Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Физико-химические и фармакологические свойства ксимедона в новых гидрофильных гелях и мазях

005006951

На правах рукописи

ПАНТЕЛЕЕВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КСИМЕДОНА В НОВЫХ ГИДРОФИЛЬНЫХ ГЕЛЯХ И МАЗЯХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 ЯН5 ¿012

Казань-2012

005006951

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития России»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Мельникова Нина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Гармонов Сергей Юрьевич

доктор фармацевтических наук Кононова Светлана Владимировна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Самарский государственный

медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита диссертации состоится 2012 года в «-?/{.» часов на

заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г.Казань, ул. К. Маркса, 68

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Автореферат разослан «¿?5"~>> 20 Ц года

Ученый секретарь /.У

диссертационного совета —~ Г.Н. Нугуманова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Медикаментозные средства для лечения гнойных и ожоговых ран занимают важное место в повседневной хирургической практике. Основными требованиями, предъявляемыми к лекарственным средствам (ЛС) при лечении гнойных и ожоговых ран мягких тканей, являются их высокая антиоксидантная, репаративная, противовоспалительная, антибактериальная активность при минимальной токсичности и гипоаллергенности.

Одной из перспективных отечественных фармацевтических субстанций, отвечающей этому комплексу требований, является ксимедон (1-(р-оксиэтил)-4,6-диметил-1,2-дигидро-2-оксипиримидин).

Системное действие, главным образом, как репаранта, препарата ксимедона в таблетированной форме надежно доказано в широкой практике (Измайлов С.Г. и др., 2001-2011). В работах казанской школы клиническими исследованиями показано, что противовоспалительное и репаративное действие при приёме внутрь обусловлено в значительной степени антиоксидантными свойствами ксимедона. Антиоксидантная активность ксимедона объясняется индуцированием активности микросомальных оксидаз печени человека, что в свою очередь способствует профилактике и лечению острых и хронических интоксикаций, стрептококковой ангины, гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области, вирусным гепатитом С, рожи на фоне базисной терапии (Погорельцев В.И. и др., 2005 г).

Антиоксидантная активность ксимедона и фармакологические эффекты, сопряженные с ней, в других лекарственных формах, предполагающих местное действие, практически не изучены. Во-первых, это связано с отсутствием мягких и других лекарственных форм ксимедона наружного применения на фармацевтическом рынке. Во-вторых, высокие гидрофильность и растворимость ксимедона в воде (~400 г/л) создают объективные трудности для обеспечения необходимой осмотической активности при его проницаемости через липофильные участки раневой ткани из наружных ЛС.

Одним из путей снижения растворимости и гидрофильное™ ксимедона является связывание его в комплексы с компонентами мягких лекарственных форм (ЛФ), например, водорастворимыми полимерами. В связи с вышеизложенным, разработка новых эффективных мягких ЛФ ксимедона с

водорастворимыми полимерами, обеспчивающими оптимальную осмотическую активность, является актуальной задачей.

Целью исследования является изучение физико-химических и фармакологических свойств ксимедона в полиэлектролитной среде и разработка норм качества новых гелей и мазей на этой основе.

Задачами исследования являются

1. Исследование кислотно-основных свойств ксимедона в водных средах в интервале рН от 1 до 12.

2. Изучение свойств и механизма образования полиэлектролитных комплексов, образованных ксимедоном и водорастворимым полимером полиакриловой кислотой.

3. Разработка составов гелей и мазей для лечения гнойных и ожоговых ран. Оценка эффективности лечения мазями и гелями в эксперименте на животных.

4. Изучение осмотической активности и кинетики выведения ксимедона из гидрофильных гелей.

5. Исследование влияния ксимедона и его электролитных комплексов как активаторов ферментов каталазы и супероксидцисмутазы на антиоксидантную активность системы.

6. Разработка экспресс-анализа деструкции ксимедона и его комплексов с полиэлектролитами в раневом отделяемом.

7. Разработка методов анализа и норм качества нового противоожогового

геля.

Научная новизна

• Установлено существование равновесных форм протонированного и не ионизованного ксимедона при различных рН и рассчитана рКа (рКвн+) для сопряжённой кислоты ксимедона. Предложен экспресс-анализ изменения структуры ксимедона в раневом отделяемом после нанесения ЛС на открытую ожоговую рану.

• Предложен механизм комплексообразования ксимедона с редко-сшитой полиакриловой кислотой по типу ассоциации биополимеров с лигандами. Рассчитана константа ассоциации (Ка = 550 л/моль), подтверждающая сильное связывание ксимедона с неионизованными карбоксильными группами.

• Обосновано пролонгированное действие ксимедон-содержащих гелей по данным осмотической активности.

• Впервые показано, что ксимедон является активатором ферментов каталазы и супероксидцисмутазы (СОД), ингибированных продуктами воспаления, что приводит к повышению антиоксидантной активности ферментов.

• Разработаны составы и нормы качества противоожогового геля "Левоксим", подтверждено повышение репаративного и противовоспалительного действия по сравнению с традиционными JIC (мази метилурацила и левомеколя) в эксперименте на животных.

Практическая значимость степень внедрения результатов в практику

Результаты экспериментальных исследований использованы при подготовке нормативной документации на гель "Левоксим". Разработан проект фармакопейной статьи предприятия ЗАО «Интелфарм».

Материалы исследований рекомендованы для использования в научной работе и учебном процессе на кафедрах «Фармацевтической химии и фармакогнозии» и «Управления экономикой фармации и фармацевтической технологии».

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах и научной новизне.

Апробация работы Результаты работы были представлены на VIII Научной сессии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2009); IX Юбилейной научной сессии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии» (Казань, 2010); 16-ой Нижегородской сессии молодых ученых (естественные науки), «Красный плес» (Нижний Новгород, 2011).

По результатам исследований получен патент, опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных для размещения материалов диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав (литературный обзор, экспериментальная часть, результаты работы и их обсуждение), 3 приложений, содержащих проект фармакопейной статьи на разработанный гель. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 46 рисунков. Список литературы включает 137 работ отечественных и зарубежных авторов.

Автор выражает глубокую признательность ЗАО «Интелфарм» за финансовую поддержку исследований и лично Яшновой O.K., а также доценту кафедры

управления экономикой фармации и фармацевтической технологии НижГМА, к.х.н., Волкову A.A. за помощь в постановке эксперимента.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Ксимедон (1 -(Р-оксиэтил)-4,6-диметил-1,2-дигидро-2-оксопиримидин),

производитель НПП ФГУП «Кристалл», г. Дзержинск Нижегородской области.

Материалы и реактивы: концентрированная соляная кислота (HCl марки «ХЧ», ГОСТ 3118-77), натрия гидроксид (NaOH марки «ЧДА», ГОСТ 4328-77), карбомер (карбопол), гиалуронат натрия (MR=50000, SIGMA Chem. Со, чистоты 99,0%), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (ТУ 2231-034-07507908-01). вода очищенная (получена на установке «Elix-З» фирмы «MILLIPORE», удельное сопротивление менее 0,2 цСм).

В работе использовали гидрогели составов (масс. %): ксимедон - 1-10; водорастворимый полимер (редко-сшитая полиакриловая кислота, натриевые соли карбоксиметилцеллюлозы и гиалуроновой кислоты) - 0,1-1; вспомогательные вещества до 100.

Состав мази (масс., %): ксимедон - 5; левомицетин- 0,75; полиэтиленоксид-400 -76,20; полиэтиленоксид-1500- 19,05.

Приборы: УФ-спектры ксимедона получены на УФ спектрофотометре «SPECORD S 100», «Analytik jena», Германия. ИК-спектры получены на инфракрасном спектрофотометре с преобразованием Фурье «IRPrestige-21» (КВг), Shimadzu, Япония. |3С ЯМР спектры регистрировали на спектрометрах «Bruker Advance DPX - 200». Квантово-химические расчеты были выполнены с использованием программы HyperChem (версия 7.52). Потенциальная функция расчетов выполнена с использованием поля ММ+. Оптимизация геометрии и минимизация энергии системы проведена при алгоритме Polak-Ribiere, плотность зарядов - DFT - метода (ВЗ - LYP). Потеициометрическое титрование проводили на иономере «И-130», Россия. Кондуктометрические измерения проводили на кондуктометре «Dist 3», «Hanna instruments», Португалия. ВЭЖХ анализ проводили на жидкостном хроматографе «LC-10Avp», Shimadzu, Япония. Монослои изучали на установке, состоящей из тефлоновой ванны (205x127x2 мм) и весов Ленгмюра (KSV Nima). Осмотическую активность ксимедона в геле (кинетику выведения ксимедона из гидрогеля) изучали методом диализа через полупроницаемую мембрану

(И.М.Перцев, 1979). В качестве мембраны применяли целлофановую мембрану толщиной 45±1 мкм.

Медико-биологические исследования

Оценка репарантных свойств и антиоксидантной активности гидрофильных мазей и гелей в эксперименте на животных

Изучены мазь состава (масс., %): левомицетин - 0,75; ксимедон - 4,00; полиэтиленоксид-400 - 76,20; полиэтиленоксид-1500- 19,05 и гель состава (масс., %): полиакриловая кислота-0,1-1,0; ксимедон 1-10,0; гелевая основа до 100.

Репаративные свойства изучены на 48 половозрелых (5 месяцев) белых крысах (самцы, масса тела 220-250 г) линии Wistar на модели ожога кожи Шб степени путем нанесения на депилированную кожу поясничного отдела крыс дозированных ожогов площадью 235 мм2 (3*78,5 мм2) с температурой ожоговой поверхности около 300°С и с длительностью соприкосновения с кожей 1 сек с нембуталовым наркозом в дозе 3540 мг/кг. Через 12 часов после термического воздействия на ожоговую рану наносили суспензию микроорганизмов Staphylococcus aureus штамм 7М (108 в микробных тел в 1 мл) количестве 0,05 мл (Маянский, 1999). Суспензии готовили путем смыва забуференным физиологическим раствором (рН 7,2-7,4) 24-часовой агаровой культуры. Стандартизация микробной взвеси проводилась по стандарту мутности Государственного контрольного института медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича для бактерий. Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, данным в руководстве Guide for care and use of laboratory animals. ILAR publication, 1996, National Academy Press. Все процедуры no рутинному уходу за животными выполняли в соответствии с СОП лаборатории.

Экспериментальные исследования по антиоксидантной активности проведены на 42 беспородных собаках массой (M±s) 22,3±2,6 кг. Животные с моделированными гнойными ранами разделены на две группы: контрольную и основную. В обеих группах лечение гнойной раны проводилось под повязкой. Эффективность лечения оценивалась на основании субъективных (визуальная оценка состояния раны) и объективных (микробиологичекие, цитологические исследования, биохимический анализ, планиметрия) критериев. Материал для всех «инвазивных» методов исследования забирался одновременно: с участка здоровой ткани в месте моделирования гнойной раны, после нагноения моделированной раны (до лечения). Иссекались грануляционная ткань и паравульнарная область на 1 см от края раны. Для оценки окислительных процессов в паравульнарных тканях при лечении ран гомогенат ткани центрифугировали, полученный супернатант использовали для

дальнейшего анализа: определяли активность ферментов каталазы и супероксиддисмутазы (СОД), активность перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для оценки активности каталазы в тканевом экстракте применяли метод Н. АеЫ (1970), основанный на способности пероксида водорода давать стойкое окрашивание с молибдатом аммония. Активность СОД в тканевом экстракте определяли по методу МясЫкши (1972), основанному на способности фермента ингибировать восстановление тетразолия нитросинего в присутствии феназинметасульфата и НАД-Н. Интенсивность процессов ПОЛ оценивалась спектрофотометрически по содержанию диеновых, триеновых конъюгатов и количеству двойных связей в продуктах после экстракции липидов из полученного супернатанта в смеси хлороформ-метанол.

Статистическую обработку проводили по программе 8гаг1з11са 6.0.

Результаты работы и их обсуждение

1. Кислотно-основные свойства ксимедона в полярной среде

Были изучены УФ- спектры поглощения ксимедона в кислой и щелочной среде и ксимедона гидрохлорида в воде и 0,1 М растворе соляной кислоты (рис. 1а,б,в).

Рис. 1.а,б,в. УФ- спектры поглощения ксимедона и его протонированной формы в водных растворах при рН: а) 1 - рН 3,99; 2 -рН 3,70; 3 -рН 3,40; 4 рН 3,22; 5-рН2,92; 6-рН 2,62; 7-рН 2,3; 8 - рН 1,3; б) 9 - рН 10,16; 10 - рН ¡0,46; 11 - рН 10,67; 12 - рН 10,82; 13 - рН 11,24; 14 - рН 11,54; 15 - рН 11,86; 16 - рН 12,86; в) раствор ксимедона и ксимедона гидрохлорида в 0,1 М соляной кислоте-17,18 и в воде -19,20.

Кривые А=/(рН) в области рН от 1 до 4 при постоянной концентрации ксимедона пересекаются в одной точке, вероятно изобестической, при длине волны

равной 296 нм, что показывает существование в равновесии по крайней мере двух форм ксимедона - протонированной и нейтральной (рис 1а).

В области сильнощелочных растворов, вероятно, преимущественно существует нейтральная форма ксимедона (рис. 16).

УФ- спектры ксимедона и его протонированной формы в 0,1 М растворе соляной кислоты и воды совпадают, а также имеют общую точку пересечения в области изобестической точки (296 нм) (рис. 1 в). Можно предположить, что в воде основное количество ионизованной формы ксимедона быстро переходит в нейтральную, а исходный ксимедон в 0,1 М растворе соляной кислоты частично протонируется и стабилизируется в ионизованной форме, характеризующейся Х^х = 309 нм (рис. 1в). Батохромный сдвиг на 9 нм свидетельствует об энергетическом изменении п - я* перехода в карбонильном хромофоре за счет протонирования кето-группы ксимедона (Кси). На основе полученных данных была расчитана величина рКа(КсиН+) по уравнениям (1) и (2)

где еко,, £ктн+, £ - кажущиеся коэффициенты молярной экстинкции ксимедона (5^=299,7 нм), его протонированной формы (^„=309,2 нм) и ксимедона (А™* при рН от 1 до 4), равные отношению наблюдаемой оптической плотности А^, к полной концентрации обеих форм в растворе. Величина рКа, рассчитанная для сопряжённой ксимедону кислоты (КсиН+), равна 3,25.

Квантово-химическими расчетами было установлено, что максимальный отрицательный заряд располагается на карбонильном атоме кислорода (-0,470), и протонирование ксимедона на первой стадии наиболее вероятно происходит по кето-группе (схема 1).

В спектрах ЯМР смеси Кси и КсиН+ наибольшие изменения происходят в карбонильной группе СЮ (8(Кси) 175,5 м.д.; 8(КсиН+) 149,0 м.д.). Различие химических сдвигов остальных групп менее значительны 3 (Ы-СН2(1)): 47,9 м.д. для Кси и 49,4 м.д. для КсиН+; 5 (С=С(4)): 160,6 м.д. для Кси и 172,1 м.д. для КсиН+; 5 (С=С(6)): 157,9 м.д. для Кси и 168,5 м.д. для КсиН+.

е-е,

рКа=рН-\%

(2),

СНз

^М-СНгСНгОН

сн3

JLv

сн2сн2он

Н3С N

СНз

Н3С N

N-CH2CH2OH

он

п

III

сн3

^N-CH2CH2OH

HaC^N^OH

СНз

/©-N-CH2CH2OH -^Ч^ОН

СНз

Н3С^ N V

N-CH2CH2OH

■f—r,

СНз -N-CH2CH2OH

Н3С^ ~он VI

H3C N

н

VII

Схема 1. Возможные структуры протонированого ксимедона.

В водной среде ксимедон и его протонированные формы КсиН+ склонны образовывать стопочные ("stacking") структуры типа (VIII-X) за счет внутри- и межмолекулярных водородных связей:

VIII IX X

Для практических целей особенно важным является образование более липофильных прочных комплексов полимеров с избыточно растворимым в воде ксимедоном (-400 г/л). Проведенные исследования показывают, что ксимедон как основание способен легко либо отрывать протон у поликислот, либо достаточно прочно связывать протон за счет образования димеров и циклических структур, преимущественно по карбонильному кислороду.

2. Изучение свойств и механизма образования комплексов ксимедона с высокомолекулярными соединениями, содержащими кислотную функцию

Комплексообразование ксимедона с полимерами может быть обусловлено силами, включающими Ван-дер-Ваальсовы, кулоновские, диполь-дипольного взаимодействия, водородные связи и гидрофобное связывание. О комплексообразовании в полимер-коллоидной системе «ксимедон-ВМС с кислотной функцией» можно судить по изменению вязкости, удельной электропроводности и рН

при увеличении концентрации ксимедона. В качестве полимеров были изучены натриевая соль гиалуроновой кислоты (степень нейтрализации 60%), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (степень нейтрализации 70%) и полиакриловая кислота (марки карбопол).

Из данных по зависимости "рН - концентрация ксимедона" в растворах полимеров следует, что в реакцию с переносом протона ксимедон вступает только с полиакриловой кислотой (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость рН растворов ВМС от концентрации ксимедона:

а) во всей изучаемой области концентраций ксимедона;

б) в области малых концентраций ксимедона

1- шЛЛГС- 0,063%; 2- сопак= 0,125%; 3- ЮПАК= 0,250%; 4- а>Гшт= 0,100%; 5- со^кщ = 0,100%.

Потенциометрическое титрование водных растворов ПАК с массовой концентрацией 0,063 %, 0,125 % и 0,250 % 0,5 М водным раствором ксимедона (Кси) показало, что зависимости рН-состав аналогичны изотермам ленгмюровского типа (рис. 2а). В области малых концентраций ксимедона зависимость рН=/(Скот) становится линейной (рис. 26).

Снижение кислотности среды при увеличении концентрации Кси может происходить за счет связывания Кси протонов, образующихся при диссоциации карбоксильных групп ПАК, в исходном растворе. Я-СООН Я-СОб+Н+ (1) Н+ + Кси ^ КсиН+ (2)

О комплексообразовании ксимедона с кислотной группой свидетельствует и изменение вязкости Т1отн 0,25% раствора ПАК при добавлении в водный раствор ксимедона: в области малых концентраций до 4-10"2 М вязкость изменяется

незначительно, тогда как в области более концентрированных растворов ксимедона отмечается аномальное увеличение вязкости раствора (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость относительной вязкости растворов ВМС от концентрации ксимедона: I- 0,25% раствор ПАК, 2- 0,25% раствор натрия карбоксиметилцеллюлозы; 3- 0,25% раствор

гиалуроната натрия.

В отличие от этого, зависимости относительной вязкости растворов натрия карбоксиметилцеллюлозы и натрия гиалуроната от концентрации ксимедона не отражают межмолекулярных взаимодействий между ксимедоном и полимером (рис. 3, кривые 2, 3). Незначительное влияние концентрации ксимедона на удельную электропроводность также подтверждает отсутствие комплексообразование ксимедона с натриевыми солями полисахаридов (рис. 4 а). Изменение удельной электропроводности ге водных растворов ПАК различной концентрации под действием Кси более сложное: аг уменьшается в области малых концентраций Кси, а затем возрастает при увеличении концентрации последнего (рис. 4 б).

а)

б)

Рис. 4. Зависимость электропроводности растворов полимеров от концентрации ксимедона:

а) полисахаридов (0,1 масс. %);

б) ПАК (1- 0)пак= 0,063%; 2- соПак" 0,125%; 3- гошк= 0,250%).

Не исключено, что такая картина обусловлена образованием стопочных ("stacking") комплексов ксимедона с карбоксильной группой звена ПАК, снижающих при малых концентрациях удельную элекропроводность, а при больших концентрацих возможна диссоциация этих комплексов, и, соответственно, повышение удельной электропроводности.

Таким образом, полученные нами данные по взаимодействию ксимедона с тремя полимерами, содержащими кислотную функцию, однозначно свидетельствуют об образовании комплексов ксимедона только с полиакриловой кислотой.

Изучение механизма комплексообразования полиакриловой кислоты с ксимедоном потенциометрическим методом.

Кривые рН =/(СКси) при поглощении ПАК ксимедона аналогичны зависимостям «свойство системы - концентрация лиганда, связанного полимером», характерным для насыщения биополимера лигандами. Ассоциацию ксимедона с ПАК (I участок на изотермах рН =/(СКси) и ае =/(СКСй)). можно выразить как:

ПАК + Кси =*= ПАК-Кси (3)

Константа ассоциации Ка для насыщения ПАК ксимедоном определяется выражением (4) или с учётом концентрации ксимедона, связанного в комплекс [Кси] связ

(5):

[ПАК-Кси] ,,,

Ка~[ПАК\\Кси} ()

к [Kcuj,,,__...

где и [Кси]своб - концентрация "свободного" ксимедона.

После преобразования выражения

(5) к виду уравнения Скетчарда, справедливому для взаимодействия биополимеров с лигандами, и при значительном избытке ксимедона как лиганда, уравнение приобретает вид, формально соответствующий математической форме уравнения Ленгмюра (6):

1 + Ка ■ Кси0

В первом приближении ответ системы R по Скетчарду пропорционален концентрации комплекса или ассоциата. Ассоциацию можно выразить как относительную степень насыщения реакционных центров ПАК ксимедоном, сопровождающуюся связыванием протона:

R = РНг ~ РН,ач _ Кп-Кд-Ск™ Г]Л

рНти-рН„„ ! + 13

Рассчитанная по выражению (7) константа ассоциации Ка, равная 550 л/моль, характеризует прочное связывание ксимедона с реакционными центрами глобул или сетки полиакриловой кислоты, а полиакриловая кислота будет являться эффективным гелеобразователем с иммобилизованным ксимедоном для приготовления медицинских гелей.

3. Изучение осмотической активности и кинетики высвобождения ксимедона из гидрофильных гелей.

Осмотическую активность ксимедона в геле на основе 0,5% раствора редко-сшитой полиакриловой кислоты оценивали методом диализа через полупроницаемую мембрану при температуре 36,5±0,5°С по кинетическим данным выведения ксимедона из гидрогеля. Концентрацию ксимедона в диализате контролировали УФ-спектральным методом. Высвобождение ксимедона из геля С=/(т) зависит от исходной концентрации ксимедона в анализируемом геле (рис. 5).

Скорость выделения ксимедона из геля через целлофановую мембрану достаточно велика в начальный период 30-40 минут, что свидетельствует о высокой осмотической активности ксимедона в данном геле (рис. 5). В дальнейшем концентрация ксимедона в диализате увеличивается медленно и кинетические кривые выделения ксимедона из геля имеют вид парабол.

С,мг/ыл

0,07 0,06 0,05 0,04

°-03 / а^о

<]/ Рис. 5. Кинетическая кривая выделения

ксимедона из геля. Концентрация ксимедона в геле: Со=0,1 мг/ш (кривая 1), Со~0,05 мг/мл -1—1—'—1—1—'—1—1 ' 1—~—'——1— (кривая 2).

20 40 60 80 100 120 24часа48часа Время диализа т.мин

Медленное снижение скорости выделения ксимедона из геля в течение нескольких суток обеспечивает пролонгированный дозируемый эффект ксимедона в анализируемых гелях.

4. Прогнозирование антиоксидантного действия ксимедона на биомнметической модели антиоксидантной активности.

Анализ поведения ксимедона на простой модели проведён с использованием монослоя биснитроксидного малонатного метанофуллерена Си (МО")2мМС60.

(N0 )2мМСбо - * -

Выбор компонента монослоя обусловлен, во-первых, спецификой электроно-дефицитного фуллеренового ядра, проявляющего себя как окислитель в водной среде за счёт перехода в супероксиданион-радикал. В возбужденном состоянии (Ьи, 02) С« [как 'С6о* так и 3С6о*] способен генерировать синглетный кислород и может взаимодействовать с донорами электронов.

Кроме того, в структуре (ЫО')2мМС6о имеются 2 нитроксильных радикала N0", что расширяет возможности модели антиоксидантной активности, включая реакции, типичные для ЫО-синтетазы.

Критерием антиоксидантной активности биологически активных веществ (БАВ) при моделировании на монослое является величина молекулярной площади А0 (МУ)2мМС60: А0 увеличивается при образовании комплекса с антиоксидантным БАВ, приобретающего отрицательный заряд и обуславливающий отталкивание (ЖУ^мМСГбо в монослое.

Молекула (ЫО')2мМСбо в монослое на поверхности воды занимает площадь 0,87 нм2. С увеличением концентрации ксимедона в водной субфазе молекулярная площадь А0 (Ж)')2мМСбо в монослое существенно увеличивается и при Скси более 0,1 М достигает предельного значения А0 ~ 1,8 нм2, что почти в 2 раза превышает теоретически рассчитанную величину (рис. 6).

Этот результат свидетельствует об иммобилизации ксимедона в монослое (Ж)')2мМС6о. Наиболее вероятно предположить, что ксимедон, взаимодействуя с фуллереновым производным образует супрамолекулярный комплекс "гость-хозяин", в котором ксимедон выполняет роль "гостя".

Перераспределение электронной плотности, сопровождающее комплексообразование в системе "ксимедон как донор электронов -электронодефицитное фуллереновое ядро", приводит к увеличению молекулярной

площади и является характеристикой антиоксидантной активности.

Влияние ксимедона на антиоксидантную активность ферментов каталазы и супероксидднсмутазы в эксперименте на животных.

Антиоксидантная активность ксимедона оценивалась в репаративном процессе заживления гнойных ран в эксперименте на собаках и на крысах линии \Vistar с использованием мазей с ксимедоном на полиэтиленоксидной основе и гидрофильных гелей. В таблице 1 приведена оценка эффективности лечения мазями в основной и контрольной группе.

Таблица 1. Оценка эффективности лечения.

Наблюдаемое явление Основная группа Ме [0,; 0,] Контрольная группа Me[Q,;Q3]

Грануляции, сут ЗГЗ;61 4[3;61

Очищение раны, сут 5 [4; 8] 7 [5; 91

Микробная обсеменённость, КОЕ*108/мл (1 сут) 2,8x10* [2,9х 10й; 4,6* 109] 7,4x108 [5,4х108;4,Зх109]

Уменьшение площади раны, % 3 сут 81 [74; 87] 89 [81; 94]

7 сут 62 [59; 681 68 [65; 74]

11 сут 25 [23; 281 45 [40; 491

Полное заживление, сут 14,4±1,3 18,5±1,4

В процессе лечения отмечалась тенденция к постепенной нормализации показателей и возвращению их к исходному уровню, при этом в основной группе, при лечении мазями с ксимедоном эта тенденция была более выражена (рис. 7).

ед актмин г ткани 40-

Н-1-1-1-1-1-1-

долечсни« 3 7 Ц 15 20 Время найлкяе ни!

Т-1-1-1-1-1-

3 7 11 15 20 Время набпкяенш

ъсут

а)

б)

ед. акт. мин г ткани

§ 2,0-

4-

Рис. 7. Изменение показателей ПОЛ:

а) диеновые конъюгаты;

б) количество двойных связей;

в) триеновые конъюгаты

здоровая ткань

1 - левомеколь

2 — ксгшедон

20 Время набгсддени г.стт

в)

Сравнение результатов исследования уровня антиоксидантной защиты по показателям активности каталазы и СОД паравульнарных тканей в разгар гнойного процесса и в процессе лечения гнойной раны свидетельствуют о преимуществах использовании мазей на основе ксимедона по сравнению с традиционными (рис. 8).

Анализ лечения мазями на основе ксимедона, используя показатели контроля ПОЛ, а также активности каталазы и СОД, позволяют сделать вывод о достоверном влиянии антиоксидантной активности ксимедона на процесс заживления гнойных ран мягких тканей. Можно предположить, что влияние ксимедона заключается в том, что ксимедон выступает как активатор или индуктор активности СОД и каталазы. В острой фазе раневого процесса каталитические центры ферментов СОД и каталазы ингибированы продуктами воспаления, вследствие чего удаление активных форм кислорода каталазой резко уменьшаются.

На основании микробиологических, цитологических, биохимических и планиметрических исследований показано, что местное лечение ксимедон содержа-

ед. апмин г тали

сд. акт. мин г паки

Т-Г—

до лечения

20 Время на блюде нго т. сут

до ляения з 7 И 13 20 Прем* набладаенж

г. Т, СУТ

а) б)

Рис. 8. Изменение активности антиоксидантной системы

а) супероксиддисмутазы и б) каталазы при лечении гнойных ран различными мазевыми формами: + - здоровая ткань; I - левомеколь; 2 - ксимедон

щими мазями гнойных ран мягких тканей более эффективно по сравнению с

традиционной схемой лечения с использованием левомеколя и метилурацила.

5. Степень выраженности показателей заживления ожоговой раны в ходе

лечения препаратом ксимедона и препаратами сравнения представлена в таблице

2.

Таблица 2. Показатели заживления ожоговой раны.

Время лечения 3 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки 10 сутки

Группы струп эпит струп эпит струп эпит струп эпит струп эпит

Контроль I - + 1 1 11 + +++ + ++ +++

Ваз. масло ■П11 - ++++ + +++ + +++ + + ++

Левоксим +++ + ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ +++

Метилура-циловая мазь 10% + + - + - ++ - +++ - +++

Примечание: струп - характеристики отторжения струпа, эпит - степень эпителизации в баллах.

6. Изучение изменения структуры ксимедона в раневом отделяемом в процессе лечения гелями на открытых ожоговых ранах проведено методом ИК-спектроскопии. Критерием сохранения базовой структуры ксимедона использован показатель К, равный отношению поглощения в области 1653 см"1 к интенсивности поглощения в области 1040 см"1 - К=1165з/11040. Для плёнки исходного геля Ко=3,3±0,3.

а=Кна6я/К0 100%, характеризующая сохранение базовой структуры ксимедона, изменялась от 100% (начало лечения) до 50% (эпителизация раны). Исследования показали, что эпителизация сопровождается увеличением содержания продуктов деструкции - преимущественно протонированной формы ксимедона.

7. Разработка состава, методов анализа и норм качества всех компонентов противоожогового геля "Левоксим"

На основании проведённых исследований разработаны: состав противоожогового геля для наружного применения, его спецификация и проект фармакопейной статьи.

Состав: ксимедон - 5%, левомицетина натрия сукцинат — 0,5%, карбопол - 0,8%, вспомогательные вещества до 100.

Таблица 3. Спецификация на гель для наружного применения

Показатель Метод Норма

Описание Визуально Розовый или светло-жёлтый прозрачный однородный гель без включений

Подлинность 1. Ксимедон 2. Левомицетина сукцинат натрия ВЭЖХ ВЭЖХ По сопоставлению времени удерживания основного пика на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов По сопоставлению времени удерживания основного пика на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов

рН ГФ XII, потенцио-метрически 6,5-8,0

Вязкость По методике НД 21-26 мм2/с

Масса содержимого Весовой 20 г± 1,8 г

Микробиологическая чистота ГФ XII, изд. №1, с. 160 Категория 2

Количественное определение ВЭЖХ Ксимедон от 90 до 110 % от номинального содержания Левомицетина сукцинат от 90 до 110 % от номинального содержания

Посторонние примеси ВЭЖХ • неболее0,5%4,6-диметил-1,2-дигидропиримидин-2-она; • не более 1,5% суммы всех примесей

Упаковка По 20 г в алюминиевые тубы с навинчивающейся крышкой из полиэтилена. Каждую тубу вместе с инструкцией по применению помещают в пачку

Маркировка В соответствии с НД

Хранение При температуре не выше 25°С

Срок годности 3 года

выводы

1. УФ, 'Н, 13С-ЯМР спектроскопией, квантово-химическими расчётами установлено, что протонирование ксимедона, как в водных растворах, так и в биологической среде, происходит по карбонильному атому кислорода. Изобестическая точка при X = 296 нм в серии УФ-спектральных кривых А=/(рН) в интервале рН 1-6 свидетельствует о равновесном существовании ионизованной и нейтральной форм ксимедона. По значениям кажущихся коэффициентов экстинкции рассчитана термодинамическая величина рКвн+, равная 3,25.

2. Комплексообразование ксимедона со звеньями полиакриловой кислоты отражается пропорциональной зависимостью изменения рН от концентрации ксимедона. Повышение рН и уменьшение удельной электропроводности объясняется связываением ксимедоном протонов, образующихся при диссоциации полиакриловой кислоты, и образованием ассоциатов, что подтверждается данными 13С-ЯМР спектров. Константа ассоциации К„ рассчитанная в приближении и по уравнению Скетчарда, равна 550 л/моль и характеризует прочное связывание ксимедона с реакционными центрами глобул или сетки полиакриловой кислоты.

3. Исследована осмотическая активность и кинетика высвобождения ксимедона из геля методом диализа через полупроницаемую мембрану при УФ контроле (Хтах = 290 нм) ксимедона в изотермических условиях (36,5 ± 0,5°С). Максимальная скорость выделения ксимедона из геля наблюдается в первые 30-40 мин, в дальнейшем проницаемость ксимедона медленно снижается, а выделение 80-90% ксимедона достигает нескольких суток, что обеспечивает пролонгированный и дозированный эффект ксимедона в гелях.

4. Разработаны оптимальные составы гелей и мазей с ксимедоном на основе кросс-сшитой полиакриловой кислоты или полиэтиленоксидов (патент РФ №2404745 от 27.11.2010 г). В экперименте на животных (крысы, собаки) доказано отсутствие токсико-аллергических реакций и высокая репаративная и противовоспалительная активность гелей.

5. Предложен эмпирический критерий сохранения исходной неионизованной формы ксимедона в раневом отделяемом после нанесения геля на ожоговую рану по показателю К, равном отношению интенсивности поглощения 11653 в области С=0 (амид I 1653 см"1) к интенсивности поглощения 1ю4о в области С-0 (первичная спиртовая группа 1040 см"1) в ИК-спектрах: К = 1,й5з/1Ш40. Доля ксимедона исходной структуры в раневом отделяемом а = Кнабл./К0, %, где Кс - показатель К в исходном состоянии, изменяется в течение 2-3 суток от 100% до 50% при благоприятном заживлении.

6. В эксперименте (42 беспородные собаки) изучено влияние ксимедона на окислительные процессы в грануляционной ткани и паравульнарной области на 1 см от края раны. Показано, что ксимедон активирует антиоксидантную активность ферментов каталазы и супероксиддисмутазы, ингибированных продуктами воспаления, и улучшает показатели ПОЛ.

7. На модели "радикальной губки" монослоёв и плёнок бис-нитроксидного метанофуллерена С6о показано интенсивное взаимодействие ксимедона с фуллереном. Концентрационная зависимость молекулярной площади А0 свидетельствует об иммобилизации ксимедона фуллереновой плёнкой и связывание ксимедона как фуллереновым ядром, так и N0' - радикальной частью. Эти данные позволяют прогнозировать антиоксидантные свойства ксимедона.

8. Разработаны методы анализа на все компоненты и нормы качества гидрофильного геля оптимального состава. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия ЗАО "Интелфарм" на гель "Левоксим".

Публикации в изданиях, рекомендованных для размещения материалов диссертаций:

1. Мельникова Н.Б. Взаимодействие редко-сшитой полиакриловой кислоты и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы с ксимедоном (1-(Р-оксиэтил)-4,6-диметил-1,2-дигидро-2-оксопиримидином) в водной среде / Н.Б. Мельникова, Д.А. Пантелеев, O.E. Жильцова, A.A. Волков, М.В. Гуленова, Т.В. Саликова. // Вестник Нижегородского Университета им. Н.И. Лобачевского. Серия Химия. - 2011. - №5.

- С. 91-96.

2. Рыжова Е.С. Взаимодействие Ы-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-1Ч'-изоникотиноилгидразида с кислотами и основаниями в водных средах / Е.С. Рыжова, Д.А. Пантелеев, Ю.В. Чудецкая, A.A. Волков, Н.Б. Мельникова, М.В. Гуленова, В.К. Османов, A.B. Борисов // Хим.- фарм. журнал.

- 2010. - 4. - том 44. - С. 43-50.

3. Мельникова Н.Б. Новые гидрофильные гели на основе репаранта - Ксимедона / Н.Б. Мельникова, A.A. Волков, Д.А. Пантелеев // Медицинский альманах. - 2009. -№3 (8).-С. 150-152.

4. Бесчастнов В.В. Антиоксидантная активность пиримидиновых производных при местном лечении гнойных ран мягких тканей (в эксперименте) / В.В. Бесчастнов, С.Г. Измайлов, A.A. Ботяков, А.Ю. Жаринов, Д.А. Пантелеев, Н.Б. Мельникова // Современные технологии в медицине. - 2011. - № 3. — С. 21 -26).

5. Майчук Ю.Ф. Экспериментальная оценка глазного геля «Визоксим» / Ю.Ф. Майчук, В.Б. Кузин, О.В. Кольчик, Л.Д. Раснецов, Я.Ю. Шварцман, Н.Б. Мельникова,

O.K. Яшнова, Д.А. Пантелеев, Г.П. Захарова, А.И. Щипанова // Российский офтальмологический журнал. - 2009. - Т.2. - № 2. - С. 42-46.

Патенты РФ:

1. Патент 2404745 Российская Федерация, МПК А61К9/06, А61К319/513, А61К31/165, А61К31/133, А61К31/245, А61Р17/02. Гидрофильная фармацевтическая композиция для лечения ожогов / Н.Б. Мельникова, Л.Д. Раснецов, Я.Ю. Шварцман, O.K. Яшнова, Д.А. Пантелеев; - заявитель и патентообладатель Раснецов Л.Д. - № 2008146608/15, заявл. 27.11.2008; опубл. 27.11.2010, Бюл. № 33.

Материалы конференций:

1. Сорокин, П.В. Оценка проницаемости геля на основе биополимера / П.В. Сорокин, М.С. Гусихина, Д.А. Пантелеев // Сборник материалов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007». - Москва, 2007. - С. 170.

2. Раснецов, Л.Д. Экспериментальная оценка нового гидрогеля «Визоксим» для офтальмологии / Л.Д. Раснецов, Я.Ю. Шварцман, O.K. Яшнова, Д.А. Пантелеев, В.Б. Кузин, О.В. Кольчик, Н.Б. Мельникова, А.И. Щипанова, Ю.Ф. Майчук // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -Москва, 2009. - С. 724.

3. Пантелеев Д.А. Кислотно-основные свойства производных пиримидина в водных гелях / Пантелеев Д.А., Рыжова Е.С. // Сборник материалов Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии», Казань: КГТУ, -2010. - С.180.

4. Пантелеев Д.А. Антибактериальное, антимикотическое и ранозаживляющее действие гелей с ксимедоном и солью серебра, способных образовывать на-раневой поверхности нанокластеры серебра / Д.А. Пантелеев, A.A. Волков // Сборник материалов IX Юбилейной научной сессии молодых ученых и студентов, посвященной 90-летию Нижегородской государственной медицинской академии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине». - Н. Новгород, 2010.-С. 215-217.

Подписано в печать 21.12.2011 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,00. Заказ № 426. Тираж 50 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40