Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунотропная активность милиацина

На правах рукописи

КИРИЛЛОВА Алла Васильевна

ИММУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ МИЛИ АЦИ НА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2004

Работа выполнена на кафедре патологической физиологам ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия МЗРФ», Оренбург

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Фролов Б.А. Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Корнеев Г.И. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кеворков Н.Н. доктор медицинских наук Юшкова ТА..

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ», Челябинск

Защита диссертации состоится «Л&» 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, гЛермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (3422) 646711.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрОРАН.4

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, член- корр. РАН /

Ившина И.Б.

ОБЩ АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди наиболее значимых задач, стоящих перед иммунологией, Петров и др. (1981) на одно из первых мест поставили изыскание и изучение лекарств для лечения расстройств иммунитета Прошедшие с этого времени почти четверть века не снизили актуальность данной проблемы. Более того, она значительно возросла, одной из причин чему является резкое ухудшение экологической обстановки, обусловливающее рост заболеваний, связанных с нарушениями в системе иммунитета (Хаитов и др., 1995; Че-решнев и др., 2000). Несмотря на очевидные успехи, достигнутые в области создания имму-нотропных лекарственных средств - препаратов, корригирующих процессы иммунитета (Хаитов, Пинегин, 1996, 2000; Петров и др., 2000; Михайлова, 2001; Пинегин и др., 2001, 2002), дальнейшие поиски в этом направлении продолжаются.

Они включают в себя получение химически чистых или охарактеризованных аналогов биологически активных природных веществ, рекомбинантных цитокинов или их индукторов, разработку синтетических иммуномодуляторов, не имеющих природных аналогов (полиэлектролиты), поиск новых химических соединений, обладающих тропностью к иммунной системе (Хаитов, Пинегин, 1996). Среди последних определенное внимание привлекают три-терпеноиды — вещества специализированного обмена, обладающие широким спектром биологического действия. К настоящему времени обнаружен эффект стимуляции гуморального и клеточного иммунитета у сапонинов мыльного дерева (Behboudi et al., 1996; Dotsika et al., 1997; Moiein et al., 1998), у других тритерпеноидных сапонинов (Santos et al., 1997; Logambal," Michael, 2000), а также у самих тритерпенов (глицирризиновая и уросоловая кислоты) и их дериватов (Ильичева и др., 2001). Однако, эти обнадеживающие результаты не коснулись милиацина — тритерпеноида растительного происхождения, входящего в состав просяного масла, используемого для лечения трофических язв, инфицированных ран и некоторых других заболеваний (Нузов, 1991; Нузов и др., 2001; Ващенко и др., 2001). Данное обстоятельство ограничивает, а в ряде случаев затрудняет комплексную оценку его саноген-ного эффекта при воспалительных и репаративных процессах. Во-вторых, отсутствие ясности в этом вопросе сдерживает практическое использование других потенциальных возможностей милиацина, а именно, его ростостимулирующего, антигликемического свойств, а также влияния на гонадотропную активность гипофиза (Олифсон и др., 1991). В третьих, оно не позволяет оценить перспективы использования милиацина в качестве адъюванта, что с учетом его крайне низкой токсичности (LD50< 1000 мг/кг) могло бы иметь важное прикладное значение. В четвертых, остается открытым вопрос о возможности использования мембрано-протекторных свойств данного тритерпеноида (Павлова, 1984) для защиты иммунной системы при дестабилизирующих воздействиях, способных

I »

Цель настоящего исследования изучение влияния милиацина на систему иммунитета в экспериментах, а также выяснение некоторых механизмов такого влияния.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние милиацина на количественные и качественные характеристики клеточных популяций циркулирующей крови, центральных (костный мозг, тимус) и периферических (селезенка) органов системы иммунитета у экспериментальных животных.

2. Определить особенности формирования гуморального и клеточного иммунного ответа при различных схемах парентерального применения данного тритерпеноида.

3. Выяснить способность милиацина оказывать адъювантный эффект при иммунизации животных столбнячным анатоксином.

4. Исследовать некоторые механизмы влияния милиацина на систему иммунитета, включая антигениндуцированную супрессию и индукцию ИЛ-1.

5. Оценить протективное действие милиацина при детергент-индуцированной иммуно-супрессии.

Научная новизна. Впервые использован комплексный подход в изучении влияния милиацина на систему иммунитета, позволивший охарактеризовать структурные и функциональные ее особенности на клеточном, органном и организменном уровне у экспериментальных животных в условиях применения тритерпеноида В экспериментах на крысах популяции Вистар обнаружена способность милиацина к стимуляции лимфопоэза, выразившаяся в увеличении относительного числа лимфоцитов в красном костном мозге, относительным и абсолютным лимфоцитозом в крови, в увеличении плотности клеточного инфильтрата в корковом и мозговом веществе тимуса, гиперцеллюлярности селезенки, сопровождающейся ростом количества клеток в В - и Т - зависимых зонах органа. Увеличение клеточного инфильтрата в В - зависимой зоне селезенки, а также в зоне красной пульпы под влиянием ми-лиацина установлено и у мышей СВА (при его десятикратном и трехкратном интервальном введении). Установлено, что милиацин оказывает стимулирующее влияние на функциональную активность иммунной системы, которое зависит от кратности и периодичности его применения. Наиболее эффективная схема трехкратного интервального (через 3 дня) использования тритерпеноида обусловливает усиление гуморального (по относительному и абсолютному количеству АТОК в селезенке) и клеточного (формирование эффекторов ГЗТ) иммунного ответа Установлены некоторые механизмы, способные определить стимулирующее влияние милиацина на функцию иммунной системы. В их числе - увеличение суммарного пула лимфоцитов, снижение формирования в ходе иммунного ответа антигениндуцирован-ной супрессии, а также пролонгирование повышенного уровня индуцированной секреции

ИЛ-1&.

Впервые обнаружена способность милиацина оказывать форсифицирующее влияние на вакцинальный процесс в виде более значимого прироста уровня антител на первичную и повторную иммунизацию столбнячным анатоксином. Впервые установлен иммунопротектор-ный эффект милиацина, проявляющийся в восстановлении уровня гуморального иммунного ответа в условиях действия на организм мембраноповреждающего фактора

Теоретическое и практическое значение работы определяется тем, что в ней представлены данные об иммунотропной активности милиацина, в стойких морфо-функциональных изменениях в иммунной системе. Тем самым раскрываются новые аспекты действия милиацина на организм, что дополняет существующие представления о его биологических эффектах и служит основой для понимания механизмов ранозаживляющего действия милиацино-содержащего средства милиацила. Выявленные механизмы стимуляции иммунного ответа под влиянием милиацина раскрывают новые возможности изыскания имму-нотропных лекарственных средств среди соединений стероидной природы естественного происхождения или синтеза их аналогов с избирательным действием на различные звенья иммунной системы. Установленная возможность усиления милиацином гуморального и клеточного иммунного ответа, включая его адъювантное действие, является экспериментальным обоснованием для использования данного тритерпеноида в качестве иммуностимулятора Защитный эффект милиацина в отношении иммунного ответа при индуцированной иммуносупрессии расширяет возможность его практического применения для протекции иммунной системы при действии на организм дестабилизирующих факторов.""

Теоретические положения и практические результаты работы, включены в учебный курс для студентов Оренбургской медицинской академии. По материалам работы оформлена Заявка на изобретение РФ «Средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина». Приоритетная справка № 023707 от 29.07.2003 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Тритерпеноид растительного происхождения - милиацин обладает способностью стимулировать эритропоэз и лимфопоэз. Активация лимфопоэза у крыс (Вистар) затрагивает Т - и В - зависимые звенья системы иммунитета и проявляется увеличением относительного содержания лимфоцитов в костном мозге животных, ростом относительного и абсолютного содержания этих клеток в крови, увеличением плотности клеточного инфильтрата коркового и мозгового слоя тимуса, гиперцеллюлярностью селезенки и увеличением количества клеток в Т - и В - зависимых зонах органа У мышей (СВА) различные схемы применения милиаци-на не приводят к увеличению числа тимоцитов, а прирост селезеночного пула спленоцитов происходит за счет увеличения клеточного инфильтрата в В - зависимой зоне органа, и в зоне красной пульпы.

2. Милиацин оказывает стимулирующее действие на гуморальный и клеточный иммунный ответ, в основе которого лежит возрастание пула лимфоцитов в лимфоидных органах, угнетение антигешшдуцированной супрессии и пролонгирование регуляторного влияния ИЛ-1а.

3. Иммунотропная активность милиащша проявляется адьювантным эффектом и сочетается с его мембранопротекторным действием, обеспечивающим возможность восстановления уровня иммунного ответа в условиях действия на организм мембраноповреждающего фактора.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, Оренбург, 1999; 2000; П съезде патофизиологов России, Москва, 2000; II конференции иммунологов Урала, Пермь, 2002; Международной научно-практической конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет», Санкт-Петербург, 2002; V конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2002; Всероссийской научной конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экстремальных и патологических условиях», Оренбург, 2003.

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ. Получена приоритетная справка по заявке на изобретение РФ «Средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина».

Объем и структура, диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, главу «Материалы и методы исследования», три главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 130 отечественных и 88 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 25 таблицами и 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 315 крысах «Вистар» массой 220 г, а также 181 мышах СВА и 833 мышах (СВАхС^ВУб)?) массой 18-22 г. Все животные получены из питомника АМН РФ «Столбовая».

В работе использовали милиацин, любезно предоставленный проф. Л.Е. Олифсоном, полученный из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаивании на холоду. Очистку препарата проводили путем его перекристаллизации из хлороформа. На основании изучения масс -, ЯМР - и ИК - спектров, хроматографической однородности и качественно-

го состава (Олифсон и др., 1991), выделенный препарат отнесен к группе пентациклических

Рис. 1. Химическая структура пентациклического тритерпеноида — мнлиацнпа.

Изучение иммунотропной активности милиацина проводили, используя его внутри-брюшинное введение в разовой дозе 2 мг/кг массы животного. Применялись различные схемы, отличающиеся кратностью и периодичностью введения тритерпеноида: десятикратное ежедневное введение у крыс «Вистар»; десятикратное, трехкратное ежедневное и трехкратное интервальное (через три дня) введение у мышей СВА и (СВАхС57В1/б)Рь Полученные результаты сопоставлялись с данными, определяемыми у интактных животных, а также у животных, подвергавшихся внутрибрюшинному введению растворителя (физ. раствор с добавлением твина - 21 в конечной концентрации 1,6 х 10-7 моль/кг) по соответствующей схеме. Забой крыс осуществляли после их предварительной наркотизации эфиром путем пересечения магистральных сосудов. Забой мышей—дислокацией шейных позвонков.

Для оценки влияния милиацина на клеточные популяции периферической крови под-считывалось количество эритроцитов и лейкоцитов, исследовался ее клеточный состав в мазках, окрашенных по Романовскому-Гинзе и бриллианткрезилбляу (для ретикулоцитов). Анализ костно-мозговых кариоцитов проводился в мазках, окрашенных по Папенгейму. В каждом мазке подсчитывалось не менее 500 клеток, после чего оценивалось относительное содержание кариоцитов различных ростков кроветворения.

Морфологические исследования тимуса и селезенки выполняли в гистологических срезах окрашенных гематоксилином Майера и эозином. Качественный и морфометрический анализ препаратов осуществляли с помощью светового микроскопа МБИ-15 и винтового окуляра - микрометра а также окулярной вставки Автандилова. Оценивались

площади коркового и мозгового вещества тимуса, Т- и В - зависимых зон селезенки, идентифицируемых по общепринятым рекомендациям (Новиков, Труфакин, 1980), плотность клеточного инфильтрата.

Исследование способности лимфоцитов тимуса и селезенки трансформироваться в бласгы под влиянием митогенов выполняли на клеточных культурах, инкубируемых в присутствии фитогемагглютинина (ФГА-Р «Diphco») - 50 мкг/мл, липополисахарида (ЛПС -«Diphco») - 50 мкг/мл, конканавалина А (КонА — «Calbiochem») - 5 мкг/мл. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации проб во влажной атмосфере с 5-8% углекислого газа при 37°С, в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, в каждом из которых сосчитывали от 500 до 1500 клеток и рассчитывали относительное содержание бластных форм. Гуморальный иммунный ответ исследовали путем определения прямых антителообразующих клеток (АТОК) в селезенке мышей (Jerne, Nordin, 1963), иммунизированных эритроцитами барана (ЭБ). Особенности формирования клеточного иммунитета изучались на модели локальной адоптивной ГЗТ (Ramshaw, Eidinger, 1979; Bretscher, 1979) и в реакции «трансплантат против хозяина» в генерализованном варианте.

Оценку адъювантного действия тритерпеноида осуществляли путем определения с помощью реакции непрямой гемагглютинации уровня антител в сыворотке крови мышей (СВА х С5тВУб)Ри иммунизированных подкожно столбнячным анатоксином (10 ЕС) после предварительного введения милиацина или растворителя.

Изучение антигеннеспецифической супрессии проводили по способности спленоци-тов неиммунных мышей (Краскина и др., 1983), получавших милиацин (или растворитель), ингибировать АТОК в популяции иммунных спленоцитов от примированных ЭБ доноров. Для определения антигениндуцированной супрессии иммунного ответа мышей — доноров иммунных клеток селезенки (ИКС) иммунизировали внутривенно 5x108 ЭБ, и на 8 день осуществляли перенос донорских спленоцитов (3x108 клеток) сингенным реципиентам (Писарев, Певницкий, 1977). Через 30-60 мин реципиентов иммунизировали 5x108 ЭБ и через 4 суток определяли АТОК в их селезенках методом Ерне.

Влияние милиацина на продукцию ИЛ-1 (а) изучали у животных после индукции секреции цитокина стрессорным воздействием. Содержание ИЛ-1 в сыворотке крови оценивали иммуноферментным методом с использованием прибора Мультискан (MS) и набора моно-ноклональных антител к человеческому ИЛ-1 (а)фирмы "Цитокин" (С -Петербург).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли по общепринятым методикам (Урбах, 1975), рассчитывая среднее арифметическое, доверительный интервал, стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t — критериев Стьюдента при нормальном распределении Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние милиацина на морфо-функциональные особенности клеточных популяций периферической крови и органов системы иммунитета

Установлено, что 10-кратное ежедневное интраперитонеальное введение милиацина индуцирует значительный прирост содержания лимфоцитов и эритроцитов в периферической крови у крыс Вистар, регистрируемый уже на 1 сутки после завершения введения тритерпеноида и удерживаемый на протяжении последующих 4 суток (табл.1.). На этом фоне происходит снижение содержания клеток нейтрофильного ряда, наиболее значимое для сег-ментоядерных нейтрофилов в ранние сроки (I сутки) наблюдения. Аналогичная направленность изменений для лимфоцитов и нейтрофилов выявлялась в течение первых трех суток и у животных, получавших растворитель. Однако, сдвиги клеточных популяций в опытной группе были выражены более значительно. Так, если у крыс, подвергнутых воздействию растворителя, прирост абсолютного содержания лимфоцитов составил 12,5+1,3% при убыли сегментоядерных нейтрофилов на 15,7+4,2%, то у крыс опытной группы, соответственно, на 31,6+2,4% и 33,8+4,3%. Более демонстративно различия между сравниваемыми группами животных выявлялись на 7 сутки, когда у крыс, подвергнутых аппликации растворителя, абсолютное содержание лимфоцитов опускалось ниже уровня, определяемого у интактных животных, тогда как у крыс, получавших милиацин, оно продолжало сохраняться значимо повышенным (на 20,2+2,5%).

Установленные под влиянием милиацина изменения в периферической крови крыс Вистар находились в полном соответствии с перестройкой у этих животных костномозгового кроветворения, выразившейся в стимуляции эритроидного ростка и двукратном приросте в нем относительного содержания лимфоцитов (табл.2.). Не обнаружено репрессивного влияния милиацина на гранулоцитопоэз, включая делящихся предшественников и этапы образования зрелых форм нейтрофилов.

Поскольку однонаправленный сдвиг лимфоцитов в крови и костном мозге под влиянием милиацина мог иметь в своей основе два альтернативных механизма: стимуляцию лимфопоэза с выходом лимфоцитов в кровоток, либо перераспределение лимфоцитов в кровь и костный мозг за счет их мобилизации из лимфоидных органов, были исследованы клеточные популяции тимуса и селезенки. Установлено, что милиацин обусловливает гипер-целлюлярность коркового и мозгового вещества тимуса, а также гиперцеллюлярность селезенки со значительным приростом числа лимфоцитов в ее Т- и В - зависимых зонах. Отсутствие возрастания в этих зонах числа митозов свидетельствует в пользу того, что увеличение в них численности лимфоцитов не определялось их пролиферацией in situ.

Изменения клеточных популяций в органах иммунной системы сопровождались ре-

Влияние милиацина на клеточный состав периферической крови крыс Вистар

Исследуемые показатели Группы животных

Интактцые После введения растворителя Интактные После введения милиацина

1 сутки 7 сутки 1 сутки 7 сутки

Эритроциты (х1012л) Гемоглобин гр% Ретикулоциты %о Лейкоциты (хЮ9 л) Эозинофилы % абс П/я нейтрофилы % абс С/я нейтрофилы % абс Лимфоциты % абс Моноциты % абс 4,3б±0,18 (6) 12,50± 0,23 (6) Не исследовалось 12,28+0,64 (б) 1,70± 0,40 (7) 0,22± 0,06 (6) 5,00± 0,42 (7) 0,61± 0,08 (6) 31,00±0,98 (7) 3,81±0Д7 (6) 61,14±0,97 (7) 7,5 0± 0,30 (6) 1,43± 0,14 (7) 0,19± 0,03 (6) 3,12±0,05* (8) 12,14± 0,36 (8) Не исследовалось 12,82± 0,58 (8) 1,87±0,49 (8) 0,24± 0,06 (8) 4,75± 0,37 (8) 0,61±0,05 (8) 25,00± 1,24* (8) ЗД1±0,16 (8) 65,87± 0,74* (8) 8,44± 0,12* (8) 2,12± 0,25 (8) 0,27± 0,03 (8) 3,35± 0,12 (8) 11,57± 0,35* (8) Не исследовалось 10,45± 0,42* (8) 3,75± 0,49* (8) 0,39± 0,05 * (8) 3,62± 0,62 (8) 0,38± 0,06* (8) 24,00± 0,86* (8) 2,51± 0,09* (8) 63Д5± 1,73 (8) 6,б1± 0,18* (8) ЗД5± 0,87* (8) 0,33± 0,09* (8) 3,98± 0,12 • (18) 12,50± 0,36 (20) 16,10± 1,75 (28) 12,37± 0,91 (18) 3,73± 0,29 (15) 0,46± 0,03 (15) 5,33± 0,52 (15) 0,66±0,06 (15) 24,40± 0,92 (16) 2,96±0,10 (16) 64,00± 1,41 (16) 7,91± 0,17 (16) 2,60± 0,66 (Н) 0,32± 0,08 (11) 4,52± 0,23 (18) 12,88± 0,56 (19) 23,18± 2,99* (10) 13,26± 0,81 (19) 2,00±0,41* (13) 0Д6± 0,05* (15) 3,55± 0,48* (П) 0,47± 0,08* (П) 14,80±0,99* (13) 1,96±0,1* (13) 78,70± 1,40* (13) 10,4± 0,18* (13) 2,00± 0,38 (8) 0,26± 0,05 (8) 4,91± 0,17* (16) 13,98± 0,59 * (17) 28,70± 4,59* (20) 12,26± 0,83 (16) 2,85± 0,39 (14) 0,35± 0,05 (14) 3,00±0,23* (15) 0,37± 0,03* (15) 16,80± 1,29* (18) 2,06± 0,16* (18) 77,30± 1,62* (18) 9,48± 0,2* (18) 1,70±0,15 (14) 0,21± 0,02 (14)

Примечание. Здесь и далее в скобках указано количество животных, * (р < 0,05) по сравнению с интактными животными.

Влияние милиацина на клеточный состав красного костного мозга крыс Вистар ( относительные показатели)

Тип клеток

Недифференцированные

Эритробласты

Нормобласты

Мегакариоциты

Плазматические

Митозы

Миелобласты

Промиелоциты

Миелоциты

Метамиелоцигы

П/я нейтрофилы

С/я нейтрофилы

Эозинофилы

Моноциты

Лимфоциты

Интактные

Группы животных

0,14+0,10

(7) 1,00+0,26

(7) 30,0012,20

(7) 1,57±0,14

(7) 0,2910,28

(7) 0,90±0,14 (7)

2,10+0,27

(7) 2,60+0,70

(7) 5,30+1,30

(7) 2,40±0,70

(7) 7,3010,90

(7) 23,3011,40

(7) 7,10±0,70

(7) 1,40+0,44

(7) 12,20+3,20 (7)

После введения милиацина

1 сутки

0,33±0,06 (18) 1,70±0,20* (18) 25,1011,20 (18) 1,00±0,06* (18) 0,78±0,06 (18) 1,2010,25 (18)

2.1040.19 (18)

2.70Ю30 (18) 3,801030 (18)

3.2010.20 (18)

7,80±0,40 (18) 21,40±0,90 (18) 3,9410,50* (18) 0,5610,07 (18) 23,ЗОЮ,80* (18)

7 сутки

0,1110,06

(19) 1,80+0,25*

(19) 23,1010,90*

(19) 0.74ЮД0*

(19) 0,4710,06

(19) 2.05Ю31*

(19) 2,4010,61

(19) 2,70+0,40

(19) 4,9010,30

(19) 3,10+0,20

(19) 9,9010.30*

(19) 19,3010,70*

(19) 4,5310,50*

(19) 1,20+0,20 (19) 25,4010,60 * (19)

Примечание * - достоверность различий с контролем.

дукцией митогениндуцированной пролиферации лимфоцитов. Она в большей степени затрагивала популяцию В - клеток и в тесте с ЛПС носила выраженный (двукратное снижение) и продолжительный (в течение двух недель) характер. В отношении тимоцитов и Т- лимфоцитов снижение РБТЛ в тесте с ФГА регистрировалось лишь в течение первых суток, а в тесте с Кон А — первых (тимоциты), а также первых и седьмых суток (лимфоциты селезенки).

Таким образом, полученные данные не позволяют сделать заключение о том, что наблюдающееся после введения милиацина увеличение содержания лимфоцитов в красном костном мозге и периферической крови крыс Вистар обусловлено их эмиграцией из лимфо-идных органов. С гораздо большей вероятностью они свидетельствуют о возможности развития лимфоцитоза, а также гиперцеллюлярности тимуса и селезенки за счет активации

Площади исследуемых зон органа (мкм2)

Периартериолярная зона

Мантийная зона

м

м

м

450 400 350 300 250 200 150 100

Плотность клеточного инфильтрата (число клеток в 1 поле зрения)

Периартериолярная зона

350 300 250 200 150 100 50 0

Мантийная зона

М

Зона красной пульпы (число кпеггок в 1 поле зрения)

350 300 250 200 150 100 50 0

А

ИРМ

ИРМ

Рис. 2. Характеристика клеточных популяций Т- н К- зависимых зон селезенки мышей СВА

под влиянием милващша

А - трехкратное интервальное введение; Б — десятикратное введение; И - тпактяые; Р - растворитель; М - милиацин; * - р < 0,05 по сравнению с интветными, ** - р < 0,05 по сравнению с растворителем.

лимфопоэза с соответствующим заселением лимфоидных органов.

Иммунотропный эффект милиацина реализуется и у мышей СВА в виде увеличения пула спленоцитов при десятикратном и трехкратном интервальном введении (рис.2.). Однако, в отличие от крыс Вистар, этот эффект распространяется на В-, но не Т- зависимую зону органа, в виде прироста в ней (а также в зоне красной пульпы) содержания лимфоцитов.

Отсутствие у мышей, в отличие от крыс Вистар, под влиянием тритерпеноида возрастания целлюлярности тимуса могло быть следствием либо недостаточности его действия (при трехкратном введении), либо избыточности самой процедуры десятикратного введения для данного вида животных. Об этом, в частности, свидетельствует падение количества ти-моцитов у мышей контрольной группы, подвергавшихся десятикратному введению растворителя. Уменьшение на этом фоне выраженности гипоплазии тимуса у животных опытной группы, получавших милиацин, может свидетельствовать о его способности оказывать протекцию при действии факторов, вызывающих клеточное опустошение органа.

В целом, полученные данные дают основание для заключения о том, что милиацин способствует возрастанию структурного обеспечения иммунной системы, что может иметь свои последствия для особенностей ее функционирования.

2. Милиацин и иммунный ответ организма

Установлено, что влияние милиацина на гуморальный иммунный ответ у мышей (СВА х С57В1/е)К к ЭБ зависит от кратности и периодичности его применения. Десятикратное ежедневное введение тритерпеноида приводит к снижению формирования АТОК в виде уменьшения их относительного количества, которое носит неспецифический характер, поскольку регистрируется при иммунизации животных и на фоне введения растворителя. Однако, в отличие от последнего, милиацин вызывает прирост суммарного пула спленоцитов, что обеспечивает поддержание абсолютного уровня АТОК в пределах значений, определяемых у только примированных животных (рис. З.Б). Трехкратное ежедневное применение ми-лиацина на протяжении трех дней с последующей (через 8 суток) иммунизацией мышей не отразилось на параметрах исследуемых показателей. При трехкратной интервальной (через 3 дня) аппликации милиацин приводит к существенному возрастанию абсолютного содержания АТОК, как за счет увеличения суммарного пула спленоцитов, так и за счет усиления формирования самих антителообразующих клеток (рис. З.А.). Последний эффект наиболее отчетлив при использовании сниженной антигенной нагрузки, т.е. в условиях, когда неспецифическое иммуностимулирующее влияние милиацина не «перекрывалось» специфическим антигенным стимулом (рис. З.С.).

Количество сплсноютов (хЮ6)

Л

АТОК/Ю

360 320 280 ■ 240 200 160 ■ 120 -80 -40 ■ О

м

И Р

м

АТОК/селезенку 63000 56000 49000 42000 35000 28000 21 ООО 14000 7000 0

м

44

■ ■

и р

м

360 320 280 240 200 160 120 80 40 - 0

* Т

; 1

Р м

63000 56000 49000 42000 35000 28000 21000 14000 7000 0

ИРМ

■ь

м

360 320 280-240 200 160 120 80 40 - О

ИРМ

63000 56000 49000 42000 35000 28000 21000 14000 7000 О

И . Р м

Рис. 3. Влияние милиацииа на гуморальный иммунный ответ у мышей (05А1СпВ1/б)Р1.

А - трехкратное интервальное введение (доза иммунизации 5x10* ЭБ); Б — десятикратное введение (доза иммунизации 5x10* ЭБ); С - трехкриное интервальное введение (доза иммунизации 5x10' ЭБ); И - иммунизации без введении растворителя и ыилиацина; Р - иммунизация после аппликации растворителя; М - иммунизация после аппликации милиацнна; • - р < 0,05 по сравнению с И, ** - р < 0,05 по сравнению с Р.

;"""! - интенсивность воспаления при использовании неиммунных спленоцитов;| | -11-11 при использовании иммунных сплсноцитов; И - доноры спленоцитов без введения растворителя и милиацина; Р -11-11, получавшие растворитель; М - //-// получавшие милиацин; * - достоверность различий внутри групп; ** - достоверность различий специфического воспаления между группами М и И; *** - //-// между группами М и Р.

Наряду с активацией гуморального иммунного ответа милиацин при трехкратном интервальном применении усиливал и индукцию эффекторов ГЗТ(рис. 4.). Это проявлялось возрастанием способности спленоцитов мышей, сенсибилизированных ЭБ на фоне предварительного введения милиацина, к формированию в адоптивном переносе совместно с антигеном более выраженного специфического воспаления в лапке реципиентов, по сравнению со спленоцитами от животных, сенсибилизированных на фоне введения растворителя, или без какого-либо предварительного воздействия.

Вместе с тем не обнаружено влияние различных схем применения милиацина на способность спленоцитов мышей СВА к индукции генерализованной РТПХ в полусингенном переносе у мышей (СВАхС57ВУб)р1 при разных дозах (108 и 5х107) трансплантируемых спле-ноцитов.

Анализ механизмов действия милиацина на иммунный ответ не позволил обнаружить его эффект на способность неиммунных спленоцитов проявлять неспецифическое стимулирующее или супрессирующее влияние на популяцию зрелых АТОК. Вместе с тем установлено, что милиацин приводит к ослаблению антигениндуцированной супрессии (рис. 5.) — одного из существенных механизмов, лимитирующих активность и длительность проявления иммунного ответа.

Это ослабление выражалось в частичном восстановлении уровня АТОК у примиро-ванных ЭБ реципиентов с трансплантированными спленоцитами от иммунных доноров ИКС,

АТОК/селезенку Эффективность супрессии (%)

(М±т)

И

М

3(Щ2± 3614

14847 ±1475 I-

51,09 ±4,85

32460*4298

13148¿90! |_L-н*--59.49± 2'77

28240 ±1529

20169 ±1939 | I и » 28>48 ± 6>88

Ч »

±*

, ♦♦♦

0 5000 10000 15000 « 20000 25000 30000 35000 40000

Рис. 5. Влияние милиацина на формирование антигениндуцированной супрессии у мышей (CBAxC57BI/t)Fi.

I | - интенсивность иммунного отпета у прнмированных ЭБ реципиентов после трансплантации неиммунных спленоцитов; I I - //-// после трансплантации иммунных сплсноцитов; И - доноры спленоцитов без введения растворителя и милиацина; Р -11-11, получавшие растворитель; М -11-11 получавшие милиацин; * - достоверность различий внутри групп; ** -11-11 между группами М и И; *** -11-11 между группами М и Р.

получавших милиацин (рис. 5.М.), по сравнению с реципиентами с трансплантированными ИКС от иммунных доноров, получавших растворитель (рис. 5.Р.), или от иммунных доноров без какого-либо предварительного воздействия (рис. 5.И.).

Наряду с этим установлено, что еще одним из механизмов, опосредующих стимулирующий эффект милиацина на иммунный ответ, может выступать ИЛ - 1 (а) — главная форма секретируемого интерлейкина - 1 у мышей (Симбирцев, 1998). Изучение влияния милиацина на секрецию этого цитокина не выявило изменений его базального уровня при аппликации тритерпеноида, что свидетельствует в пользу отсутствия его провоспалительного действия (табл. 3.). Индукция ИЛ-1а с помощью комбинированного холодового и иммобилизационно-го стресса (Рыбакина, 2000), обеспечивала закономерное и в равной мере выраженное повышение цитокина в сыворотке крови животных, получавших и не получавших милиацин. Однако, в интервале 48-72 часа после стрессорного воздействия, несмотря на снижение концентрации его уровень у животных опытной группы превышал значения контрольной вплоть до достоверных различий между ними.

С учетом способности ИЛ-1 оказывать лимфоцитактивируюшее действие (Симбирцев, 1998; 1999; Кетлинский, 2002), представляется допустимым его более выраженное участие в стимуляции преактивированных антигеном Т- и В-лимфоцитов у животных, получавших милиацин. Тем более, что продолжительность этой цитокиновой активации составляла 72 часа - период времени, соответствующий индуктивной фазе развития иммунного ответа.

Влияние милиацина на базальную секрецию и стрессорную индукцию ИЛ-1а у мышей (СВЛхС57В1/6)Г1

Сроки исследования ИЛ-1 Концентрация ИЛ-1 (пг/мл) в группах животных

Без милиацина После введения милиацина

Базальный уровень Сразу после стресса Через 24 часа после стресса Через 48 часов после стресса Через 72 часа после стресса 0,076 ±0,0019 (6) 0,096 ± 0,0064* (6) 0,086 ± 0,0070 (6) 0,070 ± 0,0053 (4) 0,076 ±0,0015 (5) 0,08 ±0,0036 (6) 0,102 ± 0,0094* (6) 0,083 ± 0,0042 (6) 0,09 ± 0,007** (6) 0,087 ± 0,0028** (5)

Примечание * - достоверность различий с базальным уровнем; ** - достоверность различий между группами животных, получавших и не получавших милиацин.

Результаты, отражающие стимулирующее влияние милиацина на систему иммуногенеза и возможные механизмы такого влияния, послужили отправным моментом в определении способности тритерпеновда оказывать форсифицирующее действие на вакцинальный процесс. Установлено, что трехкратная интервальная аппликация милиацина, предшествующая введению антигена, усиливает формирование иммунного ответа у мышей, иммунизированных столбнячным анатоксином, как при первой, так и при второй иммунизации (рис. 6.). При этом, при вторичным ответе его применение обеспечивало не только возрастание суммарного титра антител по сравнению с контрольной группой животных, но и способствовало росту числа животных с наибольшими значениями титров антител. Так, если в контрольной группе мышей лишь у 7 из 20 особей (35%) эти значения превышали ^ 4,0, то в опытной группе количество таких особей составило 15 из 20 (75%). Полученные данные, подтверждая иммунотропные свойства милиацина, представляются перспективными для дальнейшего изучения возможностей его использования в качестве адъюванта с целью оптимизации вакцинального процесса — актуальной задачи современной иммунологии (Кабанов и др., 1984; Петров и др., 1999; 2000; Хаитов, Пинегин, 2000; Кирилина и др., 2001; Медуницин и др., 2001; ВеИЪоисЦ ^ al., 1995; Бо1ака et al, 1997). Это положение имеет отношение и к формированию противостолбнячного иммунитета, о чем свидетельствует значительное возрастание незащищенности населения, привитого АКДС, против столбняка в районах повышенной антропогенной нагрузки (Каральник, Маркова, 1991).

3. Протективное действие мнлиацина при детергент-индуцированной иммуносупрессии

В заключительном разделе работы выяснялась возможность проявления у милиацина протекторного эффекта в отношении формирования иммунного ответа, нарушенного при действии на организм мембраноповреждающего фактора. В качестве последнего использован детергент: твин 21 (1,6 х 10-6моль/кг), вводимый внутрибрюшинно экспериментальным ' животным без милиацина и совместно с милиацином (2 мг/кг массы тела). Установлено, что введение детергента перед иммунизацией приводит к снижению формирования АТОК и, как следствие этого - суммарной величины иммунного ответа (рис. 7.).

Существенно, что выраженность иммуносупрессии при трехкратном и десятикратном применении твина 21 была примерно одинакова, что могло свидетельствовать о достижении максимального суммарного эффекта при трехкратной его аппликации. Милиацин, вводимый совместно с детергентом, обеспечивал сохранение уровня гуморального иммунного ответа, нарушенного при трехкратной схеме введения твина 21 в организм. В то же время милиацин не отменял и не ослаблял иммуносупрессии, индуцируемой в условиях десятикратного при .менения твина 21. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности ми-лиацина оказывать мембранопротекторный эффект в отношении иммунокомпетентных клеток, однако подобный эффект лимитирован длительностью действия и (или) суммарной ве-

личиной нагрузки мембраноповреждающего фактора. Мембранопротекторный эффект представляется существенным при оценке мшшацина как иммунокорректора, защитное действие которого определяется не только иммунными, но и биохимическими механизмами. Это обстоятельство расширяет диапазон его возможного практического использования, в частности, для протекции иммунной системы при действии на организм дестабилизирующих факторов.

20

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что милиацин в разовой дозе 2 мг/кг стимулирует лимфопоэз у крыс Вистар при десятикратном внутрибрюшинном введении и у мышей СВА при десятикратном и трехкратном интервальном (через 3 дня) введении. У крыс Вистар это проявляется возрастанием относительного числа лимфоцитов в красном костном мозге, относительным и абсолютным лимфоцитозом, гиперцеллюлярностью тимуса и селезенки с увеличением в последней площади Т - и В - зависимых зон и плотности в них клеточных инфильтратов. У мышей СВА милиацин вызывает значимое возрастание плотности клеточного инфильтрата в мантийной (В- зависимой) зоне органа и в зоне красной пульпы.

2. Показано, что рост лимфоидных популяций у крыс Вистар сопровождается снижением показателей РБТЛ тимоцитов и спленоцитов с ФГА и Кон А, а также спленоцитов с ЛПС. Редукция ответа с ЛПС носит более выраженный и продолжительный характер.

3. Установлено, что влияние милиацина на гуморальный иммунный. ответ мышей (СВАхС57В1/6)И определяется кратностью и периодичностью использования данного три-терпеноида. Его трехкратное интервальное введение, предшествующее примированию животных ЭБ, обеспечивает значимое усиление выраженности ответа, как за счет возрастания клеточной популяции селезенки, так и усиления формирования АТОК. Последнее в наибольшей степени выражено при иммунизации более низкой дозой антигена.

4. Показано, что использование аналогичной схемы применения милиацина перед сенсибилизацией животных усиливает формирование у них эффекторов гиперчувствительности > замедленного типа, но не влияет на способность лимфоцитов к развитию реакции трансплантационного иммунитета.

5. Установлено, что милиацин проявляет адъювантные свойства, повышая уровень антител у мышей (СВАхС57В1/6)И при первичной и повторной иммунизации столбнячным анатоксином.

6. Экспериментально обосновано, что влияние милиацина на функциональную активность иммунной системы реализуется за счет ослабления формирования антигениндуциро-ванной супрессии и более выраженной индукции секреции ИЛ-1а.

7. Показан мембранопротекторный эффект милиацина, обеспечивающий возможность восстановления уровня иммунного ответа в условиях действия на организм мембраноповре-ждающего фактора

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Маколдина А.В. Изменения в органах иммуногенеза у крыс при действии стероида растительного происхождения - милиацина//Сб. тез. докл. XI итог. конф. молодых ученых. -Оренбург, 1993. - С. 32-33.

2. Кириллова А.В. Протективное действие милиацина на гуморальный иммунный ответ в условиях действия на организм детергента//Сб. тез. докл. научно-практической конф. "Молодые ученые - здравоохранению". - Оренбург, 1998. - С. 38-40.

3. Кириллова А.В., Фролов БА Влияние милиацина на пролиферативную активность лимфоцитов тимуса и селезенки//Сб. тез. докл. юбилейной научной конф., посвященной 70-летию БА Саакова "Механизмы некоторых патологических процессов в эксперименте и клинке". - Ростов-на-Дону, 1999. - С. 99.

4. Кириллова А.В., Панфилова Т.В. Милиацин и гуморальный иммунный ответ у мышей (CBAxC57Bl/6)Ei//C6. тез. докл. региональной научно-практической конф. молодых ученых и специалистов Оренбуржья (ч.И). - Оренбург, 1999. - С. 50-51.

5. Кириллова А.В., Панфилова Т.В., Цинберг ЕД., Фролов БА Морфофункциональ-ные особенности иммунной системы при действии на организм тритерпеноида растительного происхождения - милиацина//Матер. 2-го съезда иммунологов России, 6-10 сентября 1999г., Сочи.- Российский иммунологический журнал. - 1999. - Т.4. - С. 245.

6. Панфилова Т.В., Кириллова А.В., Фролов БА Милиацин и клеточный иммунный ответ//Матер. II Российского конгресса по патофизиологии, 9-12 октября 2000г. - Москва, 2000.-С. 152-153.

7. Кириллова А.В., Панфилова Т.В., Фролов Б.А. Состояние иммунной реактивности при действии милиацина//Сб. докл. 14-ой Российской конф. "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". - Челябинск, 2000. - С. 53-54.

8. Корнеев Г.И., Кириллова А.В., Цинберг Е.Д. Морфофункциональные изменения в системе иммуногенеза под влиянием милиацина//Матер. V межрегиональной научно-практической конф. патологоанатомов Урала и Западной Сибири "Актуальные вопросы патологической анатомии". - Челябинск, 2001. - С. 523-525.

9. Фролов БА, Кириллова А.В., Панфилова Т.В. Биохимические и клеточные механизмы влияния тритерпеноидов на воспаление//Матер. международной научно - практической школы - конф. "Цитокины. Воспаление. Иммунитет", 23-26 июня 2002г., С-Петербург. - Цитокины и воспаление. - 2002. - Т. 1. №2. - С. 16.

10. Кириллова А.В., Панфилова Т.В., Фролов БА Иммунотропная активность милиа-цина//Матер. II конференции иммунологов Урала, 9-12 сентября 2002г., Пермь. - Иммунология Урала. - 2002. - №1(2). - С. 10-11.

11. Панфилова Т.В., Кириллова А.В., Фролов БА Влияние растительного тритерпе-ноида милиацина на индукцию эффекторов ГЗТ и ее стрессорное угнетение//Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакол. Сб. трудов 5 конгресса РААКИ.-Москва, 2002. - Т.2. - С.375.

12. Кириллова А.В., Корнеев Г.И. Влияние милиацина на морфофункциональные особенности клеточных популяций периферической крови и лимфоидных органов// Морфология. - 2003. - Т. 124. №5. - С. 54.

13. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В., Борисов С.Д., Медведева И.П., Фролов БА Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиацином// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2003. - №6. - С. 36-38.

14. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В., Борисов С.Д., Медведева И.П., Фролов БА «Средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина». Заявка на изобретение РФ. Приоритетная справка 023707 от 29.07.2003г.

КИРИЛЛОВА Алла Васильевна

ИМ МУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ МИЛИАЦИНА

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 11.02.2004. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Печатный Дом «ДИМУР» 460000, г. Оренбург, пер. Банный, 2.

«!- 353?

Среди наиболее значимых задач, стоящих перед иммунологией, решение которых имеет не только научное, но и клиническое значение, на одно из первых мест Р.В. Петров с соавт. (1981) поставили изыскание и изучение лекарств для лечения расстройств иммунитета. Прошедшие с этого времени почти четверть века не снизили актуальность данной проблемы. Более того, она значительно возросла, одной из причин чему является резкое ухудшение экологической обстановки, обусловливающее рост заболеваний, связанных с нарушениями в системе иммунитет [107, 115]. Несмотря на очевидные успехи, достигнутые в области создания иммунотропных лекарственных средств - препаратов, корригирующих процессы иммунитета [108, 110, 83, 61, 86, 87], дальнейшие поиски в этом направлении продолжаются.

Они включают в себя получение химически чистых или охарактеризованных аналогов биологически активных природных веществ, рекомбинант-ных цитокинов или индукторов их синтеза, разработку синтетических имму-номодуляторов, не имеющих природных аналогов (полиэлектролиты), поиск новых химических соединений, обладающих тропностью к иммунной системе [108]. Среди последних определенное внимание привлекают три-терпеноиды - вещества специализированного обмена, обладающие широким спектром биологического действия. Обнаруженный эффект стимуляции гуморального и клеточного иммунитета у сапонинов мыльного дерева [138, 160, 194] позволил выделить их из числа растительных адаптогенов как средств экстраиммунной терапии, т.е. реализующих влияние на иммунную систему организма через улучшение его "общего состояния" [107], и отнести к числу экзогенных средств для собственно иммунотерапии, т.е. обладающих направленным воздействием на восстановление функции иммунной системы [108]. Новые данные, полученные в последние годы, свидетельствуют о проявлении иммуностимулирующего влияния и у других тритерпеноидных сапонинов [211, 185], а также у самих тритерпенов (глицирризиновая и уросо-ловая кислоты) и их дериватов [34].

К числу тритерпеноидов, нашедших практическое применение в медицине относится милиацин, входящий в состав просяного масла, используемого для лечения трофических язв, инфицированных ран и некоторых других заболеваний [66, 67,17]. Обладая широким спектром биологической активности он стимулирует факторы неспецифичекой защиты и предотвращает их выраженную депрессию в условиях токсического поражения организма [74]. Вместе с тем, сведения о влиянии милиацина на систему иммунитета отсутствуют.

Актуальность настоящего исследования определяется тем, что до начала его выполнения не было проведено комплексного морфо-функционального изучения особенностей иммунной системы при действии на организм тритерпеноида растительного происхождения - милиацина; не были выяснены возможные механизмы, определяющие формирование этих особенностей; не были обнаружены адъювантное действие, а также протек-тивный эффект милиацина. в отношении иммуносупрессии под влиянием мембраноповреждающих факторов. Выяснение данных вопросов представляет значительный практический интерес, поскольку доступность милиацина, отсутствие токсичности и побочных эффектов в широком диапазоне доз [70], делает его перспективным для разработки в качестве иммунотропного средства.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение влияния милиацина на систему иммунитета в эксперименте, а также выяснение некоторых механизмов такого влияния.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить влияние милиацина на количественные и качественные характеристики клеточных популяций циркулирующей крови, центральных (костный мозг, тимус) и периферических (селезенка) органов системы иммунитета у экспериментальных животных.

2. Определить особенности формирования гуморального и клеточного иммунного ответа при различных схемах парентерального применения данного тритерпеноида.

3. Выяснить способность милиацина оказывать адъювантный эффект при иммунизации животных столбнячным анатоксином.

4. Исследовать некоторые механизмы влияния милиацина на систему иммунитета, включая антигениндуцированную супрессию и индукцию ИЛ-1.

5. Оценить протективное действие милиацина при детергент-индуцированной иммуносупрессии.

Научная новизна исследования

Впервые использован комплексный подход в изучении влияния милиацина на систему иммунитета, позволивший охарактеризовать структурные и функциональные ее особенности на клеточном, органном и организменном уровне у экспериментальных животных.

В экспериментах на крысах популяции Вистар обнаружена способность милиацина к стимуляции лимфопоэза, выразившаяся в увеличении относительного числа лимфоцитов в красном костном мозге, относительного и абсолютного лимфоцитоза в крови, увеличении плотности клеточного инфильтрата в корковом и мозговом веществе тимуса, гиперцеллюлярности селезенки, сопровождающейся ростом количества клеток в В - и Т - зависимых зонах органа. Увеличение клеточного инфильтрата в В - зависимой зоне селезенки, а также в зоне красной пульпы под влиянием милиацина установлено и у мышей СВА (при его десятикратном и трехкратном интервальном введении).

Установлено, что милиацин оказывает стимулирующее влияние на функциональную активность иммунной системы, которое зависит от кратности и периодичности его применения. Наиболее эффективная схема трехкратного интервального (через 3 дня) использования тритерпеноида, обусловливает усиление гуморального (по относительному и абсолютному количеству АТОК в селезенке) и клеточного (формирование эффекторов ГЗТ) иммунного ответа.

Установлены некоторые механизмы, способные определить стимулирующее влияние милиацина на функцию иммунной системы. В их числе -увеличение суммарного пула лимфоцитов, снижение формирования в ходе иммунного ответа антигениндуцированной супрессии, а также пролонгирование повышенного уровня индуцированной секреции ИЛ-1а.

Впервые обнаружена способность милиацина оказывать форсифици-рующее влияние на вакцинальный процесс в виде более значимого прироста уровня антител на первичную и повторную иммунизацию столбнячным анатоксином.

Впервые установлен иммунопротекторный эффект милиацина, проявляющийся в восстановлении уровня гуморального иммунного ответа в условиях действия на организм мембраноповреждающего фактора (детергента).

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней впервые представлены данные об иммунотропной активности милиацина, выражающиеся в стойких морфо-функциональных изменениях в периферической крови, центральных и периферических органах иммунной системы. Тем самым раскрываются новые аспекты действия милиацина на организм, что дополняет существующие представления о его биологических эффектах и служит основой для понимания механизмов ранозаживляющего действия милиацино-содержащего препарата милиацила.

Выявленные механизмы стимуляции иммунного ответа под влиянием милиацина раскрывают новые возможности изыскания иммунотропных лекарственных средств среди соединений стероидной природы естественного происхождения или синтеза их аналогов с избирательным действием на различные звенья иммунной системы.

Практическое значение работы состоит в том, что установленная в ней возможность усиления милиацином гуморального и клеточного иммунного ответа, включая его адъювантное действие, является экспериментальным обоснованием для использования данного тритерпеноида в качестве иммуностимулятора. Защитный эффект милиацина в отношении иммунного ответа при индуцированной иммуносупрессии расширяет возможность его практического использования для протекции иммунной системы при действии на организм неблагоприятных факторов.

Теоретические положения и практические результаты работы, включены в учебный курс для студентов Оренбургской медицинской академии. По материалам работы оформлена заявка на изобретение «Средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина». Приоритетная справка 023707 от 29.07.2003 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1 .Тритерпеноид растительного происхождения - милиацин обладает способностью стимулировать лимфопоэз. Активация лимфопоэза у крыс (Вистар) затрагивает Т - и В - зависимые звенья системы иммунитета и проявляется увеличением относительного содержания лимфоцитов в костном мозге животных, ростом относительного и абсолютного содержания этих клеток в крови, увеличением плотности клеточного инфильтрата коркового и мозгового слоя тимуса, гиперцеллюлярностью селезенки и увеличением количества клеток в Т - и В - зависимых зонах органа. У мышей (СВА) различные схемы применения милиацина не приводят к увеличению числа тимоци-тов, а прирост селезеночного пула спленоцитов происходит за счет увеличения клеточного инфильтрата в В - зависимой зоне селезенки, и в зоне красной пульпы.

2. Милиацин оказывает стимулирующее действие на гуморальный и клеточный иммунный ответ, в основе которого лежит возрастание пула лимфоцитов в лимфоидных органах, угнетение антигениндуцированной супрессии и пролонгирование регуляторного влияния ИЛ-1а.

3. Иммунотропная активность милиацина проявляется адъювантным эффектом и сочетается с его мембранопротекторным действием, обеспечивающим возможность восстановления уровня иммунного ответа в условиях действия на организм мембраноповреждающего фактора.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов (Оренбург, 1999; 2000), на II съезде патофизиологов России (Москва, 2000) на второй конференции иммунологов Урала (Пермь, 2002), на международной научно-практической конференции «Цитокины, воспаление, имму-нитет»(Санкт-Петербург, 2002), на пятом конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на Всероссийской научной конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экстремальных и патологических условиях» (Оренбург, 2003)

По теме диссертации опубликовано 13 работ.

139 Выводы

1. Установлено, что милиацин в разовой дозе 2 мг/кг стимулирует лимфопо-эз у крыс Вистар при десятикратном внутрибрюшинном введении и у мышей СВА при десятикратном и трехкратном интервальном (через 3 дня) введении. У крыс Вистар это проявляется возрастанием относительного числа лимфоцитов в красном костном мозге, относительным и абсолютным лимфоцитозом, гиперцеллюлярностью тимуса и селезенки с увеличением в последней площади Т - и В - зависимых зон и плотности в них клеточных инфильтратов. У мышей СВА милиацин вызывает значимое возрастание плотности клеточного инфильтрата в мантийной (В- зависимой) зоне органа и в зоне красной пульпы.

2. Показано, что рост лимфоидных популяций у крыс Вистар сопровождается снижением показателей РБТЛ тимоцитов и спленоцитов с ФГА и Кон А, а также спленоцитов с ЛПС. Редукция ответа с ЛПС носит более выраженный и продолжительный характер.

3. Установлено, что влияние милиацина на гуморальный иммунный ответ мышей (СВАхС57В1/6)р1 определяется кратностью и периодичностью использования данного тритерпеноида. Его трехкратное интервальное введение, предшествующее примированию животных ЭБ, обеспечивает значимое усиление выраженности ответа, как за счет возрастания клеточной популяции селезенки, так и усиления формирования АТОК. Последнее в наибольшей степени выражено при иммунизации более низкой дозой антигена.

4. Показано, что использование аналогичной схемы применения милиацина перед сенсибилизацией животных усиливает формирование у них эффекторов гиперчувствительности замедленного типа, но не влияет на способность лимфоцитов к развитию реакции трансплантационного иммунитета.

5. Установлено, что милиацин проявляет адъювантные свойства, повышая уровень антител у мышей (СВАхС57В1/б)р1 при первичной и повторной иммунизации столбнячным анатоксином.

6. Экспериментально обосновано, что влияние милиацина на функциональную активность иммунной системы реализуется за счет ослабления формирования антигениндуцированной супрессии и более выраженной индукции секреции ИЛ-1 а.

7. Показан мембранопротекторный эффект милиацина, обеспечивающий возможность восстановления уровня иммунного ответа в условиях действия на организм мембраноповреждающего фактора.

Заключение

Полученные данные позволили установить, что милиацин вызывает существенные изменения показателей миелограммы крыс, а также клеточных показателей крови и лимфоидных органов: тимуса и селезенки. В целом, эти изменения отражают активацию двух ростков кроветворения: эритропоэза и лимфопоэза.

Анализ возможных механизмов такой активации представляется достаточно сложным, исходя из многообразия факторов, участвующих в регуляции формирования кроветворных клеток [121, 120, 22, 130, 26]. В соответствии с существующими представлениями о динамической регуляции кроветворения [22] постулируется существование в красном костном мозге локальных механизмов, обеспечивающих количественную регуляцию гемопоэза на уровне коммитированных и частично детерминированных предшественников и ограничивающих реакцию полипотентных стволовых клеток на дальноранговые нервные и гуморальные стимулы. Такой локальной регуляторной системой служит комплекс клеточных, экстра-целлюлярных и гуморальных факторов, расположенных в непосредственной близости от гемопоэтических элементов и носящий название кроветворного или гемопоэзин-индуцирующего микроокружения (ГИМК). К элементам ГИМК относят отдельные субпопуляции Т-лимфоцитов и макрофагов (мобильные элементы), фибробласты с продуцируемыми ими компонентами экстрацеллюлярного матрикса, резидентные макрофаги, адипоциты, эпителиальные клетки, элементы микроциркуляторного русла и нервные волокна.

Своеобразной моделью взаимодействия ГИМК с кроветворными элементами, являются эритробластические островки, образование которых происходит после адгезии дифференцирующейся в проэритробласт коло-ниобразующей эритроцитарной единицы к резидуальному макрофагу костного мозга [28, 26]. Будучи гемопоэтическими элементами стромы, макрофаги реализуют стимулирующее влияние на эритропоэз различными путями, включая обеспечение эритробластов ферритином, продукцию ростовых факторов, синтез сульфатированных и сверхсульфатированных глико-заминогликанов, секрецию эритропоэтина и др. [130, 28, 22, 26]. Исходя из данных литературы о способности тритерпеноидов активировать макрофаги [138, 194], побуждая их к усилению продукции цитокинов, в частности, ИЛ-6, которому придается важное значение в стимуляции пролиферации эритроидных прекурсоров [26, 22], не исключено, что механизм такой стимуляции мог реализовываться и под влиянием милиацина, распространяясь на резидентные макрофаги костного мозга и способствуя проявлению их эритропоэтических функций.

При оценке возрастания относительного числа лимфоцитов в костном мозге крыс на 1 и 7 сутки после прекращения 10-кратного введения милиацина, обращает внимание, что этот сдвиг находился в полном соответствии с регистрируемым абсолютным и относительным увеличением содержания лимфоцитов в периферической крови в указанные периоды времени. Данное обстоятельство представляется весьма существенным, поскольку исключает такой механизм прироста лимфоцитов в костном мозге, как торможение их эмиграции из него. Вместе с тем, оно не исключает возможности этого прироста за счет иммиграции в костный мозг лимфоцитов, рециркулирующего пула, в частности, Т-лимфоцитов. Последнее характерно для действия на организм экстремальных факторов [23, 32, 21, 22, 114, 71, 127] и расценивается как срочный период проявления адаптационно-приспособительной реакции, направленной на улучшение условий для клеточного взаимодействия. Такое взаимодействие представляется необходимым для обеспечения физиологической и репаративной регенерации кроветворной ткани [22], а также для генерализации иммунного ответа при стрессе [23].

Однако, подобный перераспределительный механизм стрессорного увеличения содержания лимфоцитов в костном мозге совпадает по времени с лимфопенией, клеточным опустошением лимфоидных органов и сопровождается мобилизацией в циркуляцию гранулоцитарного костномозгового резерва, чего не наблюдалось в наших исследованиях, где возрастание относительного содержания лимфоцитов в костном мозге у крыс, получавших милиацин, регистрировалось на фоне лимфоцитоза в периферической крови и нейтропении, а также прироста числа спленоцитов в тимусе и в селезенке. Кроме того, прирост относительного содержания лимфоцитов в костном мозге (как и активация эритропоэза) протекал при значимом повышении в нем митотической активности, которая составила 30,5% на 1 сутки наблюдения и в 2,3 раза превосходила уровень, регистрируемый у интактных животных на 7 сутки. И хотя подобное повышение в значительной степени могло определяться активацией эритроидных элементов, не исключено, что определенный вклад в него вносили и коммитирован-ные предшественники лимфоидного ряда, для которых характерен высокий исходный уровень пролиферации [129]. В совокупности эти результаты дают основание полагать, что накопление лимфоидных клеток в костном мозге под влиянием милиацина обусловлено не перераспределительными механизмами, а активацией лимфопоэза, затрагивающей оба звена системы иммунитета.

Что касается влияния милиацина на генез Т-лимфоцитов, то на уровне костно-мозговых предшественников (ПТЛ) оно могло проявляться стимуляцией их пролиферации за счет усиления продукции цитокинов (ИЛ-3, ИЛ-2, ИЛ-9, ИЛ-1, ИЛ-6 в разных сочетаниях друг с другом) и ростовых факторов (фактор стволовых клеток , ИЛ-7), выделяемых ближайшим микроокружением. Кроме того, стимулирующий эффект мог опосредоваться возрастанием на поверхности ПТЛ преформированных к цитокинам и ростовым факторам рецепторов. Последнее - через встраивание молекулы тритерпеноида (в силу гидрофобности) в структуру клеточной мембраны с соответствующей перестройкой ее конформации, делающей рецепторы ПТЛ более доступными для лигандов.

Возможно, что аналогичный механизм под влиянием милйацина мог реализовываться и в отношении созревания ПТЛ в костном мозге/В соответствии с представлениями о трехстадийном развитии этих клеток |Ч29], они характеризуются приобретением на завершающем этапе определенного мембранного фенотипа, включающего, в частности, антиген CD44T к*

Ч.л молекулу Thy-1 [129, 143, 156].Экспрессия этих маркеров обеспечиваг' претимоцитам возможность миграции в тимус, преодолевая гемато\ тимический барьер и осуществляя хомминг [136, 128, 127]. С учетом того обстоятельства, что лишь незначительная часть ПТЛ, покинувшая костный мозг, проникает в тимус (~5%), даже небольшой прирост этого показателя может оказаться весьма значимым для усиления заполнения органа, хотя возможность принятия им костномозговых мигрантов в нормальных условиях достаточно ограничена.

Наблюдаемую в наших исследованиях экспансию клеток в корковом, а затем и в мозговом веществе органа, можно связать с их пролиферацией (в корковом веществе) с последующей эмиграцией в мозговое вещество. Как известно, способность самых ранних коммитированных предшественников, пришедших из костного мозга, к пролиферации под держивается как внутритимическими факторами [128, 127, 33], так и аутокринно [125, 89]. Существенно, что, во-первых, активность этой внутритимической пролиферации ПТЛ достаточно высока - в цикле находится примерно треть дубль - отрицательных лимфоцитов, а во-вторых, в результате ее, численность ПТЛ, мигрировавших в тимус, возрастает более, чем на порядок [129].

Очевидно, при подобном развитии событий закономерен повышенный выход клеток из тимуса на периферию. Кроме того, костномозговые ПТЛ могут мигрировать во вторичные лимфоидные органы и непосредственно. Основное место в таковой эмиграции принадлежит селезенке. И хотя содержание в ней ПТЛ в 56 раз ниже, чем в костном мозге [129], их последующее размножение в ней [143] в сочетании с иммиграцией в орган Тклеток тимического происхождения, может привести к гипеЪеллюлярно-сти Т- зависимых зон, что и наблюдалось в наших эксперимент

Вместе с тем, вопросы о том, как, в какой мере и на како\^апе развития Т- клеток реализуется влияние милиацина - требуют спецру1ЬНОГО изучения.

Стимулирующее влияние милиацина на В- лимфопоэз, также m\.q быть обусловлено его воздействием на костномозговые предшественнш

В-2 лимфоцитов, поскольку интенсивность антигеннезависимого размно-> жения В-клеток на периферии невелика и связана, в основном, с частич 1 ным самоподдержанием субпопуляции CD 5 (В-1)- лимфоцитов [127]. Предшественники последних, как известно, покидают костный мозг еще в эмбриогенезе и их физиологическая регенерация в течение взрослой жизни поддерживается в периферических тканях с преимущественной локализацией в плевральной и брюшной полостях [33, 93]. Решающую же роль в развитии В-2 клеток играет костномозговое окружение - клетки стромы и молекулы межклеточного матрикса, с которыми В- клетки контактируют благодаря мембранным интегринам, а также вырабатываемыми ими, близкодействующими гуморальными факторами. В частности, основным ростовым и дифференцировочным фактором на стадии про-В (наряду с фактором стволовых клеток) и пре-В-лимфоцитов является ИЛ-7 [127, 111]. Весьма значима роль и других цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-4 и возможно ИЛ-3, которые способствуют экспрессии генов иммуноглобулинов и обеспечивают выживаемость пре-В- клеток, делая их устойчивыми к апоптозу. В соответствии с существующими представлениями [127] имеются две волны пролиферации предшественников В- клеток: на стадиях пре-В и пре-В-2. Эта экспансия приводит к 20-кратному возрастанию клеток В- ряда в красном костном мозге, хотя более половины из них погибает вследствие неудачной реаранжировки генов. Еще один критический период в генезе В-лимфоцитов протекает на стадии незрелых В- клеток, где их гибель составляет от 85 до 90%, вероятно, вследствие отрицательной селекции. Тем не менее у мышей за сутки образуется около 15x106 зрелых В-лимфоцитов, которые эмигрируют в кровь и периферические лимфоидные органы. На каком из этапов пролиферации и дифференцировки предшественников может реализоваться стимулирующий эффект милиацина - неизвестно. Но факт гиперцеллюлярности В- зависимых зон селезенки при отсутствии усиления в них пролиферативных процессов, служит, по нашему мнению, аргументом в пользу такой возможности.

Таким образом, милиацин при десятикратном внутрибрюшинной введении, обеспечивает у крыс Вистар активацию лимфопоэза, выражающуюся в количественном росте лимфоцитов в красном костном мозге, крови, тимусе, а также в Т- и В- зависимых зонах селезенки животных. Т.е. эта активация затрагивает обе популяции лимфоцитов (Т- и В- зависимых) в условиях отсутствия признаков активации пролиферативных процессов лимфоидной ткани на периферии.

Существенно, что "вытеснение" на этом сроке из циркуляции сег-ментоядерных нейтрофилов не было обусловлено нарушением их костномозгового созревания и, по-видимому, носило перераспределительный характер. В основе такого сдвига могли лежать механизмы усиления эмиграции сегментоядерных лейкоцитов из кровотока и их секвестрации в различных тканях [57, 58, 25].

Исследования in vitro функциональной активности лимфоцитов крыс в тесте с неспецифическими поликлональными митогенами Т - (ФГА, Кон А) и В - (ЛПС) клеток, показали, что увеличение их пула в лимфоидных органах сопровождается снижением показателей бластной трансформации (РБТЛ).

Оценивая полученные данные важно отметить, что ответ лимфоцитов на митогены на фоне применения иммунотропных веществ, определяется не только функциональным состоянием системы иммунитета и индивидуальной чувствительностью к используемому митогену, но и тем фоном, который обеспечивает применение этих веществ, включая индивидуальную чувствительность особи к их действию. Это положение было убедительно продемонстрировано В.М.Манько с соавт.(1997), исследовавших ответ лимфоцитов селезенки животных одного и того же генотипа на ФГА при действии на организм иммуномодуляторов разной природы в оптимальных, стимулирующих иммунитет, дозах. Как оказалось, отдельные препараты оказывали разнонаправленное действие на интенсивность РБТЛ, стимулируя или уменьшая выраженность реакции. Механизмы этих эффектов не ясны, но по мнению авторов, они могут быть опосредованны изменением субпопуляционной характеристики лимфоидных клеток органа. Например, в случае снижения РБТЛ - уменьшением числа, Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФГА, или накоплением в селезенке животных зрелых Т-клеток фенотипа Lyt-2, оказывающих супрес-сорное влияние на пролиферацию тест-культуры [122]. Не исключается также, что неспособность активированных лимфоцитов отвечать на дополнительные активирующее действие митогена, обусловлена уже достигнутой максимальной величиной их активации под влиянием иммуномодуля-тора. Обращает на себя внимание и установленная авторами прямая зависимость между выраженностью реакции селезеночных клеток на ФГА in vitro и наличием реакции ГЗТ (in vivo) на применяемый препарат. Эти данные обосновали вывод об использовании теста с ФГА для оценки сенсибилизации организма к лекарственным препаратам, при которой отсутствие реакции на митоген позволяет предполагать низкий аллергизирующий потенциал исследуемого вещества. В связи с этим, установленное в наших экспериментах отсутствие подобного эффекта у милиацина, свидетельствует в пользу возможности его отнесения к веществам со слабыми аллер-гизирующими свойствами.

Снижение показателя РБТЛ с Кон А у крыс, получавших милиа-цин, несколько более пролонгировано, по сравнению с ФГА и в целом подтверждает хорошо известный факт [55] об отсутствии корреляции коэффициентов стимуляции лимфоцитов при использовании этих Т-клеточных митогенов.

Представленные положения о роли изменений субпопуляционных характеристик лимфоидных клеток селезенки в определении интенсивности РБТЛ, с определенной вероятностью можно экстраполировать и при анализе сниженного показателя стимуляции спленоцитов с поликлональ-ным В - клеточным митогеном - ЛПС. Исходя из полученных нами данных о стимуляции милиацином лимфопоэза в красном костном мозге, сопровождающейся приростом лимфоцитов в селезенке, включая ее В-зависимую зону, можно полагать, что подобная перестройка обеспечивает относительное увеличение содержания в органе незрелых B-лимфоцитов с поверхностным фенотипом, характеризующимся отсутствием (или снижением) экспрессии мембранных молекул, обеспечивающих их физиологическую активность. К числу последних может быть отнесен, например, BAFF- лиганд (мембранная молекула из семейства ФНОа), поддерживающий дифференцировку селезеночных В- лимфоцитов в зрелые, долгожи-вущие клетки, и защищающий их от апоптоза [227]. Не исключена и возможность снижения на обновляющихся клетках и других специфических участков, в том числе- для связывания ЛПС [54].

Таким образом, возрастание содержания лимфоцитов в лимфоидных органах у крыс под действием тритерпеноида сопровождается снижением пролиферативной активности клеток под действием поликлональных митогенов. Это снижение в большей степени затрагивает популяцию В-клеток, чем Т-лимфоцитов. Для последних оно носит слабовыраженный и непродолжительный характер.

Влияние милиацина на клеточные популяции иммунной системы не ограничивалось видовыми особенностями животных и проявлялось также у мышей СВА. В отличие от крыс Вистар, тритерпеноид не приводил к нарастанию целлюлярности тимуса, хотя и оказывал протективный эффект в отношении гипоплазии органа при десятикратном введении растворителя.

В то же время милиацин обусловливал увеличение суммарного пула спле-ноцитов как при трехкратном интервальном, так и при десятикратном введении. Как показали результаты морфологического анализа, эффект гипер-целлюлярности распространялся на клетки, локализованные в В но не в Т - зависимой зоне органа, при отсутствии возрастания в нем митотиче-ской активности. Последнее свидетельствует о возможности прироста пула лимфоцитов в селезенке за счет ее репопуляции В — клетками, эмигрирующими из красного костного мозга, но не о их накоплении за счет внут-риорганной пролиферации.

В целом, полученные данные дают основание для заключения, во-первых, о способности милиацина повышать структурное обеспечение системы иммунитета в виде возрастания содержания лимфоцитов в крови и в лимфоидных органах. Во- вторых, они с большой вероятностью позволяют полагать, что в основе такого сдвига лежит стимуляция лимфопоэза, реализующаяся в отношении как Т — (у крыс Вистар), так и В — звена (у мышей СВА и у крыс Вистар) системы иммунитета.

Исследование влияния милиацина на иммунореактивность in vivo позволило установить, что его эффект на гуморальный иммунный ответ, определяется кратностью и периодичностью введения тритерпеноида. Его десятикратное введение мышам (CBAxCsyBl^Fi увеличивало численность клеточной популяции селезенки, но снижало способность иммуноцитов к формированию АТОК. В этих условиях поддержание общей выраженности иммунного ответа в виде абсолютного количества АТОК обеспечивалось приростом суммарного пула спленоцитов. Последовательное трехкратное внутрибрюшинное введение милиацина не отразилось ни на количестве спленоцитов в селезенке, ни на формировании АТОК. Трехкратное интервальное (через 3 дня) введение тритерпеноида обеспечивало значимое увеличение гуморального иммунного ответа, как за счет возрастания клеточной популяции селезенки, так и усиления формирования АТОК. Последнее в наибольшей степени проявлялось при использовании более низкой дозы антигена (5x107 ЭБ), т.е. в условиях, когда неспецифическое влияние три-терпеноида на формирование антителопродуцентов не "перекрывалось" их специфической антигенной индукцией при более высокой дозе антигена (5х108 ЭБ).

Влияние милиацина на клеточноопосредованные формы иммунных реакций выражено неоднозначно. Ни при одной из трех использованных схем применения, милиацин не влиял на развитие реакции трансплантационного иммунитета в виде генерализованной реакции "трансплантат против хозяина ", воспроизводимой в полусингенном переносе донорских спленоцитов мышей родительской линии (СВА) мышам-реципиентам (СВАхС57В1/6)р1. Более того, трансплантация различных доз спленоцитов также не позволила обнаружить сколь-либо значимых изменений количественных параметров выраженности реакции (масса селезенки, селезеночный индекс) по сравнению с контролем. В то же время установлено, что применение милиацина способствовало усилению формирования эффекторов ГЗТ, обеспечивающих развитие иммунного воспаления в системе локального адоптивного переноса. Поскольку возможность такого переноса связывают Тх1 [33], не исключено, что милиацин реализовывал свое влияние через количественную и (или) функциональную экспансию данной субпопуляции лимфоцитов.

Таким образом, представленные данные позволили установить, что влияние милиацина на функциональную активность иммунной системы носит направленный характер, возможно отражая различную чувствительность клеточных клонов, участвующих в формировании различных форм иммунного ответа, к его воздействию. В целом, они свидетельствуют о способности тритерпеноида оказывать стимулирующее влияние на формирование как гуморального, так и клеточного (ГЗТ) иммунного ответа.

Изучение механизмов, опосредующих влияние милиацина на иммунную систему, обнаружило, что его применение не индуцировало в популяции спленоцитов животных неспецифических факторов, оказывающих воздействие на эффекторные иммунные механизмы. В частности, не были выявлены супрессирующее или усиливающее влияние со стороны сингеных спленоцитов, выделенных от животных, получавших милиацин, на популяцию антителопродуцентов при их совместном культивировании.

Наряду с этим установлено, что милиацин способствовал угнетению формирования антигениндуцированных супрессоров, накапливающихся в поздней стадии гуморального иммунного ответа и способных в условиях сингенного переноса ограничить формирование АТОК у реципиентов, примированных тем же антигеном. Тем самым показано, что тритерпеноид оказывает влияние на один из существенных механизмов регуляции иммунного ответа, лимитирующих интенсивность и продолжительность его проявления. Сопоставление этих материалов с результатами, отражающими стимулирующий эффект милиацина на иммунный ответ, явилось основанием для заключения об участии данного механизма в такой стимуляции.

Еще одним механизмом, способствующим проявлению стимулирующего эффекта милиацина на иммунный ответ организма, как показали наши исследования, может служить пролонгирование под его влиянием цитокиновой активации. Не сказываясь на базальном уровне ИЛ- 1а у мышей и выраженности его стрессорной индукции, трехкратное интервальное введение тритерпеноида способствовало длительному (на протяжении 72 часов) поддержанию повышенного уровня цитокина в крови. С учетом данных о способности ИЛ-1 оказывать лимфоцитактивирующее действие [94, 95, 40] представляется допустимым предположение о его более выраженном участии в стимуляции преактивированных антигеном Т- и В -лимфоцитов. Тем более, что его продолжительность цитокиновой активации составляла 72 часа - период времени, соответствующий индуктивной фазе развития иммунного ответа.

Результаты, отражающие стимулирующее влияние милиацина на систему иммуногенеза и некоторые механизмы такого влияния, послужили отправным моментом в определении способности тритерпеноида оказывать форсифицирующее действие на вакцинальный процесс. В работе установлено, что милиацин усиливает формирование иммунного ответа у мышей, иммунизированных столбнячным анатоксином как при первой, так и при повторной иммунизации. При этом, при вторичном ответе его применение обеспечивало не только возрастание суммарного титра антител по сравнению с контрольной группой животных, но и способствовало росту числа животных с наибольшими значениями титров антител. Полученные данные, подтверждая иммунотропные свойства милиацина, имеют и определенное прикладное значение. Как известно, применение адъювантов в ряде случаев не позволяет получить полноценный иммунный ответ и сформировать надежную защиту. Причиной этого могут быть различные обстоятельства, в том числе угнетение возможности иммунной системы полноценно реагировать на антигенный стимул под воздействием неблагоприятных факторов среды обитания [107, 8]. В связи с этим все большую актуальность приобретают подходы, направленные на оптимизацию вакцинального ответа [35, 82, 83, 109, 41, 59, 137, 160]. Это положение имеет отношение и к формированию противостолбнячного иммунитета, о чем свидетельствует значительное возрастание незащищенности населения, привитого АКДС, против столбняка в районах повышенной антропогенной нагрузки [37]. В связи с этим, полученные данные о возможности усиления милиацином иммунного ответа к столбнячному анатоксину представляются перспективными для дальнейшего изучения возможности использования тритерпеноида в качестве адъюванта. Тем более, что он характеризуется высокой переносимостью в широком диапазоне доз [70].

Заключительный раздел исследований, в соответствии с поставленными задачами, был посвящен выяснению возможности проявления у милиацина протекторного действия в отношении формирования иммунного ответа, нарушенного при действии на организм мембраноповреждающего фактора — детергента твин 21. Установлено, что применение тритерпеноида обеспечивало возможность сохранения уровня гуморального иммунного ответа, нарушенного при трехкратном введении детергента в организм. В то же время, милиацин не отменял и не ослаблял иммуносупрессии, индуцируемой в условиях десятикратного применения твина 21. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности милиацина оказывать мембранопротекторный эффект в отношении иммунокомпетентных клеток. Однако, они показывают, что подобный эффект лимитирован длительностью действия и (или) суммарной величиной нагрузки мембрано-повреждающего фактора. То обстоятельство, что милиацин оказывал мем-бранопротективный эффект, представляется нам весьма существенным при оценке тритерпеноида как иммунокорректора, которому при восстановлении гомеостаза принадлежит, возможно, лишь пусковая роль в развертывании защитных реакций [31]. При этом вопрос специфичности такого действия остается пока открытым, поскольку эффекты иммунокорректоров замыкаются не только на иммунные, но и биохимические, нейроэндокрин-ные, морфологические и другие цепи [87].

Обобщая полученные данные, следует отметить, что характеризуя иммунотропное влияние тритерпеноида растительного происхождения -милиацина и некоторые механизмы такого влияния, они обосновывают известные перспективы и для последующих исследований. Среди них наиболее значимыми представляются: дальнейшая разработка вопроса, связанного с использованием милиацина в качестве адъюванта, а также возможность его применения для протекции иммунной системы при действии на организм неблагоприятных факторов.