Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Направленный поиск и фармакологические свойства веществ с антиоксидантной активностью среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола

Актуальность проблемы. Свободнорадикальное окисление играет важную роль как в нормальной жизнедеятельности клеток, так и в развитии патологического процесса [Моругова Т.В., Лазарева Д.Н., 2000; Бульон В.В. и др., 2006]. Избыточная продукция свободных радикалов и (или) нарушение функционирования антиоксидантной системы рассматриваются в качестве одних из наиболее значимых факторов патогенеза старения [Голубев А.Г., 2003; Арутю-нян А.В., Козина Л.С., 2009; Golden T.R. et al., 2002], сердечно-сосудистых заболеваний [Неверов И.В., 2001; Капелько В.И., 2003; Ланкин В.З. и др., 2004; Ковалева О.Н. и др., 2005; Tardif J.C., 2005], бронхолегочной патологии [Фар-хутдинов У.Р., Фархутдинов P.P., 2000; Камышников B.C., 2003], заболеваний печени [Девяткина Т.А. и др., 2003; Камышников B.C., 2003], нейродегенера-тивных заболеваний [Федин А.И., 2002; Дзюба А.Н., Сорокин Ю.Н., 2004; Ка-тунина Е.А., 2005; Bonnefont-Rousselot D. et al., 2000; Buhmann С. et al., 2004], ишемии мозга и поражения нейронов [Зозуля Ю.А. и др., 2000; Спасов А.А. и др., 2003; Бизенкова М.Н. и др., 2006], сахарного диабета и его сосудистых осложнений [Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2000; Бардымова Т.П. и др., 2006; Vincent A.M. et al., 2004] и т.д.

Важную роль в клинической практике играют антиоксидантные средства, способные поддерживать структурный гомеостаз организма в условиях патологии [Шанин Ю.Н., 2003; Меньшикова Е.Б. и др., 2008; Gutterjdge J.M.C., Halliwell В.Н., 2000; Guerra E.J., 2001]. Однако, несмотря на широкий спектр препаратов для подавления реакций свободнорадикального окисления, возникают проблемы, связанные с использованием существующих средств, такие как токсичность некоторых фенольных антиоксидантов, вытеснение эндогенных антиоксидантов при использовании синтетических соединений и т.д. [Окови-тый C.B., 2003; Шанин 1СШ., 2003; Лукк М.В. и др., 2008]. В связи с этим является актуальным поиск новых антиоксидантных веществ, на основе которых могут быть созданы лекарственные препараты для лечения заболеваний, сопровождающихся избыточной активацией процессов пероксидации.

Производные бензимидазола имеют я-электронноизбыточную структуру, что позволяет предполагать наличие у них антиоксидантной активности [Ав-дюнина Н.И., 1979; Пожарский А.Ф., 1985; Анисимова В.А. и др., 1996]. На протяжении ряда лет на кафедре фармакологии и в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета широко исследуются различные виды биологической активности данного класса соединений, в том числе показана их способность ингибировать свободнорадикальные реакции [Спасов A.A., 1983; Островский О.В., 1996; Косолапов В А., 2005]. Учитывая вышесказанное, были проведены поиск новых высокоактивных антиоксидант-ных веществ среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола и изучение их влияния на процессы пероксидации при различных патологических состояниях.

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01200116045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ государственной регистрации 01200609434), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 8 от 20.04.2007 г.).

Целью настоящего исследования являлся направленный поиск высокоактивных антиоксидантных соединений в ряду конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола с последующим детальным изучением влияния наиболее активных веществ на процессы пероксидации и доклиническим исследованием их специфической активности на различных патологических моделях.

Для достижения указанной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Провести прогноз наличия высокоактивных антиоксидантных веществ среди ранее неиспытанных соединений из ряда конденсированных и неконден-сированных производных бензимидазола, а также изучить антиоксидантные и антирадикальные свойства веществ, отобранных при проведении прогноза, и препаратов сравнения на моделях in vitro.

2. Определить зависимость действия изучаемых соединений на свободно-радикальные процессы от их химических структур и физико-химических свойств.

3. Исследовать механизмы действия наиболее активных веществ и препаратов сравнения на различные звенья свободнорадикальных процессов на моделях in vitro.

4. Изучить острую токсичность наиболее активных соединений, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения их специфической активности.

5. Исследовать защитное действие наиболее активных соединений и препаратов сравнения на различных моделях острой гипоксии.

6. Изучить противоишемические свойства наиболее активных веществ и препаратов сравнения на модели ишемии головного мозга путем билатеральной окклюзии сонных артерий.

7. Исследовать влияние наиболее активных соединений и препаратов сравнения на процессы перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной системы, а также их гемореологические свойства при билатеральной окклюзии сонных артерий с контролируемой гипотензией.

8. Изучить влияние наиболее активных веществ и препаратов сравнения на показатели перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной системы, а также их защитное действие в отношении Р-клеток поджелудочной железы в условиях стрептозотоциновой интоксикации.

Научная новизна. Впервые для новых оригинальных химических соединений из ряда конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола был проведен прогноз уровня антиоксидантной активности в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующим экспериментальным изучением антиоксидантных и антирадикальных свойств веществ, выбранных на основе прогноза. Обнаружено, что наиболее активными являются производные ^-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, а также N9-пиперидиноэтильные производные имидазо[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве радикала R2 фенил, замещенный фенил (п-оксифенил, 4-фторфенил, 3,4-дихлорфенил) или а-нафтил. В ходе выявления взаимосвязи между действием изучаемых веществ на свободнорадикальные процессы и их физико-химическими свойствами были установлены параметры, детерминирующие наличие выраженных антиоксидантных свойств у производных бензимидазола, что позволило дать рекомендации по направленному синтезу высокоактивных антиоксидантных соединений. Были исследованы механизмы действия наиболее активных веществ, относящихся к ряду производных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, под лабораторными шифрами РУ-642 и РУ-643 на различные звенья свободнорадикальных процессов in vitro и установлена их наибольшая эффективность в отношении липопероксильного радикала и (в высоких концентрациях) стабильного свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил. Впервые были обнаружены противогипоксические и противо-ишемические свойства у нового высокоактивного и умеренно токсичного анти-оксидантного вещества РУ-642, а также его способность нормализовать гемо-реологический статус организма при ишемии головного мозга с последующей реперфузией и проявлять защитное действие в отношении (З-клеток поджелудочной железы при интоксикации стрептозотоцином. Доказано, что в основе эффективности исследуемого соединения в условиях данных патологий лежит антиоксидантный механизм его действия.

Научно-практическая значимость работы. Прогноз уровня антиокси-дантной активности в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой может быть эффективно использован для целенаправленного поиска новых гетероциклических производных с высокой антиоксидантной активностью. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска ингибиторов перекисного окисления липидов среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазолов. На основании выявленной зависимости антиоксидантной активности изучаемых соединений от их физико-химических параметров были даны рекомендации по оптимизации поиска субстанций в аналогичных рядах веществ и направленному синтезу эффективных антиокси-дантных соединений. Получены данные о наличии у вещества РУ-642 противо-гипоксических и противоишемических свойств, обнаружена его способность снижать количество продуктов перекисного окисления липидов, повышать активность ферментов антиоксидантной системы и улучшать реологические параметры крови при ишемии головного мозга с последующей его реперфузией, а также уменьшать образование продуктов перекисного окисления липидов, увеличивать активность антиоксидантных ферментов и проявлять протекторное действие в отношении р-клеток поджелудочной железы в условиях интоксикации стрептозотоцином. Выраженное защитное действие соединения РУ-642 при различных патологических состояниях, сопровождающихся активацией сво-боднорадикальных процессов, определяет перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований данного вещества.

Реализация результатов исследования. Прогноз уровня антиоксидантной активности в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой используется на кафедре фармакологии и в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета для целенаправленного поиска высокоактивных антиоксидантных веществ среди новых конденсированных и неконденсированных производных бензимида-зола. Выявленные закономерности между химическими структурами изученных производных бензимидазола и их способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов принимаются во внимание при синтезе новых антиоксидантных соединений в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, а также в экспериментальной работе лаборатории органического синтеза НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедре фармакологии Ростовского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Производные Ы1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов являются перспективным классом соединений в плане поиска новых веществ, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов.

2. Прогноз уровня антиоксидантной активности производных бензимида-зола в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой позволяет оптимизировать поиск высокоактивных антиок-сидантных соединений среди веществ данного ряда.

3. Наиболее выраженную антиоксидантную активность среди новых конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола проявляют производные К1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, а также №-пиперидиноэтильные производные имидазо[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве радикала Яг фенил, замещенный фенил (п-оксифенил, 4-фторфенил, 3,4-дихлорфенил) или а-нафтил. К физико-химическим параметрам, детерминирующим наличие выраженных антиоксидантных свойств у производных бензимидазола, относятся: молекулярная рефракция ароматического цикла молекулы вещества > 45,90; 22,48 < молекулярная рефракция радикала Ыз < 30,83; липофильность ароматического цикла молекулы вещества > 2,47; 1,41 < липо-фильность радикала Яз < 2,20; суммарный заряд радикала 13.1 > 0,076; -0,062 < суммарный заряд радикала Я3 < -0,004.

4. Производное КГ1 -замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов соединение РУ-642 превосходит по условному терапевтическому индексу антиоксидантной активности, полученной на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов, остальные исследуемые производные бензимидазола, а также препараты сравнения тролокс, дибунол и мексидол. Вещество РУ-642 эффективнее мексидола на различных моделях острой гипоксии; не уступает ему по выраженности противоишемических свойств; оказывает большее, чем препарат сравнения липоевая кислота, защитное действие при интоксикации стрептозотоцином, что является предпосылкой для дальнейших расширенных фармакологических исследований данного соединения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на ХП-ХШ Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2007-2008 гг.); 65-67-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2007-2009 гг.); Пятой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 работ (из них две - в центральной печати).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 50 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2-4), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 159 отечественных и 46 зарубежных источников.

190 ВЫВОДЫ

1. Производные 1Ч1-замещенных пиррол о [1,2-а]бензимидазолов являются перспективным классом веществ в плане поиска новых соединений, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов. В ходе изучения ан-тиоксидантной активности новых бензимидазольных веществ в ряду производных Ы1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов все соединения (6/6) оказались высокоактивными. При этом 33,3 % веществ (2/6) превосходили по активности тролокс, дибунол и мексидол, 16,7 % веществ (1/6) - дибунол и мексидол, 50 % веществ (3/6) - мексидол. Среди производных М9-замещенных имида-зо[1,2-а]бензимидазолов доля высокоактивных соединений составила 33,3 % (7/21). При этом 9,5 % веществ (2/21) превосходили по антиоксидантным свойствам дибунол и мексидол, 61,9 % веществ (13/21) - мексидол.

2. Прогноз уровня антиоксидантной активности у новых конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой позволил оптимизировать поиск высокоактивных антиоксидантных соединений среди веществ данного ряда.

3. Антиоксидантные свойства бензимидазольных соединений усиливаются при наличии в их структуре пиррольного кольца. Присутствие пиперидино-этильного радикала в положении № гетероцикла производных имидазо[1,2-а]бензимидазолов в сочетании с фенилом, замещенным фенилом (п-оксифенилом, 4-фторфенилом, 3,4-дихлорфенилом) или а-нафтилом в качестве Ы2 приводит к появлению высокой антиоксидантной активности у веществ данного ряда. Изучение зависимости антиоксидантных свойств исследуемых соединений от их физико-химических параметров методом подструктурного анализа позволило выявить признаки, детерминирующие высокую антиоксидант-ную активность у данного класса веществ.

4. Наиболее высокую антиоксидантную активность проявили производные 1Ч1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов вещества РУ-642 и РУ-643, относящиеся к классу умеренно токсичных соединений (3 класс). Вещество РУ

642 с условным терапевтическим индексом антиоксидантной активности, полученной на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов, 4517,5 превосходило по данному параметру препараты сравнения тролокс (2457,3), дибунол (701,0) и мексидол (3,9).

5. Вещество РУ-642 проявило выраженные защитные свойства в условиях острой гипобарической гипоксии, превосходя по величине ЕД50 (0,055 мг/кг) препарат сравнения мексидол (14,22 мг/кг). При гемической, гистотоксической и гиперкапнической в гермообъеме острых гипоксиях соединение РУ-642 в дозе 0,176 мг/кг увеличивало продолжительность жизни животных на 74,1; 73,9 и 27,0 % по отношению к контролю соответственно и было эффективнее мекси-дола в дозе 122,4 мг/кг (17,3; 48,4 и 21,9 %).

6. Вещество РУ-642 (0,176 мг/кг) в условиях ишемии головного мозга, вызванной перевязкой сонных артерий, повышало выживаемость животных на 12,5 % в течение всего опыта (мексидол в дозе 122,4 мг/кг проявил сходный эффект на 2-е и 3-й сутки после операции); увеличивало двигательную активность крыс в актометре, превосходя по эффективности мексидол, а также горизонтальную и поисковую активности в тесте «открытое поле», несколько уступая препарату сравнения по влиянию на горизонтальную активность; снижало, также как и мексидол, выраженность неврологических нарушений.

7. На модели ишемии головного мозга с последующей его реперфузией соединение РУ-642 снижало содержание малонового диальдегида в плазме крови и мозговой ткани на 34,9 и 26,8 % соответственно, не уступая мексидолу (31,6 и 27,0 %), а также повышало активность супероксиддисмутазы на 52,4 и 32,7 % по отношению к ишемии в плазме крови и мозге соответственно, превосходя по эффективности препарат сравнения (47,4 и 27,9 %). Исследуемое вещество уменьшало индекс агрегации эритроцитов на 7,0 % относительно ишемии, незначительно превосходя по гемореологическим свойствам мексидол (6,6 %), а также индекс агрегации тромбоцитов и максимальный наклон агрега-тограммы на 33,1 и 80,1 % соответственно (мексидол - на 28,2 и 71,0 %).

8. При интоксикации стрептозотоцином вещество РУ-642 в дозе 26,6 мг/кг оказывало выраженное позитивное влияние на состояние крыс в виде повышения выживаемости до 100 %, уменьшения потребления воды, увеличения потребления корма и массы тела, тенденции к снижению уровня глюкозы в плазме крови и моче, а также кетоновых тел в моче. Липоевая кислота (10 мг/кг) была менее эффективна по влиянию на данные показатели. В указанной дозе исследуемое соединение снижало уровень малонового диальдегида на 46,8; 69,5; 45,7 и 35,4 % в плазме крови, поджелудочной железе, сердце и почках соответственно, а также увеличивало активность супероксиддисмутазы в плазме крови, поджелудочной железе и сердце на 36,1; 62,2 и 47,0 % относительно стрептозотоциновой интоксикации соответственно. Липоевая кислота в дозе 10 мг/кг была менее эффективна и уменьшала содержание малонового диальдегида на 40,3 и 24,5 %, а также повышала активность супероксиддисмутазы на 31,8 и 36,4 % в плазме крови и поджелудочной железе соответственно.

9. При интоксикации стрептозотоцином вещество РУ-642 в дозе 26,6 мг/кг увеличивало процентное соотношение площади, занимаемой (З-клетками, к общей площади панкреатического островка с 3,0 ± 1,5 до 59,2 ± 9,6, тогда как препарат сравнения (10 мг/кг) оказывал менее выраженное протекторное действие в отношении {3-клеток поджелудочной железы.

193

4.4. Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что новое производное ТчГ'-замещенных пирролло[1,2-а]бензимидазолов вещество РУ-642 обладает выраженными противогипоксическими свойствами в условиях острой ги-побарической гипоксии и превосходит по величине ЕД50 препарат сравнения мексидол. Изучаемое соединение продемонстрировало защитное действие на модели острой гемической гипоксии, превосходя по активности мексидол, и на модели острой гистотоксической гипоксии, не уступая препарату сравнения по антигипоксическим свойствам. Однако, при гипоксии с гиперкапнией в гермо-объеме противогипоксический эффект вещества РУ-642, также как и эффект мексидола, оказался умеренным.

При изучении противоишемической активности соединения РУ-642 была отмечена его способность повышать выживаемость животных, улучшать их двигательную и поведенческую активности и восстанавливать неврологический дефицит в условиях ишемии головного мозга, вызванной билатеральной окклюзией сонных артерий. Следует отметить, что по проявленным на данной модели защитным свойствам соединение РУ-642 не уступало мексидолу.

Исследуемое вещество при ишемии головного мозга с последующей его реперфузией уменьшало проявления перекисных процессов, снижая концентрацию МДА в плазме крови и мозговой ткани, и не уступало по эффективности мексидолу. Соединение РУ-642 оказалось эффективнее препарата сравнения по способности повышать активность СОД и ГП в плазме крови и мозге в условиях ишемически-реперфузионного повреждения головного мозга.

Вещество РУ-642 оказывало стабилизирующее действие на вязкость крови и функциональную активность тромбоцитов при ишемии-реперфузии головного мозга, превосходя мексидол по антиагрегантному эффекту.

Изучение защитного действия соединения РУ-642 при интоксикации стрептозотоцином показало, что данное вещество повышает выживаемость животных, способствует нормализации веса, потребления воды и корма и превосходит по эффективности препарат сравнения липоевую кислоту в эквимоляр-ной ей дозе.

Соединение РУ-642 эффективно снижает содержание МДА в плазме крови и органах, особенно в поджелудочной железе, крыс со стрептозотоциновой интоксикацией. При введении исследуемого вещества наблюдалась нормализация показателей антиоксидантного статуса организма. Так, активность СОД увеличивалась в плазме крови и поджелудочной железе, а также имелась тенденция к повышению активности СОД в сердце и почках и ГП в плазме крови и исследуемых органах. Защитное действие липоевой кислоты в условиях исследуемой патологии было менее выраженным.

Наконец, вещество РУ-642 оказалось способным снижать цитотоксиче-ское действие стрептозотоцина на р-клетки поджелудочной железы, в то время как препарат сравнения подобного эффекта не продемонстрировал.

Таким образом, новое производное пирролло[1,2-а]бензимидазола вещество РУ-642 обладает широким спектром биологической активности, что, по-видимому, связано с его способностью вступать в реакции СРО и уменьшать выраженность патологических процессов, сопровождающихся их активацией.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Свободнорадикальное окисление является необходимым звеном метаболизма [Моругова Т.В., Лазарева Д.Н., 2000; Журавлева Т.Д. и др., 2003]. Однако, чрезмерное образование СР приводит к активации ПОЛ и соответственно к дезинтеграции биологических мембран, дефициту АТФ, подавлению энергозависимых реакций в клетках, окислению SH-групп ферментов, инактивации глу-татиона и дезорганизации нуклеиновых кислот и белков [Бульон В.В. и др., 2006]. Предотвращение избыточной активации процессов СРО осуществляется благодаря наличию специальной АОС, основу которой составляет комплекс веществ энзимной и неферментативной природы [Поварова О.В. и др., 2003; Румянцева С.А. и др., 2006]. В настоящее время установлено, что возникновение и развитие широкого круга заболеваний сопровождается нарушениями деятельности своеобразной функциональной системы ПОЛ-АОС [Федин А.И., 2002; Оковитый С.В., 2003]. В связи с этим являются актуальными поиск и фармакологическое изучение антиоксидантных средств для лечения ряда патологических состояний, сопровождающихся избыточной активацией процессов пероксидации.

На кафедре фармакологии и в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета было установлено, что производные бензимидазола проявляют антиоксидантную активность [Островский О.В., 1996; Косолапов В.А., 2005]. Наличие антиоксидантных свойств у веществ данного ряда обусловлено тем, что они обладают определенной л;-избыточностью и могут быть донорами электронных пар, не являющихся частью ароматической 7г-системы [Пожарский А.Ф., 1985], а, следовательно, ингибировать свободно-радикальные процессы. Так, структура производных имидазо[1,2-а]бензимидазолов имеет 14 л-электронную систему и две пары неспаренных электронов на орбиталях, перпендикулярных тс-системе. Производные пирро-ло[1,2-а]бензимидазолов обладают еще более выраженной л-избыточностью [Авдюнина Н.И., 1979], в связи с чем антиоксидантные свойства у веществ данного ряда усиливаются.

В целях оптимизации поиска высокоактивных антиоксидантных соединений среди новых конденсированных и неконденсированных производных бен-зимидазола был использован компьютерный прогноз антиоксидантной активности с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 [Васильев П.М., 2006]. При этом из 100 неиспытанных веществ, содержащихся в существующей в Волгоградском государственном медицинском университете компьютерной базе данных по бензимидазолам, для исследования были выбраны 27 соединений под лабораторными шифрами «РУ». Отобранные вещества принадлежат к двум классам производных бензимидазола: производные 1Ч9-замещенных ими-дазо[1,2-а]бензимидазолов (21 соединение) и производные -замещенных пир-роло[1,2-а]бензимидазолов (6 соединений).

Установлено, что в ряду производных И1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов все 6 соединений были высокоактивными. При этом 33,3 % веществ (2/6) превосходили по активности тролокс, дибунол и мексидол, 16,7 % веществ (1/6) - дибунол и мексидол, 50 % веществ (3/6) — мексидол. В то же время среди производных ^-замещенных имидазо[1,2-а]бензимидазолов только 33,3 % соединений (7/21) проявили высокую антиоксидантную активность. При этом 9,5 % веществ (2/21) превосходили по антиоксидантным свойствам дибунол и мексидол, 61,9 % веществ (13/21) - мексидол.

Таким образом, антиоксидантные свойства бензимидазольных соединений усиливаются при наличии в их структуре пиррольного кольца, в то время как замена пиррольного кольца на имидазольное приводит к уменьшению исследуемого вида активности. Полученные данные согласуются с представлениями о значении определенной л-избыточности для проявления веществами антиоксидантных свойств.

Отдельные радикалы в различных положениях гетероцикла могут усиливать донорно-акцепторные свойства производных бензимидазола. Исследование зависимости антиоксидантной активности веществ от различных заместителей в их структуре показало, что присутствие пиперидиноэтильного радикала в положении N9 гетероциклического кольца производных имидазо[1,2 а]бензимидазолов в сочетании с фенилом, замещенным фенилом (п-оксифенилом, 4-фторфенилом, 3,4-дихлорфенилом) или а-нафтилом в качестве R2 приводило к появлению выраженных антиоксидантных свойств у соединений данного ряда. Активность производных N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов была высокой и не зависела от характера заместителя в положении N1 гетероцикла. Однако, большинство веществ среди данного ряда имели фенильный и замещенный фенильный (4-хлорфенильный, 4-метоксифенильный) радикалы у 9-го и 8-го атомов углерода соответственно.

При изучении зависимости антиоксидантных свойств исследуемых соединений от их физико-химических параметров методом подструктурного анализа были выявлены признаки, детерминирующие высокую антиоксидантную активность у соединений данного ряда: молекулярная рефракция ароматического цикла молекулы вещества > 45,90; 22,48 < молекулярная рефракция радикала R3 < 30,83; липофильность ароматического цикла молекулы вещества > 2,47; 1,41 < липофильность радикала R3 < 2,20; суммарный заряд радикала Ri > 0,076; -0,062 < суммарный заряд радикала R3 < -0,004. Это обстоятельство позволит прогнозировать антиоксидантные свойства новых веществ среди производных бензимидазола.

Прогноз уровня антиоксидантной активности новых производных бензимидазола с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой позволил оптимизировать поиск высокоактивных антиоксидантных соединений и выбрать наиболее активные вещества под лабораторными шифрами РУ-642 и РУ-643 для дальнейшего детального изучения их антиоксидантных и антирадикальных свойств на моделях in vitro.

В ходе изучения возможных молекулярных механизмов действия отобранных производных N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов на сво-боднорадикальные процессы были обнаружены следующие закономерности.

Соединения РУ-642 и РУ-643 обладали наибольшей эффективностью в отношении липопероксильного радикала, ингибируя Ре2+-индуцированную XJI липидов, были менее активны в отношении радикалов люминола и АФК (преимущественно супероксида) в модельной системе с аутоокислением люминола, а также радикала АБТС в методе окисления АБТО (рис. 37-38).

Способность изучаемых веществ подавлять образование пероксильного радикала в ходе термического разложения АБАП была незначительной и проявлялась только в концентрации 100 мкмоль/л.

В отношении стабильного свободного радикала ДФПГ исследуемые соединения в концентрации 1 мкмоль/л оказались неактивными, однако, повышение концентрации до 100 мкмоль/л приводило к полному обесцвечиванию раствора ДФПГ*.

Препараты сравнения значительно уступали соединениям РУ-642 и РУ-643 по способности ингибировать реакцию аскорбат-зависимого ПОЛ (рис. 3940). Кроме того, тролокс в меньшей степени тормозил реакцию окисления АБТС*, а дибунол в концентрации 1 мкмоль/л терял активность в отношении данного радикала.

Рис. 37. Активность вещества РУ-642 в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции

Обозначения: * - данные статистически значимы (0 по отношению к контролю, р<0,05.

АФК 2,24

ПОЛ

АБТО 11,23*

ГОО-0,00 аоо*

34,01*

ДФПГ-0,00

АФК 9,16

Рис. 38. Активность вещества РУ-643 в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции

Обозначения: * - данные статистически значимы (/) по отношению к контролю, р<0,05.

Рис. 39. Активность тролокса в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции Обозначения: * - данные статистически значимы (/) по отношению к контролю, р<0,05.

ПОЛ

АФК 41,58*

ПОЛ

100/к 38,16*

АБТО 0,00 ДФПГ-3,25

LOO 67,11*

Рис. 40. Активность дибунола в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции Обозначения: * - данные статистически значимы (?) по отношению к контролю, р<0,05.

Выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства в сочетании с умеренной токсичностью (LÜ5o=792 мг/кг) позволили выбрать новое производное N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов соединение РУ-642 для дальнейшего исследования его специфической активности на патологических моделях, сопровождающихся активацией свободнорадикальных процессов, -гипоксии, ишемических повреждений головного мозга, интоксикации стрепто-зотоцином.

Гипоксия и ишемия составляют основу патогенетических механизмов многих острых и хронических заболеваний [Скороход A.A., 2004; Лукк М.В. и др., 2008].

Гипоксия приводит к комплексной модификации функций биологических мембран, затрагивающей как липидный бислой, так и мембранные ферменты. Основными причинами этого явления служат энергодефицит и активация на его фоне фосфолиполиза и ПОЛ. Последнее стимулируется в результате подавления активности антиоксидантных систем из-за распада и торможения синтеза их белковых компонентов [Коваль И.В. и др., 2008]. В связи с этим одним из основных направлений коррекции гипоксических состояний является защита клеточных структур от СРО с помощью антиоксидантных средств [Бизенкова М.Н. и др., 2006].

Полученные на различных моделях острой гипоксии данные позволили выявить выраженное антигипоксическое действие нового производного N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов соединения РУ-642, обладающего выраженными антиоксидантными свойствами в экспериментах in vitro. Так, исследуемое вещество в дозе 0,176 мг/кг увеличивало продолжительность жизни животных на 160,27 (р<0,05); 74,13; 73,88 (р<0,05) и 26,96 (р<0,05) % по отношению к контролю при ОГБГ, ОГеГ, ОГТГ и гипоксии с гиперкапнией в гермо-объеме соответственно. В то же время препарат сравнения мексидол в дозе 122,4 мг/кг повышал время жизни мышей на 182,14 (р<0,05); 17,30; 48,40 (р<0,05) и 21,86 % в тех же условиях. Десяти- и стократное увеличение дозы вещества РУ-642 на модели ОГБГ привело к возрастанию его противогипокси-ческого эффекта. При расчете величины ЕД50 было выявлено значительное превосходство исследуемого соединения (ЕД50=0,055 мг/кг) над мексидол ом (ЕД5о=14,22 мг/кг) на данной модели. Наиболее вероятно, что в основе обусловленного веществом РУ-642 повышения резистентности организма животных к острой гипоксии лежит торможение свободнорадикальных процессов.

Известно, что активация процессов СРО и угнетение АОС сопровождают эпизоды ишемии и постишемический период [Зозуля Ю.А. и др., 2000; Спасов A.A. и др., 2003; Бизенкова М.Н. и др., 2006]. Особенно чувствительны к недостатку кислорода клетки центральной нервной системы. Являясь строгим аэробом, они способны функционировать без кислорода всего несколько минут, после чего начинаются необратимые структурные изменения, приводящие к их гибели [Власова И.Г., Торшин В.И., 2004; Скороход A.A., 2004]. Последние могут иметь место не только при остром дефиците кислорода, но и возникать в период реоксигенации. В основе этих изменений лежит токсический эффект кислорода, содержание которого в крови, притекающей к мозгу после его длительной ишемии, становится избыточным. На фоне повреждения систем утилизации кислорода и дефицита антиоксидантов происходит усиление процессов ПОЛ, что приводит к еще более серьезным нарушениям в деятельности мозга [Болдырев A.A., 2001]. В этих условиях очевидна целесообразность использования антиоксидантных средств, способных защитить мозговую ткань от ише-мического повреждения [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2002; Суслина З.А., Максимова М.Ю., 2004; Румянцева С.А. и др., 2009].

При изучении защитных свойств соединения РУ-642 в условиях ишемии головного мозга, вызванной перевязкой сонных артерий, была выявлена его способность увеличивать выживаемость животных, улучшать их двигательную и поведенческую активности, восстанавливать неврологический дефицит. Так, под действием исследуемого вещества отмечалась тенденция к повышению выживаемости на 12,5 % относительно ишемии в течение всего опыта, в то время как мексидол проявил сходный эффект только на 2-е и 3-й сутки.

Способность соединения РУ-642 оказывать долгосрочный противоише-мический эффект чрезвычайно важна, так как истощение антиоксидантных систем и активное накопление продуктов ПОЛ происходят при длительной ишемии мозга [Kessiova М. et al., 2006; Atahan Е., 2007].

Вещество РУ-642 увеличивало двигательную активность животных в 6,3 (р<0,05); 5,6 и 4,5 раз по отношению к ишемии в 1-е, 2-е и 3-й сутки после перевязки сонных артерий соответственно. Мексидол оказывал менее выраженное защитное действие ив 1-е, 2-е и 3-й сутки после операции повышал двигательную активность крыс в 3,1; 4,6 и 1,6 раз относительно ишемии соответственно.

Введение вещества РУ-642 сопровождалось статистически значимым увеличением горизонтальной (на 80,69 и 190,38 % по отношению к ишемии в 1-е и 2-е сутки опыта соответственно) и поисковой активности (на 300,0 % по отношению к ишемии на 2-е сутки после операции) животных в тесте «открытое поле». Мексидол несколько превосходил исследуемое вещество по влиянию на горизонтальную активность, статистически значимо увеличивая ее на 228,56 и

182,79 % относительно ишемии на 2-е и 3-й сутки опыта соответственно, а также обладал способностью увеличивать поисковую активность животных в данном тесте, но данные являлись статистически незначимыми.

При оценке неврологического статуса ишемизированных животных по суммарной 12-ти балльной системе под действием соединения РУ-642 отмечалась тенденция к уменьшению проявлений неврологического дефицита в 1 -е и 3-й сутки исследования на 8,47 и 11,11 % по отношению к ишемии соответственно. Мексидол в 1-й день исследования несколько превосходил по эффективности вещество РУ-642, снижая выраженность неврологического дефицита на 22,03 % относительно ишемии, но к 3-му дню его защитное действие полностью исчезало.

Исследование неврологического статуса животных с ишемией головного мозга по шкале Stroke-index McGrow (в модификации И.В. Ганнушкиной) позволило выявить уменьшение выраженности неврологических нарушений на 57,65 (р<0,05); 29,17; 63,51 и 90,23 % по отношению к ишемии в 1-е, 3-й, 7-е и 14-е сутки опыта соответственно на фоне введения соединения РУ-642. Мексидол снижал выраженность неврологической симптоматики на 29,85; 79,63 (р<0,05); 85,14 (р<0,05) и 67,44 % относительно ишемии в 1-е, 3-й, 7-е и 14-е сутки после операции соответственно.

В настоящее время накоплен значительный объем экспериментальных данных, свидетельствующих о сложной перестройке мозгового метаболизма в условиях острой и хронической ишемии, приводящей к активации свободнора-дикальных процессов и гибели нейронов [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Карнеев А.Н. и др., 2006]. В то же время имеется тесная положительная корреляционная связь между сосудистой мозговой недостаточностью и нарушениями в когнитивной сфере, изменениями оптико-пространственного восприятия, расстройствами психической деятельности и т.д. [Рыжак Г.А. и др., 2003; Никифоров А.С. и др., 2004; Романова Г.А., Шакова Ф.М., 2006]. Таким образом, можно предположить, что в основе улучшения выше описанных показателей под действием вещества РУ-642 лежит устранение негативных сдвигов в системе

ПОЛ-АОС.

С целью выяснения механизма противоишемического действия соединения РУ-642 была использована модель ишемии головного мозга с последующей его реперфузией. При этом исследуемое вещество при профилактическом введении оказывало нормализующее действие на показатели ПОЛ, не уступая по эффективности мексидолу, и антиоксидантный статус организма, превосходя по активности препарат сравнения.

Так, у животных с патологией, получавших соединение РУ-642, содержание МДА в плазме крови и мозговой ткани снижалось на 34,88 и 26,77 (р<0,05) % по отношению к ишемии соответственно. Мексидол продемонстрировал сходную активность, уменьшая данный показатель на 31,61 % в плазме крови и на 27,01 % (р<0,05) относительно ишемии в мозге.

Исследуемое вещество статистически значимо повышало активность СОД на 52,35 и 32,68 % по отношению к ишемии в плазме крови и головном мозге соответственно. Препарат сравнения был менее эффективен и в плазме крови увеличивал активность фермента на 47,41 % (р<0,05), в мозговой ткани — на 27,87 % относительно ишемии.

Введение соединения РУ-642 способствовало повышению активности ГП на 21,43 и 86,87 % по отношению к ишемии в плазме крови и головном мозге соответственно, однако, данные являлись статистически незначимыми. Мексидол не оказывал влияния на активность фермента в плазме крови, но вызывал ее увеличение в мозговой ткани на 47,86 % относительно ишемии.

Известно, что роль активации ПОЛ и дефицита АОС в патогенезе ишемии мозга определяется их участием в изменении реологии крови, в формировании системных мембранопатий с нарушением структурно-функциональных свойств эритроцитов, тромбоцитов, эндотелия сосудов [Шилов A.M. и др., 2008]. Ухудшение деформируемости эритроцитов на фоне интенсификации ПОЛ затрудняет диффузию кислорода через мембрану, способствует развитию гипоксии в тканях, агрегации форменных элементов крови и замедлению кровотока, спазму сосудов и нарушению тканевого метаболизма [Плотников М.Б. и др., 1999; Ройтман Е.В. и др., 2001; Шилов A.M. и др., 2008]. Учитывая способность антиоксидантных средств ограничивать этот патологический процесс, были изучены гемореологические свойства вещества РУ-642 в условиях репер-фузии головного мозга после его ишемии.

Исследуемое соединение статистически значимо снижало вязкость крови на 8,80; 9,47; 10,72; 12,24 и 16,26 % по отношению к ишемии при скоростях сдвига 300 с"1, 200 с1, 100 с"1, 50 с 1 и 20 с" соответственно. Мексидол несколько превосходил вещество РУ-642 по активности, уменьшая показатели вязкости крови при скорости сдвига 300 с"1 на 12,00 %, 200 с"1 — на 12,59 %, 100 с'1 — на 13,65 %, 50 с"1 - на 15,02 % и 20 с"1 - на 18,84 % относительно ишемии. Снижение показателей вязкости крови крыс с ишемией-реперфузией головного мозга как при высоких, так и при низких скоростях сдвига свидетельствует о нормализации гемореологического статуса в крупных артериях и артериолах, а также в посткапиллярных венулярных отделах микроциркуляторного русла.

Изучаемое соединение продемонстрировало значительный антиагрегант-ный эффект, превосходя по активности препарат сравнения. Так, при введении вещества РУ-642 индекс агрегации тромбоцитов и максимальный наклон агре-гатограммы статистически значимо снижались на 33,13 и 80,11 % относительно ишемии соответственно. Мексидол также уменьшал функциональную активность тромбоцитов, но данные были статистически незначимыми.

Принимая во внимание роль активации свободнорадикальных процессов в гемореологических нарушениях, можно предположить, что гемореологиче-ский эффект соединения РУ-642 обусловлен выраженными антиоксидантными свойствами данного вещества.

В ряде работ показано, что развитие сахарного диабета сопровождается окислительным стрессом с генерацией АФК, истощением запасов эндогенных антиоксидантов и интенсификацией ПОЛ клеточных мембран [Haffner S.M., 2000; Зенков Н.К. и др., 2001; Бардымова Т.П. и др., 2006]. В свою очередь, повреждающее действие свободнорадикальных продуктов на р-клетки поджелудочной железы приводит к нарушению их функции и усугубляет течение сахарного диабета [Балаболкин М.И. и др., 2002; Колесниченко Л.С. и др., 2009]. Учитывая роль процессов пероксидации при сахарном диабете, было проведено изучение защитного действия соединения РУ-642 при профилактическом применении в условиях интоксикации стрептозотоцином.

Протекторный эффект исследуемого вещества при стрептозотоциновой интоксикации проявлялся прежде всего в виде повышения выживаемости животных. Так, соединение РУ-642 в дозах 0,176 и 1,76 мг/кг увеличивало выживаемость крыс на 25,0 и 66,75 % соответственно. При введении доз 8,8 и 26,6 мг/кг выживаемость достигала 83,3 и 100,0 % соответственно. В то же время липоевая кислота в дозе 10 мг/кг повышала выживаемость животных только на 25,0 % относительно патологии.

Выраженное позитивное влияние на состояние животных со стрептозотоциновой интоксикацией вещество РУ-642 оказывало в дозе 26,6 мг/кг: уменьшало потребление воды на 65,31 % (р<0,05); увеличивало потребление корма и массу тела на 40,74 (р<0,05) и 10,48 % соответственно; снижало уровень глюкозы в плазме крови и моче на 20,54 и 22,28 % соответственно, а также кетоновые тела в моче — на 52,22 % по отношению к патологии. Препарат сравнения в дозе 10 мг/кг был менее эффективен по влиянию на данные показатели и снижал потребление воды на 7,14 % (р<0,05), увеличивал потребление корма на 20,16 % (р<0,05), уменьшал содержание кетоновых тел в моче на 11,11 % по отношению к группе животным с интоксикацией стрептозотоцином.

Для подтверждения роли антиоксидантной активности вещества РУ-642 в реализации его защитного действия при интоксикации стрептозотоцином изучалось влияние данного соединения на интенсивность ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов. При этом исследуемое вещество статистически значимо снижало уровень МДА: в плазме крови - на 25,59; 26,35; 26,47 и 46,75 % в дозах 0,176; 1,76; 8,8 и 26,6 мг/кг соответственно; в поджелудочной железе — на 59,50; 62,92 и 69,49 % в дозах 1,76; 8,8 и 26,6 мг/кг соответственно; в сердце -на 45,66 % в дозе 26,6 мг/кг; в почках - на 33,62 и 35,39 % относительно стрептозотоциновой интоксикации в дозах 8,8 и 26,6 мг/кг соответственно. Липоевая кислота статистически значимо уменьшала содержание МДА только в плазме крови и поджелудочной железе на 40,25 и 24,52 % по отношению к патологии соответственно.

Под действием соединения РУ-642 в дозах 1,76; 8,8 и 26,6 мг/кг активность СОД в плазме крови статистически значимо повышалась на 27,95; 28,85 и 36,11 % по отношению к патологии соответственно. В поджелудочной железе отмечалось увеличение активности фермента на 41,94 % (р<0,05) при введении изучаемого вещества в дозах 0,176 и 1,76 мг/кг и на 51,15 % (р<0,05) и 62,21 % (р<0,05) при использовании доз 8,8 и 26,6 мг/кг соответственно. Статистически значимое изменение активности СОД в сердце (повышение на 47,03 % относительно стрептозотоциновой интоксикации) наблюдалось при введении соединения РУ-642 в дозе 26,6 мг/кг. Липоевая кислота существенно увеличивала активность фермента только в плазме крови и поджелудочной железе на 31,78 % (р<0,05) и 36,41 % (р<0,05) соответственно.

Под действием соединения РУ-642 во всех изучаемых дозах наблюдалась тенденция к повышению активности ГП в плазме крови и исследуемых органах, в то время как при введении липоевой кислоты активность фермента в плазме крови и почках оставалась без изменений.

Принимая во внимание тот факт, что токсическое действие АФК способствует деструкции и гибели Р-клеток поджелудочной железы, было проведено исследование защитного действия вещества РУ-642 в отношении Р-клеток поджелудочной железы при интоксикации стрептозотоцином. В результате в поджелудочной железе крыс, которым вводили изучаемое соединение в дозах 8,8 и 26,6 мг/кг, площадь, занимаемая р-клетками, статистически значимо увеличивалась в 4,6 и 19,7 раз по отношению к патологии соответственно. Липоевая кислота оказывала менее выраженное протекторное действие в отношении р~ клеток поджелудочной железы в условиях интоксикации стрептозотоцином.

Учитывая важную роль процессов ПОЛ в патогенезе сахарного диабета, можно предположить, что именно антиоксидантные свойства вещества РУ-642 лежат в основе его позитивного влияния при развитии стрептозотоциновой интоксикации.

Таким образом, в результате прогноза уровня антиоксидантной активности новых конденсированных и неконденсированных производных бензимида-зола с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой было установлено, что производные 1ЧГ1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, а также №-пиперидиноэтильные производные имидазо[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве радикала Я2 фенил, замещенный фенил (п-оксифенил, 4-фторфенил, 3,4-дихлорфенил) или а-нафтил, обладают выраженными антиоксидантными свойствами. Наиболее активные вещества под лабораторными шифрами РУ-642 и РУ-643, относящиеся к производным Ы'-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, особенно эффективны в отношении липопероксильного радикала, менее активны в отношении радикалов люминола и супероксида, а также АБТС. В концентрации 100 мкмоль/л указанные соединения подавляют образование пероксильного радикала в ходе термического разложения АБАП и полностью обесцвечивают раствор ДФПГ*.

При исследовании фармакологического действия вещества РУ-642 было установлено наличие у данного соединения выраженных противогипоксиче-ских свойств, что выражалось в его способности увеличивать продолжительность жизни животных в условиях острой гипоксии различного генеза: гипоба-рической, гемической, гистотоксической и гиперкапнической в гермообъеме. В то же время препарат сравнения мексидол проявил антигипоксическую активность в значительно больших дозах. Подобная закономерность отмечалась и при изучении противоишемических свойств вещества РУ-642. При этом исследуемое соединение оказывало защитное действие в условиях ишемии головного мозга, повышая выживаемость животных, нормализуя их локомоторную активность, поведение и неврологический статус, и не уступало по активности мек-сидолу. Введение вещества РУ-642 и мексидола на фоне ишемии головного мозга с последующей его реперфузией сопровождалось нормализацией показателей ПОЛ, антиоксидантного и гемореологического статуса организма. Изучение защитного действия соединения РУ-642 при интоксикации стрептозотоци-ном показало, что данное вещество повышает выживаемость животных, способствует нормализации их веса, потребления ими воды и корма, а также в дозе 26,6 мг/кг имеет тенденцию к снижению уровня глюкозы в плазме крови и моче и кетоновых тел в моче. Введение изучаемого производного пирроло[1,2-а]бензимидазола в дозах 8,8 и 26,6 мг/кг сопровождалось увеличением площади, занимаемой р-клетками, в поджелудочной железе животных с патологией. В то же время липоевая кислота не продемонстрировала достаточной активности на данной модели. Снижение количества продуктов ПОЛ и увеличение активности антиоксидантных ферментов под действием вещества РУ-642 позволили объяснить его эффективность в условиях данной патологии.

Учитывая выраженное защитное действие вещества РУ-642 при различных патологических состояниях, сопровождающихся нарушениями деятельности системы ПОЛ-АОС, можно считать перспективным дальнейшее изучение фармакологических и токсикологических свойств данного соединения.