Противодиабетические свойства гимнемовых кислот

Воронкова, Мария Павловна

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Противодиабетические свойства гимнемовых кислот

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Воронкова, Мария Павловна Волгоград 2009 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.25

Автореферат диссертации по медицине на тему Противодиабетические свойства гимнемовых кислот

На правах рукописи

ииа4713В1

ВОРОНКОВА МАРИЯ ПАВЛОВНА

ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГИМНЕМОВЫХ КИСЛОТ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 8 Ш 2009

г*

Волгоград 2009

003471361

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ и Российском НИИ Здоровья (г. Москва)

Научный консультант:

Член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Спасов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты:

1. доктор биологических наук, профессор Гарибова Таисия Леонидовна

2. доктор биологических наук, профессор Сергеева Светлана Александровна

3. доктор медицинских наук Черников Максим Валентинович

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится ОС 2009 г. в ч. на заседании Диссертационного Совета Д 208.008.02 ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов,!)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Автореферат разослан « /9 » ^ЛАХХЛА^- 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор А.Р. Бабаева

Актуальность проблемы.

Сахарный диабет (СД) зарегистрирован более чем у 150 млн. человек в мире (И.И. Дедов и др., 2008; A.C. Аметов, 2008). При этом прогнозируется удвоение числа заболевших СД каждые 12-15 лет. Из этого числа 90-95% - больные инсу-линнезависимым СД в возрасте 35-49 лет. Фактическая распространенность СД в 3-4 раза превосходит регистрируемую, что свидетельствует о пандемии СД среди взрослого населения (И.И. Балаболкин и др., 2008). Достаточно большой объем знаний в области патофизиологии диабета и наличие широкого спектра терапевтических возможностей лечения не привели к улучшению метаболического контроля заболевания от стадии глюкозотолерантности до развернутой клиники СД (И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко, 2006). Лечение усложняется, тем, что гипергликемия сочетается с ожирением, артериальной гипертенчией, дислипидемией, гиперкоагуляцией и окислительным стрессом. Так как длительно протекающая декомпенсация усугубляет инсулинорезистентность и способствует развитию вторичной резистентности к пероральным сахароснижающим средствам, составляющим основную фармакотерапевтическую группу для лечения СД II типа, потребность в новых эффективных и безопасных сахароснижающих лекарственных средствах очевидна (И.И. Балаболкин и др., 2005). В связи с этим идет интенсивный поиск как синтетических, так и растительных секретогенов, влияющих на физиологические механизмы высвобождения инсулина (М.Б. Анциферов, 2007).

чением инкретиномиметичекого действия, повышением секреторной активности и восстановлением морфологической структуры ß-эндокриноцитов (Т. Fushiki, 1992; Gymnema Lawrence Rev. 1993). Исходя из этого различные экстракты Гимнемы лесной могут являться основой для создания антидиабетических лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище.

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения». Тема утверждена на заседании Ученого Совета ВолГМУ (протокол № 1 от 10 февраля 2006 г.) и включена в план НИР.

Целью настоящего исследования является экспериментальное обоснование создания на основе экстракта Гимнемы лесной, проявляющего инкретиномимети-ческое действие, антидиабетических препаратов.

Основные задачи исследования:

1) изучение метаболических (гипогликемических, антиоксидантных, гемо-реологических) и антидиабетических свойств экстрактов Гимнемы лесной в зависимости от дозы и степени очистки;

2) исследование антиоксидантных и гемореологических свойств оптимизированной экстрактами девясила и гребней винограда Гимнемы-25 - наиболее активной фракции Гимнемы лесной;

3) углубленное доклиническое изучение антидиабетической Композиции на основе Гимнемы лесной с целью обоснования перспективы создания нового лекарственного препарата;

4) исследование панкреотропных механизмов антидиабетического действия Композиции;

5) изучение механизма экстрапанкреатических эффектов препарата;

6) исследование влияния препарата на процессы регенерации и апоптоза инсулинпродуцирующих клеток;

7) исследование фармакологических свойств биологически активной добавки к пище на основе Гимнемы лесной;

8) изучение токсикологических свойств Композиции и биологически активной добавки, созданных на основе Гимнемы лесной.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование влияния различных экстрактов Гимнемы лесной на функциональную активность и регенерацию эндокринных клеток поджелудочной железы, а также изучены механизмы секреции инсулина при экспериментальном сахарном диабете различной этиологии.

Впервые изучено влияние Гимнемы-25 на реологические свойства и тромбо-генный потенциал крови. Впервые проведен анализ уровня гипогликемической активности различных экстрактов Гимнемы лесной в зависимости от их дозы и степени очистки.

Выполнены доклинические исследования фармакодинамических свойств лекарственной Композиции на основе Гимнемы-25, проявившей выраженные антидиабетические свойства. Обоснована возможность создания антидиабетического препарата с инкретиномиметическим и экстрапанкреатическим механизмом действия.

Впервые проведена оценка пролиферативной активности р-эндокриноцитов при применении лекарственной Композиции и выявлена степень её антиапопто-генной активности.

Впервые изучены гипогликемические свойства биологически активной добавки к пище на основе Гимнемы-25 при моделировании метаболических расстройств (синдрома преддиабет), а также изучены её антиоксидантные свойства и влияние на реологические свойства крови.

Практическая значимость.

Результаты изучения уровня гипогликемической активности различных экстрактов Гимнемы лесной на интактных животных и на животных с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом позволили выявить наиболее активную фракцию Гимнемы лесной - Гимнема - 25, содержащую гим-немовые кислоты.

Результаты доклинических исследований позволили обосновать создание Композиции на основе Гимнемы-25 в виде лекарственного препарата (с добавле-

нием экстрактов гребней винограда и девясила) с антиоксидантными и гемореоло-гическими свойствами для применения в комплексной сахароснижающей терапии СДII типа и профилактики его отдаленных последствий.

Результаты доклинических исследований позволили обосновать создание биологически активной добавки к пище на основе Композиции (с введением мик-ронутриеков необходимых для стабилизации углеводного обмена: ванадия сульфата, цинка сульфата, хрома пиколината, магния сульфата, пиридоксина гидрохлорида), проявляющей антиоксидантные и гемореологические свойства для профилактики развития метаболических расстройств и поздних осложнений СД. На основании результатов клинических исследований БАД можно полагать об эффективности её использования в составе комплексной терапии у больных СД II типа.

Изучены показатели острой, хронической и специфических видов токсичности.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Экстракты Гимнемы лесной - перспективные вещества для создания противодиабетических препаратов, сочетающих гипогликемическую активность с антиоксидантными и гемореологическими свойствами.

2. Антидиабетическое действие Композиции на основе Гимнемы-25 (с добавлением экстрактов гребней винограда и цветков девясила) связано с её саха-роснижающим действием при экспериментальном стрептозотоцин, аллоксан-индуцированном, иммунозависимой форме СД, при латентной форме СД, инсули-норезистентности.

3. Композиция тормозит развитие апоптоза и способствует регенерации Р-эндокриноцитов при токсическом воздействии цитотоксинов на ткань поджелудочной железы.

4. Композиция на основе Гимнемы-25 нетоксична, оказывает комплексное антидиабетическое, антиоксидантное, гемореологическое действие.

5. БАД на основе Композиции оказывает гипогликемическое действие при экспериментальном метаболическом синдроме (предлиабет) и ожирении за счет глюкозостимулированного влияния на секрецию инсулина и потенцирования его действия, улучшения утилизации глюкозы периферическими тканями, снижения всасывания глюкозы и жирных кислот в кишечнике.

6. БАД в составе комплексной сахароснижающей терапии способствует улучшению состояния углеводного и липидного обменов, снижению инсулиновой резистентности и повышению активности антиоксидантной системы у больных СДII типа.

Реализация результатов исследования.

Система методических подходов к изучению и анализу антидиабетической активности экстрактов растений применяется при проведении исследований в лаборатории экспериментальной фармакологии ВИД РАМН и ABO, НИИ фармакологии ВолГМУ и кафедры фармакологии ВолГМУ. Биологически активная добавка к пище «Диабета» выпускается ООО «Экко Плюс» (Россия).

Результаты работы включены в лекционные курсы на кафедрах фармакологии, фармакогнозии и ботаники, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, на кафедрах фармакологии Кубанского, Саратовского и Ростовского государственных медицинских университетов.

Публикации н апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции», Волгоград, 2005; 4-ой Международной конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», «Подмосковье», 2006; XI Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Москва, 2006; XII и XIV Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство», Москва, 2006, 2007, 2008; I Международного съезда фитотерапевтов «Современные проблемы фитотерапии», Москва, 2006; II Всероссийской конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты эндокринопатий», Москва, 2006; V международного научно-практического конгресса «Человек в экстремальных условиях: Здоровье, надежность и реабилитации», Москва, 2006; 'The next line of defense' International conference on diabetes. Synergy and strategy, Анталия, Турция, 2007; III Съезде Фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; II Международной конференции "Химия, технология и медицин-

ские аспекты природных соединений", Алматы, Казахстан, 2007; Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения», Гродно, Беларусь, 2007; 63-й конференции по фармации, Пятигорская фармацевтическая академия, Пятигорск 2008; IV Всероссийском конгрессе диабе-тологов, Москва, 2008; симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» Москва, 2008; VII международной конференции «Гемореология и микроциркуляция. От функциональных механизмов в клинику», Ярославль, 2009.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 338 страницах машинописного текста, иллюстрирована 61 таблицами, 97 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы П-У), обсуждения результатов (глава VI), выводов и приложения. Список литературы включает 117 отечественных и 166 иностранных источника.

Материалы и методы исследования.

Проведено изучение фармакологической активности экстракта ГЛ (сырье поступало из КНР в виде высушенных листьев и сырого экстракта (№ сертификата анализа ОУМ-030706 от 1.06.03, КНР). В зависимости от разной степени очистки экстракта (выполненного в Российском НИИ здоровья по оригинальной методике) исследования проводились в 25%, 50%, 75% гравиметрических процентных концентрациях (далее Гимнема-25, Гимнема-50, Гимнема-75).

Изучены фармакологические свойства антидиабетической растительной Композиции (патент РФ № 2289419 от 20.12.2004) созданной на основе наиболее активной фракции Гимнемы-25 оптимизированной, в ранее не патентованных комбинациях, отечественными источниками биофлавоноидов - экстрактами гребней Винограда и Девясила высокого, как нового антидиабетического препарата с антиоксидантными и гемореологическими свойствами (табл. 1); и биологической добавке к пище (БАД), оказывающей влияние на углеводный обмен (табл. 2).

Исследования были выполнены на 3410 половозрелый нелинейных белых крысах обоего пола массой 210-330 гр., 20 белых беспородных крысах возрастом свыше 36 мес.; 160 белых беспородных крысах (до 3-х месячного возраста), мас-

сой 90 гр.; 100 белых неимбредных мышах обоего пола, массой 50 гр., 79 мышах гибридах Р| (СВАхС57ВЬ/6), массой 15-20 г.; 12 кроликах породы «Шиншилла» массой 4-4,5 кг; 15 собаках массой 8-12 кг и 60 морсхих свинках альбиносах, массой 250-300 гр, которые содержались в условиях вивария ВолГМУ с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, а также правил проведения доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351000.3-96 и 51000.4-96). Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе доклинических исследований ВолГМУ (протокол № 1 -2006 от 10.02.06).

Таблица 1

СОДЕРЖАНИЕ КОМПОНЕНТОВ В СОСТАВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА (КОМПОЗИЦИИ)

Название компонента Спецификация Масса, мг

Гимнема-25 GYM-030706 РНИИ «Здоровья» 160

Сухой экстракт Девясила ООО «Биохиммаш» 85

Сухой экстракт гребней Винограда R6BSE-030822 35

Всего: 280

Таблица 2

СОДЕРЖАНИЕ КОМПОНЕНТОВ В СОСТАВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ «ДИАБЕТА»

Название компонента Спецификация Масса, мг

Гимнема-25 GYM-030706 РНИИ «Здоровья» 80

Сухой экстракт Девясила ООО «Биохиммаш» 100

Сухой экстракт корня Солодки GK.E 030602 16

Сухой экстракт гребней Винограда R6BSE-030822 40

Пиридоксина гидрохлорид (витамин Вб) EAN 4601808000603 1,6

Магния сульфат CAS 7487-88-9 20

Цинка сульфат ГОСТ 4174-69 8

Хрома пиколинат ТУ-9318-001 -45370421 0,08

Ванадия сульфат CAS 123334-20-3 0,04

Всего (из расчета на 1 кг массы животного): 265,72

Примечание: биологически активные компоненты, которой включены в состав БАД в дозах, рекомендуемых СанПин РФ 2.3.2.1290-03 2003 г. для потребления в составе продуктов диетического питания (лечебно-профилактического) питания и БАД к пище (Методические рекомендации 2.3.1.191504) (В.И. Петров, A.A. Спасов и др., 2007).

В работе использовали: полный адъювант Фрейнда (Grand Island Biological Compani, USA), стрептозотоцин (Sigma, USA), аллоксан (Merck, США), глюкозу (ЧДА, Реахим, Россия), олеиновую кислоту (Chemapol, Чехия), натрия таурохолат

(Chemapol, Чехия), раствор Рингера (Хемофарм, Югославия), тиобарбитуровую кислоту (ТБК) (ICN Biomedicals, США), фосфорную кислоту (Реахим, Россия), люминол (Serva, Германия), сульфат железа (ЧДА, Украина), аскорбиновую кислоту (Chemapol, Чехия), 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) (Sigma, США), стрептозотоцин (Sigma, США), цитрат натрия (ЧДА, Реахим, Россия), фильтры SMWPO 5 мкм (Millipore, Франция), динатриевую соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) («Ренам», Венгрия), адреналин гидрохлорид ("Sigma", США), коллаген ("Sigma", США). В качестве препаратов сравнения использовали диабетон («Сервье», Франция), танакан (Beaufour Int., Франция), Pro-ß («PharmaTerra», США), инсулин «Актрапид НМ» («Ново-Нордиск», Дания); мальтоза (ЗАО «Век-тон, Россия), акарбоза («Bayer AG », Германия),

Уровень глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом («Глюкоза ФКД», Россия); гликозалированный гемоглобин методом катионно-обменной хроматографии низкого давления («Фосфосорб», Россия); концентрацию инсулина в плазме крови иммуноферментатквным способом (DRG, Австрия).

Изучение эффективности Композиции на толерантность к сахарной нагрузке проводили на моделях перорального (глюкоза в дозе 3 г/кг) (З.И. Цюхно и соавт., 1981; В.Г. Баранов, 1983) и внутривенного (глюкоза в дозе 1 г/кг) глюкозо-толерантных тестах (Masiello et al. 1998; Т.П. Бондарь, Г.И. Козинец, 2003) с оценкой результатов по A.B. Древаль (2005).

Гиперинсулинемию моделировали двукратным ежедневным подкожным введением инсулина «Актрапид MC» по O.E. Г'ордиенко, (1973). Для оценки состояния углеводного обмена использовали пероральный глюкозотолерантный тест, пробу Химсворда (З.И. Цюхно и соавт., 1981). Латентную форму стрептозото-цинового диабета моделировали преддиабетогенными дозами стрептозотоцина -35 мг/кг, в/брюшинно (Ю.М. Колесник, 1992; J. Duhault et al., 1998). Ожирение моделировали с использованием диеты (содержание жиров и углеводов более 80% от общей калорийности рациона) в течение месяца по И.А. Волчегорскому (2000).

Экспериментальные формы сахарного диабета (СД) моделировали: амок-сан-индуцированный СД - аллоксаном, 120 мг/кг, в/брюшинно (К. Srinivasan, Р. Ramarao, 2007); стрептозотоцин-индуцированный СД - стрептозотоцином 45

мг/кг, в/в (К. Srinivasan, P. Ramarao, 2007); илшуннозависимый СД - полным адью-вантом Фрейнда 0,2 мл однократно, п/к, и стрептозотоцином 25 мг/кг, в/в, ежедневно в течение 5 дней (В. Ziegler et al., 1990). Изучение влияния препаратов, на эффекты экзогенно введенного инсулина у панкреатэктомированных собак проводили по схеме В.A. Houssay (1960).

Морфологическое исследование' поджелудочной железы крыс проводили по общепринятым гистологическим методикам (Э.С. Северигина, 2002; В.Н. Эллини-ди, 2002) с оценкой размеров ядер р-клеток и площади, занимаемой а- р-клетками, размеров и объемной доли островка Лангенгарса (ОЛ) по отношению к экзокрин-ной части органа. Пролиферативную активность Р-клеток OJI оценивали по количеству митозов с помощью моноклональных антител к ядерному антигену про-лиферирующих клеток (PCNA, Lab Vision, США) и Ki-67 (Lab Vision, США). Для выявления процессов апоптоза использовали поликлональные антитела к Вах (BD Biosciences Pharmingen) и к каспазе-3 (Lab Vision, США); и моноклональные антитела к Р53 (Lab Vision, США) и к Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, США). Визуализировали непрямым иммунопероксидазным методом с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов no С.В. Петрову, Н.Т. Райхлину (2004). Анализ морфологических показателей проводили с использованием фотокаме-ры«Сапоп», Japan, 5.0 мегапикселей на базе микроскопа «Axiostar plus», Германия (объектив х40, хЮО и окуляр х10), при этом оценивали количество иммунопози-тивных клеток к общему количеству клеток ОЛ.

Действие препаратов на всасывание мальтозы в кишечнике оценивали по Н. Luo (2001). Изучение влияния препаратов на всасывание глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике проводили по F. Wang et al. (1998) при постоянной перфузии тонкого кишечника крыс, определяя концентрацию олеиновой кислоты по G. Duncombe (1962).

Степень утилизации глюкозы поперечно-полосатой мышечной тканью крыс оценивали по Г.П. Дудченко (2001). Влияние изучаемых веществ на массу тела

1 Исследования выполнены на базе кафедры патологической анатомии ВолГМУ. Выражаем искреннюю благодарность член-корр. РАМН, проф. ¡В.Б.Писареву! и доценту, к.м.н. Снигуру ГЛ. за помощь в проведении исследований.

фиксировали на фоне 4-х недельного принудительного плавания животных с алиментарным ожирением по И.А. Волчегорскому (2000).

Влияние изучаемых веществ на реологические свойства крови определяли по следующим показателям: вязкость крови (H.A. Добровольский, 1989), индекс агрегации эритроцитов (L. Dintenfass, 1989), индекс эффективности доставки кислорода (В.В. Якусевич, 1998), скорость фильтрации эритроцитарной взвеси, кислотную (И.А. Терской, 1967) и осмотическую резистентность эритроцитов (Т. Osaka, 2001), заряд и вязкость мембраны эритроцитов с использованием зондов ДСМ+ и ДСП"6 (В.Г. Добрецов, 1989).

Изучение влияния веществ на агрегацию тромбоцитов проводили по методу G. Вот (1962), З.А. Габбасов (1989) с использованием индуктора агрегации АДФ («Reaiial», Венгрия) в конечной концентрации 5 мкМ. Хронометрически на гемокоагулометре «SOLAR» определяли коагулографические показатели: ПРВ, ТВ, ФГ, АПТВ с использованием стандартных наборов и классических методик (З.С. Баркаган, 1999).

Антиоксидантные свойства веществ изучали с помощью моделей: аскор-бат-зависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ) (В.З. Ланкин и соавт., 1975), взаимодействия со стабильным свободным радикалом ДФПГ (G. Glavind, 1963) и хемилюминесценции (ХЛ) в системе железо (II) индуцированого окисления люминола с генерацией активных форм кислорода (АФК) (С.Г. Семешко, P.P. Фархутдинова, 2002).

Концентрации ХСобщ и ТГ определяли в сыворотке крови, а ХС ЛПВП в су-пернатанте после преципитации ЛП, содержащих ЛПОНП и ЛПНП, с использованием ферментативного колориметрического теста GPO-PAP («Biocon», Германия), и вычисляли значение концентрации ХС ЛПНП (W.T. Friedewald,1972) и индекс атерогенности (ИА) (А.Н. Климов, 1977). Эксперименты по изучению острой и хронической токсичности2, а также специфических видов токсичности3: эмбрио-

1 Исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории лекарственной токсикологии НИИ фармакологии ВолГМУ под руководством д.б.н. Л И. Бугаевой, за что выражаем

искреннюю признательность.

3 Выражаем искреннюю признательность за проведете исследований сотрудникам НИИ фармакологии РАМН под руководством д.м.н., проф. А.Д. Дурнева.

гонадотоксичности; иммунотоксичности, аллергенности, мутагенности проводились в соответствии с методическими рекомендациями проведения доклинических (токсикологических) исследований (Р.У. Хабриев и соавт., 2005) и правилами лабораторной практики в РФ (приказ № 267 от 19.07.2003 г).

Статистическую обработку данных проводили параметрическими и непараметрическими методами анализа (С. Гланц, 1998) с использованием пакета прикладных пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, США).

Результаты исследования и их обсуяздение.

Согласно результатам проведенных исследований, экстракт Гимнемы лесной (ГЛ) оказывает сахароснижающии эффект в организме интактных животных. При этом различные фракции данного экстракта проявляют неодинаковое гипог-ликемическое действие.

При изучении уровня ги-погликемической активности экстрактов ГЛ в трех концентрациях Гимнема-25, Гимнема-50, Гимне-ма-75, отличающихся друг от друга содержанием ГК и гимнемоса-понинов было выявлено, что саха-роснижающее действие Гимнемы-25 превосходит остальные фракции изучаемого экстракта (рис. 1), уступая по величине активности диабетону. Так было выявлено, что Гимнема-25 через 30 минут после введения снижает уровень глюкозы на 21,6% по сравнению с исходными показателями, а ко второму часу наблюдений уровень гликемии уменьшается на 23,9% (р<0,05).

Кроме того при проведении глюкозотолерантных тестов Гимнема-25 снижает площадь под кривой «концентрация глюкоза-время» на 26,7% (р<0,05) по отношению к значениям контрольной группы животных.

50%

-диабете«

Рис.1. Влияние Гимнемы-25, Гимнемы-50, Гимнемы-75 при пероральном введении в дозе 280

мг/кг и диабетона (10 мг/кг) на уровень глюкозы В

крови интактных крыс (м ± ш). Примечание. Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины. * - данные достоверны по отношению к контролю, парный критерий Стьюдента, (р<0,05)

При изучении зависимости «доза-эффект» (рис. 2) у Гимнемы-25 регистрируется усиление гипогликемиче-

ского эффекта в диапазоне от 70 мг/кг до 280 мг/кг. В ходе исследования для Гимнемы-25 была установлена средняя эффективная доза (280 мг/кг), при применении которой наблюдается снижение глюкозы в крови на 1/3 от исходных показателей.

Таким образом, величина гипогликемического эффекта в значительной мере зависит от сте-

доза (мг/кг)

диабета

1« as да па

Гимнеиа 25

Yf.....t

Нн

Рис. 2. Влияние Гимнемы-25 и диабетона при перо-ральном введении в различных дозах на уровень глюкозы в крови интактных крыс через 2 часа после введения веществ. Примечание. Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины.

пени очистки экстракта, снижаясь в ряду: Гимнема-25>Гимнема-50>Гимнема-75.

При исследовании антидиабетического действия экстрактов у животным с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным СД наблюдалось снижение содержания глюкозы в плазме крови во всех экспериментальных группах (табл. 3). При этом эффективность Гимнемы-25 оказалась достоверно выше таковой у Гим-немы-50 и Гимнемы-75 в 1,5 раза и в 3,4 раза, соответственно.

Таблица 3

ВЛИЯНИЕ ГИМНЕМЫ-25, ГИМНЕМЫ-50, ГИМНЕМЫ-75 (280 мг/КГ) и ДИАБЕТОНА (8 мг/кг) ПРИ ОДНОКРАТНОМ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ НА УРОВЕНЬ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ СТРЕПТОЗОТОЦИН-ИНДУЦИРОВАННЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ.

Препарат Изменения гликемии, Д%

Гимнема-25 -45,27±5,40**

Гимнема-50 -26,18±7,29*'

Гимнема-75 -13,52±4,47*

диабетон -52,59±9,88**

Обозначения. ♦ - данные достоверны по отношению к исходным значениям данной группы, (р<0,05), Меритерий Стьюдента. * - данные достоверны по отношению к контрольной группе крыс с экспериментальным сахарным диабетом, (р<0,05) Newman-Keuls test.

Примечание. Изменения приведены в процентах относительно исходных данных через 2 часа после введения веществ.

Показатели утилизации глюкозы при применении Гимнемы-50 и Гимнемы-75 уступали показателям активности Гимнемы-25 в ходе проведения пероралъного глюкозотолерантного теста. Так через 30 мин после внутрижелудочного введе-

ния Гимнемы-25 регистрировалось уменьшение уровня гликемии на 11,9% по сравнению с контролем-диабет, а спустя час после введения глюкозы ее уровень в крови понизился в 2,5 раза по сравнению с контрольными значениями. При исследовании образцов крови второго часа было выявлено, что уровень глюкозы в крови крыс, получавших Гимнему-25, составил 4,6±0,11 ммоль/л, что существенно ниже значений полученных для группы контроль-диабет. Подобные результаты были получены и в двух других экспериментальных группах (Гимнема-50 и Гим-нема-75). При этом гипогликемическая активность Гимнемы-50 превалировала над таковой Гимнемы-75, и ко второму часу наблюдения содержание глюкозы понизилось на 20,7% и на 6,2% (р<0,05), соответственно по сравнению с группой контроль-диабет. Кроме того, было зарегистрировано достоверное сокращение площади под кривой концентрация «глюкоза-время» на 32,4% в группе крыс получавших Гимнему-50, и на 13,3% у животных с Гимнемой-75 по сравнению с контролем. Таким образом, показатели утилизации глюкозы при применении Гимнемы-50 и Гимнемы-75 значительно уступали показателям активности Гимнемы-25.

При проведении внутривенного глюкозотолерантного теста было установлено, что Гимнема-25 по выраженности действия на элиминацию глюкозы из периферического кровотока, превосходит Гимнему-50 и Гимнему-75. Гимнема-25 увеличивала площадь под кривой «глюкоза-время» в 2 раза по сравнению с контролем, что больше аналогичного показателя, выявленного после применения Гимнемы-50 и достоверно превышает этот же показатель в группе, получавшей Гимнему-75. Таким образом, установлено, что после применения экстрактов ГЛ происходит умеренное сдерживание показателей гликемии. Однако по величине гипогликемической активности Гимнема-50 и Гимнема-75 уступают эффективности Гимнемы-25.

В ходе изучения механизма антидиабетического действия Гимнемы-25 были проведены эксперименты по изучению её влияния на: секрецию инсулина; на пролиферацию р-клеток островков Лангерганса; на утилизацию глюкозы мышечной тканью крыс (изолированной диафрагмой); на транспорт глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике крыс.

При экспериментальном стрептозотоцин-индуциро ванном СД у крыс регистрировалось снижение содержания инсулина в плазме крови (рис. 3), так через 3 недели эксперимента его количество достоверно уменьшилось в группе крыс с диабетом на 32,2% (р<0,05). А в группе крыс, получавших Гимнему-25, уровень инсулина понизился лишь на 18,7% по сравнению интактным контролем.

Таким образом, было установлено, что Гимнема-25 при 3-х недельном введении восстанавливает секрецию инсулина до исходных значений у интактной группы животных. Поэтому вполне вероятно полагать, что увеличение уровня инсулина в крови животных под влиянием Гимнемы-25 связано с восстановлением р-клеток поджелудочной железы крыс или с меньшей степенью их деструкции, следует отметить, что аналогичные эффекты были выявлены Ь. 1л (Ь. У й а!., 2004) для спиртового экстракта Гимнемы лесной. Кроме того, выявленное нарастание количества инсулина в крови подопытных животных, сочетающееся с сахаропонижающим эффектом, вероятно может явиться прямым доказательством инсули-нотропного эффекта Гимнемы-25, возможно основанного на стимулировании функционально способных Р-клеток островков Лангерганса.

Известно, что баланс клеточной популяции поддерживается благодаря равновесию процессов регенерации и клеточной гибели (8.Е ТашНатесН-СЬеггасП, 2003). Гимнема-25 при приёме в течение 1 недели способствует развитию умеренно выраженной гипертрофии ядер Р-клеток островкового аппарата поджелудочной железы у интакгных животных (табл. 4). Так отмечалось увеличение ядер Р-эндокриноцитов в 1,4 раза в дуоденальном отделе, в 1,3 раза в желудочном отделе и в селезеночном отделе по сравнению с группой контроля.

Интакгкые

Диабет

Диабет 1-Гимнема-25

Рис. з. Влияние Гимнемы-25 (280 мг/кг) на содержание инсулина в крови крыс с стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом (м ± ш). Примечание. Вергиканьные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины. * - данные достоверны по отношению к интактной группе крыс. 0 - данные достоверны по отношению к группе крыс с сахарным диабетом. ANOVA, Nevvman-Keuls test (р<0,05).

Таблица 4.

влияние гимнемы-25 на изменение структуры островков лангерганса поджелудочной железы крыс с стрептозотоцин-индуцигованным сахарным диабетом (м ± т).

Группы Объемная доля островков, % Площадь ядер Р-клеток, мкм2 Р-клетки, % а-клетки, %

Дуоденальный отдел

Контроль 6,8±2,5 . 22,3±2,5 51,3±9,2 47,4±5,2

сахарный диабет 4,7±3,1 23,8±3,1 29,8±5,5* 50,9±4,8

сахарный диабет + Гимнема-25 7,2±5,4 21,5±4,1 47,1 ±4,2* 44,1 ±4,7

Желудочный отдел

Контроль 12,6±6,0 23,3±3,1 64,6±9,1 31,2±3,5

сахарный диабет 10,2±6,7 25,7±2,5 43,2±5,4« 42,7±4,8

сахарный диабет + Гимнема-25 13,5±9,8 24,6±4,1 62,7±5,2* 35,8±3,7

Селезеночный отдел

Контроль 13,8=Ы7,3 25,1±2,5 78,2±б,1 20,2±3,4

сахарный диабет 11,8±10,5 29,5±2,2 47,7±8,2* 30,3±4,7

сахарный диабет + Гимнема-25 14,77±12,2 25,8±4,1 75,4±7,3* 23,5±3,7

Примечание. * - данные достоверны по отношению к интактному контролю, парный критерий Стью-дента (р<0,05).

У животных с СД получавших Гимнему-25 объемная доля островков была в 1,5 раза выше аналогичного показателя в группе крыс с СД. При этом площадь ядер Р-клеток не отличалась от того показателя в группе интактных крыс и в группе животных с диабетом, однако количество р-клеток на 36,7% (р<0,05) превышало аналогичный показатель в группе животных с СД. Вероятно это можно объяснить возможной гиперфункцией р-клеток за счет повышения уровня эндогенного инсулина и за счет регенерации р-клеток поджелудочной железы. Подтверждением этому является увеличение уровня экспрессии маркера пролиферации РСЫА при иммунозависимом СД у крыс, что, скорее всего, является свидетельством наличия репаративных процессов в ткани поджелудочной железы, который косвенно подтверждается умеренной экспрессией К>67. Кроме того, в группе животных с иммунозависимым диабетом получавших Гимнему-25, отсутствовали морфологические признаки апоптоза, о чем свидетельствует выявленный низкий уровень экспрессии р53 (ключевой фермент каскадного цикла участвующий в протеолизе белков цитоплазмы и ядра клетки) и каспазы 3 (маркер активации «апоптоза изнутри»). Возможно, что Гимнема-25 способствует регенерации эндокриноцитов поджелудочной железы, за счет стимуляции клеток гастроэнтеропанкреатической системы, вырабатывающих ИЛМ и С31Р. Полученные результаты вполне согласуются с литературными данными о способности инкретинов не только увеличи-

вать уровень секреции инсулина, но и снижать скорость апоптоза [3-эндокриноцитов, а также стимулировать их пролиферацию (гикЫк! « а!.. 1992).

Действие Гимнемы-25 на утилизацию глюкозы изолированной диафрагмой у животных с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным СД изучалось при курсовом пероральном применении изучаемого экстракта в дозе 280 мг/кг в течение месяца. В группе крыс с стрептозотоцин-индуцированным СД получавших Гимнему-25, способность мышечной ткани к поглощению глюкозы в 1,9 раза превышает аналогичный показатель у животных группы контроля (рис. 4) и соответствует снижению ее количества в пробе на 16,2% (р<0,05). В присутствии инсулина остаточная глюкоза определяется в количестве 6,9 ммоль/л, что соответствует достоверному снижению ее уровня ка 32,1% по отношению к контрольной пробе (буфер + инсулин).

Таким образом, экспериментально установлено, что Гимнема-25 в дозе 280 мг/кг при применении в течение 30 дней увеличивает коэффициент поглощение глюкозы изолированной диафрагмой крыс.

При этом эффективность Гимнемы-25 в среде без инсулина может свидетельствовать о прямом воздействии экстракта на транспортную систему утилизации глюкозы.

При исследовании влияния Гимнемы-25 на транспорт глюкозы и олеиновой кислоты при перфузии кишечника крыс было выявлено, что Гимнема-25 в дозе 280 мг/кг достоверно ингибирует всасывание глюкозы в 1,7 раза через 15 мин, и в 4,7 раза (р<0,05) через 30 минут после начала перфузии (рис. 5А). Вероятно, что в данном случае замедление скорости всасывания глюкозы обусловлено специфическим воздействием ГЛ на скорость диффузии глюкозы через слизистую оболочку

3.5

К S л 3,0

X 5 2,5

=Г ® 1 # 2.0

HI 1,5

III 1.0

3" о П £ 0,5

-е- 1

-0- 5 0,0

о ^

Е1Б+Д ОБ+Д+И

Рис. 4. Влияние Гимнемы-25 (280 мг/кг) при пероральном введении на поглощение глюкозы изолированной диафрагмой крыс со стрептозотоцин-индуцированным СД (М ± in). Обозначения. Б+И=буфер+инсули^Б+Д-буфер4- диафрагма; Б+Д+И=буфер+диафрагма+инсулин

Примечание. Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины. *- данные достоверны по отношению к контрольной группе крыс, Newman-Keuls test (р<0,05).

кишечника и может быть инициировано супрессией зависимого транспорта глюкозы. Так Б. УояЫока (Б. УовЫока е( а!., 1986) указывает на то, что это способствует поддержанию более низкой внутриклеточной концентрации Ыа+, которая является движущей силой для углеводов, поступающих в клетки из полости кишечника.

(А) глюкоза (Б) олеиновая кислота

Оипашь» •Гныиеиа-25 * Оитктиые (Гашиш-Я

Рис. 5. ВЛИЯНИЕ ГИМНЕМЫ-25 (280 МГ/КГ) ПРИ 7 ДНЕВНОМ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ НА ВСАСЫВАНИЕ ГЛЮКОЗЫ (А) И ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (Б) ПРИ ПЕРФУЗИИ КИШЕЧНИКА ИНТАКТНЫХ КРЫС (М ± ш). Обозначения. * - данные достоверны по отношению к контролю, парный критерий Стьюдента

(р<0,05)

Примечание. Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины.

Процесс абсорбции олеиновой кислоты (рис. 5Б) был несколько медленнее чем аналогичный процесс в случае глюкозы. Уровень всасывания этой ненасыщенной жирной кислоты в группе Гимнема-25 через 15 минут перфузии достоверно превышал контрольные значения в 2 раза. Однако в течение следующего временного интервала наблюдения абсорбция этой кислоты в кишечнике несколько замедлялась, при том, что количество глюкозы в этот же интервал сократилось. Это по мнению Н. 1,ио (Н. !_.ио сЧ а1., 2001) может зависеть от того, что растворенная в таурохолате олеиновая кислота легко проникает через мембрану энтероцита, а также от высокой скорости абсорбции жирной кислоты на транспортёре (40-Ша белок), который, имея высокую степень сродства со многими видами длинноцепо-чечных жирных кислот, индифферентен к глюкозе.

В ходе работы показано, что, Гимнема-25 оказывает дозозависимое влияние (при непосредственном добавлении в перфузат) на всасывание глюкозы и олеино-

вой кислоты, при этом по ингибирующей активности Гимнема-25 в дозе 0,5 мг/л превалирует над таковой в дозе 0,25 мг/л. При изучении продолжительность периода восстановления всасывания глюкозы и олеиновой кислоты было выявлено, что 6-ти часовой период является необходимым для достижения полного восстановления всасывания глюкозы и олеиновой кислоты.

На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что Гимнема-25 в дозе 280 мг/кг при курсовом 7-ми дневном введении ингибирует всасывание в кишечнике крыс глюкозы и олеиновой кислоты, при этом способность к их утилизации полностью восстанавливается через 6 ч после отмены препарата.

При изучении фармакологических свойств Гимнемы-25, необходимых для профилактики отдаленных последствий сахарного диабета были изучены анти-оксидантные свойства Гимнемы-25, а также её влияние на реологические свойства и тромбогенный потенциал крови. Так было выявлено, что Гимнема-25 снижает образование ТБК-реактивных продуктов на 82,53% (р<0,001) у животных с СД. При сравнении активности веществ по величине константы ингибиро-вания ИК50 на модели аскорбат-индуцируемого ПОЛ выявлено, что Гимнема-25 оказывает 50% эффект в значительно меньших дозах по сравнению с танаканом. Также Гимнема-25 при курсовом введении достоверно снижает количество КД в красных клетках крови, при этом несколько уступая по эффективности препарату сравнения танакану. Установлено, что после применения Гимнемы-25 особенно низкий уровень МДА (на 12,2%, р<0,05, по сравнению с контролем-диабет) отмечается в эритроцитах. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Гим-нема-25 проявляет антиоксидантные свойства, влияя на образование как начальных, так и конечных продуктов перекисного окисления и несколько увеличивая активность антиоксидантных ферментов в плазме крови крыс с экспериментальным СД, уступая по эффективности танакану.

Гимнема-25 оказывает влияние на реологические свойства крови снижая ей вязкость во всём диапазоне скоростей сдвига (300 - 10 с"1), однако наибольшая эффективность экстракта была выявлена на низких скоростях сдвига (в 1,5 раза меньше по сравнению с контролем). Кроме того Гимнема-25 оказывала влияние

на деформабельность эритроцитарной мембраны (достоверно увеличивала скорость фильтрации взвеси эритроцитарной суспензии на 37,9% и повышала индекс доставки кислорода в ткани на 21,3%), а также увеличивала заряд эритроцитарной мембраны (повышала интенсивность флуоресценции зонда ДСМ+ в эритроцитарной взвеси в 1,4 раза по сравнению с контролем). Таким образом, по полученным результатам, можно заключить, что Гимнема-25 улучшает реологические свойства крови.

О влиянии Гимнемы-25 на тромбогенный потенциал крови, свидетельствует уменьшение реакции тромбоцитов на индуктор агрегации АДФ и снижение величины индекса агрегации тромбоцитов (ИАТ) в 2 раза (по сравнению с контролем) превосходящей по эффективности танакан, после курсового введения Гимнемы-25.Однако при этом не отмечено существенного влияния Гимнемы-25 на показатели коагуляционного гемостаза. Снижение уровня агрегации тромбоцитов, может свидетельствовать об уменьшении их функциональной активности, что, в конечном счете, препятствует развитию сосудистых поражений при СД (М.И. Балаболкин и др., 2005).

По результатам проведенных исследований можно констатировать, что Гимнема-25 эффективно снижает уровень глюкозы в крови, и не уступает по величине эффекта другим экстрактам, полученными с помощью различных запатентованных методов водно-спиртовой экстракции, описанными в литературе (К. Baskaran et al., 1990; E.R. Shanmugasundaram et ai„ 1997; J.F. Gent et al., 1999).

Кроме того, Гимнема-25 восстанавливает структурную целостность инсу-лин-продуцирующих клеток поджелудочной железы, повышает утилизацию глюкозы мышечной тканью крыс, задерживает всасывание углеводов и олеиновой кислоты в кишечнике, при экспериментальных формах СД снижает уровень глюкозы в крови, улучшает реологические свойства крови и уменьшает выраженность процессов пероксидации.

Таким образом, на основании полученных результатов исследования можно сделать вывод о том, что Гимнема-25 может быть использована для создания на её основе лекарственного препарата и биологически активной добавки к пище.

ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ (КОМПОЗИЦИЯ)

Учитывая то, что Гимнема-25, оказывая умеренную антиоксидантную активность, предотвращает увеличение ПОЛ преимущественно в эритроцитах, проявляет умеренное влияние на реологические свойства крови на следующем этапе работы было сочтено возможным оптимизировать Гимнему-25 в ранее не патентованных комбинациях отечественными источниками биофлавоноидов - экстрактами гребней винограда и девясила высокого с целью создания растительной Композиции (патент РФ№ 2289419 от 20.12.2004 г), позиционируемой как потенциальный антидиабетический лекарственный препарат с антиоксидантными и геморео-логическими свойствами. В ходе работы было изучено более 20 различных комбинаций перечисленных компонентов в различных сочетаниях и дозах (отчёт СКС «Альянс» от 2.08.2005), наиболее эффективная из них Композиция была выбрана для дальнейшего исследования (табл. 1).

В настоящее время недостаточно средств, с помощью которых возможно произвести направленную блокаду механизмов деструкции (3-клеток, приводящих к развитию СД. Выбор экстракта Девясила высокого был обусловлен тем, что в основе его механизма действия лежит усиление продукции регуляторных цитоки-нов при аутоиммунном диабете, снижается уровень у-интерферона, и соответственно, повреждающее его действие на клетки поджелудочной железы, уменьшается деструкция клеток, нормализуется уровень инсулина в крови (КоЬауаэЫ Т., 2002). Сухой экстракт девясила способствует, в комплексном лечении, устранению нарушения толерантности к глюкозе и оптимизации ее метаболизма, обладает превентивным действием на деструктивный процесс в поджелудочной железе (Уа-пипкЫпа, Е., е! а! 1997; Эе Яооэ, й а1. 2000). Сухой экстракт гребней Винограда, включенный в состав Композиции, призван корректировать течение сахарного диабета, предупреждать необратимые метаболические изменения за счет действия растительных биофлавоноидов. Полифенолы винограда выступают в роли активных антиоксидантов, которые способны ингибнровать цепные свободно-радикальные реакции, снижать активность оксидативных ферментов и уменьшать концентрацию пероксидных липидов в плазме крови (У. МЬЫка\уа й а1.1976), что является одним из главных механизмов их лечебно-профилактического действия.

В ходе работы гипогликемический эффект Композиции был обнаружен на интактных животных разных видов (крысы, собаки). По результатам проведенных экспериментальных исследований Композицию можно отнести к средствам, оказывающим ги-погликемическое действие при этом по величине эффекта она незначительно уступала диабе-тону (рис. 6). В свою очередь антидиабетический эффект Композиции был изучен на животных с экспериментальным стрептозо-тоцин-, аллоксан-индуцирован-ным СД и иммунозависимой формой СД.

При исследовании продолжительности действия Композиции у крыс со стрептозотоцин-индуцированным СД было выявлено, что эффект наступает через 30 минут после введения препарата и его действие прослеживается на протяжение

20 часов, что в принципе соответствует длительности гипог-ликемического действия, оказываемого производными суль-фанилмочевины (рис. 7).

Кроме того при проведении глюкозотолерантных тестов было показано, что Композиция увеличивает скорость утилизации глюкозы из периферического кровотока, что может быть, в том числе, связано и с повышением секреции инсулина. Этот факт нашел свое подтверждение в экспериментах по изучению секретогенной активности Композиции на интактных

О 10 20 40 70 1«0 2S0 560 Ш0

Рис.6. ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИИ И ДИАБЕТОНА ПРИ ОДНОКРАТНОМ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИЕ В РАЗЛИЧНЫХ ДОЗАХ НА УРОВЕНЬ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ ИНТАКТНЫХ КРЫС Примечание. * - данные достоверны по отношению к исходным значениям до введения препарата, ANOVA (Newman-Keuls test) (р<0,05).

Рис. 7. Зависимость концентрации глюкозы в крови от времени после перорального введения Композиции (280 мг/кг) крысам с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сд (м ± т). Примечание. Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины

собаках по характеру изменения (увеличения) содержания инсулина и (снижения) глюкозы в плазме крови (рис. 8). А в серии опытов при совместном введении исследуемых веществ с физиологическим стимулятором секреции гормона - глюкозой, было установлено усиление панкреотропного действия Композиции.

-ч

С и не, мкЕД.'|ил

Д.

_____

—{

60 120 180 240 300 360 420 480 540

240 300 Эй) 420 480 540

Рис. 8. ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИИ (280 МГ/КГ) НА УРОВЕНЬ ГЛЮКОЗЫ (А) И ИНСУЛИНА (Б) В КРОВИ ИНТАКТНЫХ СОБАК (М ± ш) Примечание. Вертикальные иприхи соответствуют стандартной ошибке средней величины

Принимая во внимание патофизиологические особенности экспериментальных моделей ожирения, инсулинорезистентности и латентного стрептозото-цин-индуцированного диабета, на которых была проведена другая серия исследований, можно заключить, что Композиция проявляет антидиабетическое действие при преддиабетических состоя- м^шипл контроль

ниях (рис. 9).

В качестве основного критерия данной тенденции может служить снижение площади под кривой «концентрация глюкоза-время» в ходе проведения глюкозотолерантных тестов на 18,3% (р<0,05) при ла-

ТРНТНПЙ гЬппмр Г Л ня 96 7% Рис. 9. ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИИ (280 МГ/КГ) И ДИАБЕТО-

тентнои форме сд, на ¿ь,//о на (8 мг/кг) на уровень глюкозы в крови крыс с

9 /.Й-Ъ I .У1 \1

______.5-3 « / ткжоза время, ми

g-i-rrT.--.~- . ~3-

-120 -90

(р<0,05) при ожирении, при ин-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ОЖИРЕНИЕМ ПОСЛЕ ПЕРОРАЛЬНОЙ НАГРУЗКИ ГЛЮКОЗОЙ (3 Г/КГ) (М ± т) сулинорезистентности на 34 9% Примечание. Вертикальные иприхи соответствуют стан' даргной ошибке средней величины (р<0,05) по сравнению с контрольной группой крыс.

Улучшение утилизации глюкозы в данном случае видимо, свидетельствует о восстановлении нормальной секреции инсулина, т.к. нарушенная толерантность к углеводам при использовании данных модели патологии углеводного обмена, опосредована именно дисфункцией р-эндокриноцитов (Ю.Г. Ярошевский, 1979). Ан-тигипергликемический эффект у крыс с экспериментальным синдромом инсули-норезистентности подтверждает присутствие у Композиции помимо панкреотроп-ного действия, экстрапанкреатичесмгх эффектов.

По результатам проведенных исследований Композиция проявляла выраженное антидиабетическое действие на моделях аллоксанового (рис. 10), стрептозото-цин-индуцированного (рис. 9) и иммунозависимой форме СД (рис. 11) - уменьшая

Рис. 10. ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИИ НА

Рис. 11. ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИИ и

КОНЦЕНТРАЦИЮ ГЛЮКОЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ГИМНЕМЫ-25 НА КОНЦЕНТРАЦИЮ ГЛЮКОЗЫ КРЫС ПРИ АЛЛОКСАН-ИНДУЦИРОВАННОМ в ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС ПРИ

СД (М ± ш) ИММУНОЗАВИСИМОМСД(М±ш)

выраженность гипергликемии, полидипсии, потери массы тела, снижая уровень НЬЛ1 (на 3,9%) и стимулируя секрецию инсулина. Учитывая, что в эксперименте снижение содержание НЬд1С регистрируется одновременно с уменьшением количества сахара в крови, и так как оба эти процесса находится в прямой зависимости друг от друга, можно предположить, что применение Композиции способствует нормализации углеводного обмена. Уменьшение скорости гликозилирования белков при применении препарата, в конечном счете, может привести к замедлению образования продуктов конечного гликолиза. Принимая во внимание, что большое количество последних совместно с избытком свободных радикалов вызывают дисфункцию эндотелия, инициируя тем самым развитие ангиопатий, эффекты, выяв-

'ленные при применении Композиции, могут способствовать снижению вероятности возникновения изменений в микроциркуляторном русле и отдаленных последствий С Д. При СД II-типа нарушения углеводного обмена сочетаются с выраженными изменениями липидного обмена (М.И. Балаболкин и др., 2005). Регистрируемая, при курсовом применении Композиции, нормализация липидного спектра крови животных - снижение уровня ХСобщ, ЛПНП и ЛПОНП, а также следует выделить достоверное снижение ИАТ на 47,4%, уменьшает риск изменений морфологической структуры сосудов и возникновения микро и макроангиопатий, ингибированию ли-потоксичности, а значит, по всей видимости, препятствует явлениям цитотоксичности -неизбежным при нарушениях липидного обмена.

При исследовании механизмов действия многокомпонентного препарата (рис. 12), в частности его экстрапанкреатических эффектов, было установлено, что Композиция пролонгировала сахароснижающее действие экзогенного инсулина, введенного панкреатэкто-мированным собакам, усиливая его эффект и удлиняя время, в течение которого уровень глюкозы снижался.

При подробном рассмотрении процессов, лежащих в основе экстрапанкреатических эффектов ГЛ, на переднем плане также фигурируют механизмы, затрагивающие всасывание глюкозы в тонком кишечнике и повышение уровня её утилизации, и абсорбцию олигосахаридов и жирных кислот в кишечнике. Одним из таких механизмов действия Композиции является улучшение утилизации глюкозы мышечной тканью - изолированной диафрагмой крыс (рис. 13). В группе крыс получавших Композицию, способность мышечной ткани к поглощению глюкозы в

Рис. 12. Влияние Композиции (280 мг/кг) и диабетона (8 мг/кг) на гипогликемическое действие инсулина (0,4 НД/кг) в опытах на панкреатэктомированных собаках (м + ш). Обозначения. Вертикальные штрихи соответствуют стандартной ошибке средней величины. * - данные достоверны по отношению к группе собак, получавших только инсулин, ANOVA, Newman-Keuls test (р<0,05). Примечание. Контрольной группе животных производилось введение только инсулина, опытной - введение инсулина и одного из препаратов.

1,9 раза превышает аналогичный показатель у животных группы контроля и соответствует снижению ее количества в пробе на 16,2% (р<0,05). В присутствии саха-

роснижающего гормона остаточ-

□ Контроль

ä Композиция

л 9. 2.00

I Г 1,60

X X 1.20

'У X

3 0,80

0.40

0,00

буфер+Д

буфер+Д+И

ная глюкоза определяется в количестве 6,9 ммоль/л, что соответствует снижению ее уровня на 32,1% (р<0,05) по отношению к контрольной пробе с буфером и инсулином, что, по-видимому, связано с усилением действия инсулина.

При исследовании способ-

Рис. 13. Влияние Композиции (280 мг/кг) на поглощение глюкозы изолированной диафрагмой крыс (м ± ш). Обозначения. По оси абсцисс - буфер+диафрагма; бу-фер+диафрагма+инсулин. Примечания. Вертикальные штрихи соответствуют НОС'ГИ КОМПОЗИЦИИ ВЛИЯТЬ на про-стандартной ошибке средней величины. * - данные

достоверны по отношению к контрольной группе крыс, цессы всасывания глюкозы из ки-Newman-Keuls test (р<0,05).

шечника крыс при проведении постоянной перфузии (рис. 14) было выявлено, что Композиции снижает уровень всасывания глюкозы на 26,3% в 1-й аликвоте (через 15 мин от начала манипуляции) и достоверно сокращает количество поглощенной глюкозы в 4 раза по сравнению с контрольными значениями

в аликвотах второго временного оинтактные вГмнема-25 акомпозиция

промежутка (через 30 мин), что полностью соответствует результатам, полученным для Гимнемы-25.

Что касается влияния Композиции на процессы утилизации жирных кислот из перфузируемого ки- 15 инн 30 ww бражмат

Рис. 14. Влияние Композиции (280 мг/кг) и шечника крыс, то изучаемое средст- гимнемы-25 (280 мг/кг) на всасывание глюкозы

В КИШЕЧНИКЕ ИНТАКТНЫХ КРЫС (М ± ш). во подавляло всасывание олеиновои обозначения. * - данные достоверны по отношению

с- к контролю, ANOVA (Newman-Keuls test) (р<0,05).

кислоты в обоих временных проме- „ р 4 ' 1 '

v ' Вертикальные штрихи соответствуют стандартной

жутках перфузии, но полученные ре- ошибке сРедней величины

зультаты не превышали значений полученных для Гимнемы-25. Таким образом,

Композиция оказывает ингибирующее действие на процессы поглощения глюкозы

- ингоктхые -

—Аплокса новый диабет —л-Адлоксан + Композиция дуоденальный отдел

-интактъыв -

и олеиновой кислоты в кишечнике интактных крыс при этом по эффективности ингибирования всасывания глюкозы из кишечника не уступает Гимнеме-25. Кроме того Композиция снижает уровень всасывания мальтозы в кишечнике (уменьшение площади под кривой «концентрация глюкоза-время» на 24,02% (р<0,05)).

Полученные результаты, вероятно, могут быть связаны со способностью пероральных сахаросни-жающих препаратов с инкретино-миметическим механизмом действия замедлять метаболизм дисахари-дов и всасывание глюкозы в кишечнике (И.И. Дедов, 2007)

Противодиабетическая активность Композиции подтверждается профилактическим влиянием на изменения морфологической структуры поджелудочной железы у крыс с экспериментальным аллоксан-ин-дуцированным СД (рис. 15). Композиция при применении на фоне патологии способствовала развитию умеренно выраженной гипертрофии

ядер Р-эндокриноцитов и увеличе- Рис. 15. влияние композиции на количество

р-клеток в различных отделах поджелудоч-

нию их площади во всех отделах ной железы при экспериментальном

адлоксан-индуцированном сд (м ± ш). поджелудочной железы сравнению с Обозначения. * - данные достоверны по отношению . к контролю, ANOVA (Newman-Keuls test) (р<0,05).

группой диабет, ЧТО вероятно может Вертикальные штрихи соответствуют стандартной

свидетельствовать о гиперфункции ошибке средней величины р-клеток. При этом, изменения островкового аппарата поджелудочной железы характеризовались статистически достоверными различиями к соотношения Р-эндокриноцитов по отношению ко всем клеткам инсулярного аппарата как в опытной группе, так и в контрольной группе, однако процессы регенерации имели

—Алгоксаиоаый диабет -А-Аллоксан + Композиция желудочный отдел

арамя (ДНИ)

♦-имтвпиие Агутжсэноеый диабет -дАллоксан ♦ Композиция

селезеночный отдел

более интенсивный характер в группе крыс, получавших препарат, что определялось и по характеру изменения содержания глюкозы в плазме крови.

Аналогичная зависимость отмечалась при иммуно-гистологическом исследовании островков Лангерганса поджелудочной железы животных с экспериментальным иммунозависимым СД. Так была выявлена способность Композиции стимулировать регенерацию, и предотвращать повреждение эндокриноцитов при иммуннозависимом СД, увеличивалась доля площади, занимаемая инсулино-позитивными (слетками во всех исследуемых отделах поджелудочной железы, при этом в кишечной и селезеночной областях этот показатель увеличивался в 1,6 раза, а в желудочной в 1,5 раза. Радом с протоками и среди ацинарных клеток отмечались единичные клеточные скопления из 3-7 клеток. Выявленные тенденции также подтверждаются выявлением ядерного антигена пролиферирующих клеток и Ki-67, характерного для пролиферирующих клеток, и высоким уровнем экспрессии PCNA, преимущественно в селезеночном отделе железы. Также регистрировалось наличие единичных клеток с гиперэкспрессией PCNA в ядрах, которые имели более крупные размеры ядер по сравнению с окружающими клетками островка. При этом полученная разница в уровне интенсивности иммунного окрашивания при выявлении ядерного антигена пролиферирующих клеток и Ki-67 вероятнее всего объясняется тем, что Ki-67 характерен для пролиферирующих клеток, находящихся на разных фазах цикла деления (Gl, S, G2, М-фазы клеточного цикла) и отсутствует в G0 фазе клеточного цикла, в то время как Ki-67 отражает весь пул делящихся клеток и является наиболее надежным и четким маркером пролиферации. Кроме того, известно, что PCNA в отличие от Ki-67 экспрессируется не только на протяжении всего цикла клеточного деления, но также обязательно выявляется при репарации ДНК (М. Proctic et al., 2001). Поэтому высокий уровень экспрессии PCNA в наших исследованиях, возможно, свидетельствует о репарации ткани поджелудочной железы при моделировании СД, что также находит свое подтверждение и по литературным данным (Matthews А, et al., 1998).

Полученные результаты подтверждают возможность уменьшения выраженности явлений апоптоза в клетках островков Лангерганса при СД под воздействием Композиции. Различия интенсивности иммунного окрашивания клеток всту-

пающих в апоптоз при определении белка р53 и каепазы 3, вероятнее всего, объясняется тем, что белок р53 является короткоживущим протеином (период полураспада - 20 минут) и поэтому не всегда определяется в клетках. Каспаза 3, напротив, является ключевым ферментом каскадного цикла участвующим в протеолизе белков ядра и цитоплазмы клетки и можег экспрессироваться не только при активации гена р53, но при активации «апоптоза изнугри» (C.B. Петров и др., 2004).

При исследовании антиоксидантных свойств Композиции на модели аскор-бат-зависимого ПОЛ было показано, что эффективное уменьшение образования конечных продуктов липопероксидации. При детализации механизмов антиокси-дантной активности установлено, что комплексный препарат снижает образование конечных ТБК-активных продуктов липопероксидации, и именно комплекс веществ дает наиболее выраженный эффект по сравнению с действием компонентов в отдельности. По способности взаимодействовать со стабильным свободным радикалом ДФГТГ Композиция не уступает танакану и значительно превосходит мек-сидол и диабетон, при этом наибольшую активность среди компонентов средства проявляет девясил, в меньшей степени Гимнема-25 (табл. 5).

Таблица 5

Величины антиоксида!mюго действия ИКя изученных препаратов, мг/л (R!)

Препарат Аскорбат-зависимое ПОЛ Взаимодействие сДФПГ Люминол-зависимая ХЛ

Композиция 9,54 (0,81) 25,63 (0,94) 41,31(0,97)

экстракт девясила 4,78 (0,85) 10,64(0,93) 16,93 (0,99)

Гимнема-25 54,74 (0,74)

экстракт гребней винограда 7,35 (0,81)

Танакан 18,69(0,96) 1,40(0,87) 8,06 (0,98)

Мексидол 60,48 (0,81) 28,68 (0,98)

Диабетон 24,42(0,93)

Я -коэффициент парной корреляции; - индекс нельзя рассчитать, т.к. максимальный эффект <50%

Кроме того, Композиция продемонстрировала способность инактивировать АФК, причем достоверно высокий эффект отмечался в дозе 140 мг/кг. Таким образом, Композиция ингибирует образование АФК в широком диапазоне доз, подавляя люминол-зависимую Ре2+-индуцированную хемилюминесценцию и превосходит по антирадикальной активности и танакан (на 14%), и мексидол (на 10%).

Композиция проявляет антиоксидантные свойства у крыс со стрептозотоци-

новым СД, уменьшая образование как начальных, так и конечных продуктов пере-

кисного окисления, и увеличивая активность антиоксидантных ферментов в плазме крови.

Композиция обладает гемореологической активностью как in vitro, так и in vivo - у крыс со стрептозотоциновым СД. Так, было вьивлено влияние Композиции на агрегацию эритроцитов. При этом большая выраженность эффектов отмечается при низких скоростях сдвига, что свидетельствует о влиянии вещества на процессы агрегации эритроцитов, что, подтверждается достоверным снижением ИАЭ (табл. 6).

Таблица 6.

Влияние Композиции (280 мг/кг), Гимнемы-25 (280 мг/кг) и Танакана (7 мг/кг) при перораль-

hom введении в течение 28 дней на вязкость крови и индексы агрегации эритроцитов крыс с экспериментальным сахарным диабетом при различных скоростях сдвига (м ± ш).

Группы животных Скорость сдвига, сПз Индекс агрегации эритроцитов (у.е)

300с"' 50с' Юс"1

Интактные 3,06+0,10 4,36±0,20 7,02±0,39 1,28+0,06

Контроль - сахарный диабет 3,76+0,28* 5,71+0,57* 10,42±],17* 1,73+0,14*

Композиция 3,84±0,14 5,66±0,18 9,06±0,30 1,37+0,07*

Гимнема-25 2,84±0,И* 4,17±0,16* 6,80±0,23* 1,40+0,04*

Танакан 3,70±0,28 5,18±0,27 8Д6±0,43 1,25+0,10*

Композиция оказывала существенное влияние на вязкость взвеси отмытых эритроцитов. При этом Композиция на 25% (р<0,05) по сравнению с контролем-диабет, снижала вязкость взвеси при высоко-сдвиговых условиях (300 с"1). Это может косвенно свидетельствовать о влиянии Композиции на вязкость внутреннего содержимого эритроцита. При низких скоростях сдвига (3 с"1), где главными определяющими характеристиками являются вязкостные свойства мембраны эритроцитов и клеточная геометрия эффективность Композиции составила 11,8%.

Эффективность Композиции была выявлена и при изучении другого реологического параметра - деформируемости красных клеток крови. Композиция достоверно увеличивала скорость фильтрации эритроцитов (СФЭ) на 27,5% и индекс доставки кислорода в ткани (ИДК) на 15,4%. Кроме того, Композиция продемонстрировала влияние и на флуоресценцию зонда ДСМ+ - повышение на 27,7% (р<0,05), что может свидетельствовать об увеличении электроотрицательности мембран эритроцитов под действием Композиции.

В отношении влияния Композиции на тромбоцитарное звено гемостаза можно сделать вывод об уменьшении выраженности основных проявлений гиперагрегации тромбоцитов, так, индекс агрегации тромбоцитов уменьшился на 44,6% (табл. 7). Однако следует отметить, что Композиция уступала по величине антиагрегантного эффекта Гимнеме-25 и оба препарата превосходили эффекты та-накана. Композиция также снижала степень адгезии лейкоцитов на 17,4%, что значительно превышает эффект препарата сравнения - 10,5%.

Таблица 7.

Влияние Композиции (280 мг/кг), Гимнемы-25 (280 мг/кг) и танакaha (7мг/кг) при пе-роральном введении в течение 28 дней на адф-индуцированную (5 mkm) агрегацию тромбоцитов крови крыс с экспериментальным сахарным диабетом (м ± ш).

Группы животных Параметры агрегации тромбоцитов

ИАТ ИДТ МН

Интактные 3,44±0,63 83,95±7,17 16,36±4,13

Контроль - сахарный диабет 6,29±0,92* 54,77±5,79» 28,46±3,34

Композиция 3,49±0,70* 64,37±7,24 12,62±4,91*

Гимнема-25 2,77+0,52* 69,44+3,13 8,32±2,95*

Танакан 5,58+0,60 60,96±8,22 19,93+4,82

Обозначения: ИАТ - индекс агрегации тромбоцитов, ИДТ - индекс дезагрегации тромбоцитов, МН -максимальный наклон агрегатограммы.

Обобщая полученные результаты (рис. 16) можно предположить, что в основе механизма действия Композиции лежит увеличение секреции интестинально-го гормона GLP-1. В пользу этого предположения могут свидетельствовать изученные фармакологические эффекты Композиции. В частности повышение глюко-зозависимой секреции инсулина Р-клетками поджелудочной железы с сопутствующим снижением количества потребляемой пищи. При этом следует отметить, что регистрируемое усиление секреции инсулина при применении Композиции позволяет избежать состояния неконтролируемой гипогликемии и обеспечить оптимальный контроль уровня глюкозы в крови так необходимым условием для стимуляции секреции инсулина Композицией является наличие минимального уровня глюкозы. В свою очередь снижение избыточного количества глюкозы в плазме крови способствует снижению глюкозо- и липотоксичности. По литературным данным (T.J. Kieffer 2005; D. Kim, 2005) подобные эффекты характерны для веществ с инкретиномиметической активностью, в частности влияющих на секрецию GLP-1.

^ спфо^ш мисуяим* ^ софсцм гпюиагаи ^ желудочка) сехрсцни ^ итреВжия 1чии1 *

Угучкние тпрот уровня глиаемим Снигамв уровня ембадшх жирных «мелет 1

аголгбжлвтм 1

X* * , 1Ш

ТВс1-1 авй Вс1-11,—^сжрам-З

Ьгав»«« СЦ>-1 м мфмерм оршмферацтималпаа

Рис. 16. Предполагаемый механизм действия нового антидиабетического средства.

Обозначения. *- экспериментально выявленные эффекты Композиции

Кроме того как видно из схемы на рис. 16. указанный инкретин обладает способностью влиять на маркеры пролиферации (РСКА, К1-67) и апоптоза (Р 53 и каспаза-3) предотвращая повреждение эндокриноцитов панкреатического островка и способствуя регенерации (3-клеток, а также препятствовать процессам апоптоза. Учитывая вышесказанное можно предполагать, что в основе антидиабетического действия Композиции лежит инкретиномиметический механизм.

Так как потенциальное лекарственное средство на основе Гимнемы-25 планируется использовать в составе комплексной терапии СД II типа в течение длительного времени для лечения и профилактики развития поздних диабетических осложнений в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств», был проведен развернутый комплекс токсикологических исследований.

В ходе исследования острой и хронической токсичности Композиции было выявлено, что препарат относится к классу малотоксичных так как смертельной дозы для препарата не установлено. При изучении острой токсичности Композиции было установлено, что при внутрижелудочном введении препарата мышам регистрируется гибель 10% животных в дозе 5 г/кг. При внутрижелудочном введении Композиции крысам гибели животных не зарегистрировано в течение 14 суток наблюдения. Исходя из величины 1Л)50 при пероральном введении, показатель которой превышает дозу 5 г/кг массы животного и руководствуясь классификацией

по Т.А. Гуськовой (2008), можно сделать заключение, что Композиция относится к классу малотоксичных средств.

По результатам проведенных хронических исследований установлено, что Композиция при 6-м применении в дозе 280 мг/кг и в дозе 2800 мг/кг в опытах на крысах способствует достоверному снижению уровня глюкозы в крови, массы тела экспериментальных животных и уменьшению площади шерстного покрова. Применение Композиции в дозах 50; 280; 2800 мг/кг не вызывает патологических изменений в ЦНС, сердечно-сосудистой, детоксицирующей и выделительной системах, не изменяет качественного и количественного состава периферической крови, а также не влияет на биохимические показатели плазмы крови крыс. Композиции при 6-ти месячном применении в опытах на собаках в дозах 50, 280 и 500 мг/кг не оказывает патологического влияния на их основные гомеостатические константы. При морфологическом обследовании тканей органов собак выявлены обратимые дистрофические изменения в печени и сужение мочевых канальцев в почках в токсической дозе Композиции (2800 мг/кг).

Не выявлено патологического повреждающего действия Композиции на генеративную функцию крыс на сперматогенез и оплодотворяющую функцию крыс-самцов. В дозе 2800 мг/кг отмечено снижение индекса сперматогенеза и числа сперматогоний в канальцах семяродного эпителия, а также некоторые тенденции увеличения числа патологических форм сперматозоидов в семенной жидкости самцов восстанавливаются после отмены Композиции. При этом выявленный у самцов эффект увеличения масс гонад и эпидидимисов, возможно, обусловлен стимулирующим действием Композиции на отдельные этапы созревания и формирования сперматогенеза в тестикулах. По результатам испытаний на самках установлено, что препарат вмешивается в процесс регуляции эстральной цикличности: увеличивает встречаемость стадии эструса и метаэструса, но снижает встречаемость фазы диэструса. А в дозах 280 и 2800 мг/кг препарат может оказывать абортивный эффект при условии его введения беременным самкам на стадии имплантации, плацентации. Учитывая это, можно предположить, что Композиция способна оказывать стимулирующее влияние на синтез эстрогенов, снижая уровень гестагенов в крови. Последнее, возможно, негативно и отразилось на процессах

вынашивания плодов, а не на процессах зачатия. Вместе с тем данные эффекты имели обратимый характер н восстанавливались после отмены препарата.

Была проведена оценка специфических видов токсичности Композиции (иммунотоксичности, аллергенности, иммуногенности). Композиция не влияла на изменения фагоцитарного индекса, на интенсивность хемилюминесцентного ответа нейтрофилов; не было выявлено значимого увеличения антителообразования и показателей клеточного иммунитета, что позволяет заключить, что Композиция не обладает иммунотоксическим действием. Композиция не увеличивала интенсивность системной реакции анафилаксии и не вызывала аллергических реакций замедленного типа и значимого изменения реакции воспаления на Кон А у животных опытных групп по сравнению с контрольными, что позволяет сделать заключение об отсутствии у Композиции аллергизирующего действия. Композиция и её метаболиты не обладали способностью индуцировать генные мутации в тесте Эймса, увеличивать спонтанный уровень хромосомных повреждений в клетках костного мозга мышей, что свидетельствует о том, что Композиция не обладает мутагенным действием.

Учитывая данные об антидиабетической активности, активации процессов пролиферации и торможении апоптоза при экспериментальной форме СД, а также то, что Композиция является сбалансированным по составу комплексом с включением растительных флавоноидов, можно предположить её эффективность как потенциального антидиабетического средства для профилактики и предотвращения развития поздних осложнений, деструктивных процессов и активации регенерации в островках Лангерганса при СД II типа. Противопоказанием к применению препарата является беременность.

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ («ДИАБЕТА»)

Широко известно, что в лечении СД, особенно на ранних стадиях, удовлетворительная компенсация уровня глюкозы в крови достигается с помощью диеты. Обогащенная с помощью БАД или функциональных продуктов является важным направлением в лечении и профилактике СД. Одним из перспективных направлений в данной ситуации является создание высокоэффективных препаратов на ос-

нове природного сырья, в связи с этим было сочтено целесообразным разработать на основе лекарственной Композиции (табл. 2) биологическую добавку к пище (БАД) - растительный комплекс, стабилизирующий углеводный обмен (за счет Гимнемы-25, солей цинка, хрома и ванадия); обладающий антиоксидантными, ци-топротективными и гемореологическими свойствами (за счет добавления в основной состав экстрактов Девясила, гребней Винограда, Солодки); улучшающий процессы тканевого метаболизма и активации ферментов углеводного обмена; снижающий выраженность инсулинорезистентности (за счет сочетания магния сульфата и витамина Вб).

В ходе исследования были изучены антидиабетические свойства биологически активной добавки к пище - «Диабета». Аналогично Композиции было выявлено влияние «Диабета» на различные аспекты углеводного обмена. В частности при изучении гипогликемической активности БАД было выявлено, что наиболее эффективное сахарос-нижающее действие «Диабета» оказывает в дозе 265 мг/кг (рис. 17). При этом достоверное снижение уровня глюкозы при применении БАД в этой дозе выявлено как при однократном, так и при курсовом пероральном введении.

Кроме того при проведении глюкозотолерантных тестов (ГТТ) на животных с экспериментальным синдромом инсулинрезистентности (модель ожирения крыс, латентная форма СД) было установлено, что БАД увеличивала скорость элиминации глюкозы из кровяного русла при этом по результатам ГТТ величина эффекта «Диабета» была сравнима с диабетоном (увеличение критерия утилизации глюкозы тканями БАД- 68,45%; диабетоном - 73,63% (р<0,01)). Улучшение утилизации глюкозы в данном случае, по всей вероятности, свидетельствует о повышении

ЕЗО •

е» -

Рис. 17. ВЛИЯНИЕ «ДИАБЕТА», ГИМНЕМЫ-25 И ДИАБЕТОНА ПРИ ОДНОКРАТНОМ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ В РАЗЛИЧНЫХ ДОЗАХ НА УРОВЕНЬ ГЛЮКОЗЫ В

КРОВИ ИНТАКТНЫХ КРЫС. Обозначения; * - данные достоверны по отношению к исходным значениям до введения препарата, ANOVA (Newman-Keuls test) (р<0,05).

чувствительности глюкозо-чувствительных рецепторов к стимулирующему действию глюкозы. Что, в свою очередь, по литературным данным (A.B. Трофимов, 2005) может инициировать усиление секреции инсулина с одновременным увеличением утилизации глюкозы периферическим тканями.

Таким образом, по результатам исследованиям можно сделать вывод о перспективности использования БАД « Диабета» для терапии преддиабетических состояний и в составе комплексной терапии лечения ранних стадий СДII типа.

В серии исследований антидиабетической активности БАД у крыс с стреп-тозотоцин-индуцированным СД была установлена её эффективность в диапазоне доз от 66 до 1060 мг/кг, концентрационная зависимость величины эффекта от дозы регистрировалась в дозе 265 мг/кг. Кроме того было выявлено, что БАД компенсирует (уступая, однако по эффективности Композиции на основе Гимнемы-25) нарушенную толерантность организма к углеводам при сахарном диабете, достоверно снижая площадь под кривой «концентрация глюкозы - время» при проведении перорального и внутривенного глюкозотолерантных тестов на 39,5% и на 22,1% (р<0,05), соответственно. Таким образом, можно заключить, что БАД проявляет антигипергликемическое действие, которое, вероятно, может быть объяснено несколькими механизмами, в том числе повышением скорости элиминации глюкозы из кровяного русла, улучшением утилизации глюкозы периферическими тканями, влиянием на динамику секреции инсулина.

При изучении фармакологических свойств БАД было принципиально важно провести изучение влияния гипогликемических эффектов БАД: 1) на массу тела животных с алиментарным ожирением при монотерапии препаратом и в сочетании с физическими нагрузками; 2) на поглощение глюкозы изолированной мышечной тканью (диафрагмой); 3) на всасывание глюкозы и жирных кислот в кишечнике.

При исследовании динамики изменения веса животных с алиментарным ожирением в течение тренировочного цикла было выявлено, что применение БАД в комплексе с тренирующими физическими нагрузками (4 раза в неделю, по 30 минут с нагрузкой 5% от массы тела) способствует снижению массы тела к 28 дню наблюдений на 17,8% (р<0,05) и уменьшению количества потребляемой пищи на 15,9% (р<0,05), по сравнению с контрольной группой крыс.

При изучении влияния БАД «Диабета» на утилизацию глюкозы периферическим тканями после курсового введения добавки было зафиксировано снижение количества глюкозы на 13,4% в пробах без инсулина и на 24,3% (р<0,05) в присутствии инсулина. Что несколько уступало показателям Композиции по исследуемому параметру (19,1% и 26,4% соответственно). Таким образом, БАД при применении в течение 30 дней увеличивает коэффициент поглощения углеводов изолированной диафрагмой крыс.

Также было выявлено ингибирующее действие БАД на всасывание глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике животных. В группе животных, получавших БАД количество поглощенной глюкозы к 15 минуте перфузии понизилось на 23,1% (р<0,05), а к 30 минуте - достоверно уменьшилось в 2 раза по сравнению с группой интактных животных. Полученные результаты несколько уступают значениям, полученным для Композиции (26,3% и в 4,2 раза). Уровень всасывания олеиновой кислоты в экспериментальных группах, получавших БАД и Композицию в ходе 1-й перфузии было практически одинаковым и уменьшилось в среднем на 33,5% (р<0,05) по сравнению с контролем. Причем, скорость абсорбции жирной кислоты в ходе обеих перфузий была существенно медленнее скорости всасывания глюкозы.

Известно, что при СД наряду с изменениями процессов тканевого метаболизма, происходят нарушения обмена микро- и макроэлементов. Магний вовлечен в процессы секреции инсулина (С. Legrand, 1987), является основным кофактором большинства ферментов углеводного обмена (W. Yang, 2006). Установлено, что при СД дефицит магния, способствует усилению резистентности к инсулину. Входящий в состав биодобавки магния сульфат стабилизирует процессы метаболизма магния у крыс с алиментарной гипомагнеземией, так как применение «Диабета» в течение 10 дней приводит к полному восполнению уровня магния в эритроцитах. Вероятно БАД «разрывает порочный круг», в котором снижение уровня магния формирует резистентность к инсулину, и ослабляет захват магния в тканях.

«Диабета» оказывает антиоксидантное и антирадикальное действие на широком спектре моделей in vitro. Так, на модели аскорбат-зависимого ПОЛ доказаны ее антиоксидантные свойства и показано, что мультикомпонентный состав

БАД обладает большей активностью по сравнению с эффективностью отдельных компонентов. При исследовании «Диабета» в концентрации 265 мг/л отмечен максимальный эффект (89,7%), однако даже при уменьшении дозы в 10 и в 100 раз он сохранялся на достоверно высоком уровне (87,1% и 63,6% соответственно). БАД оказывааа ингибирующее дозозависимое действие на образование АФК при лю-минол-зависимой ХЛ. При этом антиоксидантное действие БАД отмечалось в дозе 132,5 мг/л - 82,6% (р<0,001), а в дозе 265 мг/л - 88% (р<0,001) (танакан в дозе 12 мг/л уменьшал суммарную светимость на 66%, р<0,001). При исследовании влияния «Диабета» на процессы перекисного окисления у крыс со стрептозотоцин-индуцированным СД было выявлено умеренное антиоксидантное действие БАД с некоторым снижением в печени образования конечного продукта ПОЛ - МДА.

При изучении гемореологических эффектов БАД на модели стрептозотоцин-индуцированного СД у крыс отмечено, что «Диабета» эффективно снижает вязкость крови во всем диапазоне скоростей сдвига у крыс с некоторым преобладанием эффекта на низких скоростях сдвига (25,7%, р<0,05) над препаратом сравнения. О влиянии БАД на деформабельность мембраны эритроцитов свидетельствует достоверное увеличение скорости фильтрации взвеси эритроцитов (в 1,2 раза по сравнению с контролем) и увеличение ИДК в ткани. Кроме того «Диабета» при курсовом введении снижала агрегацию тромбоцитов, уступая, однако, по величине антиагрегантного эффекта танакану. Полученные результаты позволяют констатировать наличие у БАД гемореологических свойств.

На основании проведенных экспериментальных исследований по изучению острой токсичности БАД у крыс при пероральном введении, следует, что данный препарат можно отнести к малотоксичным веществам - Ь05а>5г/кг.

Для оценки сахароснижшощего действия, эффективности и безопасности БАД были проведены клинические исследования4 по ее применению в комплексной терапии больных, страдающих СД II типа. Было проведено двойное слепое плацебо контролируемое рандомизированное 3-х месячное исследование пациентов с

4 Исследования выполнены профессором, д.м.н. [М-И. Балаболкиньщ, H.A. Пегуншюй, Е.М. Клебановон, М.Э. Теяыювой, Н.Е. Пчелющевой на кафедре эндокринологии ФППОВ ММА им И.М.Сеченова.

сахарным диабетом II типа, которым на фоне сахароснижающей терапии (манинил 2 табл. в день или инсулин до 40 ЕД/сут) назначали БАД «Диабета» (свидетельство о регистрации № 77.99.23.3.У.1472.2.06 от 20.02.06) по 2 таблетки 3 раза в день. Состояние углеводного обмена оценивалось показателям гликемии натощак, содержанием гликозилированного гемоглобина, иммуннореактивного инсулина (ИРИ) (Reagent Kit Bayer), индекса инсулинорезистентности (НОМА), общей ок-сидативной, антиоксидантной, эндогенной пероксидазной активности ("Labor Diagnostice Nord", Germany).

По результатам клинических испытаний можно заключить, что биологически активная добавка к пище «Диабета» улучшает углеводный обмен и снижает инсулинорезистентность у больных СД II типа. У больных, получавших в комплексной терапии БАД отмечалось достоверное снижение содержания глюкозы в крови (на 29,1%), уровня HbAlc (на 19,2%), уровня ТГ (на 40%) и повышение холестерина ЛВП (на 33,3%) в сыворотке крови. При применении БАД была отмечена тенденция к снижению общей оксидантной активности (на 13,1%) и к повышению общей антиоксидантной активности (на 27,3%).

Таким образом, БАД «Диабета» может быть использована как комплиментарное средство в комплексной терапии СД II типа для профилактики развития метаболического синдрома и возникновения отдаленных последствий СД. Тем не менее, необходимо отметить, что «Диабета» может использоваться только для оптимизации пищевого рациона и спектр её активности существенным образом отличается от фармакологических свойств потенциального лекарственного препарата (табл. 8).

На основании полученных данных были разработаны показания к применению БАД «Диабета»: нарушенная толерантность к глюкозе, синдром инсулинорезистентности; избыточная масса тела (ИМТ>24,9кг/м2); метаболический синдром; профилактика последствий несбалансированного питания; профилактика отдаленных последствий СД; коррекция нарушений липидного и магниевого обмена при сахарном диабете II типа.

Таблица 8

Сравнительная характеристика потенциального лекарственного и

биологически активной добавки к пище

Лекарственный препарат КОМПОЗИЦИЯ /280 мг/кг) Биологически активная добавка к пище «ДИАБЕТА» (265,72 мг)

Гимнема-25 - 160 мг/кг Сухой экстракт Девясила - 85 мг/кг Сухой экстракт гребней Винограда - 35 мг/кг Гимнема-25 - 80 мг/кг Сухой экстракт Девясила - 100 мг/кг Сухой экстракт корня Солодки - 16 мг/кг Сухой экстракт гребней Винограда - 40 мг/кг Пиридоксина гидрохлорид (витамин Вб) -1,6 мг/кг Магния сульфат - 20 мг/кг Цинка сульфат - 8 мг/кг Хрома пиколинат - 0,08 мг/кг Ванадия сульфат - 0,04 мг/кг

Гипогликемическое и антидиабетическое действие при СД смешанного типа, преддиа-бете и метаболическом синдроме. Гипогликемическое действие при СД, инсу-линорезисгентности, ожирении.

Инсулиномиметическое действие -

Пролиферативное, антиапоптогенное действие на Р-эндокриноциты -

Уменьшает образование начальных и конечных продуктов перекисного окисления, увеличивает активность антиоксидантных ферментов в плазме крови крыс с СД. Умеренное антиоксидантное действие

Полная компенсация дефицита магния в эритроцитах у животных с алиментарной ги-помагнеземией в течение 10 дней.

Снижение уровня гликозилированного гемоглобина и, нормализация лшщдиого спектра в крови животных (фракций ¿ЛПОНП.ЛПНПи *ЛПВП).

Увеличение скорости утилизации глюкозы из периферического кровотока, повышение утилизации глюкозы изолированной диафрагмой крыс, ингибирование поглощения глюкозы и олеиновой кислоты из кишечника

Выраженная гемореологическая и антиагре-гантная активность Умеренное гемореологическое действие

Умеренное снижение массы тела Эффективное снижение массы тела у животных с алиментарным ожирением в сочетании с физическими нагрузками

В ходе клинического исследования выявлено, что БАД в комплексной терапии улучшает углеводный обмен, снижает выраженность инсулинорезистентности, оксидативного стресса, повышает активность ангиоксвдант-ной системы, не вызывает побочных эффектов.

Применение: для лечения и профилактики отдаленных последствий в составе комплексной терапии СД I и II типа Применение', для оптимизации рациона питания больных с СД и в составе комплексной терапии состояния преддиабет и инсулинорезистентности.

Выводы:

1. Экстракты Гимнемы лесной стимулируют секрецию инсулина, влияют на процессы регенерации и апоптоза р~эндокриноцитов, повышают утилизацию глюкозы периферическими тканями, задерживают всасывание глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике, и могут служить основой для создания противодиабетиче-ских препаратов, биологически активных добавок к пище.

2. Величина гипогликемической активности экстрактов Гимнемы лесной, исходя из степени очистки фракции, уменьшается в ряду: Гимнема-25>Гимнема-50>Гимнема-75 в экспериментах на интактных животных и на животных с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом.

3. Гимнема-25 оказывая умеренную антиоксидантную активность, предотвращает увеличение ПОЛ преимущественно в эритроцитах, и проявляет умеренное влияние на реологические свойства крови, существенно не влияния на показатели коагуляционного гемостаза.

4. Компоненты биофлавоноидной структуры (экстракты гребней винограда и цветков девясила) усиливают антиоксидантные и гемореологические свойства Гимнемы-25.

5. Антидиабетическое действие Композиции на основе Гимнемы-25 при экспериментальных состояниях латентной формы сахарного диабета, патогенетических вариантах сахарного диабета обусловлено увеличением секреции инсулина, повышением чувствительности к нему периферических тканей, снижением скорости всасывания глюкозы в кишечнике.

6. Сахароснижающий эффект Композиции обусловлен её панкреотропным и экстрапанкреатическим действием, проявляющимся в пролонгации сахаросни-жающего действия экзогенно введенного инсулина, усилении его эффекта и удлинении времени стабилизации гликемии, улучшении утилизации глюкозы мышечной тканью в присутствии и без инсулина, в снижении коэффициента поглощения углеводов и олеиновой кислоты в кишечнике.

Ki -67, а также препятствует развитию апоптоза в эндокриноцитах панкреатических островков, что подтверждается снижением экспрессии каспазы 3.

8. Композиция оказывает антиоксидантное действие, эффективно уменьшая образование как начальных (КД в 2,8 раза), так и конечных продуктов липоперок-сидации (МДА в 1,2 раза) а также увеличивает активность антиоксидантных ферментов (СОД в 2 раза) на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления ли-пидов; взаимодействует со стабильным свободным радикалом ДФПГ и с активными формами кислорода.

9. Комплексный препарат на основе Гимнемы лесной обладает гемобиоло-гической активностью как in vitro, так и in vivo - у крыс с экспериментальным синдромом повышенной вязкости крови, влияя на основные гемореологические параметры - деформабильность и агрегацию форменных элементов крови, снижает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

10. Композиция относится к классу малотоксичных лекарственных средств, так как при исследовании острой, хронической не выявлено патологических изменений со стороны сердечно-сосудистой, выделительной систем и основных гомео-статических констант. При изучении специфических видов токсичности не выявлено аллергизирующего, иммунотоксического, мутагенного действия. Композиция в дозе 280 мг/кг обратимо повышает пред- и постимплантационную эмбриональную гибель, не влияя на органе- и фетогенез, постнатальное развитие.

11. Биологически активная добавка к пище на основе Гимнемы лесной эффективна при состояниях преддиабета и инсулинорезистентности, препятствует развитию гипергликемии, активации процессов свободно-радикального окисления, снижает агрегацию тромбоцитов в плазме крови, повышает скорость утилизации глюкозы периферическими тканями, снижает всасывание глюкозы и жирных кислот в кишечнике, уменьшает потребность в высокалорийной пище.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Обзоры и статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России:

1. Изучение.гипогликемической активности лекарственной Композиции на основе Гимнемы лесной у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе // Аллергология и иммунология. - 2006. - №1. - С. 157 (соавт: Науменко Л.В. и др).

2. Гипогликемические свойства экстракта Гимнемы лесной // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2007. - № 1(21). -С. 79-82 (соавт: [Писарев В.Б], Снигур ПЛ., и др).

3. О химическом составе сухих экстрактов листьев Gymnema sylvestre // Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - №1. Т42. - С. 30-32 (соавт: Храмов В.А. и др.).

4. Структурные изменения в островках Лангерганса при экспериментальном сахарном диабете на фоне введения биологически активной добавки на основе Гимнемы лесной // Морфология. - 2008. - №1. - С. 60-64 (соавт: Снигур Г.Л.).

5. Ультраструктурные изменения Р-клеток поджелудочной железы крыс при моделировании сахарного диабета на фоне введения препарата «Диабета» // Морфология. - 2008. - Т.133(2). - С. 127 (соавт: Спасов А.А., Снигур Г.Л. и др).

6. Гемореологическая активность экстрактов Гимнемы лесной при стрептозото-цин-индуцированном сахарном диабете // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - №3. - С. 31-33 (соавт: Спасов А.А., Буланов А.Е. и др).

7. Антидиабетогенные свойства Гимнемы лесной (обзор) // Химико фармацевтический журнал. - 2008. - Т.42, № 11.-С. 10-14 (соавт: Спасов А.А., и др.).

8. Влияние препарата "Диабета" на апоптоз р-эндокрипоцитов // Морфология. -2008. - Т. 133, №4. - С. 93 (соавт: Снигур Г.Л., ¡Писарев В.Б], и др).

9. Оценка иммунотоксического действия экстракта Гимнемы лесной (Gymnema sylvestre) // Токсикологический вестник. - 2008. - №5. - С. 11 (соавт: Дурнев А.Д., Жанатаев А.К. и др).

10. Инкретины (физиология, патология, фармакология) (обзор) // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии (в печати) (соавт: Спасов А. А., Буланов А.Е).

11. Влияние биологически активной добавки «Диабетта» на поглощение глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета (в печати) (соавт: Агарков Д.Ю. и др).

12. Механизмы токсического действия стрептозотоцина на р-клетки островков Лангерганса // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (принято к печати) (соавт: Снигур Г.Л., [Писарев еГЩ Спасов А.А., и др).

13. Антидиабетические и антиатерогенные свойства Гимнемы леской при экспериментальном иммунозависимом сахарном диабете // Патологическая физиология и экспериментальная терапия (принято к печати) (соавт: Спасов А.А.)

14. Механизм антидиабетического действия комплекса на основе Гимнемы лесной // Проблемы эндокринологии (принято к печати) (соавт: Спасов А.А., и др.).

Прочие публикации:

15. Влияние антидиабетической композиции «Диабетта» на восполнение уровня магния в эритроцитах и плазме при алиментарной гипомагниемии // Бюл.

ВНЦ РАМН и ABO. - 2007. - №2. - С.7-9 (соавт: Спасов A.A., Агарков Д.Ю., идр).

16. Использование раствора GEWF для макроскопической оценки поджелудочной железы у крыс с экспериментальным сахарным диабетом// Бюл. ВНЦ РАМН и ABO 4. - 2006. - № 11-12. - С.23-24 (соавт: Снигур Г.Л.).

17. Влияние экстракта Гимнемы лесной на перекисное окисление в эритроцитах и плазме крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом // Бюл. ВНЦ РАМН и ABO. - 2007. - С. 3-5 (соавт: Спасов A.A. и др).

18. Исследование хронической токсичности мультикомпонентного лекарственного средства на основе экстракта Гимнемы лесной (Диа-бета) // Бюл. ВНЦ РАМН и ABO. - 2008. - №2. - С. 24 (соавт: Спасов A.A. и др.).

19. Использование Гимнемы лесной в лечении сахарного диабета // Материалы научно- практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции». -Волгоград, 2005. - С. 104-105 (соавт: Спасов A.A. Снигур Г.Л. и др).

20. Изучение гемобиологической активности сухого экстракта Гимнемы лесной у крыс с экспериментальным сахарным диабетом // Материалы 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». - «Подмосковье», 2006. - С. 133 (соавт: Степанов A.B., Науменко Л.В. и др).

21. Влияние сухого экстракта Гимнемы лесной на развитие и течение иммуноза-висимой формы сахарного диабета у крыс // Материалы ХШ Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2006. - С. 795 (соавт: Спасов A.A., Буланов А.Е. и др).

22. Проблема диабета, методы профилактики и лечения // Российский НИИ здоровья. Информационный бюллетень. - 2007. - №1. - С. 4 (соавт: Спасов A.A.)

23. Диа-ß на регенерацию ß-клеток поджелудочной железы // Российский НИИ здоровья Информационный бюллетень. - 2006. - №1. - С. 6-7 (соавт: Снигур Г.Л., Спасов A.A., и др).

24. Окислительный стресс в патогенезе сахарного диабета и его осложнений // Российский НИИ здоровья Информационный бюллетень. - 2006. - №1. - С. 8 (соавт: Косолапое В.А., Спасов A.A.).

25. Фармакологические свойства Гимнемы лесной // Материалы I Международного съезда фитотерапевтов «Современные проблемы фитотерапии». - 2006. - С. 222-228 (соавт: Спасов A.A., Буланов А.Е. и др).

26. Антидиабетические свойства препарата ДИА-ß // Материалы I Международного съезда фитотерапевтов «Современные проблемы фитотерапии». - 2006. -С. 228-235 (соавт: Спасов A.A., Буланов А.Е.).

27. Морфологические особенности панкреатических островков крыс при стрепто-зотозотоцин-индуцированного иммунозависимого сахарного диабета на фоне применения экстракта Гимнемы // Материалы II Всероссийской конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты эндокрино-патий». - 2006. - С. 88-92 (соавт: ¡Писарев вТЩ Спасов A.A., и др.).

•28. Препарат «Диа-ß» // Общероссийский общественный фонд «Здоровье человека» медицинская газета «Человек и лекарство». - 2006. - №4 (26). - С. 10-11 (соавт: Спасов A.A., Буланов А.Е.).

29. Влияние «Диа-ß» на поглощение глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике крыс // Материалы XIV национального конгресса «Человек и лекарство». -2007. - С. 879 (соавт: Буланов А.Е., Чепляева Н.И., и др).

30. Влияние Гимнемы лесной на регенерацию р-клеток поджелудочной железы // Материалы XIV национального конгресса «Человек и лекарство». - 2007. - С. 863 (соавт: Снигур Г.Л., Спасов A.A., и др).

31. Изучение влияния «ДИА-ß» на уровень гликемии у крыс с нарушениями углеводного обмена // Материалы XIV национального конгресса «Человек и лекарство». - 2007. - С. 873 (Спасов A.A., Буланов А.Е. и др).

32. Antidiabetic properties of Dia-ß: experimental and clinical investigation // International conference on diabetes «The next line of defense. Synergy and strategy». -2007. - P. 7-9,11-12 (Spasov A.A., et al.).

33. QSAR-моделирование синергизма активных соединений экстракта Gymnema sylvestre // Материалы III съезда фармакологов России «Фармакология -практическому здравоохранению». - Санкт-Петербург, 2007. - Т. 7(2), - С. 1936 (соавт: Васильев П.М., Спасов A.A., и др).

34. Влияние препарата «Диа-ß» стимуляцию секреции инсулина, ингибирование апоптоза и стимуляцию репаративных процессов в эндокриноцитах // Материалы III съезда фармакологов России «Фармакология -практическому здравоохранению». - Санкт-Петербург, 2007. - Т. 7(2). - С. 1964. (Спасов A.A.)

35. Влияние на регенерацию Р-клеток поджелудочной железы комплексного препарата «Диа-Р» // Материалы II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений». - Алматы, Казахстан, 2007. - С. 135 (соавт: Спасов A.A., Буланов А.Е.).

36. Противодиабетические свойства «Диа-Р»: экспериментальные и клинические исследования // Материалы международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения». - Гродно, 2007, - С. 152-154 (соавт: Спасов A.A., Косолапов В.А., и др).

37. Экспериментальное исследование гипогликемической активности экстракта гимнемы лесной и компьютерное моделирование синергизма его компонентов // Материалы 63-й конференции по фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2008. - С. 490-491 (соавт: Васильев П.М., Чепляева Н.И.).

38. Фармакологическая коррекция апоптоза гимнемовыми кислотами // Материалы IV Всероссийского конгресса диабетологов. - Москва, 2008. - С. 335 (соавт: Снигур Г.Л., Спасов A.A., и др).

39. Инкретиномиметические свойства Гимнемовых кислот // Материалы IV Всероссийского конгресса диабетологов. - Москва, 2008. - С. 333 (соавт: Спасов A.A., Буланов А.Е.).

40. Гемореологическая активность Гимнемы-25 при экспериментальном стрепто-зотоцин-индуцированном сахарном диабете. - Ярославль, июнь 2009 (соавт: Спасов A.A., Науменко Л.В. и др)

ВОРОНКОВА Мария Павловна

ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГИМНЕМОВЫХ КИСЛОТ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 13.05.2009 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. 3 печ. л. Тираж 150 экз. Заказ 582.

Отпечатано в ОАО «Калачевская типография». 404507, Волгоградская область, г. Калач-на-Дону, ул. Кравченко, 7

Оглавление диссертации Воронкова, Мария Павловна :: 2009 :: Волгоград

ВВЕДЕНИЕ.

1. ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ И ПРОФИЛАКТИКЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПОИСКА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА II ТИПА.

1.1.1. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА СОВРЕМЕННОЙ ФАРМАКОТЕРАПИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА.'.

1.1.2. НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ В СОЗДАННЫЙ АНТИДИАБЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ.

1.1.3. ИНКРЕТИНОМИМЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ АНТИДИАБЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ.

1.2. ЭКСТРАКТЫ ГИМНЕМЫ ЛЕСНОЙ - КАК ИСТОЧНИК ИНКРЕТИНОМИМЕТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ.

1.2.1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ГИМНЕМЫ ЛЕСНОЙ.

1.2.2. ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ГИМНЕМЫ ЛЕСНОЙ ПА ГОМЕОСТАЗ ГЛЮКОЗЫ.

2. ИЗУЧЕНИЕ АНТИДИАБЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭКСТРАКТА ГИМНЕМЫ ЛЕСНОЙ.

2.1. ПШОГЛИКЕМИЧЕСКИЕ И АНТИДИАБЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКСТРАКТОВ ГИМНЕМЫ ЛЕСНОЙ.44 г

2.1.1. МА ТЕР И АЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1.2. ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТОВ ГИМНЕМЫ ЛЕСНОЙ.

2.1.3. АНТИДИАБЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТОВ ГИМНЕМЫ ЛЕСНОЙ.50 '

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Воронкова, Мария Павловна, автореферат

Актуальность темы. Сахарный диабет (СД) зарегистрирован более чем у 150 млн. человек в мире (И.И. Дедов, 2008; А.С. Аметов, 2008). При этом прогнозируется удвоение числа заболевших СД каждые 12-15 лет. Из этого числа 90-95% - больные инсулиннезависимым СД в возрасте 35-49 лет. Фактическая распространенность СД в 3-4 раза превосходит регистрируемую, что свидетельствует о пандемии СД среди взрослого населения (И.И. Балаболкин, 2008). Достаточно большой объем знаний в области патофизиологии диабета и наличие широкого спектра терапевтических возможностей лечения не привели к улучшению метаболического контроля заболевания от стадии глюкозотолерантности до развернутой клиники СД (И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко, 2006). Лечение усложняется, тем, что гипергликемия сочетается с ожирением, артериальной гипертензией, дислипидемией, гиперкоагуляцией и окислительным стрессом. Так как длительно протекающая декомпенсация усугубляет инсулинорезистентность и способствует развитию вторичной резистентности к пероральным сахароснижающим средствам, составляющим основную фармакотерапевтическую группу для лечения СД II типа, потребность в новых эффективных и безопасных сахароснижаю-щих лекарственных средствах очевидна (И.И. Балаболкин, 2005). В связи с этим идет интенсивный поиск как синтетических, так и растительных секре-тогенов, влияющих на физиологические механизмы высвобождения инсулина (М.Б. Анциферов, 2007).

В исследованиях последних лет убедительно доказано, что снижение уровня инсулина в ответ на естественный стимулятор (углеводы) может обусловливаться нарушением выделения некоторых интестинальных гормонов (GIP и GLP-1), оказывающих глюкозостимулирующее влияние на синтез инсулина (J. Hou et al, 2007; T.R. Vahi et al, 2007). Поскольку большая часть этих гормонов инактивируется еще в кишечнике, не достигая системного кровотока, то экзогенное применение инкретинов представляется технически сложным (S.C. Мс Donagh, 2007). Поэтому используются ингибиторы расщепляющих инкретины энзимов, либо вещества, проявляющие прямое или косвенное инкретиномиметическое действие (К.А. Scott, 2007). В то же время гипогликемическую активность растительного экстракта Гимнемы лесной (ветвистой лианы из семейства ластовневых) связывают с увеличением ин-кретиномиметичекого действия, повышением секреторной активности и восстановлением морфологической структуры p-эндокриноцитов, подавлением глюконеогенеза (Т. Fushiki, 1992; Gymnema Lawrence Rev. 1993). Исходя из этого различные экстракты Гимнемы лесной могут являться основой для создания антидиабетических лекарственных и нелекарственных препаратов.

Целью настоящего исследования является экспериментальное обоснование создания на основе экстракта Гимнемы лесной, проявляющего инкретиномиметическое действие, антидиабетических препаратов.

Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:

1) изучение метаболических (гипогликемических, антиоксидантных, гемореологических) и антидиабетических свойств экстрактов Гимнемы лесной в зависимости от дозы и степени очистки;

2) исследование антиоксидантных и гемореологических свойств оптимизированной экстрактами девясила и гребней винограда Гимнемы-25 -наиболее активной фракции Гимнемы лесной;

4) исследование панкреотропных механизмов антидиабетического действия Композиции;

5) изучение механизма экстрапанкреатических эффектов препарата;

6) исследование влияния препарата на процессы регенерации и апоп-тоза инсулинпродуцирующих клеток;

7) исследование фармакологических свойств биологически активной добавки к пище на основе Гимнемы лесной;

Научная новизна.

Впервые изучено влияние Гимнемы-25 на реологические свойства и тромбогенный потенциал крови. Впервые проведен анализ уровня гипогли-кемической активности различных экстрактов Гимнемы лесной в зависимости от их дозы и степени очистки.

Впервые проведена оценка пролиферативной активности |3-эндокриноцитов при применении лекарственной Композиции и выявлена степень её антиапоптогенной активности.

Научно-практическая значимость

Результаты доклинических исследований позволили обосновать создание Композиции на основе Гимнемы-25 в виде лекарственного препарата (с добавлением экстрактов гребней винограда и девясила) с антиоксидантными и гемореологическими свойствами для применения в комплексной сахарос-нижающей терапии СД II типа и профилактики его отдаленных последствий.

Результаты доклинических исследований позволили обосновать создание БАД на основе Композиции (с введением микронутриенов необходимых для стабилизации углеводного обмена: ванадия сульфата, цинка сульфата, хрома пиколината, магния сульфата, пиридоксина гидрохлорида), проявляющей антиоксидантные и гемореологические свойства для профилактики развития метаболических расстройств и поздних осложнений СД. На основании результатов клинических исследований БАД можно полагать об её эффективности при использовании в составе комплексной терапии у больных СД II типа.

Изучены показатели острой, хронической и специфических видов токсичности.

Реализация результатов исследования

Система методических подходов к изучению и анализу антидиабетической активности экстрактов растений применяется при проведении исследований в лабораторий экспериментальной фармакологии ВНЦ РАМН и АВО, НИИ фармакологии ВолГМУ и кафедры фармакологии ВолГМУ. Биологиче

10 ски активная добавка к пище «Диабета» выпускается ООО «Экко Плюс» (Россия).

Результаты работы включены в лекционные курсы на кафедрах фармакологии ВолГМУ, фармакогнозии и ботаники ВолГМУ, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, на кафедрах фармакологии Кубанского, Саратовского и Ростовского государственных медицинских университетов.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Антидиабетическое действие Композиции на основе Гимнемы-25 (с добавлением экстрактов гребней винограда и цветков девясила) связано с её сахароснижающим действием при экспериментальном стрептозотоцин, ал-локсан-индуцированном, иммунозависимой форме СД, при латентной форме СД, инсулинорезистентности.

3. Композиция тормозит развитие апоптоза и способствует регенерации (3-эндокриноцитов при токсическом воздействии цитотоксинов на ткань поджелудочной железы.

5. БАД на основе Композиции оказывает гипогликемическое действие при экспериментальном метаболическом синдроме (преддиабет) и ожирении за счет глюкозостимулированного влияния на секрецию инсулина и потенцирования его действия, улучшения утилизации глюкозы периферическими тканями, снижения всасывания глюкозы и жирных кислот в кишечнике.

6. БАД в составе комплексной сахароснижающей терапии способствует улучшению состояния углеводного и липидного обменов, снижению ин-сулиновой резистентности и повышению активности антиоксидантной системы у больных СД II типа.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались в материалах: научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции», Волгоград, 2005; 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», «Подмосковье», 2006; XI Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммуно-реабилитации, Москва, 2006; XII и XIV Российских национальных конгрессов «Человек и лекарство», Москва, 2006, 2007, 2008; I Международного съезда фитотерапевтов «Современные проблемы фитотерапии», Москва, 2006; II Всероссийской конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты эндокринопатий», Москва, 2006; V международного научно-практического конгресса «Человек в экстремальных условиях: Здоровье, надежность и реабилитации», Москва, 2006; 'The next line of defense' International conference on diabetes. Synergy and strategy, Анталия, Турция, 2007; III Съезде Фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; II Международной научной конференции "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений", Алматы, Казахстан, 2007; Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения», Гродно, Беларусь, 2007; 63-й конференции по фармации, Пятигорская фармацевтическая академия, Пятигорск 2008; IV Всероссийском конгрессе диабетологов, Москва, 2008; симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» Москва, 2008; VII международной конференции «Гемореология и микроциркуляция. От функциональных механизмов в клинику», Ярославль, 2009.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 339 страницах машинописного текста, иллюстрирована 61 таблицей, 97 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II-V), обсуждения результатов (глава VI), выводов и приложения. Список литературы включает 117 отечественных и 166 иностранных источников.

Заключение диссертационного исследования на тему "Противодиабетические свойства гимнемовых кислот"

7. ВЫВОДЫ:

1. Экстракты Гимнемы лесной стимулируют секрецию инсулина, влияют на процессы регенерации и апоптоза (3-эндокриноцитов, повышают утилизацию глюкозы периферическими тканями, задерживают всасывание глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике, и могут служить основой для создания противодиабетических препаратов, биологически активных добавок I к пище.

2. Величина гипогликемической активности экстрактов Гимнемы лесной, исходя из степени очистки фракции, уменьшается в ряду: Гимнема-25 □Гимнема-50>Гимнема-75 в экспериментах на интактных животных и на животных с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом.

4. Компоненты биофлавоноидной структуры (экстракты гребней винограда и цветков девясила) усиливают антиоксидантные и гемореологи-ческие свойства Гимнемы-25.

6. Сахароснижающий эффект Композиции обусловлен её панкрео-тропным и экстрапанкреатическим действием, проявляющимся в пролонгации сахароснижающего действия экзогенно введенного инсулина, усилении его эффекта и удлинении времени стабилизации гликемии, улучшении утилизации глюкозы мышечной тканью в присутствии и без инсулина, в снижении коэффициента поглощения углеводов и олеиновой кислоты в кишечнике.

7. Композиция способствует активации репаративных процессов в Р-эндокриноцитах при экспериментальном иммунозависимом сахарном диабете, что подтверждается высоким уровнем экспрессии PCNA и умеренной экспрессией Ki-67, а также препятствует развитию апоптоза в эндокриноци-тах панкреатических островков, что подтверждается снижением экспрессии каспазы 3.

8. Композиция оказывает антиоксидантное действие, эффективно уменьшая образование как начальных (КД в 2,8 раза), так и конечных продуктов липопероксидации (МДА в 1,2 раза) а также увеличивает активность антиоксидантных ферментов (СОД в 2 раза) на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов; взаимодействует со стабильным свободным радикалом ДФПГ и с активными формами кислорода.

9. Комплексный препарат на основе Гимнемы лесной обладает ге-мобиологической активностью как in vitro, так и in vivo - у крыс с экспериментальным синдромом повышенной вязкости крови, влияя на основные ге-мореологические параметры — деформабильность и агрегацию форменных элементов крови, снижает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

10. Композиция относится к классу малотоксичных лекарственных средств, так как при исследовании острой, хронической не выявлено патологических изменений со стороны сердечно-сосудистой, выделительной систем и основных гомеостатических констант. При изучении специфических видов токсичности не выявлено аллергизирующего, иммунотоксического, мутагенного действия. Композиция в дозе 280 мг/кг обратимо повышает пред- и постимплантационную эмбриональную гибель, не влияя на органо- и фетоге-нез, постнатальное развитие.

5.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований можно заключить, что препарат относится к классу малотоксичных - токсической дозы для Композиции не установлено, т.к. в дозе 5 г/кг не установлено гибели животных не установлено. Кроме того, шестимесячное применение препарата в терапевтической и субтоксической дозах способствует достоверному снижению массы тела экспериментальных животных и уменьшению площади частичной потери шерстного покрова. Композиция не вызывает патологических изменений в ЦНС, сердечно-сосудистой, детоксицирующей и выделительной системах, не изменяет качественного и количественного состава периферической крови, а также не влияет на биохимические показатели плазмы крови крыс.

По результатам проведенных хронических исследований установлено, что Композиции при шестимесячном применении у собак в дозах 50, 280 и 500 мг/кг не оказывает патологического влияния на их основные гомеостати-ческие константы. Электрокардиографические сдвиги у собак не выходили за рамки физиологической нормы и были обратимыми, что также свидетельствует о взаимосвязи влияния Композиции на сократительную активность сердца. Гематологическими и биохимическими исследованиями выявлено отсутствие влияния Композиции при шестимесячном введении собакам на эритро- и лейкопоэз, а также функциональную активность органов детокси-кации и выведения. При морфологическом обследовании тканей органов собак выявлены обратимые дистрофические изменения в печени и сужение мочевых канальцев в почках в токсической дозе Композиции.

Не выявлено патологического повреждающего действия изучаемого препарата на генеративную функцию крыс на сперматогенез и оплодотворяющую функцию самцов. Снижение индекса сперматогенеза и числа спер-матогоний в канальцах семяродного эпителия, а также некоторые тенденции увеличения числа патологических форм сперматозоидов в семенной жидкости самцов восстанавливаются после отмены Композиции. При этом выявленный у самцов эффект увеличения масс гонад и эпидидимисов, возможно, обусловлен стимулирующим действием испытуемого препарата на отдельные этапы созревания и формирования сперматогенеза в тестикулах.

По результатам испытаний на самках установлено, что Композиция вмешивается в процесс регуляции эстральной цикличности: увеличивает встречаемость стадии эструса и метаэструса, но снижает встречаемость фазы диэструса. Учитывая это можно предположить, что препарат способен оказывать стимулирующее влияние на синтез эстрогенов, снижая уровень геста-генов в крови. Последнее, возможно - негативно и отразилось не на процессах зачатия, а на процессах вынашивания плодов. Также можно предположить, что Композиция в дозах 280 и 2800 мг/кг может оказывать абортивный эффект при условии его введения беременным самкам на стадии имплантации, плацентации, органогенеза. Вместе с тем данные эффекты имели обратимый характер и восстанавливались в исследованиях. Композиция не оказывает повреждающего действия на антенатальное и постнатальное формирование потомства плодов в ранние и отдаленные периоды наблюдений.

Композиция не обладает аллергизирующими свойствами, так как после её введения не отмечено увеличения интенсивности системной реакции анафилаксии, не установлено аллергических реакций замедленного типа при иммунизации препаратом в изучаемых дозах в смеси с полным адъювантом Фрейнда.

Композиция не обладает иммунотоксическим действием, так как при её курсовом применении не выявлено значимого увеличения антителообразова-ния и увеличения показателей клеточного иммунитета.

Потенциальный лекарственный препарат не обладает мутагенным действием, так как не увеличивает спонтанного уровня хромосомных повреждений в клетках костного мозга самцов и самок мышей.

6. ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор растительного экстракта Гимнемы лесной в качестве основы для создания нового антидиабетического средства с принципиально новым механизмом действия обусловлен доказанными гипогликемическими свойствами Гимнемы лесной, которые подтверждены литературными данными, а также результатами предварительных исследований, проведенных на кафедре фармакологии ВолГМУ (А.А. Спасов и др., 2003 - 2007 г; Г.Л. Снигур и др., 2008).

Экспериментальные данные, опубликованные за последнее десятилетие, свидетельствуют о том, что гипогликемическая активность ГЛ обусловлена антидиабетической активностью ГК (V-VII) и гимнемосапонинов (F. Gent Janneane, 1999), проявляющейся повышением секреторной активности, восстановлением морфологической структуры Р -эндокриноцитов и подавлением глюконеогенеза, супрессией повышения уровня глюкозы, ингиби-рованием её захвата и поглощения в кишечнике (L.F. Wang, 1998; F. Janneane, 1999; Y. Sugihara, H. Nojima, H. Matsuda, 2000; Y. Ogawa, 2004), влиянием на метаболизм липидов крови и снижением массы тела (R. Asano, М. Shinosaka, M.Okazaki, N. Shigemasu, 2002).

Учитывая многообразие уже описанных и приведенных выше видов антидиабетической активности, а также то, что гипогликемическую активность растительного экстракта ГЛ связывают с увеличением секреции пептида GLP-1 и GIP, следовательно, к ГЛ вполне применимо определение «инкре-тиномиметик», введенное в научный оборот за последние несколько лет.

В последнее время в странах Европы, Японии и США активно работают с экстрактом ГЛ, в плане создания лекарственного препарата нового типа действия. Как правило, эти исследования нацелены на очистку субстанции и выделение различных фракций экстракта ГЛ (United States Patent № 5,116,820 от 26.05.1992; № 5,605,698 от 25.02.1997; № 5,612,039 от 18.03.1997; № 6,413,545 от 2.07.2002).

На данный момент в лечении СД, как правило, применяют комбинированную терапию, что особенно важно для профилактики отдаленных последствий (L.A. Donnelly, 2006; Peter Timmins, 2006). В отдельных случаях создаются комплексные препараты (P.D. Home , C.J Bailey et al., 2007) для лечения и профилактики отдаленных последствий СД, которые, помимо гипогли-кемического действия, обладают антиоксидантными свойствами и стабилизируют гемореологические свойства крови (М. Comaschi , A. Demicheli, 2007; М. Comaschi , A. Corsi, 2007).

Новый антидиабетический препарат создан на основе экстракта Гимнемы-25, полученного новым методом экстракции из сухого сырья ГЛ, с помощью оригинального метода РНИИ здоровья. Уникальность технологии получения Гимнемы-25 состоит в том, что в процессе очистки используется не только этанол, но и другие органические спирты, с сохранением всех сапонинов, включая гимнемогенин, гимнемовые кислоты (ГК) I-XVIII и гим-немосапонины I-V, определяющие, по зарубежным данным антидиабетические свойства ГЛ (М.А. Feanny, 2007; L. Hong, 2001; N. Murakami, 1999).

Поскольку Гимнема-25 является экстрактом, ранее не исследовавшимся, было сочтено необходимым изучить его фармакологические свойства. На первом этапе работы было проведено изучение уровня гипогликемической активности экстрактов ГЛ в трех концентрациях Гимнема-25, Гимнема-50, Гимнема-75, отличающихся друг от друга содержанием ГК и гимнемосапо-нинов на интактных животных и на животных с экспериментальной патологией. Была выявлена зависимость антидиабетической активности экстрактов ГЛ от степени очистки экстракта, которая снижается в ряду:

Гимнема-25>Гимнема-50>Гимнема-75 По результатам исследования можно заключить, что наиболее активный экстракт гимнемы лесной - Гимнема-25 относится к группе малотоксичных веществ который (так же как и Гимнема лесная (К. Shapiro, 2002), оказывает гипогликемическое действие, а также снижает скорость и продолжительность гипергликемии при проведении глюкозотолерантных тестов. Учитывая, что в настоящее время в клинической практике РФ не используются растительные гипогликемические средства препаратом сравнения было выбрано синтетическое соединение - диабенол. При этом необходимо отметить, что гипогликемический эффект Гимнемы-25 уступает ему по величине активности.

Полученные результаты несколько превосходят имеющиеся литературные данные по величине активности экстракта ГЛ, полученного из сырья высушенных листьев ГЛ другими методами (J.J. Mier, 2001; E.R. Shanmuga-sundaram et al., 1990). Вероятно, это связано с тем, что в листьях тропической лианы ГЛ, помимо комплекса пентациклических тритерпенов, содержатся разнообразные органические соединения как — то: аминокислоты, растительные фенолокислоты которые в свою очередь могут существенно влиять на фармакологические эффекты препаратов ГК (G.Y Yen, 2003). Оригинальная технология очистки экстракта ГЛ, вероятно, позволяет сохранить комплекс активно действующих компонентов в составе Гимнемы-25, а их эффективность, возможно, обусловливается потенцирующим синергетическим эффектом компонентов гимнемозидного комплекса Гимнема-25 (П.М. Васильев и др., 2008). При изучении состава Гимнемы-25, помимо ГК, были обнаружены и некоторые органические вещества: сравнительно высокое содержание ультрафиолет-поглощающего соединения, по хроматографической подвижности относящегося к группе так называемых гидроксикоричных кислот и кумаринов; аминокислоты, которые, возможно, сами обладают определенным фармакологическим эффектом (В.А. Храмов и др., 2008). Известен, например, гипогликемический эффект производных хлорогеновой кислоты и антиоксидантное действие растительных фенольных соединений (А.А. Дьяков, 2002).

В ходе изучения механизма антидиабетического действия Гимнемы-25 были проведены эксперименты по изучению секретогенной активности экстракта. Выявленное увеличение количества инсулина в крови подопытных животных, сочетающееся с сахаропонижающим эффектом, вероятно, может явиться прямым доказательством инсулинотропного эффекта Гимнемы-25, возможно, основанного на стимулировании функционально способных Р - клеток островков Лангерганса. Полученные данные согласуются с литературными о том, что механизм действия ГЛ связан с повышением высвобождения инсулина из инсулинпродуцирующих клеток за счет увеличения Р-эндокриноцитов, а не за счет высвобождения инсулина по истощающему ти пу (Y. Ogawa, 2004), увеличением инсулина в плазме крови и достоверным снижением уровня глюкозы и количества гликилированного гемоглобина (N. Shigemasu et al, 2001).

Известно, что баланс клеточной популяции поддерживается благодаря равновесию процессов регенерации и клеточной гибели (Э.С. Северигина, 2002). Особенности эмбрионального развития поджелудочной железы и сохранение клеток-предшественниц являются предпосылками для возможной регенерации Р - эндокриноцитов путем неогенеза ПО из эпителия протоков, ациноинсулярной трансформации или по альтернативному пути - дифферен-цировке клеток-предшественниц, расположенных в ПО (В.Ф. Иванова, А.А. Пузырёв, 2006). Гимнема-25 при приёме в течение одной недели увеличивает количество Р-эндокриноцитов во всех отделах поджелудочной железы и способствует умеренно выраженной гипертрофии ядер Р-клеток островко-вого аппарата поджелудочной железы у интактных животных, что может свидетельствовать о повышении функциональной способности Р-клеток, присущей экстрактам ГЛ полученным различными способами экстракции (R.R. Chattopadhyay, 1996; N. Murakami, 1996). Кроме того Гимнема-25 повышает уровень экспрессии маркера пролиферации PCNA при иммунозави-симом диабете, что также является свидетельством наличия репаративных

280 процессов в ткани поджелудочной железы и который косвенно подтверждается умеренной экспрессией Ki-67. Так при применении Гимнемы-25 у животных с иммунозависимым диабетом отсутствовали морфологические признаки апоптоза, о чем свидетельствует выявленный низкий уровень экспрессии р53 (ключевой фермент каскадного цикла, участвующий в протеолизе белков цитоплазмы и ядра клетки) и каспазы 3 (маркер активации «апоптоза изнутри»). Вероятно, Гимнема-25 способствует регенерации эндокриноцитов поджелудочной железы как и за счет стимуляции клеток гастроэнтеропан-креатической системы, вырабатывающих GLP-1 и GIP (T.R. Vahi, 2007), так и за счёт способности инкретинов не только увеличивать уровень секреции инсулина, но и снижать скорость апоптоза [3-эндокриноцитов, а также стимулировать их пролиферацию (S.L. Aronoff, 2004; М.А. Feanny, 2007; Gymnema Review, 2003).

При исследовании экстрапанкреотических эффектов было выявлено, что при применении в течение 30 дней Гимнемы-25 в дозе 280 мг/кг регистрируется количественное увеличение поглощения глюкозы изолированными диафрагмами крыс. При этом эффективность Гимнемы-25 в среде без инсулина может свидетельствовать о её прямом воздействии на транспортную систему утилизации глюкозы и повышении чувствительности периферических тканей к инсулину у крыс с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным СД. Увеличение коэффициента поглощения глюкозы выявило его зависимость от присутствия инсулина в среде, что, вероятно, связано, на уровне тканей, с потенцирующим действием экстракта ГЛ на действие инсулина. Это дает еще один аргумент в пользу предположения о непосредственном влиянии Гимнемы-25 на углеводный обмен и о наличии экстрапанкреатических эффектов в механизме антидиабетического действия, что в свою очередь подтверждается данными литературы о влиянии ГЛ на повышение чувствительности периферических тканей к глюкозе (К. Baskaran, 2003).

Гимнема-25 достоверно ингибирует всасывание глюкозы и олеиновой кислоты, но с существенным замедлением последнего процесса. Тем не менее, установлено дозозависимое влияние Гимнемы-25 (при непосредственном добавлении в перфузат) на всасывание глюкозы и олеиновой кислоты, при этом по ингибирующей активности Гимнема-25 в концентрации 0,5 мг/л превалировала над таковой в дозе 0,25 мг/л. Полученные результаты полностью соответствуют имеющимся литературным данным по соответствующим эффектам ГЛ (К. Baskaran et al., 1990; А.К. Khare, 1983; L. Wang, 1995) и могут объясняться наличием различных внутриклеточных механизмов утилизации глюкозы и жирных кислот, обусловленных индивидуальными особенностями химического строения гимнемовых кислот, способных независимо друг от друга блокировать транспортеры как олеиновой кислоты, так и глюкозы (I. Fushiki, 2003). Помимо этого в ходе работы показано, что практически полное восстановление процессов поглощения жирной кислоты и глюкозы происходит спустя 6 часов после отмены препарата. В данной временной точке регистрируются значения, тождественные показателям у интактных животных, что свидетельствует об обратимости действия Гимнемы-25.

Известно, что основная роль в развитии сосудистых осложнений диабета принадлежит неферментативному аутоокислительному гликозилирова-нию и окислительному стрессу, которые вызваны нарушением углеводного обмена (М.И. Балаболкин и др., 2005). При исследовании фармакологических свойств ГК, необходимых для профилактики развития отдаленных последствий СД, было выявлено, что Гимнема-25 в дозе 280 мг/кг обладает антиокси-дантной активностью, снижая образование ТБК-реактивных продуктов на 82,53% (р<0,001) у животных с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным СД, превышая при этом эффективность препарата сравнения растительного происхождения танакан (37% в дозе 12 мг/кг). Полученные результаты получили подтверждение и при сравнении активности веществ по величине константы ингибирования ИК50 на модели аскорбатиндуцируемого ПОЛ. Так было выявлено, что Гимнема-25 оказывает 50% -эффект в значительно меньших дозах по сравнению с препаратом сравнения.

Кроме того, было установлено, что развитие стрептозотоцинового диабета сопровождается повышением уровня первичных продуктов ПОЛ - КД по сравнению с интактными животными. Так наибольший темп роста КД (на 39,3%) был отмечен в плазме крови при незначительном росте этого показателя в эритроцитах. Нарастание количества КД в указанных средах может вызвать повреждение и частичное лизирование клеточных мембран эритроцитов и повреждение эндотелия сосудов (М.И. Балаболкин, 2005). Формирование патологии также сопровождалось увеличением уровня конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида. Максимальные изменения выявлены в плазме, где уровень этого продукта был на 20,5% больше, чем в группе интактных животных. Вероятно, что столь существенное усиление указанных процессов может привести к усилению процессов пероксидациии липидов и изменению качественных характеристик липопротеидов с их накоплением в пенистых клетках, являющихся основой атеросклеротического поражения крупных сосудов, и принимают участие в повреждении эндотелиальных клеток, способствуя развитию микроангиопатии (S.F.Wolf, 1993).

Кроме того, течение стрептозотоцинового диабета сопровождается снижением активности супероксиддисмутазы. Наиболее выраженное уменьшение количества фермента отмечается в плазме крови крыс, что, по-видимому, ведет к накоплению продуктов окисления и увеличивает вероятность повреждения тканей (В.А. Барсель и др., 1999). В ходе эксперимента выяснилось, что после курсового введения Гимнемы-25 регистрировалось достоверное снижение количества КД в красных клетках крови, при этом несколько уступая по эффективности препарату сравнения танакану. Установлено, что после применения Гимнемы-25 особенно низкий уровень МДА (на 12,2%, р<0,05, по сравнению с группой контроль-диабет) отмечается в эритроцитах. Таким образом, Гимнема-25 проявляет антиоксидантные свойства, влияя на образование как начальных, так и конечных продуктов пере-кисного окисления и несколько увеличивая активность антиоксидантных ферментов в плазме крови крыс с экспериментальным СД, но при этом уступает по эффективности танакану. Полученные результаты также свидетельствуют о некоторой тенденции к восстановлению дисбаланса между прооксидантами и аитиоксидантной системой и вполне согласуются с результатами ранее проведенных исследований (отчет СКС «Альянс от 12.01.05).

Следующим этапом работы было выяснение влияния Гимнемы-25 на реологические свойства крови, поскольку при СД активация свободно-радикальных процессов обуславливает нарушения гемореологических свойств крови, реализуемые через повреждения циркулирующих эритроцитов и соответственно изменение вязкостных характеристик крови (A.M. Шилов и др., 2008). Так было выявлено, что Гимнема-25 оказывает влияние на реологические свойства крови, о чём свидетельствует статистически значимое снижение показателей вязкости крови по отношению к группе крыс со стрептозотоцин-индуцированным СД во всем диапазоне скоростей сдвига и снижение индекса агрегации эритроцитов в 1,4 раза по отношению к контрольной группе крыс с СД. Так как повышенная вязкость крови явлется независимым фактором риска для СД вследствие нарушения микроциркуляции, то влияние Гимнемы-25 на уменьшение вязкости крови в капиллярной системе имеет особую значимость, поскольку показано, что сопротивление на уровне микроциркуляторного русла составляет до 70% общего сосудистого сопротивления (О.В. Коркушко, В.Ю. Лишневская, 2002).

Основными факторами, создающими феномен вязкости крови кроме объёмной концентрации эритроцитов, свойств и состава плазмы, клеточной агрегации, является деформируемость клеточных элементов (Л.Н. Катюхин, 2005). Будучи важнейшим свойством эритроцитов, деформируемость обусловливает их способность выполнять транспортную функцию (К.М. Аносова и др., 2006). В представленном исследовании с использованием фильтрационного теста было выявлено, что Гимнема-25 при курсовом применении увеличивала скорость фильтрации взвеси эритроцитов на 37,9%, что по литературным данным (В.В. Зинчук, 2001) может свидетельствовать об о влиянии Гимнемы-25 на внутреннюю вязкость, клеточную геометрию и на свойства мембраны обеспечивающие форму и эластичность эритроцита. Подтверждением данного тезиса можно считать зарегистрированное достоверное увеличение индекса доставки кислорода на 21,3%.

Немаловажным фактром в снижении деформируемости эритроцитар-ных мембран является снижение поверхностного заряда мембраны эритроцита (Ю.В. Котовская, 2005). Гимнема-25 повышет интенсивность флуоресценции зонда ДСМ4" в эритроцитарной взвеси в 1,4 раза по сравнению с кон-тролем-диабет, а значит, препятствует агрегации эритроцитов и снижает травматизацию и разрушение клеток в процессе гемоциркуляции. А это, в свою очередь, предотвращает выделение в кровь факторов свертывания, улучшая процессы микроциркуляции (Г.Е. Ройтберг и др., 2007).

Известно, что повышенная агрегация эритроцитов характерная для СД приводит к нарушению транскаппилярного обмена, выбросу биологически активных веществ, и стимулирует адгезию и агрегацию тромбоцитов (О.П. Шевченко и др., 2006). Гимнема-25 при курсовом введении снижала выраженность основных проявлений гиперагрегации тромбоцитов, что подтверждалось уменьшением величины индекса АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в 2 раза (по сравнению с контролем-диабет), превосходящей по эффективности танакан, при этом и Гимнема-25 и танакан не оказывали существенного влияния на показатели коагуляционНого гемостаза. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии Гимнемы-25 на уменьшение функциональной активности тромбоцитов и их способности к внутрисосудистой агрегации, что, в конечном счете, препятствует развитию сосудистых поражений (М.Н. Мамедова и др., 2003).

По результатам проведенных исследований можно констатировать, что Гимнема-25 также эффективно снижает уровень глюкозы в крови и сопоставима по эффекту с препаратом «Рго-b» (США) и другими экстрактами ГЛ, полученными с помощью различных запатентованных методов водно-спиртовой экстракции, описанных в литературе (Gymnema sylvestre, 2003). Кроме того, Гимнема-25 восстанавливает структурную целостность инсули-нопродуцирующих клеток поджелудочной железы, задерживает всасывание углеводов и олеиновой кислоты в кишечнике, при экспериментальных формах сахарного диабета нормализует уровень глюкозы в крови, снижает уровень холестерина и влияет на липиды плазмы крови, улучшает реологические свойств крови и уменьшает выраженность процессов пероксидации.

Проанализировав вышеизложенные данные, на следующем этапе работы мы посчитали возможным оптимизировать Гимнему-25 в ранее не патентованных комбинациях отечественными источниками биофлавоноидов - экстрактами гребней винограда и девясила высокого (патент РФ № 2289419 от 20.12.2004 г.) с целью создания растительной Композиции, позиционируемой как потенциальный антидиабетический лекарственный препарат с антиокси-дантными и гемореологическими свойствами (табл. 6.1).

В настоящее время недостаточно средств, с помощью которых возможно произвести направленную блокаду клеток, принимающих участие в механизмах деструкции Р-клеток, приводящих к развитию сахарного диабета, его профилактике и устранению сопутствующих осложнений. Выбор экстракта девясила высокого был обусловлен тем, что в основе его механизма действия лежит усиление продукции регуляторных цитокинов при аутоиммунном диабете (Т. Kobayashi et al., 2002), снижается уровень у-интерферона и соответственно его повреждающее действие на клетки поджелудочной железы, уменьшается деструкция клеток, нормализуется уровень инсулина в крови. Сухой экстракт девясила в комплексном лечении устраняет нарушения толерантности к глюкозе и оптимизирует ее метаболизм, обладает превентивным действием на деструктивный процесс в поджелудочной железе (Q.H. Song, 2002).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Воронкова, Мария Павловна

1. Автандилов, Г.Г. Основы количественной патологической анатомии / Г.Г. Автандилов М.: Медицина, 2002. - 240 с.

2. Адо, В.А. Подавление аллергических реакций низкомолекулярными соединениями / В.А. Адо, Л.А. Горячкина Минск, 1971, - 40 с.

3. Аметов, А.С. Факторы риска сахарного диабета. Роль ожирения. // Русский медицинский журнал T.l 1 - № 27 - 2003 - С. 1447-1480.

4. Анализатор вязкости крови / Н.А. Добровольский и др. // Реологические исследования в медицине: сб. науч. тр. М.: НЦХ РАМН, 1998. - с.45-51.

5. Аннотированный отчёт «Изучение гипогликемических свойств биологически активного вещества (гимнемы лесной) / Отчет СКС «Альянс» от 28.05.2003 и 18.10.03 // Под рук. А.А. Спасова и др. // Волгоград, ВолГМУ. -2003.- 12 с.

6. Антигипергликемические и антиоксидантные эффекты «Диа-(3» у больных сахарным диабетом 2 типа / М.И. Балаболкин и др. // Клиническая эндокринология\\ реф. сб. новости науки и техники 2007.- № 4.- С. 6-14.

7. Анциферов, М.Б. Исследование UKPDS и основные принципы перо-ральной терапии сахарного диабета 2 типа / М.Б. Анциферов // Ожирение, метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа; под общ. ред. И.И. Дедова М., 2000.- 111с.

8. Анциферов, М.Б. Новые подходы к лечению сахарного диабета типа 2: Глюкагогоподобный пептид-1 и эксенатид (БАЕТА) / М.Б. Анциферов, Л.Г. Дорофеева // Фарматека. 2007. - № 11. - С. 4-23.

9. Артериальная гипертония и ожирение / О.П. Шевченко, Е.А. Праскур-ничий, А.О. Шевченко // М. Реофарм. -2006. 213 с.

10. Арутюнян, А.В. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма / А.В. Артюнян, Е.Е. Дубина, Н.Н. Зыбина СПб., 2000. - 294 с.

11. Бабичев, В.Н. Нейрогуморальная регуляция овариального цикла\ В.Н. Бабичев М.: Медицина, 1984. - 240 с.

12. Балаболкин, М.И. Влияние метформина («Polfa) на показатели пере-кисного окисления липидов у больных сахарным диабетом 2 типа / М. И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская // Клин, фармакология и терапия. -2001.-№4.-с. 89-90.

13. Балаболкин, М.И. Лечение сахарного диабета и его осложнений / М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова, В.М. Креминская. Москва, 2005 - 512 с.

14. Балаболкин, М.И. Роль гликирования белков, окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений при сахарном диабете / М.И. Балаболкин // Сахарный диабет. 2002, - № 5. - С. 8 - 16.

15. Балаболкин, М.И. Существуют ли возможности улучшения сахарос-нижающей терапии сахарного диабета типа II? / М.И. Балаболкин // Информационный бюллетень РНИИ Здоровья.- М., 2006. №' 1.- С. 1-3.

16. Баранов, В.Г. Экспериментальный сахарный диабет / В.Г. Баранов -Л., 1983.-300 с.

17. Баркаган, З.С. Основы диагностики нарушений гемостаза / З.С. Барка-ган, А.П. Момот М.: «Ныодиамед», 2001. - С. 285.

18. Беленький, М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / М.Л. Беленький. Л., - 1963. - 152 с.

19. Бобырева, Л.Е. Влияние фенольных антиоксидантов на развитие ал-локсанового диабета у крыс. / Л.Е. Бобырева // Эксп. клин. фарм. 1997. - Т. 60, № 3.- С. 51-53.

20. Болдырев, А.А. Двойственная роль свободнорадикальных форм кислорода в ишемическом мозге / А.А. Болдырев // Нейрохимия 1995. - Т. 12, № 3. - С. 246-257.

21. Бондарь, Т.П. Лабораторно-клиническая диагностика сахарного диабета и его осложнений / Т.П. Бондарь, Г.И. Козинец М.: Медицинское информационное агенство, 2003. - 88 с.

22. Боровая, Т.Г. Влияние экспериментальной гиперпролактинемии на половой цикл и фолликулогенез / Т.Г. Боровая, О.В. Волкова // Бюл. эксперим. биологии и медицины 1994. - № 9 - С. 326-328.

23. Василенко, В.В. Сахарный диабет. Место комбинированных сахарос-нижающих препаратов / В.В. Василенко // Русский медицинский журнал 2007. - №1. - С. 468.

24. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М., 1972. - 124 с.

25. Влияние «Диа-р» на регенерацию Р-клеток поджелудочной железы. / М.П. Самохина и др. // Информационный бюллетень РНИИ Здоровья.- М., 2006.-№ 1.-С. 6-7.

26. Влияние Гимнемы лесной на регенерацию Р-клеток поджелудочной железы / В.Б. Писарев и др. // Сб. матер. XIV Национального конгресса «Человек и лекарство» 2007. - Р. 863.

27. Влияние зиксорина на фармакокинетику антипирина у интактных и сенсибилизированных морских свинок / Т.Г. Хлопушина и др.. // Бюл. экспер. биол. 1991. - № 7. - с. 67-69.

28. Влияние нафтидрофурила на перекисное окисление липидов сыворотки и мембраны эритроцитов больных инсулинзависимым сахарным диабетом /

29. A.А. Кубатиев и др. // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. 1996. - Т. 122, №9.-С. 338-41.

30. Возможности неинвазивного конроля показателей, характеризующих реологические и коагуляционные свойства крови / О.А. Царев и др. //Ангиология и сосудистая хирургия. 2004, - Т. 10. - С. 52-53.

31. Волчегорский, И.А. Тест «принудительное плавание» / И.А. Волче-горский М. - 2000. - 111 с.

32. Галенок, В.А. Гемореология при нарушениях углеводного обмена /

33. B.А. Галенок, Е.В. Гостинская, В.Е. Диккер. Новосибирск: Наука, 1987. -232 с.

34. Гипогликемические свойства экстракта Гимнемы лесной / А.А. Спо-асов и др. // Вестник ВолГМУ. 2007. - №1 (12). - С. 78-72.

35. Гительзон, И.И. Закономерности распределения эритроцитов по стойкости к различным гемолитикам / И.И. Гительзон, И.А. Терсков // Вопросы биофизики, биохимии и патологии эритроцитов. 1961. - С. 30-59.

36. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц; пер. с англ.-М., Практика, 1998. 459 с.

37. Гущин, А.Г. Оценка комплекса гемореологических параметров при эритроцитозе / А.Г. Гущин, А.В.Муравьев, И.К. Шаечкина // Физиология человека. 2000.-№ 2. - С.111-114.

38. Дедов, И.И. Введение в диабетологию: Руководство для врачей / И.И. Дедов, В.В. Фадеев. М.: Берег, 2000. - 300 с.

39. Дедов, И.И. Влияние антиоксидантов на состояние ПОЛ и функцию клеток у больных с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом / И.И. Дедов, В.А. Горелышева, О.Н. Смирнова // Проблемы эндокринологии.- 1995.- Том 41, №5.-С. 16-20.

40. Дедов, И.И. Клинические рекомендации. Эндокринология / И.И. Дедов, Г .А. Мельниченко М.: ГЭОТАР МЕДИА, 2008. - 304 с.

41. Дедов, И.И. Сахарный диабет и артериальная гипертензия / И.И. Дедов, М.В. Шестакова. М.: МИА, 2006. - 344 с.

42. Дедов, И.И. Экономические проблемы сахарного диабета в России / И.И. Дедов, С.В. Сунцов, С.В. Кудряков // «Сахарный диабет»- 2000.- № 3. -1580.

43. Демидова, И.Ю. Фармакотерапия сахарного диабета II типа / И.Ю.Демидова // РМЖ. 1999. - № 7. с. 18.

44. Дефицит витаминов у больных сахарным диабетом пути компенсации / В.Д. Забелина // Consilium provizorum. - 2004. - № 5. - С. 13.

45. Добрецов, Г.Е., Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов / Г.Е. Добрецов. М.: Наука. 1989. - 277с.

46. Древаль, А.В. Взаимосвязь HbAlc и параметров перорального теста толерантности к глюкозе у больных сахарным диабетом 2 типа. / А.В. Древаль, Редькин Ю.А., Богомолов В.В. // Проблемы эндокринологии М. - 2005. - Деп. № 53913.

47. Дудченко, Г.П. Противодиабетическая активность производных бен-зимидазола: дис. д-ра биол. наук: 14.00.25 / Г.П. Дудченко; Волг. мед. ун-т, 2001.-331 с.

48. Зборовский, А.Б. Осложнений Фармакотерапии / А.Б. Зборовский, И.Н. Тюренков М.: Медицина. - 2003 - 333 с.

49. Зинчук, В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты / В.В. Зинчук // Физиол. чел. 2001. - № 2. - С. 154-160.

50. Зинчук, В.В. Роль кислородосвязывающих свойств крови в поддержании прооксидантно-антиоксидантного равновесия ограпнизма / В.В. Зинчук, М.В. Борисюк // Успехи физиологических наук. 1999. - №3. - С. 38-48.

51. Иванов, К.П. Роль лейкоцитов в динамике микроциркуляции в норме и при патологии / К.П. Иванов, Н.Н. Мельникова // Общ. биол. 2004. - № 1. - С. 3-13.

52. Иванова, В.Ф. Структурно-функциональные изменения в поджелудочной железе белой крысы при введении глюкозы / В.Ф. Иванова, А.А. Пузы-рёв // Морфология. 2006. - Т. 129. - С.67-71.

53. Избыточный вес и ожирение / Д.Г. Бессесен, Р. Кушнер. М., 2006 -240 с, ил.

54. Изменения реологических свойств крови у больных с метаболическим синдромом / A.M. Шилов и др. // РМЖ № 2. - 2008. - С. 18.

55. Йена, С.С. Репродуктивная эндокринология: пер. с англ; под ред. С.С Йена, Р.Б. Джарффе. М., 1998. - Т. 1. - 704 с.

56. Катюхин, JI.H. Реологические свойства эритроцитов. Современные методы исследования / JI.H. Катюхин // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1995. - Т 81. - №6. - С. 122-129.

57. Катюхии, JI.H. Роль реологических детерминант эритроцитов в регуляции структуры кровотока. / JI.H. Катюхин. // Клин. лаб. диагностика. 2001. -№ 12. - С. 22.

58. Катюхин, JI.H. Роль реологических параметров эритроцитов в поддержании структуры кровотока у стрессированных крыс / JI.H. Катюхин // Авиакосмос и экологическая медицина. 2002. - № 1. - С. 64-67.

59. Кеттайл, В.М. Патофизиология эндокринной системы: пер. с англ./

60. B.М. Кеттайл, Р.А. Арки. М.: «БИНОМ», 2007. - 336 е., ил.

61. Климов, А.Н. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. -С+Пб: «Питер», 1999. 512 с.

62. Кондратьева, JI.B. Бигуаниды в лечении сахарного диабета 2 типа. Современный взгляд на проблему/ JI.B. Кондратьева // Русский медицинский журнал. 2007. - №1, - С. 305.

63. Коррекция тромбоцитарно-сосудистого гемостаза при метаболическом синдроме / И.Н.Медведев и др. // Клиническая медицина. 2006. - № 1.1. C.46.

64. Косолапов, В.А. Окислительный стресс в патогенезе сахарного диабета и его осложнений / В.А. Косолапов, М.П. Самохина, А.А. Спасов // Информационный бюллетень РНИИ Здоровья. 2006. - № 1- С. 8.

65. Крылов В.Н. Типовые изменения электрофоретической подвижности эритроцитов при стрессовых воздействиях / В.Н. Крылов, А.В. Дерюгина // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2005. - № 4. - С. 364-366.

66. Кубатиев, А.А. Индуцированная АДФ и тромбином мобилизация внутриклеточного Са2+ в тромбоцитах больных сахарным диабетом с сосудистыми осложнениями / А.А. Кубатиев, Т.С. Балашова, Е.Н. Томилова // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1996. - № 1. - С. 112-115.

67. Лаикин, В.З. Изучение аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов тканей при помощи теста с 2-тиобарбитуровой кислотой. / В.З. Ланкин,

68. С.М. Гуревич, Е.Б Бурлакова // Труды московского общества испытателей природы. М. - 1975. - Т. 52. - С. 73-78.

69. Лебедева, Е.А. Фармакологическая блокада гликозилирования белков при сахарном диабете производными сульфонилмочевины и бигуанидами / Е.А. Лебедева // Эксп. и клин, фармакология. 1996. - №5. - С.40-42.

70. Лекарственные растения / А.Ф. Лебеда и др.. М.: АСТ-Пресс Книга,2004.-296 с.

71. Люсов, В.А. Метод графической регистрации агрегации тромбоцитов и изменения ее при ишемической болезни сердца / В.А. Люсов, Ю.Б. Белоусов // Кардиология. 1971. - № 8. - С.459-461.

72. Максимов, Г.В. Исследование роли вязкости и проницаемости плазматической мембраны эритроцита в изменениях связывания кислорода гемоглобином при сахарном диабете / Г.В. Максимов // Бюллетень эксп. биологии и мед.2005. Т.140, №11. - С. 519-522.

73. Мамедов, М.Н. Возможны ли диагностика и лечение метаболического синдрома в реальной практике? / М.Н. Мамедов // Лечащий врач. 2006.- № 6. -С.18.

74. Маньковский, Б.Н. Лечение сахарного диабета второго типа фарма-коэкономические соображения. / Б.Н. Маньковский // Медицинская газета «Здоровье Украины». - 2004. - №108. - С. 14-20.

75. Матюшичев, В.Б. Связь электрофоретической подвижности эритроцитов с их концентрацией в крови крыс /В.Б. Матюшичев, В.Г. Шамратова // Бюллетень эксп. биологии и мед. 2005, - Т. 139, № 3. - С. 250-51.

76. Метаболический синдром / Под редакцией Г.Е. Ройтберг. // Москва, «МЕДпресс-информ», 2007. 300 С., ил.

77. Мирсаева, Г.Х. Влияние танакана на свободно-радикальное окисление и систему гемостаза у больных гемореологической лихорадкой с почечным синдромом / Г.Х. Мирсаева, Р.Ф. Фазлыева, Ф.Х. Камилов // Нефрология. -2001. -№4. С49-54.

78. Муравьев, А.В. Реологические свойства крови и транспорт кислорода при долговременной адаптации к мышечным нагрузкам. / А.В. Муравьев, А.Г. Гущин, А.А. Муравьев // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2001. - № 7. -С. 895-900.

79. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов / З.А. Габбасов и др. // Лабораторное дело. 1989. - №10. - С. 15-18.

80. О лекарственных средствах: Федеральный закон РФ // Собрание законодательства РФ, 1998. № 26. - Ст. 2.

81. О лекарственных средствах: Федеральный закон РФ // Собрание законодательства РФ, 2000. № 2. - Ст. 2.

82. О лекарственных средствах: Федеральный закон РФ // Собрание законодательства РФ, 2002. № 1, часть I. - Ст. 2.

83. О лекарственных средствах: Федеральный закон РФ // Собрание законодательства РФ, 2003. № 2. - Ст. 167.

84. Положение о Министерстве здравоохранения Российской Федерации // Собрание законодательства РФ, 2002. №18. - Ст. 1771.

85. Потемкин, В.В. Метаболические показатели и структура мембран эритроцитов при ожирении и метаболическом синдроме у женщин / В. В. Потемкин, С.Ю.Троицкая, А.Г. Максина // Российский медицинский журнал. -2006. №1. - С.35.

86. Прилепская, В.Н. Ожирение Клиника, Диагностика, лечение / В.Н. Прилепская, Е.В. Цаллагова. М., «МЕДпресс-информ», 2007 - 98 с.

87. Рациональная фармакотерапия заболеваний эндокринной системы и нарушения обмена веществ. Руководство для практикующих врачей. / под ред. И.И. Дедова, Г.А. Мельниченко. М.: Литтера, 2006. - 1080 с.

88. Результаты клинических исследований нового антидиабетического препарата / М.И. Балаболкин и др. // Бюллетень российского НИИ здоровья — 2007.-№2.-С. 13-18.

89. Ройтман, Е.В. Биореология. Клиническая гемореология. Фундаментальные основы, показатели, приборы / Е.В. Ройтман // Клип. лаб. диагн. 2001,- № 5. С. 25-32.

90. Российская энциклопедия биологически активных добавок / В.И. Петров и др.. М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2007. - 1062с.

91. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / 3-е изд., доп. и перераб.; под общ. редакцией С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина.- Казань, 2004. 456 с.

92. Руководство по проведению клинических исследований новых лекарственных средств / под ред. Р.У. Хабриева, И.А. Денисова, В.Б. Герасимова, В.Г. Кукеса. М., 2005. - 359 с.

93. Саноцкий, И.В. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений / И.В. Саноцкий, И.П.Уланова. М.: Медицина, 1975. - 328 с.

94. Саноцкий, И.В. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм / И.В. Саноцкий, В.Н. Фоменко М.: Медицина, 1979. - 33 с.

95. Саркисов, Д.С. Микроскопическая техника: руководство / Д.С. Сарки-сов, Ю.Л. Перов. М.: Медицина, 1996. - 544с.: ил.

96. Сахарный диабет у детей и подростков / И.И. Дедов, Т.Л. Кураева, В.А. Петеркова. М., 2007. - 160 с.

97. Сахарный диабет: патогенез, классификация, диагностика и лечение: пособие для врачей / И. И. Дедов и др.. Москва, 2003, - 171с.

98. Севергина, Э.С. Инсулинзависимый сахарный диабет взгяд морфолога / Э.С. Севергина. - М.: Издательский дом Видар - М, 2002. - 152 е., ил.

99. Семешко, С.Г. Общая антиоксидантная активность слезной жидкости. / С.Г. Семешко, P.P. Фархутдинов // Клин. лаб. диаг. 2002. - № 24. - С. 33-34.

100. Синдром диабетической стопы. Атлас для врачей-эндокринологов /

101. М.Б. Анциферов и др.. М., 2002 - С.80.

102. Синдром повышенной вязкости крови / М.Б. Плотников и др. // Бюлл. Экспериментальной биологии и медицины. 1998. - Т. 126, № 8. - С. 18.

103. Смирнов, А.Н. Элементы эндокринной регуляции: научное издание / под ред. акад. РАМН В.А. Ткачука. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 352 е.: ил.

104. Сорокина, А.А. Фитотерапия сахарного диабета у детей / А.А. Сорокина, В.П. Кукес, А.К. Углицких // Медицинский научный и учено методический журнал. - 2001.- № 4. - С. 14.

105. Спасов, А.А. Гимнема лесная / А.А. Спасов, А.П. Ефремов // Информационный бюллетень РНИИ Здоровья. М., 2006. - № 1. - С. 9-10.

106. Спасов, А.А. Магний в медицинской практике / А.А. Спасов. Волгоград, 2000 - С 269.

107. Спасов, А.А. Проблема диабета, методы профилактики и лечения / А.А. Спасов, М.П. Самохина // Российский НИИ здоровья, Информационный бюллетень М., 2006. - № 1. - С.4.

108. Справка о нецелесообразности изучения канцерогенных эффектов мультикомпонентного лекарственного средства на основе экстракта гимнемы лесной (диа-Р) / Отчет СКС «Альянс» от 2.08.2005 // Под рук. А.А. Спасова и др. // Волгоград, ВолГМУ. 2008. - 32 с.

109. Токсикология лекарственных средств. Издание второе дополненное / Т.А. Гуськова М.: МДВ., 2008. - 161 с.

110. Трофимов, А.В. Нейрокринные клетки желудочно-кишечного тракта в моделях преждевременного старения / А.В. Трофимов, И.В. Князькин, И.М. Кветной Спб.: ДЕАН, 2005.- 208 с.

111. Фармакологические свойства Гимнемы лесной / А.А. Спасов и др. // материалы 1-го международного съезда фитотерапевтов «Современные проблемы фитотерапии». М., 2006. - С. 228-235.

112. Фирсов, Н.Н. Классификация тяжести гемореологических расстройств / Н.Н. Фирсов, Т.В. Коротаева, М.А. Вышлова // Тромбоз, гемостаз и реология. 2003.-№ 1. - С. 14-15.

113. Фисенко, В.П. Анализ наиболее перспективных исследований по созданию новых лекарственных средств / В.П. Фисенко, А.П. Дрожжин, М.Т. Абидов. Научный центр экспертизы и государственного контроля лекарственных средств Минздрава России, 2000. - 48 с.

114. Функциональные методы исследования в эндокринологии / З.И. Цюхно и др.. Киев: Здоровье, 1981. - 240с.

115. Чазова, И.Е. Методы диагностики инсулинорезистентности / И.Е. Чазова, В.Б. Мычка // Consilium medicum. 2004. - № 1. - С. 186.

116. Эллиниди, В.Н. Практическая иммуногистоцитохимия: методические рекомендации / В.Н. Эллиниди, Н.В. Аникеева, Н.А. Максимова СПб.: ВЦЭРМ МЧС России, 2002. - 36 с.

117. Эндокринология: национальное руководство / И.И. Дедов. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - С. 1072.

118. Якусевич, В.В. Синдром гипервязкости при артериальной гипертонии и его лечение тренталом / В.В. Якусевич, А.В. Муравьев, Л.Г. Зайцев // Клин, фармакол. и терапия. 1998. - №2. - С. 53-54.

119. Antidiabetic properties of Dia-P: experimental and clinical investigation / A.A. Spasov et al. // International conference on diabetes. 2007. P. 7-12.

120. A genomic perspective on protein tyrosine phosphatases: gene structure, pseudogenes, and ge linkage // JN. Andersen et al. // Vecchio RD,FASEB J. 2004. -№18 -P. 8-30.

121. Abbitt, K.B. Rheological properties of the blood influencing selectin-mediated adhesion of flowing leukocytes / K.B. Abbitt, G.B. Nash // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2003. - № 1. - P. 229-240

122. Ahmed, M. Molecular modeling of SWR-0342SA, a beta3-selective agonist, with betal- and beta3-adrenoceptor / M. Ahmed, M. Ishiguro, T. Nagatomo // Life Sci. 2006. - №78. - P. 2019-23.

123. Ahren, B. Gut peptides and type 2 diabetes mellitus treatment / B. Ahren // Curr Diab Rep. 2003. - № 3. P. 365-372.

124. American Conference of Governmental Industrial Hygienists. Documentation of Threshold Limit Values for Chemical Substances and Physical Agents and Biological Exposure Indices for 2001. Cincinnati, OH. 2001. - P. 1.

125. American Diabetes Association: Clinical practice recomendations .- Diabetes Care (suppl. l).-2000. P. SI-SI 16.

126. An extract of Gymnema sylvestre leaves and purified gymnemic acid inhibits glucose-stimulated gastric inhibitory peptide secretion in rats / T.Fushiki et al. // J Nutr. 1992. - Vol. 122, № 12. - P. 2367-2440.

127. Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin dependent Diabetes mellitus patients / K. Baskaran et al. // J. Ethnopharma-col. 1990. - № 30. - P. 295 - 305.

128. Antihyperglycemic effects of gymnemic acid IV, a compound derived from Gymnema sylvestre leaves in streptozotocin-diabetic mice / Y. Sugihara et al. // J Asian Nat Prod Res. 2000. - № 2. P. 321-7.

129. Aronoff, SL. Glucose metabolism and regulation beyong insulin and glucagon / SL. Aronoff, K. Berkowitz, B. Shireiner // Diabetes Spectrum. 2004. -№17.-P. 183-90.

130. Baggio, LL. Glucagon-like peptide-1 and glucagon-like peptide-2. Best Pract Res / LL. Baggio, DJ. Drucker // Clin Endocrinol Metab. 2004. - № 18. - P. 531-554.

131. Bailey, C.J. Potential new treatments for type 2 diabetes. / С J. Bailey // Diabetologia. 2000. - Vol.43, №21. - P. 259-265.

132. Baskurt, O.K. Blood rheology and hemodynamics / O.K. Baskurt, H.J. Meiselman // Semin. Thromb. Hemost. 2003. - № 29. - P. - 435-450.

133. Baskurt, O.K. Protection of erythrocytes from sub-hemolytic mechanical damage by nitric oxide mediated inhibition of potassium leakage / O.K. Baskurt, M. Uyuklu, H.J. Meiselman // Biorheology. 2004. - № 41. - P. 79-89.

134. Beer, T Prognosis in malignant mesothelioma related to MIB1 proliferation index and histological subtype. / T. Beer, R. Buchanan, A. Matthews, R. Strad-ling, N. Pullinger, R.Pethybridge // Human Pathol 1998. - № 15. - P. 146.

135. Bertalli, E. Association between endocrine pancreas and ductal system. More than an epiphenomenon of endocrine differentiation and development? / E. Bertalli, M. Bendayan //J. Histocem. & Cytocem. 2005. - P. 1071-1086.

136. Betta-cell response to metformin-glidenclamide combination tablets (Glucovance) in patient with type 2 diabetes / S. Bruce et al. // Int.J Clin. Pract. -2007. № 60(7). - P. 783-9.

137. Bhakuni, D.S. Screening of Indian plants for biological activity: Part III. /D.S. Bhakuni, M.L. Dhar, M.M. Dhar, B.N. Dhawan // Ind. J. Exp. Biol.- 1971.- № 9.-P. 91-102.

138. BIBRA Working Group; ТА: Toxicity Profile. TNO BIBRA Intl 2001.

139. Birks, J. Ginkgo biloba for cognitive impairment and dementia / J. Birks, E.V. Grimley, M. Van Dongen // Cochrane Database Syst Rev. 2002. - №4. - C.312.

140. Bishayee, A. Hypolipidaemic and antiatherosclerotic effect of oral Gym-nema sylvestre R.Br, leaf extract in albino rats fed on a high fat diet / A. Bishayee, M. Chatterjee // Phytotherapy Res. 1994. - Vol. 8, № 2.- P. 118-120.

141. Blood rheology in acute myocardial infarction: effects of high dose i. v. streptokinase compared to placebo / H.R. Arntz et al. // Eur. Heart J. - 1992. -Vol. 13.-№2. - P. 275-280.

142. Bone, K. Phytotherapy Review & Commentary Gymnema: A Key Herb in the Management of Diabetes, FNIMH, FNHAA / K. Bone. // 2002.

143. Born, G. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. / G. Born // Nature. 1962. - №9. - P. 927-936

144. Bozdouani, О. Effect of the combination of glibenclamide, fn ATF-dependent potassium Channel Blocker, and Metoprolol, a cardioselective p-adrenoreceptor blocker / O. Bozdouani, J. Lepr // DiabeticMedicine. 2006. - №23(2) - P128-133.

145. Bradley, R. Algorithm for complementary and alternative medicine practice and research in type 2 diabetes / R. Bradley // J. Altern Complement Med. 2007. -№13(1).-P. 159-75.

146. Brichard, S.M. The role of vanadium in the management of diabetes. // S.M. Brichard, J.C. Henquin // Trends Pharmacol Sci.- 1995,- Vol. 16.- N8.- P. 265335.

147. Brubaker, PL. Minireview: Glucagon-like peptides regulate cell proliferation and apoptosis in the pancreas, gut, and central nervous system / PL. Brubaker, DJ. Drucker // Endocrinology. 2004. - № 145. P. 2653-2659.

148. Buse, JB, Type 2 diabetes mellitus. / In: Larsen PR, Kronenberg HM, Melmed S, Polonsky KS, eds. // Williams Textbook of Endocrinology. 2003. - № 10. - P. 1427-1483.

149. Butler, A.E. p-cell deficit and increased P-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes / A.E. Butler, J. Janson, B. Bonner-Weir // Diabetes. 2003. - P. 102110.

150. Chini, E. N. Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate: a new intracellular second messenger / E. N. Chini, F. G. S. De Toledo // Am J Physiol Cell Physiol. 2002.-№ 282 (6).-C. 1191 - 1198.

151. Clayton, G.D. Patty's Industrial Hygiene and Toxicology / G.D. Clayton, F.E. Clayton // Toxicology. 1994. - Vol. 2A-F. - P. 3566-73567.

152. Clustem expression during regeneration of pancreatic islet P-cell in streptozotocin-induced diabetic rats / B.M. Kim et al. // Diabetologia. 2001. - P. 2192-2202.

153. Combined Inhibitors of Carcinogenesis: Effect on Azoxymethane-induced Intestinal Cancer in Rats / N.D. Nigro et al. // J. Natl. Cancer Inst. 1982. -№69(1).-P. 103-107.

154. Cowan, J.A. Structural and catalytic chemistry of magnesium-dependent enzymes / J.A. Cowan // Biometals. -2002. Vol. 15, № 3. - P. 225-235.

155. C-peptide, Na+, K(+)-ATPase, and diabetes / P. Vague et al. // Exp. Diabesity Res. 2004. - № 15. - P. 37-50.

156. Critical roles of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in type 1 diabetes / S-E Lamhamedi-Cherradi et al. // Diabetes. 2003. - №52 - P. 2274-2279.

157. Cyano-(S)-pyrrolidine: a potent, selective, and orally bioavailable dipep-tidyl peptidase IV inhibitor with antihyperglycemic properties // J Med Chem. 2003. - № 46. - P. 2774-89.

158. Dako internationals group. Режим доступа: http://www.dako.co.uk/.

159. Decreased red blood cell aggregation subsequent to improved glycaemic control in Type 2 diabetes mellitus / B. Chong-Martinez et al. // Diabet. Med. -2003.-№ 186. P. 301-306.

160. Deport-specific regulation of perelin by rosiglitasone in diabetic animal model / H.J. Kim et al.. // Metabolism. 2007. - №56(6). - P. 676-85.

161. Desfaits, A.C. Normalization of plasma lipid peroxides, monocyte adhesion and tumor necrosis factor-a production in NIDDM patients after gliclazide treatment / A.C. Desfaits, O. Serri, G. Renier // Diabetes care. 1998. - Vol.21, № 4. -P. 21-28.

162. Development of 3DQSARmodels in cyclic ureidobenzenesulfonamides: human beta3-adrenergic receptor agonist / S.K. Kashaw et al. // Bioorg Med Chem3261.tt.-2003.-№ 13.-P. 2481-4.

163. Diet- and diabetes-induced changes of ob gene expression in rat adipose tissue. // D.J. Becker et al. // FEBS Lett. 1995. - Vol. 371. - № 3. - P. 324-332.

164. Dintenfass, L. Modifications of blood rheology during aging and agere-lated pathological conditions / L. Dintenfass // Aging (Milano). 1989. - № 1. - P. 99125.

165. Discovery of dapagliflozin: a potent, selective renal sodium-dependent glucose cotransporter 2 (SGLT2) inhibitor for the treatment of type 2 diabetes / Meng et al. // J Med Chem. 2008. - Vol. 51 (5). P. 1145-9.

166. Drucker, D.J. Biological actions and therapeutic potential of the gluca-gon-like peptides. / DJ. Drucker // Gastroenterology 2002. - № 122. - P. 531-544.

167. Drucker, D.J. Glucagon-like peptide-1 and the islet P-cell: augmentation of cell proliferation and inhibition of apoptosis / D.J. Drucker // Endocrinology. -2003.-P. 5145-5148.

168. Duncombe, W. G. The colorimetric micro-determination of long-chain fatty acids / W. G. Duncombe // J. Biochem. 1963. - № 88. - P. 7.

169. Dunn, C.J Metformin. A review of its pharmacological properties and therapeutic use in non-insulin-dependent diabetes mellitus / Dunn C.J., Peters D.H. // Drugs. 1995. - Vol. 49, № 5.- P. 721-770.

170. Effect of 6-week course of glucacons-like peptide 1 on glucaemic control, insulin sensitivity, and beta-cellfunction in type 2 diabetes: a parallel-group study /М. Zander et al. // Lancet. 2002. - № 359. - P.824-830.

171. Effect of Dianex, a herbal formulation on experimentally induced diabetes mellitus / M. S. Meghaddam et al. // Phytother Res. 2005. - № 19(5). - P. 40915.

172. Effect of Gymnema sylvestre, R.Br, on glucose homeostasis in rats / Y. Okabayashi et al. // Diabetes Res. Clin. Pract. 1990. - Vol. 9, № 2. - P. 143-151.

173. Effect of metformin treatment on insulin action in diabetic rats: in vivo and in vitro correlations. / L. Rossetti et al. // Metabolism. 1990. - Vol. 39, № 4.- P. 425-460.

174. Effect of novel non-tiazolidindinion peroxisome proliferation-activated receptor alfa/gamma agonist jn glucose uptake / X. Hu et al. // Diabetologia. 2007. -№50(5). -P. 1048-57.

175. Effect of plasma cholesterol on red blood cell oxygen transport / H. Buchwald et al. // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2000. - № 27(12). - P. 951-5.

176. Effect on regeneration of pancreatic P-cell in neonatal streptozotocin-treated rats / L. Li et al. // Diabetes. 2004. - P. 608-615.

177. Effects of acetyl- and proprionyl-L-carnitine on peripheral nerve function and vascular supply in experimental diabetes. / MA. Cotter et al. // Metabolism. 1995. - Vol. 44. - № 9. - P. 1209-1223.

178. Effects of replacement fluids on plasma viscosity used for therapeutic plasma exchange / O. Arslan et al. // Ther Apher. 2004. - № 8(2). - P. 144-147.

179. Eherli, A.M. Drugs that alter blood viscositi. Their role in therapy / A.M. Eherli//Drugs. 1990. - Vol. 39, № 2. - P. 155-159.

180. Enzyme changes and glucose utilization in diabetic rabbits. The effect of Gymnema sylvestre R.Br. / K.R. Shanmugasundaram et al. // J. Ethnopharmacol.-1983.-№7.-P. 205-234.

181. Extraction and quantification of gymnemic acids through gymnemagenin from callus cultures of Gymnema sylvestre / P.V. Kanetkar et al. // Phytochem Anal. -2006.-№17(6).-P. 409-13.

182. Fecal Steroid Excretion Is Increased in Rats by Oral Administration of

183. Gymnemic Acids Contained in Gymnema sylvestre Leaves // Y. Nakamura et al. //328

184. Division of Food Chemistry, National Institute of Health Sciences. 1998. - № 18. -P.123

185. Fill, M. Ryanodine Receptor Calcium Release Channels / M. Fill, J. A. Copello // Physiol Rev. 2002, - № 82 (4). - P. 893 - 922.

186. Friedewald, W. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma without use of the preparative ultracentrifuge / W. Friedewald, R. Levy, D. Fredrickson // Clin Chem. 1972. - Vol. 18. - P. 499-502.

187. Functional food properties of non-digestible oligosaccharides: a consensus report from the ENDO project (DG//-I AIRI-CT94-1095) / J. Van Loo et al. // Br. JNutr. 2007. - №81. - P. 121-132.

188. Furse, KE Three-dimensional models for betaadrenergic receptor complexes with agonists and antagonists / KE. Furse, TP. Lybrand // J. Med Chem -2003. №46. - P. 4450-62.

189. Glevind, G. Antioxidants in animal tissue / G. Glevind // Acta chemica scand. 1963. - Vol.17, № 6. - P.1635-1640.

190. Goldin, B.R. Effect of Lactobacillus acidophilus dietary supplements on 1,2 dimethylhydrazine dihydrochloride-induced intestinal cancer in rats / B.R. Goldin, S.L. Gorbach // Natl. Cancer Inst. 1980. - № 64. - P. 263-265.

191. Gurmarin sensitivity of sweet taste responses is associated with co-expression patterns of Tlr2, Tlr3, and gustducin / N. Shigamura et al. // Biochem Biophys Res Commun. 2008. - № 367(2). - P. 356-63.

192. Gymnema sylvestre stimulates insulin release in vitro by increased membrane permeability / S.J. Persaud et al. // J Endocrinol. 1999. - № 163. - P. 207-212.

193. Gymnema. Lawrence Review of Natural Products // Aug. 1993. - P.201.

194. Hepatic РТР-IB expression regulates the assembly and secretion of apol-ipoprotein B-containing lipoproteins: evidence from protein tyrosine phosphatase-IB overexpression, knockout, and RNAi studies / W. Qiu et al. // Diabetes. 2004. -№53. P. 3057-66.

195. Hong-Min, L. Isolation and Structure elucidation of Gymnemic Acids, antisweet principles Gymnema sylvestre. / L. Hong-Min, K. Fumiyuki, T. Yoshisuke //Chem. Pharm. Bull. 1992. - Vol. 40, № 6. - P. 1366-1375.

196. Human beta3 adrenergic receptor agonists containing cyanoguanidine and nitroethylenediamine moieties / LL. Brockunier et al. // Bioorg Med Chem Lett. -2001.-№ 11.-P. 379-82.

197. IARC Carcinogenicity Ratings for CAS 8002-09-3 // IARC. 2004.

198. Idris, I. Sodium-glucose co-transporter-2 inhibitors: an emerging new class of oral antidiabetic drug / I. Idris, R. Donnelly // Diabetes Obes. Metab.- 2009. Vol. 11(2).-P. 79-88.

199. Immunobiochemical and molecular biologic characterization of the cell proliferation-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67. / J. Gerdes et al. // Amer J Pathol. 1991. - P 123.

200. Immunological detection of tumor growth fraction (Ki-67 Antigen) in formalin-fixed and routinely processed tissues / J. Gerdes et al. // J Path. 1992. - P. 47.

201. In silico fragmentbased discovery of DPP-IV SI pocket binders. C. Rummeyet al. // Bioorg Med Chem Lett. 2006. - № 16. - P. 1405-9.

202. Inhibit Tumor Promotion in Mouse Skin Two-stage Carcinogenesis Car-thami Flos Extract and Its Component, Stigmasterol / Y. Kasahara et al. // Phytother. Res. 1994.-№ 8(6).-P. 327-331.

203. Inhibitory effect of gymnemic acid on intestinal absorption of oleic acid in rats / L.F. Wang et al. // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1998. - Vol. 76, № 10-11. -P. 1017-1040.

204. Islet-sparing effects of protein tyrosine phosphatase-1 b deficiency delays onset of diabetes in IRS2 knockout mice / J.A. Kushner et al. // Diabetes. 2004. -№53.-P. 61-6.

205. Isoxazole carboxylic acids as protein tyrosine phosphatase IB (PTP1B) inhibitors / H. Zhao et al. // Bioorg Med Chem Lett. 2004. - № 14. - P. 5543-6.

206. Jabbour, SA. Sodium glucose co-transporter 2 inhibitors: blocking renal tubular reabsorption of glucose to improve glycaemic control in patients with diabetes / SA. Jabbour, BJ. Goldstein // Int J Clin Pract. 2008. - Vol. 62(8). - P. 1279-84.

207. Kamerlin, S.C.L. A targeted molecular dynamics study of WPD loop movement in PTB1B / S.C.L. Kamerlin, R. Rucker, S. Boresch // Bichem Biophys Res Comm. 2006. - № 345. - P. 1161-66.

208. Kanetkan, P. Gymnema sylvestre: A Memoir / P. Kanetkan, R. Singhal, M. Kamat // J Clin Biochem Nutr. 2007. - № 41(2). - P. 77-81.

209. Khare, A.K. Hypoglycaemic activity of an indigenous drug (Gymnema sylvestre, «Gurmar») in normal and diabetic persons. / A.K. Khare, R.N. Tandon, J.P. Tewari // Indian J. Physiol. Pharmacol. 1983. - Vol. 27, № 3. - P. 257 -258.

210. Kieffer, Timothy J. The Glucagon-Like Peptides / Timothy J. Kieffer, J.F. Habener // Endocrine Reviews. 2007. - № 20(6). - P 876-913.

211. Kim, D. Exenatide reduzierte HbAlc und gewicht uber 82 wochen bei patienten mit typ-2 diabetes / D. Kim, M.E. Troufman // Diabetes Stoffwechsel. -2007. -№ 14(2). P.161.

212. Kimura, I. Convergent synthesis of a trisaccharide as its 2-(trimethylsilyl)ethyl glycoside related to the flavonoid triglycoside from Gymnema sylvestre /1. Kimura // Carbohydr Res. 2006. - № 341 (10). - P. 1697-701.

213. Knight, A.P. Plants associated with Congenita Defects and reproductive failure (Review) / A.P. Knight, R.G. Walter. Teton NewMedia. - 2004. - 200 c.

214. Knudsen, LB. Glucagon-like peptide-1: the basis of a new class of treatment for type 2 diabetes / LB. Knudsen // J Med Chem. 2004. - № 47. - P. 4128-34.

215. Kumar, P.S. CoMFA study on selective human (3-3-adrenoreceptor agonists / P.S. Kumar, P.V. Bharatam // ARKIVOC. 2005. - P. 67-79.

216. Lach, M.G. Gymnema sylvestre for diabetes mellitus: a systematic review / M.G. Lach // J Altern Complement Med. 2007. - № 13(9). - P.977-83.

217. Legrand, C. Glucose homeostasis in magnesium-deficient rats / C. Legrand // Metabolism. 1987. - Vol. 36. - P. 160-164.

218. Lemon, Ch. H. Differential Gurmarin Suppression of Sweet Taste Responses in Rat Solitary Nucleus Neurons. / Ch. H. Lemon, T. Imoto, D. V. Smith // J Neurophysiol. 2003. - № 90. - P. 911-923.

219. Luo, IT. Inhibitory effect of voglibose and gymnemic acid on maltose absorption in vivo / H. Luo, T. Imoto, Y. Hiji // World J Gastroenterol. 2001.- Vol. 7, № 2. - P. 270 - 274.

220. Madsen, P. N-Dibenzylidenhydrazines: Potent Competitive glucoses-phosphate catalytic enzyme inhibitors / P. Madsen, P. Jakobsen, N. Westergaard // Bi-org Med Chem Lett. 2001. - № 11. - P. 2165-7.

221. Mayer, RM. PDH kinase inhibitors: A novel therapy for type II diabetes? / RM. Mayer, B. Leighton, E. Kilgour // Biochem Soc Trans. 2005. - № 33. - P. 367-70

222. Medicinal Foodstuffs (IX1) The Inhibitors of Glucose Absorption from the leaves of Gymnema sylvestre R.Br. (Asclepiadaceae): Structures of Gymneo-mosides A and B. / Y. Masayuki et al. // Chem. Pharm. Bull. 1997. - Vol. 45. - № 10. - P. 1671-1676.

223. Modeling aided design of potent glycogen phosphoiylase inhibitors \\ Q.

224. Deng et al. // J Mol Graph Model. 2005. - № 23. - P. 457-64.

225. Molecular identification and characterisation of the platelet ADP receptor targeted by thienopyridine antitrombotic drugs / C.J. Foster // J. Clin. Invest. -2001.-V. 107. P.1591-1598.

226. Molecular interaction of the antagonist N-(Piperidin-l-yl)-5-(4-hlorophenyl)-l-(2,4-dichlorophenyl)-4-methyl lH-pyrazole-3-carboxamide with the CB1 cannabinoid receptor / J.Y. Shim et al. // J Med Chem. 2002. - № 45. - P. 1447-59.

227. Monocyclic thiophenes as protein tyrosine phosphatase IB inhibitors: capturing interactions with Asp48 / Z.K. Wan et al. // Bioorg Med Chem Lett. -2006.-№ 16. -P 4941-5.

228. Mooradian, A.D. The antioxidative potential of cerebral microvessels in experimental diabetes mellitus / A.D. Mooradian // Brain Res. 1995. - Vol. 671. -P. 164-169.

229. Mukhopadhyay, B. Decreased bodyweight without rebound and regulated lipoprotein metabolism by gymnemate in genetic multifactor syndrome animal / B. Mukhopadhyay, R.A. Field // Mol Cell Biochem. 2007. - № 299(1-2). - P. 93-8.

230. Nandhini, T.A. Inhibition of lipid peroxidation, protein glycation and elevation of membrane ion pump activity by taurine in RBC exposed to high glucose / T.A. Nandhini, C.V. Anuradha // Clin. Chim. Acta. 2003. - № 27. - P. 129-135.

231. Nathan, D.M. Insulin Treatment of Type 2 Diabetes: The Real Deal. / D.M. Nathan // Endocrinology Rounds. 2002. - № 1(1). - P. 1-8.

232. PDX-1 Expression Is Associated with Islet Proliferation In Vitro and In Vivo / M.A. Feanny et al. // J.Surg. Res. 2007. № 19. - P. 342.

233. Pei, Z. Inhibition of protein tyrosine phosphatase IB as a potential treatment of diabetes and obesity / Z. Pei et al. // Curr Pharm Des. 2004. - № 10. - P. 3481-504.

234. Platelet activation in patients with diabetic retinopathy / S.H. Bae et al. //J. Ophthalmol. 2003. - № 17. - P. 140-144.

235. Possible regeneration of the islets of langerhans in streptozotocin-diabetic rats given Gymnema sylvestre leaf extracts / E.R.B. Shanmugasundaram et al. // J. Ethnopharmacol. 1990. - № 30. - P. 265-279.

236. Prakash, A.O. Effect of feeding Gymnema sylvestre leaves on blood glucose in Beryllium nitrate treated rats / A.O. Prakash, S. Mathur, R. Mathur // J. Eth-nopharmcol. 1986. - № 18. - P.143 - 146.

237. Prathipati, P. Characterization of (3-3-adrenergic receptor: determination of pharmacophore and 3D QSAR model for beta3 adrenergic receptor agonism / P. Prathipati, AK. Saxena // J Comput Aided Mol Des. 2005. - № 19. - P. 93-110.

238. Prognostic significance of a formalin-resistant nuclear proliferation antigen in mammary carcinomas as determined by the monoclonal antibody Ki-67 / H. Kreipe et al. // Amer J Pathol. 1993. - P. 3542-95.

239. Prognostic value of interleukin-6, plasma viscosity, fibrinogen, von Wil-lebrand factor, tissue factor and vascular endothelial growth factor levels in, congestive heart failure / B.S. Chin et al. // Eur. J. Clin Invest. 2003. - № 33. - P. 941-948.

240. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): ringmaster of the genome. T. Paunesku et al. // Int J Radiat Biol. 2001. - № 13. - P. 32.

241. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: Inhibitors of PTP1B-1B for treatment of diabetes / N.P.H. Moller et al. // Curr Opin Drug Discov Dev. -2000. -№3.-P. 527-40.

242. Puratchimani, V. Standardisation of Gymnema sylvestre with reference to gymnemagenin by high-performance thin-layer chromatography / V. Puratchimani, S. Jha // Phytochem Anal. 2004. - № 15(3). - P. 164-6.

243. QSAR analysis of thiazole benzenesulfonamide substituted 3pyridylethanolamines as beta3-adrenergic receptor agonist / P. Hanumantharao // Bio334org Med Chem Lett. 2005. - № 15. - P. 3167-73.

244. Reduced insulinotropic effect of Gastric Inhibitory polypeptide in first-degree relatives of patients with type 2 diabetes / J.J. Mier et al. // Diabetes. 2001. -P. 2497-2504.

245. Reitman, L.M. Schadt Pharmacogenetics of metformin response: a step in the path toward personalized medicine / Marc L. Reitman, E. Eric // Clin Invest. -2007.-№ 117(5).-P. 1226-1229.

246. Remogliflozin etabonate, in a novel category of selective low-affinity sodium glucose cotransporter (SGLT2) inhibitors, exhibits antidiabetic efficacy in rodent models / Y Fujimori et al. // J Pharmacol Exp Ther. 2008. - Vol. 327(1). P. 268-76.

247. Role of glial cell-line derived neurotropic factor family receptor {al-pha}2 (GFR{alpha}2) in the actions of the glucagon-like peptides on the murine intestine / S.C. Mc Donagh et al. // Am. J Physiol Gastrointest Liver Physiol. -2007. -№21.-P. 231.

248. Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies / B.B. Aggarwal et al. // Anticancer Res. 2004. - № 24. - P. 2783840.

249. Rossetti, L. Glucose toxicity / L. Rossetti, A. Giaccari // Diabetes Care. -1990.-Vol. 136.- P. 610-640.

250. Scott, K.A. The GLP-1 agonist exendin-4 reduces food intake in non-human primates through changes in meal size / K.A. Scott, T.I. Morgan // Am.J.Physiol. Regul Integr. 2007. - № 20. - P. 212.

251. Shigematsu, N. Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre leaves on lipid metabolism in rats / N. Shigematsu, R. Asano, M. Okazaki // Biol Pharm Bull. 2001. - № 24. - P. 713-717.

252. Song, Q.H. Effects of Inula Britannica on the production of antibodies and cytokines and on T cell differentiation in C57BL/6 mice immunized by ovalbumin. / Q.H. Song, T. Kobayashi, J.C. Cyong // Am J Chin Med. 2002. - Vol. 30, № 2-3.-P. 297-305.

253. Standard aggregating media to test the «aggregabiliti» of rat red blood cells / H.J. Meiselman et al. // Clin. Hemorheol. Microcirc. 2000. - Vol. 22. - № 2. P. 161-166.

254. Standardisation of Gymnema sylvestre R.Br, by high-performance thin-layer chromatography: an improved method / H. Luo et al. // Phytochem Anal. -2006.-№ 17(3).-P. 192-6.

255. Stremmel, W. Uptake of fatty acids by jejunal mucosal cells is thediated by a fatty acid binding membrane protein / W. Stremmel // J. Clin. Invest. 1988. - № 82. P. 2001-2010.

256. Structure studies of new antisweet constituents from gymnema sylves-tris. / Y. Kuzuko et al. // Tetrahedron lett. 1989. - Vol. 30, № 9. - P. 1106-1130.

257. Studies on the effect of Gymnema sylvestre on diabetes / K.B. Balasu-bramaniam et al. // J. Nat. Sci. Coun. Srilanka. 1992.- Vol. 20, № 1. - P. 81-89.

258. Suppression of glucose absorption by some fractions extracted from Gymnema sylvestre leaves / K. Shimizu et al. // J. Vet. Med. Sci. 1997. - № 4. - P. 245-251.

259. Survival of islet isografts despite cytotoxicity against pancreatic islets measured in vitro / B. Ziegler et al. // Exp Clin Endocrinol. 1990. - Vol. 95, №1. -P. 31-39.

260. Systematic Review of Herbs and Dietary Supplements for Glycemic Control in Diabetes. / Gloria Y. et al. // Diabetes Care. 2003. - Vol. 26, № 4. - P. 1277-1294.

261. Szkudelsk, T. // Physiol. Res. 2001. Vol. 50. N P. 536-546.

262. The effects of cholesterol levels on hemorheological parameters in diabetic patients / M Ercan et al. // Clin. Hemorheol. Microcirc. 2002. - № 26. - P. 257-263.

263. The efficacy and safety of miglitol therapy compared with glibenclamide in patients with NIDDM inadequately controlled by diet alone / P. Segal et al. // Diabetes Care. 1997. - Vol. 20, № 5. - P. 687-778.

264. Tomomatsu, H. Health effects of oligosaccharides / H. Tomomatsu // Food Technology. 1994. - P. 61-5.

265. Tosiello, L. Hypomagnesemia and diabetes mellitus / L. Tosiello // Arch Intern Med. 1996.-№156. - P. 1143-8.

266. Toxicology of protein allergenicity: prediction and characterization I. Kimber et al. //Toxicol. Sci. 1999, - Vol. 48. - P. 157-162.

267. Trucco, M. Reregeneration of the pancreatic P-cell / M. Trucco // J. Clin. Investigation. 2005. - P. 5-12.

268. UK Prospective Diabetes Study Group/ Intensive blood-glucose control with sulfonoreas or insulin compared withconventional treatment and rick of complications in patients with type 2 diabetes (UKRDS 33) // Lancet. 1998. - № 52. - P. 837- 853.

269. Use of Gymnema sylvestre leaf extract in the control of blood glucose in insulin dependent diabetes mellitus / E.R.B. Shanmugasundaran et al. // J. Ethnopharmacol. 1990.- № 30. - P. 281-294.

270. Validation and application of an automated rheoscope for measuring red blood cell deformability distributions in different species / J.G. Dobbe et al. // Bior-heology. 2004. - № 41. - P. 65-77.

271. Wang, C. 3D-QSAR of 4,5,6,7-tetrahydrothienopyridines analogues as glucose-6-phosphatase inhibitors / C. Wang, L. Yang, S.L. Yang // J Mol Struc. -2006. № 782. - P. 49-54.

272. Wolf, F.I. Chemistry and biochemistry of magnesium / F.I. Wolf, A. Cit-tadini // Mol. Aspects Med. 2003. - Vol. 24, № 1-3. - P. 3-9.

273. Yoshioka, S. Inhibitory effects of gymnemic acid and an extract from the leaves of Zizyphus jujuba on glucose absorption in the rat small intestine. / S. Yoshioka, J. Yonago // Med. Assoc. 1986. - № 37. - P. 142-145.

274. Zhen, H. The pharmacognostical identification of peel of Gymnema sylvestre / H. Zhen, S. Xu, X. Pan // Zhong Yao Cai. 2001. - Vol. 24, № 2.- P. 95-102.