Автореферат и диссертация по медицине (14.00.45) на тему:Протекторные свойства унитиола при экспериментальной наркотической и алкогольной интоксикации

На правах рукописи

ЗЕНОВИЧ Сергей Михайлович

ПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА УНИТИОЛА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ НАРКОТИЧЕСКОЙ И АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

14.00.45. - наркология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Московском научно-практическом центре профилактики наркоманий Департамента здравоохранения г. Москвы (директор - к.м.н. Брюн Е.А.).

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Калинина Анна Георгиевна

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Панченко Леонид Фёдорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Коган Борис Михайлович

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Терентьев Александр Александрович

Ведущая организация:

Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского МЗ РФ

Защита диссертации состоится « 27 » января_ 2004 года в 10 час на заседании диссертационного совета Д 208.051.01 при Национальном научном центре наркологии МЗ РФ по адресу: 119002, Москва, Малый Могильцевский переулок, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ННЦ наркологии МЗ РФ по адресу:

Москва, Малый Могильцевский переулок, д. 3

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.Ф.Львова

Л. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Задача поиска средств эффективного воздействия на различные звенья патогенеза алкогольной болезни и наркомании продолжает оставаться актуальной. Широкое распространение заболеваний, связанных с чрезмерным употреблением алкоголя, усугубляется ростом удельной доли низкосортных и содержащих большое количество токсичных примесей спиртных напитков в общем количестве потребляемого алкоголя.

Эффективные методы и средства лечения наркоманий и алкоголизма могут быть осуществлены лишь на основе целенаправленной коррекции биологических нарушений, составляющих патогенетическую основу заболевания (И.П. Анохина, 1988). Такой подход даёт возможность предупредить последствия злоупотребления другими психоактивными веществами. Токсические эффекты наркотических средств и алкоголя многообразны, однако есть и общие звенья в патогенезе заболеваний, вызванных употреблением этих веществ. К ним относятся каскад взаимосвязанных и взаимообусловленных нарушений в системе катехоламиновой регуляции и нейромедиации (И.П. Анохина, 1992), а также цепь нарушений, связанных со свободнорадикальным, в частности, перекисным, окислением липидов. Достаточно детально изучен свободнорадикальный механизм повреждения биомембран при алкогольной интоксикации (Л.Ф. Панченко, C.B. Пирожков и др., 1981-1990).

Известно, что наркотические анальгетики влияют на структуру и липидный состав нейроцитов, что лежит в основе одной из теорий развития толерантности и зависимости к морфину на уровне мембраны (Heron et al., 1982). В последнее десятилетие изучалась способность наркотических веществ и их метаболитов влиять на характер процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) биомембран in vivo при поступлении в организм наркотических веществ (А.Г. Калинина, C.B. Пирожков, Л.Ф. Панченко, 1992). Исследовано также состояние эндогенной антиоксидантной (АО) защиты организма в эксперименте и в клинике, а также осуществлена попытка коррекции окислительного стресса при острой и хронической интоксикации морфином и промедолом с помощью а-токоферола (Соловьёва А.Г., 1995, Соловьёва А.Г., Панченко Л,Ф., Сокур М.И., 1995).

К эффективным средствам, противодействующим патологически возрастающей скорости ПОЛ, относятся вещества природного и синтетического происхождения под общим названием антиоксиданты. Накоплен немалый положительный опыт их применения в медицинской практике в качестве лекарственных и вспомогательных средств для лечения заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом (Биленко М.В., 1989, Барабой В.А. и др., 1992). Тем не менее, в организме человека про- и антиоксидантные системы достаточно сложны и полифункциональны, а токсические эффекты алкоголя и наркотических веществ разнообразны. Поэтому проведение антиоксидантной терапии оказывается, как правило, недостаточным для одновременного повышения -устойчивости организма к

устойчивости организма к прооксидантным воздействиям и купирования токсического действия психоактивных веществ.

Задача поиска средств, которые сочетали бы в себе одновременно антиоксидантные и антитоксические свойства, представляется актуальной. Для продвижения в её решении нами предложено пероральное введение вицинальных дитиогликолей, группы химических соединений, к которым относятся некоторые известные инъекционные лекарственные средства, например, унитиол и дикаптол.

Химические свойства вицинальных дитиогликолей (ВД), в которых тиоспиртовые группы связаны с соседними атомами углерода, дают основания предполагать перспективу их применения в наркологии. На это имеются, по меньшей мере, две причины: 1) в медицинской литературе имеются указания (Л.Г. Голота, 1980) на антиоксидантные свойства ВД, что важно при окислительном стрессе, сопровождающем наркотическую интоксикацию; 2) химическая структура ВД подразумевает их активность по отношению к карбонильным соединениям, к которым относятся основные токсические метаболиты этанола (ацетальдегид и др.). Карбонильные соединения является также токсичными примесями многих алкогольных напитков.

Для экспериментальной оценки перспективности перорального применения этого класса веществ в наркологической практике нами был выбран унитиол. Его синтез освоен отечественной промышленностью в 50-х годах XX века (В.Е. Петрунькин), препарат (5%-ный раствор для инъекционного введения) знаком наркологам, поскольку ранее применялся в составе детоксикационных мероприятий при купировании тяжёлых абстинентных состояний и алкогольного делирия. Мы предположили, что применение унитиола per os более перспективно, чем инъекционное введение, по меньшей мере, при острой интоксикации этанолом. Основанием для этого являются исследования метаболических путей этанола и выявление основных органов-мишеней, проведённые в последние десятилетия (И.П. Анохина, Н.Н Иванец, В.Я Дробышева, 1998).

Цель исследования. Изучить мембранопротекторные и детоксицирующие свойства унитиола при пероральном применении в условиях экспериментальной наркотической патологии, а также провести ограниченные испытания эффективности препарата в условиях клиники.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние унитиола на процессы ПОЛ и систему АО резистентности животных при экспериментальной интоксикации этанолом.

2. Определить параметры ПОЛ, АО защиты организма при бытовом приеме слабоалкогольных напитков и влияние на них перорального приема унитиола в постинтоксикационный период.

3. Исследовать влияние унитиола на течение процесса ПОЛ, антиоксидантный статус организма и активность ферментов-маркёров

патологии печени при купировании алкогольного абстинентного синдрома в условиях наркологического стационара

4. Изучить мембранопротекторные свойства унитиола при экспериментальных острой и хронической интоксикации морфином, в частности, определить влияние препарата на скорость реакций ПОЛ; оценить степень влияния унитиола на систему эндогенной антиоксидантной резистентности.

4. Исследовать острую токсичность унитиола при пероральном применении в опыте in vivo.

5. Оценить диапазон эффективных доз для дезинтоксикационной терапии и разработать методические рекомендации по применению унитиола per os в составе средств купирования острой алкогольной интоксикации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Приём унитиола per os при купировании острой алкогольной интоксикации в условиях наркологического стационара снижает скорость реакций перекисного окисления липидов, активность ферментов-маркеров патологии печени (проявляет гепатопротекторное действие), повышает антиоксидантный статус организма.

Пероральный приём унитиола в первый день лечения в дополнение к стандартной детоксикационной терапии даёт достоверно более выраженное снижение интенсивности процесса перекисного окисления липидов и снижение активности трансаминаз по сравнению с этими же показателями больных, получивших только стандартную терапию.

2. Пероральный приём унитиола в период постинтоксикационного алкогольного состояния при интоксикации слабоалкогольными напитками бытового уровня достоверно снижает интенсивность процесса перекисного окисления липидов с одновременным повышением концентрации основных эндогенных неферментативных антиоксидантов, а угнетает активность аминотрансфераз печени.

3. Унитиол при пероральном введении в условиях алкогольной интоксикации обладает сильным антитоксическим действием за счёт достаточно быстрого и полного попадания в печень, основной орган, метаболизирующий этанол и токсические примеси алкогольных напитков. Здесь в полной мере реализуются его активность по отношению к карбонильным соединениям, в частности, ацетальдегиду, а также проявляются выраженные антиоксидантные свойства.

4. Пероральное введение унитиола достоверно снижает интенсивность процессов перекисного окисления липидов биомембран гепатоцитов при экспериментальной острой и хронической интоксикации животных морфином. На этом основано одно из мембранопротекторных действий унитиола при приеме per os.

5. Пероральное введение унитиола повышает потенциал антиоксидантной резистентности организма при наркотической и этанольной интоксикации.

Научная новизна работы. Впервые проведены исследования перорального применения унитиола, известного в медицинской практике в виде 5%-ного раствора унитиола для инъекций. При этом обнаружены:

- выраженные мембранопротекторные свойства унитиола при его пероральном применении в условиях острой и хронической экспериментальной наркотической интоксикации;

выраженные мембранопротекторные свойства унитиола и детоксицирующий эффект при постинтоксикационном алкогольном состоянии (ПАС) и при интоксикации слабоалкогольными напитками

Впервые установлено, что пероральное введение унитиола больным алкоголизмом при проведении дезинтоксикационной терапии (в первый день пребывания в наркологическом стационаре) в сочетании с последующей стандартной терапией достоверно улучшает ряд биохимических показателей по сравнению с показателями больных, получивших только стандартную терапию.

Сделан вывод о том, что пероральный путь введения унитиола названный в работе «циклом пероральной этанольно-альдегидной детоксикации», быстро ведёт к ускоренному купированию соматических и биохимических проявлений ААС и дано расширенное объяснение молекулярного механизма антиоксидантного действия унитиола. Научно-практическая значимость работы.

Выполненные исследования позволяют расширить оценку унитиола как средства, применяемого в составе общей детоксикационной терапии. Новый путь введения препарата ведёт к значительному усилению его известного действия и раскрывает дополнительные возможности использования субстанции в медицинской практике, в частности, в наркологии, с целью купирования проявлений наркотической интоксикации. Данные работы дают основания для разработки перорального лекарственного средства на основе унитиола, предназначенного для повышения эффективности существующей терапии. Рекомендуется также разработка пероральных средств более широкого применения, чем лекарственные, в частности, биологически активных добавок на основе унитиола, для приёма в целях снятия симптомов постинтоксикационного алкогольного состояния, снижения токсических эффектов употребления или злоупотребления алкогольными напитками.

Опыт перорального применения и спектр коррекции биохимических показателей с помощью унитиола обобщён в Методических рекомендациях, «Пероральное применение унитиола в составе детоксикационных мероприятий при купировании алкогольного абстинентного синдрома», разработанных коллективом авторов Московского научно-практического центра профилактики наркоманий Департамента здравоохранения Москвы и Московского городского наркологического диспансера №1.

По части материалов работы произведено патентование. Роспатентом РФ выдан патент № 2157647 на изобретение «Пищевая добавка и способ её получения, биологически активная добавка к пище и способ её получения, пищевой продукт и способ его получения» с приоритетом от 29.12.1999 г.

Подана заявка № 2003119563 на получение патента РФ на изобретение «Средство для снижения скорости течения, предупреждения развития, предупреждения возникновения патологических процессов, вызываемых употреблением этанола и/или веществ, обладающих аддиктивным потенциалом».

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании Учёного совета Московского научно-практического центра профилактики наркоманий Департамента здравоохранения г. Москвы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на заседании Проблемной комиссии по медико-биологическим проблемам наркологии при ННЦ наркологии МЗ РФ. Большая часть основных результатов доложена на 1-й Международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» (Испания, 2002).

По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, получен 1 патент.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 106 страниц машинописного текста. Библиографический указатель включает 200 источников, в том числе 96 отечественных и 104 зарубежных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 43 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Выполнение экспериментальной части работы начато в ООО «Биохимсинтез», продолжено и завершено в Московском научно-практическом центре профилактики наркоманий Департамента здравоохранения г. Москвы при сотрудничестве с лабораторией биохимии Национального научного центра наркологии МЗ РФ. Клинические исследования проведены в 1 Московском городском наркологическом диспансере. Исследования выполнены впервые.

В экспериментах использовали крыс-самцов линии Wistar-100 с исходной массой 150-250 г. (острая и хроническая интоксикация морфином и этанолом), беспородных белых мышей-самцов 2 мес. (испытания на токсичность per os). Проводились исследования крови и гомогенатов печени крыс. При экспериментах, выполненных с участием добровольцев и больных в условиях стационара - использовали биологические жидкости (кровь, моча).

Соединения, использованные в экспериментах in vivo: унитиол (субстанция), морфина гидрохлорид (субстанция), этанол.

В плазме крови и гомогенатах печени животных фиксировали содержание конечных продуктов ПОЛ (ТБК-положительных продуктов), в плазме крови животных и людей - также интенсивность ПОЛ и состояние системы эндогенной антиоксидантной резистентности (концентрацию витаминов Е, А, аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и SH-групп), а также активность ферментов - маркёров повреждения печени АЛТ, ACT.

Содержание перекисей липидов в плазме крови определяли флуориметрически после реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методу Neiman J. et al. (1987) и модифицированным методом Wade C.R., van Rij A.M. (1988). Уровень малонового диальдегида (ТБК-положительных продуктов) в моче измеряли спектрофотометрически. Концентрацию витаминов Е и А в плазме крови определяли флуориметрически, используя в качестве экстрагента гексан. Содержание SH-групп в плазме крови определяли, используя реактив Элмана по методу Wayner D.D.M. et al. (1987). Количество урата определяли спектрофотометрически. Активность ферментов AJIT, ACT измеряли в соответствии с рекомендациями фирмы "Boehringer" (ФРГ), используя фирменные стандартные наборы реактивов.

Статистическая обработка данных производилась с помощью программы STATISTICA. Для сравнения средних двух совокупностей использовался t-критерий Стьюдента. Мы применяли t-критерий в двух ситуациях: для сравнения средних двух независимых выборок (t-критерий для независимых выборок) и для сравнения средних зависимых выборок (t-критерий для зависимых выборок).

Для статистической обработки результатов эксперимента были использованы непараметрические методы, в частности, критерий Колмогорова-Смирнова и, дополнительно, U-критерий Манна-Уитни, поскольку t-критерий Стьюдента имеет недостаточную точность при сравнительно небольших объёмах выборки, а также при отклонении распределения от нормального. С целью визуализации данных в диссертации использованы применяемые в математической статистике диаграммы размаха. В автореферате для визуализации используются столбчатые диаграммы.

Острую интоксикацию морфином моделировали на крысах введением интраперитонеально среднетоксической дозы морфина гидрохлорида (25 мг на кг массы животного). Хроническую интоксикацию животных морфином моделировали введением наркотика в течение 7 дней в возрастающих дозах от 10 до 70 мг/кг массы. Хроническую интоксикацию этанолом моделировали на крысах-самцах в течение 6 месяцев, для которых единственным источником питьевой жидкости служил 12% раствор этанола. Контрольная группа животных имела свободный доступ к питьевой воде.

Исследование влияния интоксикации слабоалкогольными напитками на биохимические параметры и действия унитиола в этих условиях проводилось с участием взрослых добровольцев-мужчин (38-47 лет), не принадлежащих к категории наркологических больных и не отягощенных психосоматическими расстройствами. По оговоренным условиям эксперимента в течение 14 дней испытуемые ежедневно выпивали 1 л пива в одно и то же вечернее время. Возможный дополнительный приём спиртных напитков не запрещался, однако по окончании испытаний стало известно, что злоупотреблений спиртными напитками среди участников не было.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Исследование острой токсичности препарата per os в опыте in vivo.

Пероральное применение унитиола в наркологической практике (в

эксперименте и клинике) предпринято нами впервые, поэтому мы сочли необходимым провести предварительное исследование острой токсичности в опыте in vivo. В определении LD50 мы следовали действующим методическим рекомендациям Фармакологического Комитета (1997).

Использовали беспородных мышей-самцов, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Количества унитиола, вводимые животным, составили ряд: 300, 500, 1000, Í500 и 2000 мг на кг массы тела животного, каждая группа состояла из 10 животных. Результаты исследования показали абсолютную выживаемость всех участвующих в эксперименте особей в указанном диапазоне доз. Таким образом, токсичность унитиола при пероральном введении в указанных пределах доз не была обнаружена.

3.2. Показатели ПОЛ и уровни основных компонентов неферментативной АО защиты у крыс в условиях постинтоксикационного периода при хроническом введении этанола.

В конце эксперимента по хронической интоксикации этанолом через 10 часов после отмены этанола животные 1-й опытной группы (ОГ) получили 15 мг/кг массы унитиола в желатиновой капсуле, 2-я опытная группа получила пустую капсулу. 3-я группа животных (контрольная) в течение 6 месяцев оставалась интактной. Постинтоксикационное состояние оценивалось по биохимическим параметрам, включая уровни перекисей липидов в плазме крови, показатели АО системы и активности трансаминаз. Фактически в эксперименте оценивался отклик биохимических параметров в организме крыс после 6-месячной алкоголизации на однократное пероральное введение унитиола в конце эксперимента. Имелось ввиду получить также косвенные данные о скорости воздействия унитиола при таком пути введения. Для этого отбор проб производился через 2,5 часа после введения препарата.

Данные эксперимента показывают достоверные различия в измеряемых показателях между 1-й и 2-й опытными группами, различия между показателями 2-й и 3-й (контрольной, КГ) группами. Существенно, что такой отклик параметров на введение унитиола происходил быстро.

Уровень перекисей липидов во 2-й ОГ в 2,5 раза выше, чем в 1-й ОГ. Во 2-й ОГ в 4 раза выше, чем в КГ, в 1-й ОГ значение показателя на 60% выше, чем в КГ. Все различия статистически значимы (Рис.1). Аналогичные соотношения активности ферментов AJIT и АСТ (Рис. 2).

Рис. 1. Перекиси липидов в плазме крови крыс при хронической интоксикации этанолом

1 2 3

группы

Рис. 2. Активности трансаминаз в плазме крови крыс при хронической интоксикации этанолом

Уровень 8Н-групп у животных 1-й группы более чем в 1,5 раза выше такового во 2-й группе и на 35% выше уровня в 3-й группе, урата - во 2-й ОГ 25% выше, чем в 1-й ОГ, и в полтора раза меньше, чем в КГ.

Табл.1 Содержание БН-групп и урата в плазме крови хронически алкоголизированных крыс

Группа животных Показатель

SH-группы Урат

1 опытная (А1с+унитиол) 440,1*** 232,67**

2 опытная (Ale) 236,7 189

1 опытная (А1с+унитиол) 440** 232,67*

3 (контрольная) 324 279,4

2 опытная (Ale) 236,7** 189**

3(контрольная) 324 279,4

*-Р<0,05; **-Р<0,01; ***-Р<0,001

Таким образом, унитиол, полученный животными однократно после шестимесячной интоксикации 12% раствором этанолом достоверно тормозит скорость реакций ПОЛ с одновременным повышением содержания эндогенных антиоксидантов SH-rpynn и урата, а также оказывает гепатопротекторное действие, выражающееся в снижении активности трансаминаз.

3.3. Исследование влияния приема унитиола для снятия проявлений интоксикации при бытовом употреблении слабоалкогольных напитков

Участвующие в эксперименте добровольцы (их данные приведены на стр. 11 в разделе «Материалы и методы»), выпивающие ежедневно по 1 л пива с высоким содержанием альдегидов, были разделены на три группы: две опытных (ОГ) и одну контрольную (КГ). Первая опытная группа (ОГ-1) - в течение первой недели каждое утро принимала 100 мл питьевой воды, а ОГ-2 принимала в течение этого срока 100 мл водного раствора унитиола (0,25 г/ 100 мл воды). Последующие 7 дней прием унитиола был назначен ОГ-1, а второй группе - отменен. Ниже сопоставлены измеряемые биохимические параметры - ТБК-положительные продукты, витамины Е, А, урат, SH-группы, АЛТ, ACT - демонстрирующие динамику средних по группам в зависимости от приёма или неприёма унитиола для всех групп в эксперименте. Кровь на испытания брали 3 раза: в начале исследования, через неделю и через 2 недели после начала исследования. Мочу исследовали каждые 2 дня. Как и ожидалось, исследуемые параметры в группе сравнения (контроля) не испытывали серьёзных колебаний и здесь мы их не приводим.

АЛТ. Сравнение начальной активности фермента и его активности в плазме крови испытуемых в конце 1-й недели эксперимента для ОГ-1 даёт

достоверные различия в сторону возрастания (Р< 0,05), в то время как между начальным уровнем и конечным (в конце 2-й недели) нет статистически значимых отличий (Р = 0,77), т.е. активность фермента после недели интоксикации повышается на 60%, а затем к концу 2-й недели (уже при приеме унитиола) возвращается к исходному уровню.

Сравнение в ОГ-2 начального уровня с конечным, который повышается почти на 50%, указывает на статистически значимые отличия, в то время как между начальным уровнем и уровнем в конце 1-й недели нет статистически значимых отличий (Рис. 3).

ACT. Активность ACT в конце 1-й недели для ОГ-1 указывает на возрастание на 86% и возвращение к начальному уровню в конце эксперимента. Сравнение в ОГ-2 исходной активности ACT с конечной дает статистически значимые отличия (Р < 0,05), в то время как между исходным уровнем активности ACT активностью в конце 1 -й недели нет статистически значимых отличий (Рис. 3).

ТБК-положительные продукты. К концу 1-й недели уровень ТБК-положительных продуктов в ОГ-1 возрастает на 70% (статистически достоверно), в то время как между начальным уровнем и конечным уровнем у испытуемых ОГ-1 нет статистически значимых отличий; к концу 2-й недели значения возвращаются к исходным. В ОГ-2 уровень ТБК-положительных продуктов к концу 1-й недели уменьшается на 30%, затем, к

Рис. 3. Динамика среднего уровня активности ACT в плазме крови добровольцев обеих опытных групп при интоксикации слабоалкогольными напитками

номера измерений

концу 2-й - постепенно возрастает по ходу эксперимента в 2 раза (Рис. 4).

Рис. 4. Динамика среднего уровня ТБК-положительных продуктов в моче добровольцев при интоксикации слабоалкогольными напитками

номера измерений

SH-группы. Сравнение содержания SH-групп в начале эксперимента и в конце 1-й недели для ОГ-1 показывает уменьшение уровня на 10%, а к концу 2-й недели возвращение к исходному уровню (с небольшим превышением его). Сравнение в ОГ-2 начального уровня SH-групп с промежуточным и конечным уровнями указывает, что значимых отличий обнаружено не было.

Урат. В ОГ-1 уровень урата после 1-й недели снижается относительно начального уровня примерно на 10% (статистически недостоверно), а к концу 2-й недели показатель возвращается к базовому значению. Для группы ОГ-2, напротив, после 1-й недели не наблюдается изменение уровня урата, зато после 2-й недели эксперимента происходит снижение уровня показателя примерно на 17%.

Аналогичные изменения отмечены при исследовании в плазме крови содержания витаминов А и Е (Табл. 2). К концу 1-й недели в ОГ-1 наблюдается падение уровня витаминов показателя в 1,6 и в 1,3 раза, соответственно, а после начала приёма унитиола на 2-й неделе происходит их восстановление: концентрация витамина А на 5% превосходит стартовый уровень, а витамина Е соответствует исходному. В группе ОГ-2 на фоне интоксикации с параллельным приёмом унитиола содержание витамина А к концу 1-й недели превышает начальный на 16%, а витамина Е менее значительно (2-3%); после отмены унитиола оба показателя снижаются: витамина А на 44% по сравнением с достигнутым, а Е - на 23% по сравнению с исходным (см. Табл. 2).

Табл. 2 Содержание эндогенных антиоксидантов в плазме крови _1_испытуемых добровольцев_

Номер Номер измере- Показатель (единицы измерения указаны в

эксперим. ния: тексте)

группы 1- начальный

2-через неделю SH- Урат Витамин А Витамин

3-через 2 группы Е

недели

ОГ-1 1 372,250 273,75 1,45 2,325

2 341,750 251,5 0,9 1,775

3 385,0 270,5 1,525 2,2

ОГ-2 1 340,714 272 1,78 2,7

2 352,857 272,5 2,014 2,771

3 335,0 232,29 1,4 2,186

КГ 1 358,2 272 1,82 3,14

2 372 271,8 1,94 3,14

3 369 273,2 1,86 2,325

Таким образом, в эксперименте выявлено достоверное влияние унитиола на снижение активности трансаминаз, интенсивности процессов ПОЛ, повышение уровня эндогенных антиоксидантов, что указывает на выраженное гепатопротекторное действие.

3.4.° Клиническое исследование влияния перорального приёма унитиола в период детокснкации в условиях наркологического стационара.

Клинические исследования действия унитиола при пероральном приёме проведены в стационаре 1-го Московского наркологического диспансера. У больных алкоголизмом (2-3 стадия) мужчин в возрасте от 43 до 62 лет при поступлении в стационар диагностировался абстинентный синдром средне-тяжёлой степени. Больные были разделены на 2 группы, имевшие статистически однородные показатели по всем измеряемым биохимическим параметрам. В первый день, наряду с осуществлением традиционной детоксикационной терапии, больные 1 группы 1-3 раза (по усмотрению врача и в зависимости от тяжести состояния) получали по 0,2 г унитиола в виде 3% раствора с интервалом в 2 часа. Контрольная группа больных (2-я) не получала унитиол. Таким образом, группа 1 рассматривалась нами как опытная, а группа 2 - как контрольная.

В дальнейшем больных обеих групп лечили в течение двух недель в соответствии со стандартами наркологической помощи.

У всех больных биологические жидкости - кровь и мочу - исследовали дважды - до начала лечения и после курса детокснкации. Измеряли уровень перекисей липидов и активность ферментов АЛТ и ACT в плазме крови.

По активности печеночных ферментов до начала лечения обе

группы испытуемых были однородны (^критерий для независимых выборок указывает на высокую статистическую однородность исходных показателей: Р = 0,577).

Необходимо отметить, что лечение пациентов обеих групп приводит к несомненно положительным результатам - на это указывают статистические различия начальных и конечных средних в обоих применяемых методах. Но при сравнении эффекта терапевтических мероприятий с применением унитиола и без такового обнаруживаются следующие результаты.

Активность АЛТ у пациентов, не получивших перед лечением унитиол (2-я группа), на 64% выше, чем у больных 1-й группы, а сравнение абсолютных значений сдвига активности АЛТ по результатам лечения для испытуемых обеих групп показывает, что у пациентов, принявших унитиол в начале курса лечения, абсолютное значение уменьшения активности фермента на 50% выше, чем у пациентов, получивших стандартное лечение.

Рис. 5. Сравнение эффективности терпии по относительному сдвигу уровня трансаминаз для обеих групп алкогольных больных

в %% к исходному уровню 50

Р = 0,0028

Относительные сдвиги активности АЛТ для каждой группы (в %% к исходному уровню) отличаются значимо: Р = 0,002772 (по t-критерию). На рис. 5 (ряд 1) приведены диаграммы для относительных сдвигов уровней активности фермента, исчисленных в процентах к исходному уровню. Средние значения относительных сдвигов отличаются примерно на 60% и это отличие статистически значимо. По уровню активности фермента ACT

данные аналогичны. Относительные эффективности лечения для обеих групп по активности ACT представлены на диаграмме Рис. 5, ряд 2. Перекиси липидов. Эффективность лечения, характеризующаяся данным показателем, приведена на Рис. 6

Рис. 6. Сравнение эффективности терапии по относительным сдвигам уровня перекисей липидов в сыворотке крови обеих групп алкогольных больных

1 2 группы

Относительное снижение показателя в гр.1 более чем в 1,6 раза превосходит относительное снижение показателя в гр. 2, и это различие статистически значимо, что указывает на несомненно бблыпий эффект лечения в гр. 1.

3.5. Влияние унитиола на ПОЛ и уровень основных компонентов неферментативной АО защиты у крыс в условиях острой и хронической интоксикации морфином

Для исследования действия унитиола при острой интоксикации морфином через 20 минут после введения крысам среднетоксической дозы морфина гидрохлорида (25 мг/кг) животные первой опытной группы (ОГ-1) получили перорально унитиол (15 мг/кг массы в желатиновой капсуле), а второй опытной группы (ОГ-2) - пустую капсулу. Контрольной группе крыс вводили вместо раствора наркотика эквиобъемное количество физраствора. Декапитировали животных через 2,5 часа после введения морфина.

Исследование содержания перекисей липидов в плазме показало сохранение их концентрации на уровне контрольных значений в ОГ-1. В ОГ-2 тот же режим острой интоксикации привел более чем к пятикратному возрастанию содержания продуктов ПОЛ в плазме крови (Рис. 6).

Измерение концентрации витаминов Е и А показало небольшое (на 15% и 11% соответственно) возрастание их концентрации, а уровень БН-групп снизился существенно - на 37%. Эти данные соотносятся с ранее

отмеченным эффектом воздействия токсиканта на систему антиоксидантной защиты, заключающемся в том, что первый отклик АО системы организма состоит в адаптационном повышении уровня эндогенных антиоксидантов. Только после исчерпания адаптационной возможности системы происходит снижение уровня эндогенных антиоксидантов. Полученные данные указывают, что SH-группы являются первым «эшелоном» защиты, поскольку их уровень начинает снижаться уже тогда, когда уровни витаминов А и Е ещё остаются адаптационно повышенными. Этим дополнительно подтверждается целесообразность применения унитиола, являющегося донором SH-групп, утверждаемая в настоящей работе.

Первая опытная группа (ОГ) хронически морфинизированных крыс получала унитиол в дозе 15 мг/кг ежедневно в желатиновой капсуле и дополнительно однократно 20 мг/кг массы тела в последний день введения морфина, вторая опытная группа - пустую капсулу; контрольная группа (получающая физраствор вместо раствора морфина гидрохлорида в течение всего срока наркотизации) - также пустую капсулу. В эксперименте измеряли уровни ТБК-положительных продуктов, концентрации основных компонентов эндогенной антиоксидантной защиты, активности ферментов-маркеров патологии печени. Содержание ТБК-положительных продуктов в плазме крови крыс ОГ-1 существенно (в 2 раза) превышает этот показатель в ОГ-2. Тем не менее, эти показатели статистически значимо отличаются от контрольных значений. У животных, получавших вместо унитиола пустую капсулу, величины активности АЛТ и ACT более чем вдвое превышают таковые в 1-й опытной группе.

Рис. 7. Концентрация витамина А в плазме крови крыс при хроническом введении морфина

|

к Z

1 2 3

номер группы

Концентрация витамина А в плазме крови крыс, получавших на фоне хронического введения морфина унитиол, оказалась на 35% выше, чем у животных, получавших пустую капсулу, и на 10% ниже, чем в контрольной (рис. 7). Аналогичный отличия между группами наблюдались по концентрации витамина Е. Уровень SH-групп по измерениям в тех же группах различался более чем в 2 раза, в первой группе он практически не отличался от уровня такового в контрольной группе.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Интерес к синтетическим антиоксидантам вызван тем, что ряд природных соединений, имеющих антирадикальную активность, например, а-токоферол, обладают способностью к инверсии активности в прооксидантную при использование в лечебных целях в высоких дозах [Ланкин В.З. и др., 1999]. Данные наших исследований указывают, что унитиол per os сохраняет антиоксидантную активность в широком диапазоне концентраций, что согласуется с литературными сведениями, а токсичность этого соединения в этом случае минимальна; в опыте на животных летальность не обнаружена до концентрации 2г/кг массы.

Антиоксидантная активность унитиола при парентеральном введении известна. Его применяли, например, при детоксикации у обожженных больных и отметили улучшение их общего состояния и более быструю по сравнению с контрольной группой нормализацию биохимических показателей: уменьшения СОЭ, лейкоцитоза, а также нормализацию ферментных систем печени [Алексеев A.A. и др., 2000]. Наши данные указывают на сильные протекторные свойства унитиола при пероральном введении. Как в остром, так и в хроническом эксперименте по интоксикации морфином, введённый перорально унитиол показал сохранение на уровне контрольных значений скорости реакций ПОЛ и сохранение базового уровня содержания эндогенных антиоксидантов (раздел 3.5.). Изменения активности ферментов-маркёров патологии печени - АЛТ и ACT - при острой и хронической интоксикации морфином, дают возможность предположить прямое вмешательство унитиола в стабилизацию мембран гепатоцитов, противодействующую повреждающему действию наркотика: у животных, не получавших унитиол, величины активности АЛТ и ACT более чем вдвое превышают таковые в группе животных, получавших унитиол (раздел 3.5.).

Мембранопротекторные свойства унитиола, проявившиеся в указанных выше сериях экспериментов, на наш взгляд, не могут быть объяснены только по аналогии с классическим антиоксидантом (а-токоферолом). Вицинальные SH-группы являются «ловушками» свободных радикалов и способны активно с ними взаимодействовать. В этом отношении действие унитиола (и других ВД) аналогично действию а-токоферола, как антиоксидантов, действующих по механизму прерывания цепи окисления. Кроме этого, вицинальные дитиогликоли способны образовывать комплексы с металлами,

индуцирующими процессы свободнорадикального окисления, что позволяет отнести ВД также и к классу превентивных антиоксидантов. Взаимодействие ВД с ионами двухвалентных металлов протекает по реакции: Я'СЩЗНЭСЩЗНЖ2 + Ме2+ К1СН(8(Ме)8)С1Ж2 .

Образующееся с унитиолом соединение является водорастворимым и в таком виде выводится из организма с мочой. Таким образом, унитиол способен активно связывать негемовое железо Ре2+ , которое физиологами рассматривается в качестве одного из главных индукторов процесса свободнорадикального окисления за счёт способности многократного окисления и восстановления при переходе от Ре2+ к Ре3+ и обратно. Избыток ионов Ре2+ катализирует реакции Фентона и Хабера-Вайса, текущие в норме, что ведёт к патологической скорости образования свободных радикалов. Таким образом, антиоксидантные свойства унитиола реализуются посредством нескольких различных механизмов, что характеризует его как весьма эффективный экзогенный антиоксидант. На основании этого можно прогнозировать перспективное терапевтическое применение унитиола при гепатопатиях различной, в том числе и неалкогольной, этиологии, т.к. все они сопровождаются окислительным стрессом.

На основании проведённых исследований мы считаем, что именно пероральное применение унитиола позволяет наиболее полно реализовать его терапевтические возможности в наркологии. При пероральном введении унитиол быстро попадает в кишечник, где происходит его всасывание (в основном, по-видимому, в тонкой кишке) и попадание через систему циркуляции в печень. В отличие от парентерального введения, при котором до 40% препарата экскретируется почками в неизменённом виде, а вся масса вещества равномерно распределяется в объёме крови, пероральное введение приводит к более быстрому и полному проникновению массы субстанции в печень. Именно печень служит органом, где осуществляется метаболизм большинства токсикантов, в том числе наркотиков и этанола. Быстрое попадание препарата в печень косвенно подтверждается данными экспериментов на крысах при острой интоксикации морфином и этанолом, когда эффект перорального введения унитиола проявлялся уже через 2-2,5 часа после однократного приёма препарата (разделы 3.2. и З.5.).

Конкурентное ингибирование процессов ПОЛ можно, по-видимому, исключить за счет гидрофильности молекулы унитиола. Зато весьма велика вероятность реактивации эндогенных сульфгидрильных соединений, принимающих на себя первыми «удар» при окислительном стрессе. На это указывают данные эксперимента по хронической интоксикации крыс морфином: снижение уровня БН-групп вдвое у наркотизированных животных без применения унитиола и достоверное сохранение показателя на уровне контроля при его использовании (раздел. З.5.). На этот же эффект указывают данные эксперимента по хронической алкоголизации животных: уровень БН-групп у алкоголизированных животных, получивших унитиол, более чем в 1,5 раза выше уровня показателя в алкоголизированной группе

без унитиола и на 35% выше уровня в контрольной группе (раздел 3.2.). Данные этих экспериментов подтверждены также измерениями уровня SH-групп в плазме крови добровольцев, получавших регулярную слабоалкогольную нагрузку: динамика этого показателя при интоксикации достоверно связана с введением или отсутствием препарата (раздел 3.3.).

Эндогенные антиоксиданты, как известно, функционируют в организме преимущественно комплексно [Воскресенский О.Н. и др., 1992]. Как ферментные системы, так и неферментативные ингибиторы органических радикалов выстроены в цепь синергических взаимопревращений, в условном конце которых образуется менее активная форма радикала. В такой цепи эффективность каждого компонента определяется работой всех остальных [Bast A. et al., 1991]. Поэтому, реактивируя SH-содержащие антиоксиданты организма, унитиол запускает своеобразный «каскад» поддержки остальных эндогенных неферментативных антиоксидантов. Кроме естественных антиоксидантов, содержащих SH-группы, тиоловые соединения входят в состав более 100 ферментов, которые деактивируются при токсической нагрузке различного происхождения в той или иной степени. При этом происходят метаболические сдвиги и возникают нарушения жизненно-важных физиологических процессов.

При исследовании действия унитиола в составе детоксикационных мероприятий в условиях наркологического стационара (раздел 3.4.) прием унитиола назначался в зависимости от тяжести состояния (1-3 раза по 0,2 г в течение первых суток). Ни в одном из случаев не было отмечено негативного побочного осложнения; только 2 из 10 больных высказывали неудовольствие по поводу запаха раствора унитиола. По всей видимости, поступая в организм больного при детоксикации, вещество выполняет несколько функций: во-первых, тормозит патологически высокую скорость ПОЛ с сохранением антиоксидантного статуса организма, во-вторых, выполняет функции «реаниматора» SH-содержащих макромолекул. Какой из процессов первичен или доминирует, следует изучить дополнительно, что предполагается сделать в перспективе.

Наш вывод о том, что активация SH-зависимого компонента системы антиоксидантной защиты организма ведёт к общему укреплению всей этой системы, основан на всем имеющемся экспериментальном материале. Уровни таких компонентов системы, как витамины А и Е, урат, прямо коррелируют с уровнями SH-групп в экспериментах: на фоне интоксикации при приёме унитиола сохранялся уровень этого показателя одновременно с сохранением или слабо выраженным снижением остальных вышеперечисленных эндогенных антиоксидантов. Напротив, токсическая нагрузка без приёма унитиола в ситуации, когда происходило снижение уровня SH-групп, достоверно связана со статистически значимым снижением уровня остальных эндогенных антиоксидантов. Соответствующие данные приведены в разделах 3.2.-3.5.

В исследованиях с добровольцами (раздел 3.3), субъективно отмечено более благоприятное состояние, снятие признаков интоксикации, если спустя 10-12 часов после приёма пива испытуемые принимали per os раствор унитиола. Биохимические показатели достоверно подтверждают нормализацию процессов ПОЛ и состояние системы антиоксидантной защиты и обнаруживают еще одно позитивное качество исследуемого соединения. Группа испытуемых, получавшая в течение первой недели унитиол на фоне приема пива, в последующую неделю (прием пива без унитиола) показала менее значимое ухудшение биохимических показателей, чем группа участников исследования, не получавшая унитиол в течение первой недели (раздел 3.3.). Унитиол оказывал пролонгированный эффект, который может быть связан с аккумуляцией некоторого количества свободных сульфгидрильных групп с последующим «расходованием» при продолжающейся токсической нагрузке. Напротив, в группе участников, не принимавших унитиол в течение первой недели, мебранодеструктивные показатели оказались более выраженными, по-видимому, за счет длившейся дезактивации антиоксидантных систем в течение первой недели.

В целом, более ранний опыт применения унитиола в наркологической практике (инъекционно - при лечении алкоголизма) (Божко Г.Х., 1994) и наши исследования показали существенное детоксицирующее свойство унитиола. Божко Г.Х отмечено субъективное улучшение самочувствия пациентов и уменьшение в сыворотке крови аномально высоких концентраций этанола, ацетальдегида, нормализация дискатехоламинемий. Нами зафиксированы антиоксидантный эффект с субъективной нормализацией общего состояния.

Нормализация дискатехоламинемий, по-видимому, может происходить по единому пути с мембраностабилизирующим действием унитиола. Один из механизмов активации ПОЛ определяется возможным стимулированием выброса катехоламинов в кровяное русло (Thureson-Klein A. et al., 1978). Катехоламины, особенно 6-оксидофамин, являются весьма реакционноспособными соединениями. Они легко окисляются супероксидным анионом с образованием более токсичных продуктов, например адренохрома из адреналина и нейромеланина из дофамина. Последняя реакция сопровождается генерацией свободных радикалов (Dexter D.T.,etal., 1989).

Хиноновые и семихиноновые формы катехоламинов вызывают модификацию жизненно важных макромолекул - ферментов и нуклеиновых кислот. В присутствии ионов Fe2+ или Си2+ и О2" формируется тройной комплекс катехоламин-Ре2+-01'. При этом возрастает способность катехоламинов восстанавливать кислород. Полагают, что такой комплекс может служить и непосредственным инициатором перекисных реакций. В таком случае, роль унитиола, в дополнение к выше описанным, может сводиться еще к связыванию ионов металлов переменной валентности, что, в свою очередь, препятствует образованию катехоламинового комплекса и

является препятствием для развития окислительного стресса. Характерно, что при этом унитиол, в отличие от других подобных соединений, не накапливается в организме в виде токсических метаболитов, а, образуя водорастворимые комплексы, выделяется с мочой в виде продукта неполного окисления, либо в виде тетрасульфида (продукта полного окисления) и не снижает запасов незаменимых микроэлементов (Голота Л.Г., 1980). Там же отмечено свойство унитиола активировать АТФ-азу клеточных мембран, восстанавливая при этом транспорт электролитов и препятствуя токсическому эффекту ряда химических соединений. Обсуждая различные возможные механизмы действия унитиола при наркологических патологиях, следует отметить связь этого свойства с выявленной в работах Л.Ф. Панченко, А.Г. Калининой, C.B. Пирожкова корреляцией между возрастанием интенсивности перекисных процессов в организме при интоксикации наркотическими веществами с одновременной инактивацией мембраносвязанной АТФ-азы.

К позитивным моментам, относящимся к субъективному ощущению улучшения состояния наркологических больных, можно отнести желчегонное действие унитиола, а также диуретическое - связанное с увеличением клубочковой фильтрации и снижением канальцевой реабсорбции (Голота Л.Г., 1980). Эти свойства унитиола способствуют повышению элиминации ядов и метаболитов токсикантов. Наконец, имеются конкретные сведения о повышении унитиолом антитоксической функции печени при парентеральном введении, увеличении содержания гликогена в сердечной мышце и печени, что способствует повышению энергетических резервов этих органов.

Самое прямое и быстродействующее дезинтоксикационное свойство унитиола, на наш взгляд, определяется универсальным связыванием токсических агентов, относящихся к алкогольсодержащим напиткам.

Необходимо отметить, что, с нашей точки зрения, вицинальные дитиогликоли, в том числе испытываемый нами в эксперименте унитиол, обладают ещё одной особенностью, делающей их особенно привлекательными для применения при интоксикации этанолом: они активно взаимодействуют с карбонильными соединениями по реакции: R'CH(SH)CH(SH)R2 + R3R4CO н> R'CHtStR'CR^CHR2

Продукты реакции унитиола с альдегидами (циклические тиоацетали) являются прочными водорастворимыми соединениями. При физиологических условиях реакция связывания ацетальдегида унитиолом необратима. Поэтому при попадании унитиола в печень он быстро реагирует с ацетальдегидом, наиболее токсичным метаболитом этанола. Естественно предположить целесообразность применения унитиола как средства скорой помощи при бытовых отравлениях алкогольсодержащими напитками, особенно содержащими токсические метаболиты спиртового дрожжевого брожения - альдегиды и кетоны. К ним относятся, помимо высших спиртов («сивушных масел»), ацетальдегид и его гомологи, ацетон и его гомологи.

При пероральиом приёме унитиол наиболее быстро и полно попадает в печень, где одновременно связывает ацетальдегид (и другие альдегиды), удаляет негемовое железо Ре2+, связывает свободные радикалы, активирует БН-группы аминокислот и ферментов, благодаря чему быстро снимаются токсические эффекты алкогольной интоксикации.

1. Описанное комплексное действие унитиола при интоксикации этанолом реализуется в цикле, названном нами «пероральной этанольно-альдегидной детоксикацией унитиолом». Он состоит из следующих звеньев:

1.1. При пероральном введении унитиол всасывается в желудочно-кишечном тракте (более всего, по-видимому, в тонкой кишке) и через воротную и портальную вену быстро попадает в печень, где осуществляется основной метаболизм этанола.

1.2. Унитиол быстро и необратимо (при физиологических условиях) связывает ацетальдегид (главным образом, в цитозоле гепатоцитов), что приводит к быстрому сдвигу равновесия в обратимой реакции Этанол о Ацетальдегид.

1.3. Сдвиг в реакции приводит (при высокой трансмембранной проницаемости этанола и существенно меньшей проницаемости ацетальдегида) к быстрому выходу этанола из органов и тканей, где он распределён, и его проникновению в тот орган, где, согласно принципу Ле Шателье-Брауна, нарушено равновесие реакции (т.е. в печень).

1.4. Снижение содержания этанола в органах и тканях, в частности, мозге, снижает уровень токсической нагрузки на нейроциты.

1.5. Дальнейший метаболизм этанола в печени протекает в зависимости от того, имеется ли в ней несвязанный унитиол. Избыток препарата способен, по-видимому, активировать алкогольдегидрогеназу и, следовательно, активировать процесс окисления этанола, после чего цикл связывания ацетальдегида и притока в печень этанола при одновременном его оттоке из других органов и тканей повторяется. При отсутствии в печени унитиола метаболизм экзогенного этанола протекает обычным образом.

Описанный выше цикл пероральной этанольно-альдегидной детоксикации унитиолом в условиях острой интоксикации этанолом бытового уровня приводит к быстрой детоксикации, что подтверждено испытаниями с участием добровольцев.

2. Второй механизм, обеспечивающий участие унитиола в защите от токсических эффектов этанола и/или наркотических анальгетиков, сводится к антиоксидантному действию. Обнаружено, что пероральное введение унитиола приводит к существенному усилению всех звеньев антиоксидантной резистентности организма (витаминов Е, А, С, 8Н-групп, урата), а также к снижению уровня продуктов перекисного повреждения липидных компонентов клеточных мембран, в первую очередь гепатоцитов, что подтверждается результатами измерений активности аминотрансфераз и уровней продуктов ПОЛ.

3. Объяснение молекулярного механизма антиоксидаитного действия вицинальных дитиогликолей (на примере унитиола) сводится к двум вариантам.

3.1. Первый вариант - действие по принципу ловушки радикалов. Концевая SH-группа способна активно связываться с неспаренным электроном, а молекула унитиола имеет две такие группы, что даёт возможность быстро прерывать цепь окисления, протекающего по свободнорадикальному механизму.

3.2. Второй вариант механизма антиоксидаитного действия -удаление негемового железа Fe2+, являющегося индуктором реакции образования гидроксильных и липидных радикалов. В этом отношении действие унитиола аналогично действию таких эндогенных антиоксидантов, как церулоплазмин плазмы крови, клеточный ферритин, карнозин.

Таким образом, унитиол обладает способностью проявлять себя одновременно как антиоксидант, гасящий (прерывающий) цепь окисления, так и как превентивный антиоксидант, снижающий скорость инициации цепной реакции. Сочетание этих свойств выделяет унитиол как особо перспективный антиоксидант для его перорального использования в наркологии и других отраслях медицины: гепатологии, токсикологии и др.

ВЫВОДЫ:

1. Проведено исследование мембранопротекторных свойств унитиола при экспериментальных острой и хронической интоксикации животных морфином:

а) Установлено достоверное снижение интенсивности процессов ПОЛ при пероральном введении унитиола по сравнению с контролем.

б) Установлено, что пероральное введение унитиола при наркотической или этанольной интоксикации достоверно повышает уровень всех измерявшихся в эксперименте эндогенных антиоксидантов: витаминов А, Е, мочевой кислоты, SH-групп по сравнению с контролем.

2. Исследовано влияние унитиола на течение ПОЛ, антиоксидантный статус организма и активность ферментов-маркеров патологии печени при купировании алкогольного абстинентного синдрома в условиях наркологического стационара.

а) Установлено достоверно более выраженное снижение интенсивности перекисного окисления липидов в группе больных, получивших в дополнение к стандартной терапии унитиол per os в первый день лечения, чем снижение показателя интенсивности ПОЛ в группе больных, получивших только стандартную терапию.

б) Установлено, что больные, получившие в дополнение к стандартной терапии унитиол per os в первый день лечения, имели достоверно более высокие уровни эндогенных антиоксидантов, измерявшихся в эксперименте

(витаминов А и Е, мочевой кислоты, SH-rpynrr) по сравнению с больными, получившими стандартную терапию.

в) Установлено, что уровни активности ферментов АСТ и АЛТ в плазме крови больных после курса терапии были достоверно ниже в группе больных, получивших в дополнение к стандартной терапии унитиол per os в первый день лечения.

3. Определены параметры ПОЛ, АО защиты организма при бытовом приеме слабоалкогольных напитков и влияние на них перорального приема унитаола в постинтоксикационный период. Установлено, что пероральный приём унитиола достоверно улучшает показатели антиоксидантной защитной системы организма и достоверно снижает показатели интенсивности перекисного окисления липидов.

4. Исследована острая токсичность унитиола при пероральном применении в опыте in vivo. Токсичность унитиола в эксперименте в исследуемом диапазоне доз обнаружить не удалось.

5. Произведена оценка диапазона эффективных доз для дезинтоксикационной терапии с применением унитиола per os и разработаны методические рекомендации по применению унитиола в составе мероприятий по купированию алкогольного абстинентного синдрома.

6. Дано объяснение молекулярных механизмов антиоксидантного действия унитиола.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. A.Kalinnina, S.Zenovich. Research of the application of vicinal dithioglicols to stop the conséquences of the occasional alcoholic intoxication// Materials of the conférence «High médical technologies in XXI century», Spain, 2002, p. 101.

2. A.Kalinnina, S.Zenovich, L.Panchenko. Research of the antioxidant activity of vicinal dithioglicol at the experimental drug abuse pathology/ZIbid., p. 103.

3. Калинина А.Г., Бузик О.Ж., Савельев A.B., Зенович С.М. Антитоксическое действие пероксифага при употреблении слабоалкогольных напитков.// Материалы Международной научно-практической конференции «Современные проблемы наркологии». М., 18-20 ноября 2002. С. 32-33.

4. Зенович С.М., Калинина А.Г., Халилов Э.М., Панченко Л.Ф. Исследование антиоксидантных свойств унитиола при экспериментальной постнаркотической интоксикации.//Наркология. 2004 г., №1. С. 33-35

5. Патент РФ № 2157647 на изобретение «Пищевая добавка и способ её получения, биологически активная добавка к пище и способ её получения, пищевой продукт и способ его получения» с приоритетом от 29.12.1999 г.

подписано в печать 24.12.2003 г. Формат 60x90 1/16

Уч.-изд.л. 1,2 Тираж 100 экз. заказ 440

отпечатано в ООО «спп» 107996, Москва, ул.Гиляровского, 31

Д2004 К--24 6

РНБ Русский фонд

2005-4 17656

Наркомании и токсикомании, как понятия в современном смысле этих слов, приобрели социально-медицинскую значимость лишь в последние десятилетия. Однако, широкое распространение и доступность наркотических средств, а также постоянное пополнение списка химических соединений, способных вызвать эффект эйфории за счет «проб и ошибок» подростков, представляет собой одну из самых серьезных проблем, стоящих перед человечеством.

Не менее трагично выглядит ситуация с распространением заболеваний, связанных с чрезмерным употреблением этанолсодержащих напитков. Особенно это относится к употреблению низкосортных и содержащих большое количество токсичных примесей спиртных напитков.

В «Государственном докладе о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2000 г.» зафиксировано, что «Алкогольная ситуация в стране на протяжении длительного времени весьма неблагополучна., среднегодовое потребление алкоголя составляет около 14 л на человека, тогда как ВОЗ оценивает ситуацию как опасную при 8 л в год». Комиссия по здравоохранению Государственной Думы РФ считает эту цифру заниженной, поскольку она не учитывает дополнительное потребление 6 л алкоголя из «подпольных источников». При этом известно, что потребление более 12 л алкоголя в год приводит к отчетливому увеличению частоты формирования генетических дефектов у населения [ А.И. Хазанов, 90].

Эффективные методы и средства лечения наркоманий и алкоголизма могут быть осуществлены лишь на основе целенаправленной коррекции биологических нарушений, составляющих патогенетическую основу заболевания [ И.П. Анохина, 6]. Такой подход даёт возможность предупредить и последствия злоупотребления психоактивными веществами.

Токсические эффекты наркотических средств и алкоголя многообразны, однако есть и общие звенья в патогенезе заболеваний, вызванных употреблением этих веществ. К ним относятся каскад взаимосвязанных и взаимообусловленных нарушений в системе катехоламиновой регуляции и нейромедиации [И.П. Анохина, 7], а также цепь нарушений, связанных со свободнорадикальным, в частности, перекисным, окислением липидов. Достаточно детально изучен свободнорадикальный механизм повреждения биомембран при алкогольной интоксикации (Л.Ф. Панченко, A.M. Герасимов, В.Д. Антоненков, С.В. Пирожков, 1981-1990 г.г.) и доказан для ряда химических и лекарственных препаратов [74]. Из сообщения Heron et al., (1982) известно, что наркотические анальгетики влияют на структуру и липидный состав нейроцитов, что лежит в основе одной из теорий развития толерантности и зависимости к морфину на уровне мембраны [136]. В последнее десятилетие изучалась способность наркотических веществ и их метаболитов влиять на характер процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) биомембран in vivo при поступлении в организм наркотических веществ [А.Г. Калинина, С.В. Пирожков 50]. Исследованы также состояние эндогенной антиоксидантной (АО) защиты организма в эксперименте и в клинике, а также попытка коррекции окислительного стресса при острой и хронической интоксикации морфином и промедолом с помощью а-токоферола [84, 85].

К эффективным средствам, противодействующим патологически возрастающей скорости ПОЛ, относятся вещества природного и синтетического происхождения под общим названием антиоксиданты. Накоплен немалый положительный опыт применения их в медицинской практике в качестве лекарственных и вспомогательных средств для лечения заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом [9, 11, 14]. Тем не менее, в организме человека про- и антиоксидантные системы достаточно сложны и полифункциональны, а токсические эффекты алкоголя и наркотических веществ разнообразны. Поэтому не всегда проведение антиоксидантной терапии оказывается достаточным для одновременного повышения устойчивости организма к прооксидантным воздействиям и купирования токсического влияния психоактивных веществ.

Задача поиска средств, которые сочетали бы в себе одновременно антиоксидантные и антитоксические свойства, представляется актуальной. Для продвижения в ее решении нами предложено пероральное введение унитиола, представителя вицинальных дитиогликолей, группы химических соединений, к которым относятся некоторые известные инъекционные лекарственные средства, например, унитиол и дикаптол.

Химические свойства вицинальных дитиогликолей (ВД), в которых тиоспиртовые группы связаны с соседними атомами углерода, дают основания предполагать определенную перспективу их применения в наркологии. На это имеются a priori две причины. Во-первых, в медицинской литературе имеются указания на антиоксидантные свойства унитиола и других ВД, что важно при окислительном стрессе, сопровождающем наркотическую интоксикацию [Л.Г. Голота, 35]. Во-вторых, химическая структура ВД даёт основания рассчитывать на их активность по отношению к карбонильным соединениям, некоторые из которых, например, ацетальдегид, являются основными токсическими метаболитами этанола.

Для экспериментальной оценки перспективности перорального применения этого класса веществ в наркологической практике необходимо было выбрать один из ВД. По ряду причин, которые будут изложены ниже, мы остановились на унитиоле. Здесь лишь отметим, что синтез унитиола освоен отечественной промышленностью начиная с 50-х годов прошлого столетия (его синтезировал впервые В.Е. Петрунькин), а препарат (5%-ный раствор унитиола для инъекционного введения) знаком наркологам, поскольку ранее применялся в составе детоксикационных мероприятий при купировании тяжёлых абстинентных состояний и алкогольного делирия.

Мы предположили, что применение унитиола per os более перспективно, чем инъекционное введение, по крайней мере, при острой интоксикации этанолом. Основанием для этого являются исследования метаболических путей этанола и выявление основных органов-мишеней, проведённые в последние десятилетия [И.П. Анохина, Н.Н Иванец, В.Я Дробышева, 5].

ЦЕЛЬЮ настоящей работы явилось исследование мембранопротекторных и детоксицирующих свойств унитиола при пероральном применении в условиях экспериментальной наркотической патологии и ограниченные испытания эффективности препарата в условиях клиники.

В связи с целью были определены и решены следующие ЗАДАЧИ: 1. Исследовать влияние унитиола на процессы ПОЛ и систему АО резистентности животных при экспериментальной интоксикации этанолом.

2. Определить параметры ПОЛ, АО защиты организма при бытовом приеме слабоалкогольных напитков и влияние на них перорального приема унитиола в постинтоксикационный период.

3. Исследовать влияние унитиола на течение процесса ПОЛ, антиоксидантный статус организма и активность ферментов-маркёров патологии печени при купировании алкогольного абстинентного синдрома в условиях наркологического стационара

4. Изучить мембранопротекторные свойства унитиола при экспериментальных острой и хронической интоксикации морфином, в частности, определить влияние препарата на скорость реакций ПОЛ; оценить степень влияния унитиола на систему эндогенной антиоксидантной резистентности.

4. Исследовать острую токсичность унитиола при пероральном применении в опыте in vivo.

5. Оценить диапазон эффективных доз для дезинтоксикационной терапии и разработать методические рекомендации по применению унитиола per os в составе средств купирования острой алкогольной интоксикации.

Научная новизна. Впервые проведены исследования перорального применения унитиола, известного в медицинской практике в виде 5%-ного раствора унитиола для инъекций, в наркологических целях. При этом обнаружены:

- выраженные мембранопротекторные свойства унитиола при его пероральном применении в условиях острой и хронической экспериментальной наркотической интоксикации;

- выраженные мембранопротекторные свойства унитиола и детоксицирующий эффект при постинтоксикационном алкогольном состоянии (ПАС) и при интоксикации слабоалкогольными напитками

Впервые установлено, что пероральное введение унитиола больным алкоголизмом при проведении дезинтоксикационной терапии (в первый день ^ пребывания в наркологическом стационаре) в сочетании с последующей стандартной терапией достоверно улучшает ряд биохимических показателей по сравнению с показателями больных, получивших только стандартную терапию.

Сделан вывод о том, что пероральный путь введения унитиола названный в работе «циклом пероральной этанольно-альдегидной детоксикации», быстро ведёт к ускоренному купированию соматических и биохимических проявлений ААС и дано расширенное объяснение молекулярного механизма антиоксидантного действия унитиола.

Научно-практическая значимость работы. Выполненные исследования позволяют расширить оценку унитиола как средства, применяемого в составе общей детоксикационной терапии. Новый путь введения препарата ведёт к значительному усилению его известного действия и раскрывает дополнительные возможности использования субстанции в медицинской практике, в частности, в наркологии, с целью купирования проявлений наркотической интоксикации. Данные работы дают основания для разработки перорального лекарственного средства на основе унитиола, предназначенного для повышения эффективности существующей терапии. Рекомендуется также разработка пероральных средств более широкого применения, чем лекарственные, в частности, биологически активных добавок на основе унитиола, для приёма в целях снятия симптомов постинтоксикационного алкогольного состояния, снижения токсических эффектов употребления или злоупотребления алкогольными напитками.

Опыт перорального применения и спектр коррекции биохимических показателей с помощью унитиола обобщён в Методических рекомендациях «Пероральное применение унитиола в составе детоксикационных мероприятий при купировании алкогольного абстинентного синдрома», разработанных коллективом авторов Московского научно-практического центра профилактики наркоманий Комитета здравоохранения Москвы и Московского городского наркологического диспансера №1.

По части материалов работы произведено патентование. Роспатентом РФ выдан патент № 2157647 на изобретение «Пищевая добавка и способ её получения, биологически активная добавка к пище и способ её получения, пищевой продукт и способ его получения» с приоритетом от 29.12.1999 г.

4)

Подана заявка № 2003119563 на получение патента РФ на изобретение «Средство для снижения скорости течения, предупреждения развития, предупреждения возникновения патологических процессов, вызываемых употреблением этанола и/или веществ, обладающих аддиктивным потенциалом».

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 107 страниц машинописного текста. Библиографический указатель включает 200 источников, в том числе 96 отечественных и 104 зарубежных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 43 рисунками.

ВЫВОДЫ:

1. Проведено исследование мембранопротекторных свойств унитиола при экспериментальных острой и хронической интоксикации животных морфином: а) Исследовано влияние препарата на скорость реакций ПОЛ. Установлено достоверное снижение интенсивности процессов ПОЛ при пероральном введении унитиола по сравнению с контролем. б) Исследовано влияние унитиола на систему эндогенной антиоксидантной резистентности. Установлено, что пероральное введение унитиола при наркотической или этанольной интоксикации достоверно повышает уровень всех измерявшихся в эксперименте эндогенных антиоксидантов: витаминов А, Е, мочевой кислоты, SH-групп по сравнению с контролем.

2. Исследовано влияние унитиола на течение ПОЛ, антиоксидантный статус организма и активность ферментов-маркеров патологии печени при купировании алкогольного абстинентного синдрома в условиях наркологического стационара. а) Установлено достоверно более выраженное снижение интенсивности ПОЛ в группе больных, получивших в дополнение к стандартной терапии унитиол per os в первый день лечения, чем снижение показателя интенсивности ПОЛ в группе больных, получивших только стандартную терапию. б) Установлено, что больные, получившие в дополнение к стандартной терапии унитиол per os в первый день лечения, имели достоверно более высокие уровни эндогенных антиоксидантов, измерявшихся в эксперименте (витаминов А и Е, мочевой кислоты, SH-групп) по сравнению с больными, получившими стандартную терапию. в) Установлено, что уровни активности ферментов ACT и АЛТ в плазме крови больных после курса терапии были достоверно ниже в группе больных, получивших в дополнение к стандартной терапии унитиол per os в первый день лечения.

3. Определены параметры ПОЛ, АО защиты организма при бытовом приеме слабоалкогольных напитков и влияние на них перорального приема унитиола в постинтоксикационный период. Установлено, что пероральный приём унитиола достоверно улучшает показатели антиоксидантной защитной системы организма и достоверно снижает показатели интенсивности ПОЛ.

4. Исследована острая токсичность унитиола при пероральном применении в опыте in vivo. Токсичность унитиола в эксперименте в исследуемом диапазоне доз обнаружить не удалось.

5. Произведена оценка диапазона эффективных доз для дезинтоксикационной терапии с применением унитиола per os и разработаны методические рекомендации по применению унитиола в составе мероприятий по купированию алкогольного абстинентного синдрома.

6. Дано объяснение молекулярных механизмов антиоксидантного действия унитиола.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, на основании изложенного обзора литературы, можно сделать следующие выводы.

1. Токсическое действие наркотических анальгетиков и этанола при всем своем разнообразии объединяет влияние на липидный компонент биомембраны, где активируется процесс его переокисления.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИGЛКОТСКА

Токсический эффект этанола опосредуется в наибольшей степени печенью, где метаболизируется не менее 70% этанола и ацетальдегида - наиболее токсичного метаболита этанола. Печень является также одним из основных органов-мишеней наркотических анальгетиков.

Адекватные мероприятия в составе детоксикации при острых алкогольных и наркотических интоксикациях должны препятствовать развитию вторичной патологии, в частности печеночной.

Опыт применения унитиола в медицинской и, в частности, наркологической практике позволяет обосновать и исследовать его действие при пероральном приеме.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ

Экспериментальная часть работы выполнена на крысах-самцах линии Wistar-100 с исходной массой 150-250 г. Крыс содержали в клетках по 5 животных в условиях искусственного освещения (12 часов в сутки) и постоянного доступа к стандартному комбинированному корму и воде.

Соединения, использованные в экспериментах in vivo:

- унитиол-субстанция, синтезирован предприятием «Петрохим», Санкт-Петербург, 0,9% изотонический раствор хлорида натрия, морфина гидрохлорид (субстанция).

2.1. Моделирование острой и хронической интоксикации наркотическими анальгетиками или этанолом.

Для острой интоксикации крысам однократно интраперитонеально вводили морфина гидрохлорид в дозе 25 мг на килограмм массы тела.

Хроническую интоксикацию наркотиками моделировали введением животным интраперитонеально морфина гидрохлорида в течение 7 дней в возрастающих дозах от 10 до 70 мг/кг массы животного. Животные первой опытной группы получали также унитиол. Животные второй опытной группы получали плацебо. Животные контрольной группы получали эквиобъемные количества физиологического раствора. Каждая группа состояла из 10 особей.

Как в условиях острого эксперимента, так и при хроническом опыте по наркотизации, животные первой опытной группы получали унитиол перорально в желатиновой капсуле (15 мг/кг массы тела): в первом случае через 20 минут после введения наркотика, во втором случае - после последнего введения морфина на 7 день эксперимента. Животные второй опытной группы в эти же сроки получали плацебо - желатиновую капсулу без унитиола. Декапитировали животных через 2,5 часа после острого введения, а в хроническом эксперименте -через сутки после последнего введения морфина.

Хроническую интоксикацию этанолом моделировали жидкой этанолсодержащей диетой, в качестве единственного источника жидкости для подопытных животных использовали 12% раствор этанола.

Во всех фрагментах эксперимента исследовали плазму крови и ткань печени, фиксируя количество продуктов перекисного окисления липидов, показатели активности системы эндогенной антиоксидантной резистентности (содержание в плазме крови витаминов Е, А, аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и SH-групп), активность ферментов - маркеров повреждения печени.

Содержание перекисей липидов в плазме крови определяли флуориметрически после реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методу Neiman J. et al. [165] и модифицированным методом Wade C.R., van Rij A.M. [192]. Скорость неэнзиматического ПОЛ определяли в гомогенатах печени до и после индукции процесса Fe—АДФ - аскорбатом (0,1 - 1,5 - 0,1 мМ) по реакции продуктов ПОЛ с ТБК-реагентом, как описано в [165]. Уровень малонового диальдегида (ТБК-положительных продуктов) измеряли спектрофотометрически по разности оптических плотностей при длинах волн 535 и 570 нм через 30 и 60 минут после начала инкубации.

Уровень витаминов Е и А в плазме крови определяли флуориметрически, используя в качестве экстрагента гексан. Витамин Е определяли при длине волны возбуждения 295 нм и длине волны эмиссии 320 нм, витамин А - при длине волны возбуждения 340 нм и длине волне эмиссии 475 нм как описано Thompson J.N. et al. [187]

Метод определения восстановленной формы аскорбиновой кислоты основан на взаимодействии 2,4-динитрофенилгидразина с дигидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислотами (ДАК и ДКГК соответственно) и на способности аскорбата образовывать окрашенный комплекс с 2,6-дихлорфенолиндофенолом.

Содержание SH-групп в плазме крови определяли, используя реактив Элмана по методу Wayner D.D.M. et al. [193]. Количество мочевой кислоты (урата) определяли спектрофотометрически, регистрируя образование окрашенного комплекса урата с вольфраматгидроксиламиновым реагентом при 690 нм [193].

Активность ферментов - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) измеряли в соответствии с рекомендациями фирмы "Boehringer" (ФРГ), используя фирменные стандартные наборы реактивов.

Острую интоксикацию морфином моделировали на крысах введением интраперитонеально среднетоксической дозы морфина гидрохлорида (25 мг на кг массы животного). Хроническую интоксикацию животных морфином моделировали введением наркотика в течение 7 дней в возрастающих дозах от 10 до 70 мг/кг массы. Хроническую интоксикацию этанолом моделировали на крысах-самцах в течение 6 месяцев, для которых единственным источником питьевой жидкости служил 12% раствор этанола. Контрольная группа животных имела свободный доступ к питьевой воде. Каждая группа состояла из 10 особей.

Исследование влияния интоксикации слабоалкогольными напитками на биохимические параметры и действия унитиола в этих условиях проводилось с участием взрослых добровольцев-мужчин (38-47 лет), не принадлежащих к категории наркологических больных и не отягощенных психосоматическими расстройствами. По оговоренным условиям эксперимента в течение 14 дней испытуемые ежедневно выпивали 1 л пива в одно и то же вечернее время. Возможный дополнительный приём спиртных напитков не запрещался, однако по окончании испытаний стало известно, что злоупотреблений спиртными напитками среди участников не было. В каждой группе было 10 испытуемых.

2.2. МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЭКСПЕРИМЕНТА.

Выбор методов статистической обработки результатов экспериментов должен адекватно учитывать специфику полученных данных.

Для сравнения средних двух совокупностей использовался t-критерий Стьюдента, сокращённо называемый t-критерием. Случайной величиной, подчиняющейся распределению Стьюдента с п степенями свободы, называется отношение независимых случайных величин tn= £ / ( L '/„ • x2n t , где - случайная величина, имеющая нормальное распределение с параметрами (0,1), а х2п подчиняется распределению %2 с п степенями свободы. t-критерий является наиболее часто используемым методом для выявления различий между средними двух выборок. Теоретически t-критерий может применяться даже если размер выборки очень невелик (например, 10; некоторые исследователи считают, что критерий применим и при меньшем объёме выборки). Предполагается, что наблюдаемые величины нормально распределены (внутри групп), а дисперсии наблюдений в группах не слишком различны. Известно, что t-критерий относительно устойчив к отклонениям от нормальности.

Мы применяли t-критерий в двух ситуациях: для сравнения средних двух независимых выборок (t-критерий для независимых выборок) и для сравнения средних зависимых выборок (t-критерий для зависимых выборок). Последний вариант критерия применяют для экспериментов, в которых две сравниваемые группы наблюдений основываются на одной и той же выборке наблюдений (субъектов), которые тестировались дважды, например, до лечения и после лечения определённым методом.

Для статистической обработки результатов эксперимента были использованы непараметрические методы, в частности, критерий Колмогорова-Смирнова и, дополнительно, критерий Вилкоксона, поскольку t-критерий Стьюдента имеет недостаточную точность при сравнительно небольших объёмах

• выборки, а также при отклонении распределения от нормального.

Критерий Колмогорова-Смирнова относится к непараметрическим критериям, поскольку с его помощью можно проверять гипотезу об однородности двух выборок (равенстве средних двух совокупностей) не имея никаких априорных сведений о характере распределения. Альтернативная гипотеза критерия - выборки извлечены из разных совокупностей. Критерий чувствителен к различию общих форм распределения (например, асимметрии и т.п.), что снижает его мощность.

При недостаточной мощности критерия Колмогорова-Смирнова, а также при различии в объёмах выборок, проводились дополнительные вычисления с привлечением U-критерия Манна-Уитни, поскольку программный пакет Statistica даёт возможность пользоваться критерием Вилкоксона только при одинаковых объёмах в зависимых выборках, что является искусственным ограничением критерия. Критерий Манна-Уитни является непараметрической альтернативой t-критерию Стьюдента для независимых выборок, причём наиболее мощной (мощнее критерия Колмогорова-Смирнова). Фактически, в некоторых случаях он имеет даже большую мощность, чем t-критерий. Статистика U-критерия вычисляется как

U = W — !/2 • m(m+l) = I" Zm б,7 , где W - так называемая статистика Вилкоксона, J I, если х, < уу 0 в противном случае

Для сравнения выборок ниже приводится оценка доверительной вероятности для ошибки первого рода по критерию Колмогорова-Смирнова для гипотезы о том, что представленные наблюдения в сравниваемых выборках принадлежат одной совокупности. Приводятся также: значение средних в каждой сравниваемой группе, стандартные отклонения, максимальные положительная и отрицательная разности для эмпирических функций распределения. Вычисления производились с помощью программы Statistica.

При сравнении средних, как и всегда в анализе данных эксперимента, очень полезна визуализация данных. С этой целью мы используем применяемые в математической статистике диаграммы размаха, точнее категорированные т диаграммы размаха. Сам термин «диаграммы размаха» (их ещё называют графиками «ящик-усы») был введён Тьюки в 1970 г. На графиках изображают диапазоны значений выбранной переменной, построенные отдельно для каждой группы наблюдений, определяемой значениями категоризующей или группирующей переменной (например, номером экспериментальной группы). Чрезвычайно удобно для визуализации данных, что на одном графике можно представить более одной зависимой переменной для сравнения распределений результатов соответствующих измерений по группам. Поскольку на диаграмме размаха представлены сведения о минимальном и максимальном значениях в выборке, медиана выборки, процентили (как правило, мы применяли квартили), то она визуально даёт значительно больше информации, чем ранее применявшиеся столбчатые диаграммы. На каждой диаграмме размаха внизу рисунка справа указаны сведения о выбранной процентили и т.д. Горизонтальные отрезки прямых обозначают min и max значения наблюдаемой величины, медиана выборки - маленький прямоугольник внутри большого прямоугольника, большой прямоугольник - границы измерений между 25 и 75 процентилями.