Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, [А]-аланин, [В]-аланин

На правах рукописи

Лапочкин Олег Владимирович

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ВАНАДИЛА С АМИНОКИСЛОТАМИ:

Г1 ПШТИ"» 1 ^Т 1 ТТ»ЯГТ Г» Д ГГ 1 ГТГТ гт

1 ЛНЦИП, и-ллдпип, Р-АЛАИШ1

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК - 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Вергейчик Евгений Николаевич

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Компанцев Владислав Алексеевич

доктор химических наук, профессор Маршалкин Михаил Федорович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Пермская ГФА Росздрава»

<" - с

Защита состоится Л Дй-^уЦ 2008 года в -У часов на заседании

Диссертационного совета Д 208 069 01 при ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА

Росздрава» (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава»

Автореферат разослан « ¡(у

» ¿¿/¿.¿УД-У 2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета , / ЕВ Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск лекарственных средств для лечения больных диабетом является актуальной задачей для фармацевтической химии По данным Всемирной организации здравоохранения около 170 млн человек в мире больны сахарным диабетом и с каждым годом их число растет Благодаря успехам органического синтеза в настоящее время в медицинскую практику внедрен ряд лекарственных средств для лечения инсулиннезависимого диабета Что касается инсулинозависимого диабета, то единственным лекарственным средством до настоящего времени остаётся инсулин Однако в последние годы во многих странах ученые обратили внимание на соединения редких и рассеянных элементов, так как многие из них оказывают значительный биологический эффект на различные системы организма Так показано, что хром способствует оптимизации толерантности к глюкозе, селен оказывает ангиоксидангнос действие, молибден обеспечивает метаболизм пуринов и серы, кобальт является одной из важнейших частей структуры вшамика Б^ и 1 д.

Особый интерес вызывают соединения ванадия, который участвует в процессах формирования костей и зубов, метаболизма жиров, влияет на рост и репродукцию клеток, оказывает противоопухолевое действие В 80-е годы прошлого столетия было описано инсулиноподобное действие ванадия В настоящее время установлено, что все соединения ванадия независимо от его степени окисления проявляют указанный эффект Гипогликемическое действие ванадия объясняется различными механизмами, наиболее важными из которых является ингибирование фосфотирозинпротеинфосфатаз, стимулирование активности ферментов гликолиза, ингибирование Ыа+/К+-АТФазы и др, хотя точный механизм инсулиноподобного действия ванадия остается неизвестным Для исследования биологической активности ванадия необходима разработка доступных методов получения его соединений, приемлемых для применения На наш взгляд, наиболее целесообразным является получение комплексных соединений ванадия с такими биолигандами, как аминокислоты Это связано также и с тем, что комплексные соединения тяжелых и

редкоземельных металлов с аминокислотами обладают большей проницаемостью через мембраны клеток по сравнению с неорганическими солями этих элементов, но при этом токсичность их снижается Наибольший интерес представляют соединения ванадия(1У), так как по данным литературы они обладают большей активностью. До настоящего времени методики препаративного получения комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами не разработаны Поэтому получение и изучение комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является получе1ше и исследование комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи

1 Изучить состав и устойчивость комплексных соединений ванадия с аминокислотами глицин, а-аланин, р-аланин в растворах при разных значениях рН среды.

2 Разработать методику препаративного получения комплексных соединении ванадила с аминокислотами, глицин, а-аланин, р-аланин

3 Предложить методики определения всех компонентов в комплексных соединениях ванадила с аминокислотами

4 Установить соотношение компонентов и характер связей в полученных комплексных соединениях ванадила с аминокислотами

5 Изучить острую токсичность ванадийсодержащих соединений

6 Изучить гипогликемическую активность ванадийсодержащих соединений. Научная новизна. Изучены условия комплексообразования ванадила

сульфата с глицином, а-аланином и Р-аланином в растворах. Показано, что комплексообразование проходит в узких интервалах значений рН среды Рассчитаны равновесные константы комплексообразования ванадила сульфата с аминокислотами в растворе Разработана методика синтеза комплексных соединений ванадия(ГУ) с аминокислотами и впервые препаративно получены комплексные соединения ванадия(1У) с аминокислотами глицин, а-аланин и р-

аланин Методом ИК-спектрофотометрии показано, что в комплексообразовании участвуют амино- и карбоксильная группы аминокислот

Изучена острая токсичность и противодиабетическое действие полученных комплексов ванадия(1У) с аминокислотами. Показано, что острая токсичность комплексных соединений ванадия(ГУ) с аминокислотами достоверно ниже, чем токсичность ванадила сульфата, причем токсичность комплексных соединений ванадила с глицином или а-аланином в 2-2,5 раза ниже острой токсичности ванадила сульфата в пересчете на ванадий

Гипогликемическое действие комплексных соединений ванадила было изучено на модели аллоксанового диабета Установлено, что гипогликемическое

-Т^ггчт-"* I 1 и--■ 7 - р-ШПГП .'1 Г Т) ! Г.-.-- Т> Г тт П71 Т т П1•17 ! ; Г 71Л г- г П V -7-7} [7ПТ7-7 ; 7 у Г

-------------- ---------. „ — ---- --------------J-------------J ----------- -

аллоксан-индуцированным диабетом, чем в случае применения его у здоровых животных Уровень глюкозы у животных с аллоксан-индуцированным диабетом после однократного пероралыюго применения соединений ванадия(1У) в дозе 0,25ммоль/кг снизился в 3-3,5 раза (нормализованные данные)

Научная новизна исследований защищена патентом РФ «Оксованадиевый комплекс с глицином, проявляющий гипогликемическую активность» (решение о выдаче патента на изобретение от 06 июня 2008 года)

Практическая значимость исследования Разработаны методики получения комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами Полученные комплексные соединения ванадия(1У) проявляют гипогликемическое действие как у интактных животных, так и на модели аллоксанового диабета Комплексообразование ванадия(1\0 приводит к снижению его токсичности Предложены методики качественного и количественного анализа полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а- и Р-аланин

Внедрение результатов исследования в практику На основании результатов исследования составлено информационное письмо «Исследование противодиабетических свойств комплексных соединений ванадия(1У)» и получено заключение проблемной комиссии ГОУ ВПО «Пермская ГФА Росзярава» о

принятии полученных комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами глицин, а- и р-аланин, - на расширенные фармакологические испытания

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01 2 00101060)

Апробация и публикация результатов исследования. Фрагменты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 62-ой и 63-ей научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г Пятигорск, ПятГФА, 2007, 2008), на межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы фармации» (г Владикавказ, СГУ им Хетагурова, 2007), на 66-ои открытой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г Волгоград, ВолГМУ, 2008)

По теме диссертации опубликовано ^ работ (в том числе 2 опубликованы в журналах, рекомендуемых ВАК), s которых отражено основное содержание диссертации

Положения выносимые на защиту:

1 Результаты исследования комплексообразования ванадила с аминокислотами глицин, а-аланин, р-аланин в растворах

2 Результаты определения констант устойчивости комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а-аланин, р-аланин

3 Способ препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а-аланина, Р-аланин

4 Методики анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами и результаты определения состава полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а-аланин, р-аланин

5 Результаты предварительного фармакологического исследования полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами глицин, а-аланин, Р-аланин

Объем н структура диссертации. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 42 рисунка, состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Объектов и методов исследования», 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 137 источников, в том числе 78 иностранных

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучение комплексообразованпя ванадня(1У) с аминокислотами в растворах

В качестве объектов исследования были использованы ванадила сульфат пентагпдрат и аминокислоты глицин, а-аланин, (З-алакин

В зависимости от значения рН среды ванадий(1У) может находиться в различных состояниях Это приводит к тому, что комплексообразование ванадия(1У) может проходить различно в кислой, нейтральной и щелочной среде Поэтому нами

цштлтгл П1Г1П пч/т ТТГМ1 МЛЧТТТП/ птппачткп/ пО I |«Т1 иилтатчп»

ианидил П^Н рШ1Ш1Л опипепплд ['1 1 ирп

диаграмм состояния вакадия(1\г) и аминокислот в растворах бьшо показано, что наиболее вероятно комплексообразование в области рН 2-4 и 6-8

В спектре поглощения раствора ванадила сульфата, приведенного на рисунке 1, имеется полоса поглощения с максимумом при 770 нм и плечо в области 580 нм

На рисунке 1 приведены спектры растворов ванадила сульфата в присутствии различных количеств глицина Значение рН растворов во всех случаях было в пределах 3-4 Из рисунка следует, что при увеличении концентрации глицина наблюдается повышение светопоглощенюг при 770 и 580 нм Это указывает на возможность комплексообразования между ванадила сульфатом и аминокислотой Такие же изменения в спектрах наблюдаются при добавлении а-аланина и Р-аланина

Рисунок 1 - Спектры поглощения раствора У0804 и растворов, содержащих \'0304 и глицин. Суо5о4=0,03 М(1); соотношение ванадии : глицин 1:1(2); 1:2(3); 1:3(4); 1:4(5); 1:5(6); 1:6(7); 1:10(8). рн соответственно 3,15(1); 3,47(2); 3,49(3); 3,51(4); 3,52(5); 3,55(6); 3,58(7) и 3,67(8)

При изучении соотношения компонентов в растворах комплексных соединений методом Остромысленского-Жоба (изомолярных серий) в качестве | измеряемой величины было использовано значение разности светоноглощения (АА) раствора ванадила сульфата с аминокислотой и без аминокислоты при 770 нм, так как ванадила сульфат имеет собственное светопоглощение. На рисунке 2 приведена зависимость значения АА от состава изомолярных серий для ванадила сульфата и глицина (2а) или Р-аланина (26).

а) зависимость ДА от соотношения ванадила сульфата и глицина в растворе. рН 2,0-3,0.

б) зависимость ДА от соотношения ванадила сульфата и (З-аланина в растворе. рН 3,0-4,0.

987654321 р-элэнич

Рисунок 2 - Зависимость величины светопоглощения растворов ванадила сульфата и аминокислоты от состава изомолярных серий

Как следует из рисунка 2, максимальное значение ДА соответствует отношению компонентов 1:1. Необходимо отметить, что при низких значениях концентраций компонентов наблюдается значительная диссоциация комплексных соединений, что особенно наглядно в крайних точках изомолярных серий.

Соотношение компонентов было подтверждено методом Асмуса. В качестве примера приведено изучение отношений ванадила сульфата и а-аланина. При изучении соотношений готовили серию растворов с постоянной когатентрацией ванадила сульфата и переменном объёме (V, мл) раствора а-аланина. Затем строили

зависимость величины — от . Графики такой зависимости приведены на рисунке 3.

12345Й7Я9

l/V-1.2

Рисунок 3 - Графики зависимости — от —. 1)п=1,2)п=2

1/А

I юлученные данные показывают, что линейная зависимость наЬлюдается при п~1. Это соответствует с о с/г н о ¡л спито компонентов металл : лиганд Irl.

В связи с тем, что в растворе возможно ступенчатое комплексообразование наиболее информативным является метод Бьеррума, который также позволяет рассчитать константы образования комплексных соединений.

Метод Бьеррума основан на определении величины функции закомплексованности (и) от концентрации лиганда (Q.) и металла (См):

П CL [L\ + [ML\ + 2[ML1Y где [Л/1, [/,], [ML] и [М12 ] равновесные концентрации металла, лиганда и комплексных соединений различного состава

Преобразование данного уравнения по методу Россоти Ф. и Россоти Г.,

позволяет ксхитй знэ.чсния кокстант!

2-п

[М],

(1 -п)[Щ

где Kj и К2 - константы устойчивости комплексного соединения в соотношении

Для решения полученного уравнения строили зависимость молярного коэффициента светопоглощения от концентрации лиганда. По этим калибровочным кривым находили соответственные растворы, т.е. растворы с одинаковым светопоглощением, функцией закомплексованности и одинаковой равновесной концентрацией металла.

Строили зависимость концентрации ванадила в растворе от концентрации а-аланина. Равновесная концентрация металла равна отрезку, отсекаемому на оси ординат, а функция закомплексованности равна тангенсу угла наклона прямых.

Подставляя полученные значения функции закомплексованности и равновесной концентрации ванадила в правую и левую часть уравнения, можно найти значения констант образования ггпи ступенчатом комгтлексообоазовании. Значение константы комплексного соединения образующегося в соотношении I;! находим по отрезку, отсекаемом на оси ординат, а константа комплекса 1:2 равна тангенсу угла наклона (рис. 4).

Л

Рисунок 4 - Графическое определение константы устойчивости ванадила с а-аланином

На данном рисунке видно, что значение первой константы около 8. Так как полученная прямая параллельна оси абсцис, т.е. не имеет угла наклона,

соответственно комплексного соединения ванадила с а-аланином в соотношении 1 2 в слабокислой среде не образуется

Значение константы образования комплексного соединения ванадила с а-аланином в слабокислой среде определяли по уравнению Накагуры Для расчета значения константы готовили растворы с постоянной концентрацией ванадила сульфата и различными концентрациями лиганда

С^А-Л)

где А0 - светопоглощение раствора ванадила сульфата, А и А' - свстопоптощение раствора ванадила сульфата в присутствии а-аланина различной концентрации и Съ, соответственно

Значение константы образования, рассчитанное по методу Накагуры, равно 6,57±0,85 Следует отметить, что значения констант, полученные различными методами, близки между собой

Значения констант комплексных соединений ванадила с глицином и |>-аланином, образующихся в слабокислой среде, находили по методу Адамовича Определяли молярный показатель поглощения комплексного соединения Для этого строили график обратной зависимости молярного коэффициента поглощения в расчете на концентрацию ванадила сульфата от концентрации лиганда Экстраполяцией графика получали значение молярного коэффициента поглощения комплексного соединений Используя найденные значения находили равновесные концентрации комплекса, металла и лиганда, по которым рассчитывали значение константы образования Значения молярных коэффициентов поглощения и констант образования комплексных соединений приведены в таблице 1

На основании полученных данных можно сделать заключение, что в слабокислой среде образуются комплексные соединения ванадила с аминокислотами в соотношении 1 1 Значения констант образования показывают, что в растворах комплексные соединения сильно диссоциируют

Возможность образования комплексных соединений ванадила другого состава изучали при более высоких значениях рН Для предотвращения гидролиза ванадила

сульфата был взят значительный избыток аминокислоты. При повышении рН светопоглощение при 550-560 нм в случае глицина и а-аланина значительно возрастает (рис.5).

Рисунок 5 - Спектры поглощения раствора, содержащего ванадила сульфат (С=0,02 М) и а-аланин (С=1,0 M). 1 - рП 3,98; 2 pfl 4,20; 3 - рН 4,86; 4 -рН 5,36; 5 - рН 6,93; 6 - рН 8,44

Из рисунка следует, что с повышением значения рН происходит увеличение интенсивности светопоглощения и сдвиг полосы поглощения в более коротковолновую область спектра. Спектр поглощения растворов ванадила с а-аланином при рН выше 4,0 значительно отличается от спектров таких же смесей при рН 2-4. Очевидно, что в указанных условиях образуется комплексное соединение другого состава. По данным литературы эта полоса поглощения характерна для комплексных соединений ванадила с органическими аминами в соотношении 1:2.

Спектры поглощения растворов ванадила сульфата и р-аланина при различных значения рН представлены на рисунке 6.

А

0.5ЕШ

Рисунок 6 — Спектры поглощения раствора, содержащего VOSQ4 (С=0,03 М) и Р-аланин (С=1,0 М). 1 - рН 3,75; 2 - рН 4,24; 3 - рН 4,85; 4 - рН 4,96; 5 - рН 5,04; 6 рН 5,13; 7 рН 5,25; 8 - рН 5,33; 9 - рН 5,44

В спектре поглощения растворов, содержащих ванадила сульфат и р-аланин, при повышении значения рН наблюдаются изменения характерные для продуктов гидролиза ванадил-ионов. Полоса поглощения присущая комплексному соединению 1:2 отсутствует. Таким образом, можно констатировать, что ион ванадила в нейтральной и слабощелочной среде образует комплексные соединения с а-аминокислотами (глицин и а-аланин) и не образует комплексного соединения с р-аланином.

Константы образования полученных комплексов ванадила с глицином и а-аланином в нейтральной среде находили также по методу Адамовича. При рН 7-8 светопоглощение растворов при длине волны 555 нм остаётся постоянным, что позволило рассчитать молярный показатель поглощения комплексного соединения. Используя значения молярного коэффициента поглощения комплексного

соединения, ваг гад ила сульфата и константу равновесия аминокислоты находили равновесные концентрации комплексного соединения, а также металла и лиганда и рассчитывали константу образования Константы образования комплексных соединений ванадила с глицином и а-аланином в соотношении 1 2 приведены в таблице 1

Таблица 1 - Молярные коэффициенты поглощения и константы устойчивости

полученных комплексов

Состав 1 1 1 2

^770.,,. М'> 1 К! К2

Ванадил-глицин 33 1 1 1,94±0,50 17,28±0,19 ' (6,22±0,66) 107

Ванадил-а-аланин 29 6,57±0,85 16„70±0,19 (6,79±1,07) 107

Ванадил-Р-аланин 33 1 3,65±0,62

Таким образом в кислых растворах образуются слабые комплексные соединения ванадила с аминокислотами в соотношении 1 1 В нейтральной среде образуются устойчивые комплексные соединения ванадила с глицином и а-аланином в соотношении 1 2 (5-Алании комплексные соединения с ванадилом в нейтральной среде не образует

Получение комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами

Несмотря на длительные исследования комплексных соединений ванадия в растворах, методики препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами не существует.

Поэтому нами разработана методика получения комплексных соединений

Г., л ................... . , ТГ...... . ... . ..._____ . . __________ .... ^ ....... ( ...

оападила ^ амппиммшкиуш Даппал м^1идила ¿аиа1Ыииоапа 1 п мыудшш

заключается в получении комплексных соединений ванадила сульфата с аминокислотами в спиртоводной среде При нагревании смеси спиртового раствора ванадила сульфата и насыщенного водного раствора аминокислоты образуется сиропообразный сгусток, который постепенно уплотняется и осаждается на дне реакционной колбы Осадок собирали, промывали спиртом этиловым 96% и высушивали Полученные вещества представляют собой голубые кристаллические вещества, легко растворимые в воде

Методики анализа комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами

Для полученных соединений нами предложены методики качественного и количественного определения Для подтверждения подлинности нами использованы различные методы Наиболее приемлемыми оказались следующие Качественные реакции на ионы ванадия(1У) основаны на окислении ванадия(1У) ионами железами) в нейтральной среде или в 1% водном растворе аммиака Образующиеся в результате реакции ионы железа(П) дают красное окрашивание с диметилглиоксимом или с 2,2'-дипиридилом Другая методика обнаружения ванадил-ионоп основана на сиектрофотометрии После подкисления серной кислотой до рН 1,0-1,5 все комплексные соединения ванадила с аминокислотами имеют спектр поглощения идентичный спектру поглощения ванадила сульфата (^ = 770шг) Аминокислоты в комплексных соединениях дают положительные реакции с нингидрином Сульфа1-ионы обнаруживали по реакции с хлоридом бария

Количественное определение ванадил-ионов проводили

спектрофотометрическим методом Суть методики заключается в измерении светопоглощения раствора комплексного соединения ванадила с аминокислотой в сернокислой среде при л„1Ч = 770ни. Предварительно методика была валидирована Результаты валидационной оценки предложенной методики представлены в таблице 4

Таблица 4 - Результаты валидации методики количественного определения ванадил-ионов в комплексных соединениях ванадила с аминокислотами

Валидационные параметры Результаты испытаний

Линейность результатов у=17,24х-0,0024

г-0,9996

Диапазон линейности, мг/мл 0,2-2,0

Прецизионность, СУ(%)

Повторяемость 1,10

Внутрилабораторная изменчивость 1,19

Правильность, % 98,4-101,8

Данные таблицы 4 свидетельствуют о пригодности предложенной методики для анализа Методика позволяет проводить определение ванадия(1\0 с относительной погрешностью ±2,0%

Количественное определение аминокислоты в составе комплексных соединений провопили фотометрическим метпггпм по реакции с нинтилпином Результаты валидациопной оценки предложенной методики представлены в таблице

Таблица 5 - Результаты валидации методики количественного определения глицина в комплексных соединениях ванадила с аминокислотами

Валидационные параметры Результаты испытаний

Линейность результатов у=10710х+0,0154

г=0,996

Диапазон линейности, мг/мл 10" 4,0-20,0

Прецизионность, СУ(%)

Повторяемость 1,43

Внутрилабораторная изменчивость 1,60

Правильность, % 97,8-103,6

Данные таблицы 5 свидетельствуют о пригодности предложенной методики для анализа Относительная погрешность определения, рассчитанная статистически, не превышает ±3,0% Аналогичные данные были получены при оценки методики определения а- и |3-аланина

Количественное определение сульфат-ионов проводили методом обратного комплексонометрического титрования Валидационную оценку методики не проводили, так как она осуждена во многих руководствах по аналитической химии

Таким образом, методики определения ванадия(1У), аминокислот и сульфат-ионов позволяют использовать их для анализа полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами

Определение состава полученных комплексных соединений ванадия(ГУ) с аминокислотами

Состав полученных веществ рассчитывали после количественного определения всех компонентов по приведенным выше методикам Результаты количественного определения всех компонентов выражены в процентах и представлены в таблице 2

Таблица 2 - Результаты анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами

Содержание, % Состав

2+ УО Ь БО.2 4 2+ УО ь

Ванадил-

глицин 22,3 47,8 32,4 1 2 1

Ванадил-а- 1

аланин 20,0 50,7 29,0 1 2 1

Ванадил-(3-

аланин 26,5 38,1 35,8 1 1 1

Примечание I - аминокислота

По полученным данным был рассчитан состав, равный для комплексного соединения ванадила сульфата с глицином и а-аланином 1 2 1, и ванадила сульфата с р-аланином 1 1 1

При сравнении ИК-спектров полученных комплексных соединений с ИК-спектрами исходных веществ наблюдается исчезновение полосы поглощения протонированной аминогруппы с частотой 2200-2100 см"1 на спектре комплексного соединения, изменение характера полосы поглощения карбоксильной группы с частотой 1610-1580 см"1 На спектре комплексных соединений присутствуют полосы поглощений ванадила сульфата с частотами 1132, 1040 и 972 см"1

Такие изменения ИК-спектров характерны для всех полученных комплексных соединений На основании этих данных можно сделать вывод, что комплексообразование происходит по карбоксильной и аминогруппе аминокислоты

Фармакологические исследования

Ь*ЛШП1Т01'Л111 Т¥ РПОТТШЮШП! ПОпаиш/ТХА /» О Ш1111Л1/ЧГО 1ТПТ<Ш»1

»икшщьпуишл |1Ъ11><11 I ; V М1'|Д111и>111 V«! V/ * 4* 114»

Фармакологические исследования заключались в изучении острой токсичности, гипогликемической активности соединений ванадия у интактных животных и на модели аллоксанового диабета

Острую токсичность определяли методом Кероера, рекомендуемым для определения токсичности веществ Для расчета стандартной ошибки использовали формулу Гэддама (таб 2)

Таблица 3 - Острая токсичность соединений ванадия(ТУ)

№ группы 1 вещество 1Л)50, мг/кг Ы)5о (в пересчете на ванадий), мг/кг

I ванадила сульфат • пентагидрат 310±20 , 62±4

II 1 ванадила би-а-аланинат гидросульфат 1020±30 153±5*

III ванадила би-Р-аланинат гидросульфат 460±25 92±4*

IV ванадила би-глицинат ■ гидросульфат 990±30 1 162^-5* 1

р<0,05 ао сравнению с ванадила сульфаюм

Комплексообразование снижает токсичность ванадила, особенно это выражено в случае получения комплексных соединений ванадила с глицином и а-аланином

Изучение гипогликемического действия ванадила с глицином у интактных животных в отсутствии I люкозной нагрузки показало снижение концентрации глюкозы в крови в среднем на 20% В присутствии глюкозной нагрузки концентрация глюкозы в крови под действием комплексного соединения ванадила снижалась на 30% и более

На модели аллоксапового диабета показано, что при однократном введении ванадий содержащих соединений наблюдается снижение в несколько раз концентрации глюкозы в крови по сравнению с контрольными животными При этом диурез и содержание глюкозы в моче также статистически достоверно снижаются Эго сииде1ельствует о том, что уменьшение концентрации глюкозы в крови под действием соединений ванадила происходит не за счет повышения выделения ее с мочой, а за счет повышения утилизации глюкозы клетками тканей организма

Таким образом, при комплексообразовании ванадила с аминокислотами сохраняется фармакологическая активность ванадила, а токсичность его уменьшается

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

Изучено комплексообразование в растворе ванадила сульфата и глицина, показано, что в зависимости от рН, образуются комплексные соединения в соотношении ванадил глицин 11с константой образования 1,94±0,20 и в соотношении 1 2 с константой образования (6,22±0,66) 107 Изучено комплексообразование в растворе ванадила сульфата с а-аланином, показано, что в зависимости от рН, образуются комплексные соединения в соотношении ванадил а-аланин 1 1 с константой образования 6,57±0,82 и в соотношении 1 2 с константой образования (6,79±1,07) 107 Изучено комплексообразование в растворе ванадила сульфата с р-аланином, показано, что в данной системе образуется только одно комплексное соединение в соотношении 1 1 с константой образования 3,65±0,25 Разработана методика, с помощью которой получены комплексные соединения ванадила с аминокислотами глицин, а-алашш, Р-аланип Методами химического анализа установлено, что в комплексном соединении ванадила с глицином соотношение компонентов 12, в комплексном соединении с а-аланином - 1 2, в комплексном соединения с Р-аланином — 1 1 Методом ИК-спектрофотометрии показано, что комплексные соединения образуются за счет непротонированной аминогруппы и карбоксильной группы

Изучение острой токсичности ванадийсодержащих соединений показало, что комплексообразование с аминокислотами снижает токсичность ванадия(1У) Изучение гипогликемической активности ванадийсодержащих соединений показало, что комплексные соединения проявляют высокую гипогликемическую активность

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Лапочкин, О В Изучение комплексообразования ванадила с а-аланином / О В. Лапочкин, Е H Вергейчик // Актуальные проблемы фармации сб. статей межрегион науч. конф 26-27 апр 2007 г - Владикавказ Сев -Осет гос ун-т, 2007 - С 36-37

2 Лапочкин, О В Методика получения комплексных соединений ванадила с различными аминокислотами глицин, а-аланин, р-аланин / О В Лапочкин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр / Пятигорск ГФА, СПб ГХФА - Пятигорск, 2007 - Вып 62 -С 322-323

3 Лапочкин, О В. Получение и изучение комплексного соединения ванадила с глицином / О В Лапочкин, Е Н. Вергейчик // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2008 - №3 - С 22-24.

4 Лапочкин, О В Получение и исследование комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами и шиффовыми основаниями / О В Лапочкин, Е.В Вергейчик//Человек и лекарство тез докл. 15 Рос нац конгресса 14-18 апр 2008 г - M, 2008 - С.655

5 Лапочкин, О В Получение и изучение комплексных соединений ванадила сульфата с а- и р-аланином / О В Лапочкин // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины материалы 66-й открытой итоговой науч -практ конф молодых учёных и студентов с междунар участием 23-25 апр 2008 г - Волгоград Изд-во ВолГМУ,2008 -С270-271

6. Вергейчик, Е H Изучение комплексообразования ванадия(1У) с аминокислотами / Е H Вергейчик, О В Лапочкин // Медико-социальная экология личности состояние и перспективы материалы VI междунар конф 4-5 апр 2008 г - Минск БГУ, 2008 - С 127-129

7 Лапочкин, О В Получение и изучение влияния новых комплексных соединений ванадила с аминокислотами на уровень глюкозы в крови у крыс при аллоксановом диабете / О В Лапочкин, В.Е Погорелый, Е H Вергейчик // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье» — 2008 -№2 - С 135-139

Лапочкив Олег Владимирович

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ВАНАДИЛА С АМИНОКИСЛОТАМИ: ГЛИЦИН, а-АЛАНИН, р-АЛАНИН

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати > ¿^>Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная Печать ротапринтная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ №

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, Ставропольский край, г Пятигорск, пр Калинина, 11)

Актуальность темы. Поиск лекарственных средств для лечения больных диабетом является актуальной задачей для фармацевтической химии. По данным Всемирной организации здравоохранения около 170 млн. человек в мире больны сахарным диабетом и с каждым годом их число растёт. Благодаря успехам органического синтеза в настоящее время в медицинскую практику внедрен ряд лекарственных средств для лечения инсулиннезависимого диабета. Что касается инсулинозави-симого диабета, то единственным средством до настоящего времени остаётся инсулин. Однако в последние годы во многих странах учёные обратили внимание на соединения редких и рассеянных элементов [122, 34, 21, 50], так как многие из них оказывают значительный биологический эффект на различные системы организма [49, 51]. Так показано, что хром способствует оптимизации толерантности к глюкозе; селен оказывает антиоксидантное действие; молибден обеспечивает метаболизм пуринов и серы; а кобальт является одной из важнейших частей витамина В12 и т.д. [29,13].

Особый интерес вызывают соединения ванадия, который участвует в процессах формирования костей и зубов, метаболизма жиров, влияет на рост и репродукцию клеток, оказывает противоопухолевое действие [69, 136, 106]. В 80-е годы прошлого столетия было описано инсулиноподобное действие ванадия [73, 112]. В настоящее время установлено, что все соединения ванадия независимо от его степени окисления проявляют указанный эффект [54]. Гипогликемическое действие ванадия объясняется различными механизмами, наиболее важными из которых является ин-гибирование фосфотирозинпротеинфосфатаз, стимулирование активности ферментов гликолиза, ингибирование №+/К+-АТФазы и др. [17], хотя точный механизм ин-сулиноподобного действия ванадия остаётся неизвестным. Для исследования биологической активности ванадия необходима разработка доступных методов получения соединений ванадия, приемлемых для применения. На наш взгляд, наиболее целесообразным является получение его комплексных соединений [99, 20, 27] с такими биолигандами, как аминокислоты [31, 32, 33]. Это связано также и с тем, что комплексные соединения тяжёлых и редкоземельных металлов с аминокислотами обладают большей проницаемостью через мембраны клеток по сравнению с неорганическими солями этих элементов, но при этом токсичность их снижается. Из соединений ванадия наибольший интерес приставляют соединения ванадия(1У), так как по данным литературы они обладают большей активностью. До настоящего времени методики получения реальных комплексных соединений ванадия(ГУ) с аминокислотами не разработаны, поэтому получение и изучение комплексных соединений ва-надия(ГУ) с аминокислотами является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является получение и исследование комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить состав и устойчивость комплексных соединений ванадия с аминокислотами: глицин, а-аланин, (3-аланин в растворах при разных значениях рН среды.

2. Разработать методику препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, |3-аланин.

3. Предложить методики определения всех компонентов в комплексных соединениях ванадила с аминокислотами.

4. Установить соотношение компонентов и характер связей в полученных комплексных соединениях ванадила с аминокислотами.

5. Изучить острую токсичность ванадийсодержащих соединений.

6. Изучить гипогликемическую активность ванадийсодержащих соединений. Научная новизна. Изучены условия комплексообразования ванадила сульфата с глицином, а-аланином и |3-аланином в растворах. Показано, что комплексообра-зование проходит в узких интервалах значений рН среды. Рассчитаны равновесные константы комплексообразования ванадила сульфата с аминокислотами в растворе. Разработана методика синтеза комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами и впервые препаративно получены комплексные соединения ванадия(1У) с аминокислотами: глицин, а-аланин и |3-аланин. Методом ИК-спектрофотометрии показано, что в комплексообразовании участвуют амино- и карбоксильная группы аминокислот.

Изучена острая токсичность и противодиабетическое действие полученных комплексов ванадия(1У) с аминокислотами. Показано, что острая токсичность комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами достоверно ниже, чем токсичность ванадила сульфата, причём токсичность комплексных соединений ванадила с глицином или а-аланином в 2-2,5 раза ниже острой токсичности ванадила сульфата в пересчёте на ванадий.

Гипогликемическое действие комплексных соединений ванадила было изучено на модели аллоксанового диабета. Установлено, что гипогликемическое действие соединений ванадия сильнее в случае применения его у животных с аллоксан-индуцированным диабетом, чем в случае применения его у здоровых животных. Уровень глюкозы у животных с аллоксан-индуцированным диабетом после однократного перорального применения соединений ванадия(1У) в дозе 0,25ммоль/кг снизился в 3-3,5 раза (нормализованные данные).

Научная новизна исследований защищена патентом РФ «Оксованадиевый комплекс с глицином, проявляющий гипогликемическую активность» (решение о выдаче патента на изобретение от 06 июня 2008 года).

Практическая значимость исследования. Разработаны методики получения комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами. Полученные комплексные соединения ванадия(1У) проявляют гипогликемическое действие как у интактных животных, так и на модели аллоксанового диабета. Комплексообразование ванадия(1У) приводит к снижению его токсичности. Предложены методики качественного и количественного анализа полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин.

Внедрение результатов исследования в практику. На основании результатов исследования составлено информационное письмо «Исследование противодиа-бетических свойств комплексных соединений ванадия(ГУ)» и получено заключение проблемной комиссии ГОУ В ПО «Пермская ГФА Росздрава» о принятии полученных комплексных соединений ванадия(1У) с аминокислотами: глицин, а- и р-аланин, - на расширенные фармакологические испытания.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.2.00101060).

Апробация и публикация результатов исследования. Фрагменты диссертационной работы докладывались и обсуждались на 62-ой и 63-ей научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г.Пятигорск, ПятГФА, 2007, 2008), на межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы фармации» (г. Владикавказ, СГУ им.- Хетагурова, 2007), на 66-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Волгоград, ВолГМУ, 2008).

По теме диссертации опубликовано 7 работ. Положения выносимые на защиту:

1. Результаты исследования комплексообразования ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин в растворах.

2. Результаты определения констант устойчивости комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин.

3. Способ препаративного получения комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин.

4. Методики анализа комплексных соединений ванадила с аминокислотами и результаты определения состава полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, р-аланин.

5. Результаты предварительного фармакологического исследования полученных комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, р-аланин.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на' 139 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 42 рисунка, состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Объектов и методов исследования», 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 137 источников, в том числе 78 иностранных.

В первой главе диссертации дана общая характеристика ванадия, его биологическая роль и перспективность применения в качестве противодиабетического средства. Приведены литературные сведения по материалам, методам изучения влияния биологически активных веществ на углеводный обмен и моделирование сахарного диабета у животных.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования, используемых в работе.

Третья глава включает результаты изучения комплексообразования ванадия(1У) с аминокислотами: глицин, а- и [3-аланин в растворах. Исследования были проведены при различных рН среды. Показано, что в зависимости от рН среды ванадила сульфат может образовывать комплексные соединения различного состава. Определены константы образования комплексных соединений.

В четвертой главе рассмотрено получение и изучение комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Предложены методики качественного и количественного определения компонентов комплексных соединений. Проведена валидаци-онная оценка количественного определения ванадил-ионов и содержания аминокислоты в составе комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Проведено количественное определение компонентов в полученных комплексных соединениях и изучение взаимодействия ванадия(ГУ) с аминокислотами методом инфракрасной спектрофотометрии.

В пятой главе описаны результаты предварительных фармакологических исследований полученных комплексных соединений ванадия(ГУ) с аминокислотами: глицин, а- и Р-аланин. Приведены сравнительные данные по токсичности ванадила сульфата и комплексных соединений ванадила с аминокислотами. Гипогликемиче-ская активность комплексных соединений ванадия(1У) проявляется как у интактных животных, так и животных с аллоксановым диабетом.

Общие выводы

Изучено комплексообразование в растворе ванадила сульфата и глицина; показано, что в зависимости от рН, образуются комплексные соединения в соотношении ванадил : глицин 1:1 с константой образования 1,94±0,51 и в соотношении 1:2 с константой о^разовани(я (6,22±1,7)-107.

Изучено комплексообразование в растворе ванадила сульфата с а-аланином; показано, что в зависимости от рН, образуются комплексные соединения в со отношении ванадил : а-аланин 1:1с константой образования 6,57±0,73 и в со отношении 1:2 с константой^образова^ия (6,79±2,75)407.

Изучено комплексообразование в растворе ванадила сульфата с (3-аланином; показано, что в данной системе образуется только одно комплексное соединение в соотношении 1:1 с константой образования 3,65±0,64. Разработана методика, с иомощыо крторой получены комплексные соединения ванадила с аминокислотам и/глицин, а-аланин, (3-аланин. Методами химического анализа установлено, что в комплексном соединении U./ ванадила с глицином соотношение компонентов 1:2, в комплексном соединении с а-аланином - 1:2, в комплексно^ соединения с р-аланином — 1:1. Методом ИК-спектрофотометрии/показано, что комплексные соединения обч7 ( разуются за счёт непротониррванной аминогруппы и карбоксильной группы.

7. Изучение острой токсичности ванадийсодержащих соединений показало, что

1 . комплексообразование с аминокислотами снижает токсичность ванадия(1У).

V /

8. Изучение гипогликемической активности ванадийсодержащих соединений показало, что комплексные соединения проявляют высокую гипогликемическую активность.

Предложены методики качественного^ количественного определения комплексных соединений ванадила с аминокислотами: глицин, а-аланин, Р-аланин.

7.

8.