Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Протективная активность милиацина при стрессиндуцированной иммуносупрессии

На правах рукописи

ПАНФИЛОВА Татьяна Владимировна

ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИЛИАЦИНА ПРИ СТРЕССИНДУЦИРОВАННОЙ ИММУНОСУПРЕССИИ

14.00.36 Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь - 2007

003068450

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Оренбург

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Фролов Борис Александрович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Черешнева Маргарита Владимировна кандидат медицинских наук, доцент Шилов Юрий Иванович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «» 2007 г. в -/С' часов на заседании

диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 2446711.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан « » .яУу^^^С- 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАН . Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Со времени открытия общего адаптационного синдрома Н. Selye (1936) интерес к исследованию особенностей функционального состояния иммунной системы при стрессорных воздействиях не утратил своей остроты. В значительной степени это обусловлено её ключевой ролью в обеспечении генетического постоянства внутренней среды организма (Ярилин, 1999; Хаитов и др., 2000; Хаитов, 2006). Многочисленными исследованиями, выполненными к настоящему времени, показано, что длительные и (или) интенсивные стрессорные воздействия нарушают функционирование различных звеньев иммунной системы, что создает реальную угрозу развития инфекционной патологии, аутоиммунных и опухолевых заболеваний (Корнева, 1993; Пшенникова, 2001; Owen et al., 2003; Purcell et al, 2003). В связи с этим разработка подходов, направленных на предупреждение или ограничение подобных негативных последствий стресса, является актуальной задачей иммунологии.

Несмотря на обнадеживающие результаты, достигнутые в ее решении (Корнева и др., 2000, 2002, 2004; Волчегорский и др., 2000; Шилов и др., 2000, 2005; Немирович-Данченко, Фомичева, 2001, 2003; Пиванович, 2002; Пономарев и др., 2005; Daynes et al, 2003; Wintergerst et al., 2006), дальнейшее развитие данного направления продолжается. При этом все более заметное место в нем занимает использование синтетических и природных веществ, обладающих тропностью к иммунной системе (Хаитов, Пинегин, 2000). Среди последних пристального внимания заслуживают тритерпе-ноиды - вещества специализированного обмена, обладающие широким спектром биологического действия. Продемонстрированная в ряде работ способность тритерпенои-дов к стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа (Ильичева и др., 2001; Behboudi et al., 1996; Villacres-Eriksson et al, 1997; Morein et al, 1998; Bernhardt et al., 2000; Logambal, Michael, 2000) характеризует их как перспективные средства иммунотерапии. Вместе с тем эти исследования практически не коснулись оценки эффективности тритерпеноидов при их использовании для профилактики дисфункций иммунной системы в условиях экстремальных воздействий на организм. Это положение относится и к милиацину - тритерпеноиду растительного происхождения, обладающему способностью стимулировать лимфопоэз, проявлять адьювантную активность и оказывать мембранопротекторное действие (Кириллова, 2004).

Отсутствие ясности в данном вопросе не позволяет оценить перспективы использования милиацина в качестве иммунопротекторного средства при дестабилизирующих воздействиях, что с учетом его доступности, крайне низкой токсичности

(1ЛЭ5о > ЮОО мг/кг) и побочных эффектов в широком диапазоне доз (Олифсон и др., 1991) могло бы иметь важное прикладное значение.

Цель настоящего исследования - экспериментальное изучение протективного влияния милиацина при стрессиндуцированной иммуносупрессии, а также выяснение некоторых механизмов такого влияния.

Основные задачи исследования

1. Изучить особенности формирования гуморального и клеточного иммунного ответа при стрессе в условиях применения милиацина или без его применения.

2. Оценить влияние милиацина на выраженность стрессорной реакции.

3.Проанализировать влияние милиацина на состояние внутрииммунных регу-ляторных механизмов при стрессорном воздействии.

4. Определить эффект тритерпеноида в отношении глюкокортикоидиндуциро-ванного апоптоза тимоцитов и лимфоцитов селезенки.

5. Исследовать способность милиацина к ограничению стрессорной активации перекисного окисления липидов.

Научная новизна. Впервые определено протективное влияние милиацина в отношении стрессорной дисфункции иммунной системы. В экспериментах на мышах (СВАхС57В1б)р1 установлена способность тритерпеноида отменять стрессорное угнетение формирования АТОК и эффекторов ГЗТ. Показано, что влияние милиацина на стрессорную супрессию первичного гуморального иммунного ответа зависит от срока воспроизведения стрессорного воздействия относительно фазы развития иммунной реакции. Установлено, что милиацин обеспечивает восстановление уровня ответа в случае воспроизведения комбинированного стресса перед иммунизацией животных и не влиет на выраженность иммуносупрессии при стрессорном воздействии на 3 сутки после иммунизации. Впервые обнаружены механизмы, обеспечивающие защитное влияние милиацина при стрессиндуцированных нарушениях функций иммунной системы. В их числе - ослабление антигенспецифической и антигеннеспецифической супрессии и повышение устойчивости лимфоцитов селезенки к апоптогенному действию глюкокортикоидов. Выявлена антиоксидантная способность милиацина, проявляющаяся в ограничении индуцируемого стрессом перекисного окисления липидов и накопления в крови продуктов липопероксидации.

Теоретическое и практическое значение работы. Представленные данные расширяют представление о степени выраженности протективного влияния милиацина в отношении стрессиндуцированных нарушений функций иммунной системы и о механизмах такого влияния. Раскрываются новые аспекты действия милиацина на

организм, что расширяет существующие представления о его биологических эффектах, в том числе о способности тритерпеноида реализовывать не только иммунотроп-ную активность, но и проявлять антиоксидантное действие как важных составляющих его протективного влияния при экстремальных воздействиях. Выявление защитного действия милиацина в отношении стрессорной дисфункции иммунной системы раскрывает новые возможности для изыскания иммунотропных лекарственных средств -протекторов среди соединений стероидной природы естественного происхождения или осуществления их синтеза с избирательным влиянием на различные звенья иммунной системы. Установленная в работе возможность ограничения стрессорных нарушений функций иммунной системы с помощью милиацина служит экспериментальным обоснованием для исследования данного тритерпеноида в качестве иммуно-протектора при действии на организм экстремальных факторов.

Результаты диссертационной работы включены в учебный курс для студентов Оренбургской государственной медицинской академии. По материалам работы получен Патент на изобретение РФ № 2244548 "Средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина". Зарегистр. в Госреестре изобретений 20.01. 2005.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин оказывает защитное действие в отношении стрессорного угнетения функциональной активности иммунной системы. Данная протекция распространяется как на гуморальную, так и на клеточную (ГЗТ) формы иммунного ответа.

2. Протективное влияние милиацина не связано с ограничением стрессорной мобилизации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы. Механизмы этого влияния реализуются, по меньшей мере, в трех направлениях: путем ослабления антигенспецифической иммуносупрессии, развивающейся в ходе формирования иммунного ответа; через снижение стрессиндуцированной антигеннеспецифической супрессии; путем повышения устойчивости лимфоцитов к апоптогенному действию глюкокортикоидов.

3. Протективная активность милиацина сочетается с его антиоксидантной способностью, проявляющейся ограничением перекисного окисления липидов в условиях действия на организм стрессорного фактора.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, Оренбург, 1999, 2000; II Съезде патофизиологов России, Москва, 2000; II Конференции иммунологов Урала, Пермь, 2002; Международной научно-

практической конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет», Санкт-Петербург, 2002; V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2002; Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», Санкт-Петербург, 2003; III Конференции иммунологов Урала, Челябинск, 2003; III Съезде иммунологов России, Екатеринбург, 2004; Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Типовые патологические процессы», Уфа, 2005; IV Конференции иммунологов Урала, Уфа, 2005.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 20 научных работах, в том числе в статьях, опубликованных в рецензируемом научном журнале «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». Получен Патент на изобретение РФ №2244548.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, главу «Материалы и методы исследования», 3 главы собственных исследований, обсуждение, выводы и указатель цитируемой литературы, включающий 170 отечественных и 131 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 11 таблицами и 21 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 51 мышах СВА и 1170 мышах-самцах (CBAxC57B16)F, массой 18-22г, поставленных из питомника АМН РФ «Столбовая». Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре, двухразовом питании натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам, при неограниченном доступе к воде. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985). Выведение из опыта мышей осуществляли цервикальной дислокацией. В качестве модели стрессорного воздействия применяли комбинированный стресс (Рыбакина, 2001), включающий 16-часовую иммобилизацию животных, при которой в течение первых двух часов они выдерживались при температуре 4-5°С, а последующие 14 часов - при комнатной температуре. Иммобилизацию воспроизводили путем фиксации мышей за конечности в положении «на спине». Интенсивность стрессорной реакции оценивали по уровню кортикостерона (исследование проведено в отделе общей патологии и патофизиологии ИЭМ РАМН; руководитель - акад.

РАМН, профессор Е.А. Корнева), определяемого в сыворотке крови мышей радиоиммунологическим методом конкурентного связывания (Гончаров и др., 1986).

В работе использовали милиацин, любезно предоставленный профессором Л.Е. Олифсоном и полученный из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаивании на холоду. Очистка препарата проведена путем его перекристаллизации из хлороформа. На основании изучения масс-, ЯМР- и ИК- спектров, хроматографи-ческой однородности и качественного состава (Олифсон и др., 1991) выделенный препарат отнесен к группе пентациклических тритерпеноидов (рис. 1), имеющих структуру З-Р-метоксигерманицена (3-р-метокси-Д18-олеанена).

НзС СНз

НзС СНз

Рис. 1. Химическая структура пентациклического тритерпеноида - милиацина.

Для изучения протективной активности милиацина проводили его внутри-брюшинное введение в разовой дозе 2 мг/кг массы животного. Схема применения тритерпеноида включала его трехкратное интервальное (через 3 дня) введение, последнее из которых выполнялось за 24 часа перед воспроизведением стрессорного воздействия. Выбор указанной схемы основывался на ранее полученных данных (Кириллова A.B., 2004), демонстрирующих ее высокую эффективность в реализации им-мунотропного влияния милиацина. Во всех экспериментах по оценке защитного влияния милиацина на развитие стрессорной дисфункции иммунной системы использовали 6 групп примированных животных, иммунизация которых эритроцитами барана (ЭБ) осуществлялась: 1) без какого-либо воздействия; 2) после завершения иммобилизации; 3) после введения растворителя для милиацина (физ. раствор с добавлением твина-21 в конечной концентрации 1,6x10"7 моль/кг) по соответствующей схеме; 4) после завершения иммобилизации на фоне предварительного введения растворителя; 5) после трехкратного введения милиацина; 6) после завершения иммобилизации на фоне предварительного введения милиацина. Исключение составили опыты по изучению протективного влияния тритерпеноида на гуморальный иммунный ответ при воспроизведении стресса в продуктивную фазу иммуногенеза, где введение милиацина

осуществлялось за 120 часов, а примирование животных за 72 часа до стрессорного воздействия.

Гуморальный иммунный ответ исследовали путем определения прямых анти-телообразующих клеток (АТОК) по методу N.K. Jerne, A.A. Nordin (1963) в селезенке внутрибрюшинно иммунизированных (5х108 ЭБ) животных. Изучение особенностей формирования клеточного иммунитета проводили на модели локальной адоптивной ГЗТ (Bretscher, 1979), и в реакции "трансплантат против хозяина" в генерализованном варианте.

Оценку антигеннеспецифической супрессии проводили по способности спле-ноцитов неиммунных мышей (Краскина и др., 1983), получавших милиацин (или растворитель), ингибировать АТОК в популяции иммунных спленоцитов от примирован-ных ЭБ доноров. Для определения антигенспецифической супрессии иммунного ответа, мышей - доноров иммунных клеток селезенки (ИКС) иммунизировали внутривенно 5х108 ЭБ, и на 8 день осуществляли перенос донорских спленоцитов (ЗхЮ8) син-генным реципиентам. Через 30-60 мин реципиентов иммунизировали 5х108 ЭБ и еще через 4 суток определяли АТОК в их селезенках методом Ерне.

Содержание ИЛ-1 в сыворотке крови оценивали иммуноферментным методом с использованием прибора Мультискан (MS) и набора моноклональных антител к человеческому ИЛ-1 (а) фирмы "Цитокин" (С-Петербург).

Исследование глюкокортикоидиндуцированного апоптоза тимоцитов и лимфоцитов селезенки осуществляли in vitro с клетками, выделенными от интактных животных и животных, получавших предварительно милиацин или растворитель. 16-часовую инкубацию этих клеток (0,1 мл; 4х105) проводили в пластиковых планшетах ("Costar") в среде (2,9 мл) ДМЕМ ("Пан Эко"), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Bio Whittaker"), 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина без добавления или с добавлением дексаметазона ("Sigma") в конечных концентрациях 60, 300 или 3000 нМ. Раннюю фазу апоптоза выявляли по способности клеток связывать аннексии V, конъюгированный с ФИТЦ, позднюю - по их прокрашиванию 0,15% раствором пропидия йодида ("Sigma", США). Интенсивность флюоресценции оценивали на проточном цитофлюориметре "FACSCalibur" ("Becton Dickinson") по FL1 при длине волны 515 нм и FL2 при длине волны 640 нм (фрагмент работы выполнен в НИИ ЭДИТО Онкоцентра им. H.H. Блохина; зав. - профессор А.Ю. Барышников). Результаты цитофлюориметрии (не менее 5000 событий для каждого образца) анализировали с помощью программного обеспечения "CellQuest™" ("Becton Dickinson"). Глюкокортикоидиндуцированный апоптоз рассчи-

тывали как разницу между показателями проб, инкубированных с дексаметазоном и без дексаметазона.

Перекисное окисление (ПОЛ) в сыворотках крови мышей исследуемых групп оценивали в модельной системе, осуществляя генерацию активных форм кислорода 50 мМ раствором двухвалентного железа (FeS04 ■ 7Н20), который (1,0 мл) добавлялся к образцам сывороток, находящихся в кювете хемилюминесцентной установки XJIM-003 и предварительно разведенных фосфатным буфером (рН-7,45) в соотношении 1:40. Инициированное в этих условиях окисление ненасыщенных жирных кислот регистрировали по хемилюминесценции (XJ1) с определением (в условных единицах) амплитуды (Ахл) максимального свечения и светосуммы (2ХЛ) (Лопухин, 1993).

Способность милиацина оказывать влияние на образование активных форм кислорода изучали в условиях индукции последних с помощью Н202, вносимой в инкубационную среду культуры лимфоцитов (в конечной концентрации 50 мкМ и 100 мкМ) с последующей детекцией "кислородного взрыва" с использованием зонда: 2,7-дихлордигидрофлюоресцина диацетата - DCFDA ("Sigma",США). Интенсивность флюоресценции клеток, меченных зондом, отражающую активацию внутриклеточного окисления, определяли на проточном цитофлюориметре "FACSCalibur" при длине волны возбуждения 540 нм с длиной волны испускания 600 нм. Результаты (не менее 10000 клеток для каждого образца) оценивали по сдвигу популяции клеток в яркий диапазон шкалы в % к общему числу клеток (исследование выполнено в лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток Онкоцентра им. H.H. Блохина РАМН; зав. лабораторией - доктор медицинских наук A.A. Штиль).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли по общепринятым методикам (Урбах, 1975), рассчитывая среднее арифметическое, доверительный интервал, стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t - критерия Стъюдента при нормальном распределении. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Защитное влияние милиацина при стрессорной дисфункции иммунной системы

Установлено, что трехкратное интервальное введение милиацина, предшествующее иммунизации мышей (CBAxC57Bl6)Fb не сказывалось существенно на формировании АТОК (относительное содержание), но приводило к возрастанию общего пула спленоцитов и, как следствие этого - к увеличению абсолютного содержания антителопродуцентов (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние милиацина на гуморальный иммунный ответ у мышей (СВДхС^П!«)?,, подвергнутых стрессорному воздействию перед примированием

Группы животных Сроки прими- Исследуемые показатели

рования ЭБ (5x108) Масса селезенки (мг) Кол-во спленоцитов (xl О6) АТОК (хЮ6) АТОК!/ селезенку

I Интактные

II Стрессиро-ванные

III Введение растворителя

IV Стрессиро-ванные после введения растворителя

V Введение милиацина

VI Стрессиро-ванные после введения милиацина

Без предварительного воздействия

Сразу после стресса

165,0±12,9 (15)

128,0±4,1* (15)

На 11 сутки от начала введения растворителя Сразу после стресса(на 11 сутки от начала введения растворителя На 11 сутки от начала введения милиацина Сразу после стресса(на 11 сутки от начала 153,0+6,7» введения милиацина)

160,4±10,2 (8)

115,2±5,21*'i (8)

190,9±3,7* (15)

(15)

175,0+8,6 (15)

И9,0±4,8*" (15)

170,2±10,3 (8)

110,5+6,4*"« (8)

216,6±5,2*" (15)

162,0±5,2»"

(15)

226,0±14,1 (15)

120,0±18,5*" (15)

220,5±12,6 (8)

122,6±12,4*" (8)

246,2±8,1 (15)

222,0±10,9и (15)

40297+3918 (15)

14335±2570*" (15)

37225±2589 (8)

13831±2070*"» (8)

52980±1779»' (15)

35664±2312.". (15)

Примечание.

* - достоверность с группой I (при р < 0,05); *' - то же (при р < 0,01); *" - то же (при р < 0,001);

- достоверность между группами IV и III (при р < 0,01); •" - то же между группами IV и III; VI и V (при р< 0,001);

■ - достоверность между группами VI и И; VI и IV (при р < 0,05); - то же (при р < 0,01); ■" - то же (при р < 0,001).

Комбинированный стресс, воспроизводимый перед иммунизацией животных, вызывал снижение суммарного уровня ответа как за счет угнетения формирования АТОК, так и за счет убыли спленоцитов. Применение тритерпеноида перед стрессор-ным воздействием, оказывало выраженный защитный эффект. Обнаружено, что в основе данного эффекта лежит отмена стрессорного угнетения формирования АТОК. В то же время милиацин не ослаблял выраженность клеточного опустошения селезенки, которое, как известно (Горизонтов и др., 1983), обусловлено активацией симпато-адреналовой системы (САС). Подобное обстоятельство может означать, что применение милиацина не затрагивает стрессорной мобилизации САС и не сказывается на чувствительности лимфоцитов селезенки к данному действию катехоламинов, осуще-

ствляемому при участии а-адренорецепторов (Зимин, 1983). Исходя из этого, с большой вероятностью допустимо предполагать, что защитное влияние милиацина связано с его прямым воздействием на клетки, участвующие в формировании иммунного ответа, предотвращающим стрессиндуцированное нарушение их функции.

Защитное влияние милиацина на стрессорную супрессию первичного гуморального иммунного ответа зависит от срока воспроизведения стрессорного воздействия относительно фазы формирования иммунной реакции и не регистрируется в случае нанесения комбинированного стресса на 3 сутки после иммунизации. Отсутствие протекции в этом случае не связано с большей выраженностью супрессии в виде более значимого снижения относительного и абсолютного количество АТОК. Возможно, что такая ситуация отражает меньшую чувствительность к защитному действию милиацина клеток - эффекторов гуморального ответа (В-лимфоцитов, плазмоцитов) по сравнению с клеточными популяциями (СЭ4Т Т-хелперы; моноциты/макрофаги), участвующими в его индукции. Наряду с этим она может быть связана и с большей чувствительностью клеток, находящихся в логарифмической фазе антигензависимой пролиферации к различного рода дестабилизирующим воздействиям, что нивелирует проявление защитного действия тритерпеноида.

Оценка протективного эффекта милиацина в отношении уже сформировавшегося иммунного ответа при воспроизведении стресса у животных, ревакцинированных столбнячным анатоксином, позволило зарегистрировать важный факт усиления выраженности вторичной иммунной реакции при использовании тритерпеноида (без стресса), что свидетельствует о его способности оказывать форсифицирующее воздействие на вакцинальный процесс. Вместе с тем, влияния самого стресса на уровень антител в крови ревакцинированных мышей обнаружить не удалось, что можно расценивать как проявление устойчивости к нему сформировавшегося механизма гуморального иммунного ответа. Такая устойчивость могла быть обусловлена особенностями антител, находящихся в циркуляции на пике ревакцинации и характеризующихся принадлежностью к классу молекул ^О, которые отличаются достаточно высокой резистентностью к катаболизму и слабо выраженной экзосекрецией (Хаитов, 2006), что обеспечивает продолжительность их пребывания в крови и лимитирует роль данных механизмов в развитии феномена постстрессорного снижения уровня антител (Першин и др., 2002).

Исследование протективного влияния милиацина на клеточно-опосредованную форму иммунной реакции - ГЗТ позволило выделить два значимых положения. Первое из них заключается в обнаружении стимулирующего действия тритерпеноида на фор-

мнрование эффекторов )ЗТ или (и) экспрессию их активности при трансплантация сиигенным реципиентам (рис. 2).

Интенсивность специфического __воспаления (Д)

III

iv

V

VI

И—I

41,0 ± 10,9%*'

-6.1 ± 9.2% 35,8 ± 7,4%*' 6,9 ±7,1% 82,2 ±7,4%*". 54,7 ± 11,0% *"■"

Рис. 2 Влияние милиацина на формирование эффекторов ГЗТ у мышей (СВЛхСяВ^)Г,, подвергнутых воздействию комбинированного стресса.

Р - интенсивность воспаления при использовании неиммунных спленоцитов; - //-// при использовании иммунных спленоцитов; ! - нейрессироваиные доноры спленоцитов без введения растворителя и милиацина; И - доноры, подвергнутые стрессу; III - //-//, получавшие растворитель; IV /1-11, подвергнутые стрессу после введении растворителя; V - ¡14!, получавшие мачяации; VI - //-//, подвергнутые стрессу после введения милиацина; *' - достоверность различий специфического воспаления внутри групп (при р<0.01); *"- то же (при р<0,001); • - достоверность различий между группами V и 1; V и 1П (при р<0,05): ■" - достоверность различий между группами VI и II: VI и IV (при р^С.001).

Второе - й установлении протективного влияния милиацина при стрессорном угнетении этих эффекторов. Последнее выражалось вое произвел ищем специфического воспаления при использовании донорских иммунных спленоцитов от стрессиро-ванных животных, получавших ми.тацин. при фактическом отсутствии такой возможности в случае использования аналогичных спленоцитов от только стресс про в энных животных, или стрессированных животных, получавших растворитель.

В другой экспериментальной модели клеточной реакции - генерализованной Р ТЛХ не было установлено сколь-либо значимого влияние на способность донорских спленоцитов мышей СВЛ к ее индукции и полусингенном переносе мышам (СВЛ х ни у милиацина. ни у стрессорного воздействия.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о позитивном влиянии милиацина при стрессррной дисфункции иммунной системы. Направленный характер этого влияния, зависящий от фазы (гуморальный ответ) и формы (РТ1IX: ГЗТ) иммунного ответа, может отражать различную чувствительность клеточных клонов, участвующих в формировании иммунных реакций к действию тритср пеной да. В целом же. они демонстрируют потенциальную возможность использования милиацина для ограничения неблагоприятных последствий стресса в отношении гуморальных и клеточных факторов иммунной защиты,

2. Механизмы протективного действии милиацина при стрессиядуцировзнной иммуносулрессив

Изучение механизмов, опосредующих протективнос влияние милиацина при стрессорных нарушениях функций иммунной системы, не привело к обнаружению существенных различий в уровне кортикостерона в кропи животных, подвергнутых стрессу на фоне предварительного применения тритертюноида. или без такового

(рис. 3.).

нг/мл

454]

400

550

МО

250

200

150

1 СП

50

0

¿А

Перед стрессом

(базальный \ ровен Ц)

Сразу поело стресса

гН

4К часов после стресса

72 часа после стресса

Рис. 3. Влавнне милиаинна на стрессорную индукцию кортикостерона у мышен

(СВАхСя ВЫЬ ,

но оси абсцисс - сроки исследования; по оси ординат - уровень кортикостерона (нг/мл): I 1 - без предварительного введения милиацина или растворителя; Д - предварительное введение растворителя; ЕЭ - предварительное введение милиацина; * - достоверно по отношению к исходному уровню (при р<0,05); *'- то же (при р<0,01); *"- то же (при р<0,001)

Иными славима, милиацин не ослаблял выраженное™ мобилизации одной из

ведущих стресс-реализуют их систем: гипоталамо-гжгофизнрно-адрепокпртика.тьной

(ГТАКС), которая традиционно рассматривается в качестве важнейшего механизма

стрессорной иммуносупрессии. Таким образом, полученные нами данные не позволили сделать заключение об опосредованное™ защитного действия милиацина ослаблением участия этой системы в развитии стрессорной реакции.

Наряду с этим в работе изучены особенности стрессорной индукции ИЛ-1 - цитокина, характеризующегося не только иммунотропными эффектами, но и играющего важную медиаторную роль при нейроиммуноэндокринных взаимодействиях, осуществляемых, в частности, между ГГАКС и иммунной системой (ВезейоУБку й а1., 1986; Акмаев, 1998; Рыбакина, 2001). Проведенные исследования не выявили существенных различий в особенностях индукции ИЛ-1 и в уровне его подъема при стрессе, воспроизводимом на фоне введения милиацина, по сравнению с динамикой и пиковым уровнем цитокина, регистрируемым у животных, при стрессорном воздействии без применения тритерпеноида (табл. 2). Вместе с тем, более высокий уровень цитокина в интервале 48-72 часа после стрессорного воздействия у мышей опытной группы, может отражать меньшую депрессию цитокинпродуцирующей активности клеток их моно-цитарно-макрофагальной системы в указанные сроки постстрессорного периода в случае превентивного использования тритерпеноида.

Таблица 2.

Влияние милиацина на индукцию ИЛ-1а у мышей (СВАхС57В1б)Р1

Сроки исследования ИЛ-1 Концентрация ИЛ-1 (пг/мл) в группах животных

Без милиацина | После введения милиацина

Базальный уровень 0,076 ± 0,0019 0,08 ± 0,0036

(6) (6)

Сразу после стресса 0,096 ± 0,0064 * 0,102 ±0,0094*

(6) (6)

Через 24 часа после 0,086 ± 0,0070 0,083 ± 0,0042

стресса (6) (6)

Через 48 часов после 0,070 ± 0,0053 0,09 ± 0,007 .

стресса (4) (6)

Через 72 часа после 0,076 ±0,0015 0,087 ± 0,0028

стресса (5) (5)

Примечание. * - достоверность различий с базапьным уровнем (при р<0,05); • - достоверность различий между группами животных, получавших и не получавших милиацин (при р<0,05); то же (при р<0,01).

Исследование влияния милиацина на особенности антигенспецифической супрессии в условиях стрессорного воздействия, позволило установить, что комбинированный стресс не стимулировал усиления формирования (или активности) антиген-специфических супрессоров и, следовательно, данный механизм не лежит в основе стрессорного подавления иммунного ответа (рис. 4).

Эффективность

ЛТО К/сел езенку супрессии (%)

II

iii

iv

VI

-I

5J.09 + 4.B5*

Н

|—F=r

, ^=1-<

52,49 ± 4,05* 59.44 ± 2.77* 55.54 ± 4,34* 28,48 ±6,88*'

1—[—I 32,44 ±3,91*

I ^ ЛТОК/ссл«скку (Х|Й!)

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Рис. 4. Влияние милиацина на формированиеантнгенспецвфической супрессии у мышей (CRAxCs7BI()Fif подвергнутых воздействию комбинированного стресса.

О - интенсивность иммунного ответа у примированных ЭБ реципиентов после трансплантации неиммунных спленоцитов; Q - //-// после трансплантации иммунных спленоцитов: I - нестресси-рованныс доноры сппсноцитов без введения растворителя и милиацина; II - доноры, подвергнутые стрессу; Щ - //-//. получавшие растворитель; IV - //-//, подвергнутые стрессу после введения растворителя; V - II-II, получавшие мклиашш; VI - Ii-Ii, подвергнутые стрессу после введения милиацина; *' - достоверность различий внутри групп (при р<0,01): *" - то же (при pcü.ÜOl); • -достоверноса различий между группами V и I; V и III (при р<0,05); ■ - достоверноаъ различий между группами VI и II; V! и IV (при р<0,05)

В то же время мйлиацин ослабляет формирование (или активность) tynpccсорных клеток и этот эффект сохраняется в условиях стрессорного воздействия. Очевидно, что способность милиацина снижать экспансию антигенспецифических супрессо-ров в ходе развития иммунного отпета, в том числе в условиях стрессорного воздействия, может обеспечить большую выраженность иммунной реакции у стресс«рованных животных, и. таким образом, выступить как значимый фактор ограничения стрсссип-дуцированной иммуносупресеии.

Еще одним механизмом, опосредующим защитный эффект милиацина при стрессорной дисфункции иммунной системы, может служить способность тритерпе-ноида лимитировать стрессорную индукцию антигеннеЫецифической супрессии (рис. 5).

Эффективность супрессии (%)

1

II

III

IV

V

VI

33,3+4,4»'

35,4 ± 2,6»"

15,4 ± 6,0 I

АТОК/ 106

Рис. 5. Влияние милиацина на антигеннеспецифическую супрессию спленоцитов мышей (CBAxC57Bl6)Fi, подвергнутых стрессорному воздействию.

0 - количество АТОК при инкубации иммунных спленоцитов (ИС) в среде 199; I - II-II при инкубации ИС со спленоцитами от интактных доноров; II - II-II при инкубации ИС со спленоцитами от стрессированных доноров; III - II-II при инкубации ИС со спленоцитами доноров, получавших растворитель; IV - //-// при инкубации ИС со спленоцитами доноров, подвергнутых стрессу на фоне введения растворителя; V - //-// при инкубации ИС со спленоцитами доноров, получавших милиацин; VI - //-// при инкубации ИС со спленоцитами доноров, подвергнутых стрессу на фоне введения милиацина; *' - достоверность различий между группами II и I (при р<0,01); *" - то же между группами IV и III (при р<0,001); ■ - достоверность различий между группами VI и II (при р<0,05); ■"- то же между группами VI и IV (при р<0,001).

Этот эффект проявляется в отмене депрессивного влияния спленоцитов неиммунных стрессированных животных на популяцию зрелых антителопродуцентов от сингенных доноров в условиях применения милиацина перед стрессорным воздействием.

Наряду с этим установлено, что существенное значение в механизмах обеспечения иммунопротективного действия милиацина при стрессе принадлежит способности тритерпеноида повышать устойчивость лимфоцитов (но не тимоцитов) к апопто-генному действию глюкокортикоидов (рис. 6).

Это влияние не обнаруживалось на ранней стадии апоптотического процесса при формировании ассиметрии клеточных мембран (тест с аннексином), но отчетливо регистрировалось на более позднем этапе в тесте с пропидием йодида и характеризовалось менее выраженным нарастанием гиподиплоидных клеток под влиянием декса-метазона в популяции лимфоцитов селезенки от животных, получавших милиацин, по сравнению с лимфоцитами от интактных мышей, или мышей, получавших раствори-

тель. С учетом возможности остановки апоптоза на ранних этапах его развития (11 о-ташгев. 2002) представляется вероятным, что милиадин мог либо стимулировать антиапоптотические механизмы, либо выступать и качестве одного из них.

|—i - лимфоциты селезенки от иитактных

| | - лимфоциты селезенки от животных, получавших растворитель

[:■ ¡ - лимфоциты селезенки от животных, получавших _милиацин

т 757 Ш W

Доза ГК: 300-3000 нмоль/мл

Рис. 6. Влияние милианнна на дексаметазоЕ!-иидуциро ванный япоптоз лимфоцитов селезенки, выявляемый и кете с аннекенном (А) и пропилив йод ид ом (I [.II).

* - достоверность различий между группами животных, получавших мил нации и иитактных животных (при р<0,05); • - достоверность различий между группами животных, получавших милиацин и растворитель (при р<0,05)

3. Антноксндантнян активность милиацина

В заключительном разделе работы выяснялась возможность проявления ми-лиацином антиоксидантной активности, как существенного механизма ограничения стрессорного повреждения биомембран и áno[логической гибели лимфоцитов. С этой целью исследовалась способность тритерпеноида лимитировать перекисное окисление яипйдов (ПОЛ), индуцированное стрсссорным воздействием, а также подавлять образование активных форм кислорода (АФК). Установлено, что используемая модель комбинированного стресса приводит к значительной активации свободнорадикальлого Окисления, регистрируемого по показателям хемилюминесценции продуктов ПОЛ в сыворотке крови животных после добавления к ней раствора двухвалентного железа (табл. 3).

Применение милиацина нестрессированным животным не сказывалось на исследуемых параметрах хем и люминесценции по сравнений) с интактными. Однако его введение перед стрсссорным воздействием существенно снижало интенсивность ПОЛ но сравнению с таковой, регистрируемой у только стрессированных мышей, или у мышей, получавших перед стрсссорным воздействием растворитель.

Таблица 3

Влияние милиацина на показатели ПОЛ и сыворотке кропи мышей (CBAxCS7BI6)Fif подвергнутых стрессорному воздействию

№ групп

Условия эксперимента

Исследуемые показатели

Ма\ светимость (Адл) M¿m | С вето су мм a (S^i) М±гп

I

II

III

IV

V Vi

Интактиые(14)

Стрессироваиные (17)

Введений растворителя (6)

Стрессированные после введения растворителя(6) Введение милиацина (12)

Стресс и ро ванные после введения милиацина(13)

2.8 ±0,18 5,71 ¿0,49*"

2,78 ±0,1 6,21 ±0,66*' 2,97 ± 0,07 4,17 ± 0,14*"и'

7,78 ± 0,44 20,46 i 1,13»"

8,47 ± 0,55 23,04 ±2,12*"

8,85 ± 0,41 16,67 ± 0,68*"в'

Примечание. *" - Достоверность между группами II и I; IV и Ш, VI и V (при р < 0,001); и' - достоверность между группами VI и II; VI и [V (при р<0,01).

Вместе с тем, изучение влияния милиацина на генерацию активных форм кислорода, служащих инициаторами ПОЛ, не позволило установить участие этого механизма п проявлении ингибирующего эффекта тритерпеноида на активность свободно-

радикального окисления (рис. 7).

%

60

30 ■ 20 ■

-ш

_ ..

[-¡ - ии гактиые

ш - получавшие растворитель (контроль) ■ получавшие милиацин (опыт)

СП.,

50 мкМ 100 мкМ

Рис 7. Влияние милиацина на относительное содержание лимфоцитов в области яркий шкалы измерение флюоресценции зонда DCFDA, подвергающегося окислению иод влиянием перекиси в ид о рода

По оси абсцисс - концентрация H¡0;, по оси ординат - удельное содержание к дета к в области яркой шкапы измерения

Представляется вероятным, что ннгибирование ПОЛ под действием милиацина обусловлено другими механизмами, а именно - его мсмбраностабилизирующим действием (Чернов и др.. 1983; Кириллова. 2004), определяющим устойчивость мембран к липопероксидации. Очевидно, что этот механизм способен ограничить выраженность ПОЛ на системном уровне, обеспечив тем самым протективный эффект милиацина.

19

Выводы

1. Установлено, что милиацин в разовой дозе 2 мг/кг при трехкратном интервальном (через 3 дня) внутрибрюшинном введении, предшествующим стрессорному воздействию, ослабляет иммуносупрессивный эффект комбинированного стресса на гуморальный иммунный ответ у мышей (СВАхСяВЦ^. В основе протективного действия тритерпенои-да лежит предотвращение стрессорного угнетения формирования АТОК, но не ограничение клеточного опустошения селезенки.

2. Показано, что протективный эффект милиацина в отношении стрессорного угнетения формирования гуморального иммунного ответа зависит от фазы развития иммунной реакции и реализуется в условиях воспроизведения стресса перед иммунизацией животных. При стрессорном воздействии в экспоненциальную фазу иммунного ответа защитное действие милиацина не проявляется.

3. Обосновано, что использование аналогичной схемы применения милиацина усиливает индукцию эффекторов ГЗТ у сенсибилизированных животных и оказывает защитное влияние при стрессорном угнетении формирования этих эффекторов.

4. Не обнаружено влияния милиацина на стрессиндуцированное повышение уровня кортикостерона и ИЛ-1а в крови, а также на динамику их содержания в различные сроки (0, 24, 48, 72 часа) после стрессорного воздействия.

5. Установлено, что защитное влияние милиацина в отношении гуморального и клеточного (ГЗТ) иммунного ответа при стрессе опосредовано ослаблением супрессорных механизмов. Показано, что милиацин подавляет формирование антигениндуцированных супрессоров, и этот эффект сохраняется в условиях стрессорного воздействия. Наряду с этим, милиацин препятствует стрессорному усилению антигеннеспецифической супрессии.

6. Выявлена способность милиацина повышать устойчивость лимфоцитов селезенки (но не тимоцитов) к апоптогенному действию глюкокортикоидов (дексаметазона). Блокирование милиацином апоптотического каскада происходит на относительно ранних этапах его развития: дистальнее транслокации фосфатидилсерина и проксимальнее фрагментации ДНК.

7. Показано, что милиацин ограничивает индуцируемую стрессом активацию пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) и накопление в крови продуктов липопероксидации. Ингибирующее действие милиацина на ПОЛ не связано с его способностью напрямую подавлять образование активных форм кислорода.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кириллова A.B., Панфилова Т.В. Милиацин и гуморальный иммунный ответ у мышей (СВА х C57BL6) Р^/Матср. Регион, научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов Оренбуржья. - Оренбург, 1999. - Ч. II. - С. 50 -51.

2. Кириллова A.B., Панфилова Т.В., Цинберг Е.Д., Фролов Б.А. Морфофункцио-нальные особенности иммунной системы при действии на организм тритерпеноида растительного происхождения-милиацина//Матер. 2-го Съезда иммунологов России. -Сочи, 1999. - Русский иммунологический журнал. - 1999. - Т. 4. - С. 245.

3. Кириллова A.B., Панфилова Т.В., Фролов Б.А. Протективный эффект милиацина при стрессорной иммунодепрессии//Матер. 3-го Съезда иммунологов и аллергологов СНГ. - Сочи, 2000. - Аллергология и иммунология. - 2000. - Т. 1, № 2. - С. 116.

4. Панфилова Т.В., Кириллова A.B., Фролов Б.А. Милиацин и клеточный иммунный ответ//Матер.П Рос. конгресса по патофизиологии. - Москва, 2000. - С. 152 -153.

5. Кириллова A.B., Панфилова Т.В., Фролов Б.А. Состояние иммунной реактивности при действии милиацина//Сб. докл. 14-ой Рос. конф. "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". - Челябинск, 2000. - С. 53 - 54.

6. Панфилова Т.В., Кириллова A.B., Медведева И.П., Фролов Б.А. К вопросу о механизме протективного влияния милиацина на стрессорную иммуносупрессию//Сб. трудов 4-го Рос. конгресса РААКИ "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакол." - Москва, 2001. - Т. 2. - С. 103.

7. Фролов Б.А., Кириллова A.B., Панфилова Т.В. Биохимические и клеточные механизмы влияния тритерпеноидов на воспаление//Матер. Междунар. научно-практ. школы-конф. "Цитокины. Воспаление. Иммунитет". - С-Петербург, 2002. - Цитокины и воспаление. - 2002. - Т. 1, № 2. - С. 16.

8. Кириллова A.B., Панфилова Т.В., Фролов Б.А. Иммунотропная активность милиацина//Матер. II Конф. иммунологов Урала. - Пермь, 2002. - Иммунология Урала. - 2002. - № 1(2).-С. 10-11.

9. Панфилова Т.В., Кириллова A.B. Нарушения гуморального и клеточного иммунного ответа при комбинированном стрессе у мышей и защитный эффект милиаци-на//Матер. II Конф. иммунологов Урала. - Пермь, 2002,- Иммунология Урала. - 2002. -№ 1(2).-С. 15.

Ю.Панфилова Т.В., Кириллова A.B., Фролов Б.А. Влияние растительного тритерпеноида милиацина на индукцию эффекторов ГЗТ и ее стрессорное угнетение//Сб. трудов 5-го Рос. конгресса РААКИ "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакол." - Москва, 2002. - Т. 2. - С. 375.

П.Панфилова Т.В., Кириллова A.B., Фролов Б.А. Молекулярные механизмы протективного действия милиацина при стрессорной иммуносупрессии. Роль ИЛ-1// Матер. Науч. конф. "Механизмы типовых патологических процессов". - С-Петербург, 2003. - Медицинский академический журнал (приложение). - 2003. - Т. 3. - С. 151-152.

12. Панфилова Т.В., Штиль A.A., Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю., Фролов Б.А. Влияние тритерпеноида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу, индуцированному дексаметазоном//Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2003. - Т. 136, № 10. - С. 382-385.

13. Панфилова Т.В., Штиль A.A., Фролов Б. А. Влияние милиацина на чувствительность лимфоцитов мышей (СВА х C57BL6)F, к глюкокортикоидиндуцированному апоптозу//Матер. III Конференции иммунологов Урала. - Челябинск, 2003. - Иммунология Урала. - 2003. - № 1(3). - С. 103-104.

14. Кириллова A.B., Скачков М.В., Панфилова Т.В., Борисов С.Д., Медведева И.П., Фролов Б.А. Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиаци-ном//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2003. - № 6. - С. 36-38.

15. Фролов Б.А.Д Панфилова Т.В. Иммунопротекторные эффекты милиаци-на//Матер. Объединенного иммунологического форума. - Екатеринбург, 2004. - Русский иммунологический журнал. - 2004. - № 9(1). - С.42.

16. Панфилова Т.В., Фролов Б.А. Антиоксидантная активность милиаци-на//Матер. III Рос. конгресса по патофизиологии с междунар. участием "Дизрегуляци-онная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)". - Москва, 2004.-С.157.

17. Фролов Б.А., Панфилова Т.В., Штиль A.A., Кириллова A.B., Железнова А.Д., Калинина О.В., Медведева И.П., Беляева Н.М., Цинберг Е.Д. Милиацин как иммуно-протектор. Механизмы защитного влияния при иммуносупресссии в условиях воздействия на организм дестабилизирующих факторов//Сб. научных трудов ученых Оренбургской медицинской академии "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины". - Оренбург, 2005. - Т. XXXI. - С. 169-178.

18. Панфилова Т.В., Штиль A.A., Фролов Б. А. Клеточные аспекты стресс-протективного действия милиацина: ограничение перекисного окисления липидов и возможный механизм его реализации//Матер. Межрегион, научно-практ. конф. - Уфа, 2005. — Изд-во: Здравоохранение Башкортостана. Спец. выпуск. - 2005. - № 7. - С. 176179.

19. Панфилова Т.В., Штиль A.A., Фролов Б. А. Перекисное окисление липидов и Н202-индукция реактивных метаболитов кислорода в лимфоцитах селезенки мышей (СВА х C57BL6) F) в условиях применения тритерпеноида растительного происхождения милиацина//Матер. IV конференции иммунологов Урала. - Уфа, 2005. - Иммунология Урала. - 2005. - № 1(5).- С. 23-25.

20. Панфилова Т.В., Штиль A.A., Фролов Б. А. Тритерпеноид милиацин снижает индуцированное стрессом ПОЛ//Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2006.- Т. 141, № 6.-С. 633-635.

Патент РФ

Кириллова A.B., Скачков М.В., Панфилова Т.В., Борисов С.Д., Медведева И.П., Фролов Б.А. "Средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина". Патент на изобретение РФ № 2244548. Зарегистр. в Госреестре 20.01.2005.

ПАНФИЛОВА Татьяна Владимировна

ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МИЛИАЦИНА ПРИ СТРЕССИНДУЦИРОВАННОЙ ИММУНОСУПРЕССИИ

Автореферат

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99.

Подписано в печать 05.04.2007 г. Тираж 100 экз. Уч. изд. Л. 1,0 Формат 60x84/16. Набор компьютерный. Заказ № 246.

Отпечатано в ООО Печатный дом «Пресса» 460000, г. Оренбург, ул. Комсомольская, 45.