп превосходят молочко.

5. Доказано, что трехдневные маточные личинки, как отходное сырье при получении маточного молочка, имеют такой же качественный и количественный химический состав, что и остальные виды рас-

плода в возрасте от 6 до 14 дней.

6. Установлено, что физико-химические показатели и количественный состав биологически активных компонентов, в отличие от маточного молочка, не зависят от породы пчел, географического расположения и климатических условий.

7. Доказана целесообразность использования трутневого расплода (смеси трутневых личинок и предкуколок) и маточных личинок как источников получения лекарственных препаратов. Установлены критерии и нормы качества наиболее перспективных субстанций пчелиного расплода, изучены условия и сроки их хранения.

8. Показана возможность создания новых лекарственных и лечебно-профилактических средств на основе пчелиного расплода. Обоснованы и разработаны составы таблеток «Апилар», «Апилармил», мазей «Апилар-Г», «Апилар-проп», кремов «Апилар», «Апилармил», крем-маски «Виталар» и суппозиториев «Простопин», «Апипрост», «Апикаленд», содержащих в качестве активного компонента как субстанции пчелиного расплода, так и их комбинации с другими пчелопродуктами.

. 9. Установлено, что пчелиный расплод относится к практически нетоксичным веществам и не проявляет аллергизирующих свойств. Подтверждено наличие у изучаемого объекта анаболического, ак-топротекторного и иммунотропного действия.

10. Экспериментально установлено, что разработанные лекарственные препараты обладают выраженным фармакологическим действием: таблетки - анаболическим, актопротекторным; мази - противовос-палтельным, ранозаживляющим, противоожоговым; крема и суппозитории - противовоспалительным действием.

11. Проведена стандартизация разработанных лекарственных и лечебно-профилактических средств. Установлены их сроки и условия хранения для гомогената пчелиного расплода (1 год при темпера-

туре -10 - 0°С), лиофилизата, адсорбированного гомогената пчелиного расплода и лекарственных препаратов на их основе (2 года при температуре не более +10°С).

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Перспективы использования расплода пчел в медицинской практике: Учебное пособие, рекомендованное ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ-Пятигорск: ПятГФА, 2002,- 132 с.

2. Способ стабилизации маточного молочка// Положительное решение о выдаче патента №014971 от 24.01.01 (соавт.: Сотникова Е.М.).

3. Способ получения мази «Апилар-Г», обладающей противовоспалительным действием // Положительное решение о выдаче патента, № 2001115308/14 (016026) от 04.06.01. (соавт.: Сотникова Е.М., Федорова Е.П., Вергейчик Т.Х.

4. Мазь «Апилар-Л», обладающая противовоспалительным действием // Положительное решение о выдаче патента, №201115306/14(016024) от 04.06.01. (соавт.: Сотникова Е.М., Федорова Е.П., Линникова В.А.).

Критерии качества IруI несого-молочка7/Актуальные-вопросы-ис~ пользования природных преформированных факторов и фитотерапии в клиническом лечении заболеваний органов пищеварения и обмена веществ: Материалы регион, конф. науч. и санатор,- курорт, учреждений Кавк. Мин. Вод, посвящ. 74-летию основания здравницы (1; 1996; Ессентуки).- Ессентуки, 1996.- С.100. (соавт.: Боднар И.П., Суворов А.Н., Максименко Т.Н.).

6. Количественная оценка содержания белка в трутневых личинках// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (52; 1997; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 1997.-С.85-86. (соавт.: Боднар И.П., Беликов В.Г., Суворов А.Н.).

7. Стандартизация гомогената пчелиных личинок. //Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (52; 1997; Пяти-

горек): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 1997. - G.86. (соавт.: Ка-тусина О.П., Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б.)

8. Исследование минерального состава гомогената трутневых личинок// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (53; 1998; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА1998.-С.81. (соавт.: Вергейчик Т.Х., Шабалин C.B., Линникова В.А., Гуськова Г.Б.)

9. Исследование минерального состава гомогената маточных личинок/Ют Materia Medica к современным медицинским технология м: Материалы Всерос. науч. конф. 13-15 мая 1998г.- С.-Петербург,

1998.-С.92. (соавт.: Вергейчик Т.Х., Шабалин C.B., Хочава М.Р., Линникова В.А., Гуськова Г.Б.).

10. Исследование аминокислотного состава пчелиных личинок.// Фармация в XXI веке: инновации и традиции: Тез. докл. Международ, конф. 7-8 апр. 1999г.- С.-Петербург, 1999.- С.172. (соавт.: Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б.).

11. Химико- технологическое исследование гомогената трутневых ли-чинок//Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Международ, съезда (3; 1999; Санкт-Петербург- Пушкин).- Спб., 1999.- С.277. (соавт.: Кононихина Н.Ф., Ремезова И.П.)

12. Пчелиный расплод как новый источник получения лечебно-профилактических средств.//Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Международ, съезда (3; 1999; Санкт-Петербург- Пушкин).- Спб.,

1999.- С.278-281. (соавт.: Красовская C.B.).

13. Химико- технологическое исследование гомогената пчелиных ли-чинок.//Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (54; 1999; Пятигорск): Материалы...- Пятигорск: ПятГФА, 1999.- С.55. (соавт.: Кузнецова Л.С., Максименко Т.И.,

Катусина О.П.).

14. Исследование аминокислотного состава трутневых личи-нок.//Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (54; 1999; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 1999. - С.82-83. (соавт.: Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б., Суворов А.Н.).

15. Изменения факторов неспецифической резистентности организма при экспериментальном гепатозе и их коррекция продуктами из личинок пчел.//Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (54; 1999; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 1999. - С. 127-128. (соавт.: Клишина И.И., Василенко Ю.К., Фролова Л.М.,. Парфентьева Е.П., Скульте И.В.).

16. Исследование физико- химических свойств и химического состава маточных личинок пчел// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55; 1996; Пятигорск): Материалы...- Пятигорск: ПятГФА, 2000.- С.110-111. (соавт.: Красовская C.B., Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б., Клишина И.И., Гонча-

-рова-ЛтВг).----

17. Сравнительная оценка гиполипидемической активности гомогена-та и лиофилизата трутневых личинок// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55; 2000; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 2000.- С.194-195. (соавт.: Климова О.В, Василенко Ю.К.).

18. Сравнительная оценка гепатопротекторной активности гомогената трутневых личинок при поражении печени тетрахлорметанолом и изониазидом// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55; 2000; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 2000,- С. 196-197. (соавт.: Клишина И.И., Василенко Ю.К., Саджая Л.А.).

19. Изучение химического состава трутневого расплода пчел с целью

получения лекарственных препаратов //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Междунар. съезда (4; 2000; Великий Новгород).-СПб., 2000,- С.81-83. (соавт.: Вергейчик Т.Х., Федорова Е.П., Сот-никоваЕ.М., Линникова В.А.).

20. Изучение химического состава и фармакологической активности трутневого расплода//Человек и лекарство: Тез. докл. Рос. нац. конгресса (7; 2000; Москва)-М.: ГЭОТАР Медицина, 2000.- С.605. (соавт.: Василенко Ю.К., Клишина И.И., Климова О.В.).

21. Хромато-масс-спектрометрическое исследование состава жирных кислот и свободной органической фракции трутневого расплода// Человек и лекарство: Тез. докл. Рос. нац. конгресса (7; 2000; Моск-ва)-М.: ГЭОТАР «Медицина», 2000,- С.614 (соавт.: Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б.).

22. Исследование состава жирных кислот и свободной органической фракции маточного расплода пчел// Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацев-

• тической деятельности: Материалы междунар. науч. конф. - Томск, 2000. - С.43-44. (соавт.: Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б., Красовская С.В)

23. Получение и стандартизация лечебных косметических кремов на основе трутневого расплода пчел //Человек и лекарство: Тез.докл. Рос. нац. конгресса (8; 2001; Москва)-М.: ООФ «Здоровье человека», 2001,- С.584. (соавт.: Сотникова Е.М., Федорова Е.П., Вергейчик Т.Х., Линникова В.А.).

24. Влияние пчелиного расплода на иммунометаболические процессы при химической интоксикации. // Человек и лекарство: Тез.докл. Рос. нац. конгресса (8; 2001; Москва)-М.: ООФ «Здоровье человека», 2001,- С.686. (соавт.: Василенко Ю.К., Клишина И.И., Климова О.В.)

25. Количественное определение углеводов в гомогенате расплода пчел// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (56; 2001; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 2001,- С.108-109. (соавт.: Сотникова Е.М., Красовская C.B., Криков М.В., Вергейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б.).

26. Сравнительное изучение актопротекторной активности расплода пчел// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (56; 2001; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: С.218-219. ПятГФА, 2001,- С.218-219.

(соавт.: Сотникова Е.М., Криков М.В., Кулешова С.А.).

27. Исследование липидного состава маточного расплода методом тонкослойной хроматографии// Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: Материалы 2 Российской конференции молодых ученых (2;2001;Москва). - М., 2001. - С.248. (соавт.: Красовская C.B.)

28. Разработка и стандартизация мази на основе трутневых личинок // В III тысячелетие с богатством «Золотого Улья»: Материалы Меж-дунар—Вееров—науч^практич—конф—по-пчеловодству-и-апитера--

пии. (3 и 9; 2001; Саратов).- Саратов, 2001,- С.123-124.

29. Трутневый расплод как гиполипидемическое средство// Достижения, проблемы, перспективы фармац. науки и практики. Материалы науч.-практ. конф. - Курск, 2001. - С.246-247. (соавт.: Климова О.В., Василенко Ю.К.)

30. Сравнительное изучение основных показателей качества пчелиного расплода// Пятигорск: ПятГФА, 2002. - 21с. Деп. в ВИНИТИ 24.01.2002, №136-В2002. Библ.указатель: Деп. науч. работы. -М.,2002. - №3 - С. 10-11.

31. Изучение фармакологической активности пчелиного расплода и мазей на его основе, Пятигорск: ПятГФА, 2002. - 25с. Деп. в ВИНИТИ 24.01.2002, №137-В2002. Библ.указатель: Деп. науч. работы.

- М.,2002. - №3 - С.10-11. (соавт.: Сотникова Е.М., Кулешова С.А.).

32. Сравнительное исследование липидной фракции пчелиного рас-плода//Пятигорск: ПятГФА, 2002. - Л7с. Деп. в ВИНИТИ 24.01.2002, № 138-В2002. Библ.указатель: Деп. науч. работы. -М.,2002.-№3-С.10-11.

33. Исследование углеводного состава гомогената пчелиного расплода// Пятигорск: ПятГФА, 2002. - 22с. Деп. в ВИНИТИ 24.01.2002, №139-82002. Библ.указатель: Деп. науч. работы. - М.,2002. - №3 -С.10-11.

34. Изучение липидного состава субстанций пчелиного расплода.// Человек и лекарство: Тез.докл. Рос. нац. конгресса (9; 2002; Моск-ва)-М.: ООФ «Здоровье человека», 2002,- С.648.

35. Сравнительное изучение физико-химических показателей субстанций пчелиного расплода.// Человек и лекарство: Тез.докл. Рос. нац. конгресса (9; 2002; Москва)-М.: ООФ «Здоровье человека», 2002.-С.648.

36. Определение фосфотаз в пчелином расплоде.// Человек и лекарство: Тез.докл. Рос. нац. конгресса (9; 2002; Москва) - М.: ООФ «Здоровье человека», 2002.- С.648. (соавт.: Сотникова Е.М.).

37. Определение содержания различных форм азота и белка в трутневом расплоде // Пятигорск: ПятГФА, 2002,- 16 с. Деп. в ВИНИТИ 30.05.2002, № 968-В-2002.

38. Изучение ферментного состава расплода пчел // Пятигорск: ПятГФА, 2002. - 19с. Деп. в ВИНИТИ 30.05.2002, № 969-В-2002.

39. Пчелиный расплод как источник получения лекарственных средств.// Пятигорск: ПятГФА, 2002. - 22с. Деп. в ВИНИТИ 30.05.2002, № 970-В-2002.

40. Изменения активности факторов естественного иммунитета и функционального состояния печени при введении трутневого рас-

плода в условиях химической интоксикации //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Междунар. съезда (6; 2002; СПб).- СПб., 2002,- С.403-406. (соавт. Клишина И.И., Василенко Ю.К.).

41. Влияние расплода пчел на физическую выносливость //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Междунар. съезда (6; 2002; СПб).-СПб., 2002,- С. 428-432.

42. Изучение гормонального состава расплода пчел. //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Междунар. съезда (6; 2002; СПб).- СПб., 2002,- С.250-252 .

43. Получение стабильных субстанций расплода пчел и их стандартизация //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Междунар. съезда (6; 2002; СПб).- СПб., 2002,- С.84-86.

44. Изучение иммунотропной активности расплода пчел //Актуальные

происхождения: Материалы Междунар. съезда (6; 2002; СПб).-СПб., 2002,- С.507-509 (соавт. Сотникова Е.М., Компанцева Е.В., Гутенева Г.С.).

45. Углеводный состав расплода пчел //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Междунар. съезда (6; 2002; СПб).- СПб., 2002,- С.301-303. (соавт. Сотникова Е.М.).