Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Экспериментальное обоснование применения милиацина для коррекции иммуносупрессии,индуцированной метотрексатом

004611099

На правах рукописи ^

ЖЕЛЕЗНОВА Алла Дмитриевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МИЛИАЦИНА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ИММУНОСУПРЕССИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ МЕТОТРЕКСАТОМ

14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 1 ОКТ ?пю

Пермь - 2010

004611099

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Оренбург

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Фролов Борис Александрович Научный консультант:

доктор медицинских наук Штиль Александр Альбертович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Долгих Олег Владимирович доктор медицинских наук, профессор Ширшев Сергей Викторович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится шэлЕ^Л 2010 г в (О часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 2446711

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Автореферат разослан «¡¿У»

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Метотрексат, будучи классическим иммунодепрес-сантом, подавляющим практически все звенья иммунной системы (Петров, Манько, 1971; Хаитов, 2006; Trevillian, Nunter, 2006; Pillans, 2006), широко применяется в клинической практике для лечения аутоиммунных и онкологических заболеваний. Одним из главных негативных последствий применения метотрексата являются инфекционные осложнения, возникающие вследствие развивающейся иммунодепрессии. В связи с этим разработка подходов, направленных на предупреждение и (или) ограничение иммунодепрессивного влияния метотрексата (Gerards et al., 2003; Cetiner et al., 2005; van der Heijden et al., 2009) является актуальной задачей, имеющей важное прикладное значение.

Сформировавшиеся к настоящему времени представления об основных группах иммуномодуляторов, механизмах их действия и принципах использования (Петров и др., 1999; 2008; Хаитов, Пинегин, 1996; 2000; Черешнев и др., 2006; 2007) не ослабили интереса к дальнейшему поиску веществ, обладающих иммунокорригирую-щей активностью. Необходимость в подобных исследованиях определяется потребностью улучшения эффективности иммунокоррекции на основе снижения побочных эффектов, повышения специфичности и точной адресной доставки иммупокорректо-ров (Гаврилова, 2006; Кетлинский, Симбирцев, 2008; Черешнев, Гейн, 2009).

Перспективным соединением среди таких веществ представляется милиацин-пентациклический тритерпеноид растительного происхождения, обладающий низкой токсичностью (Олифсон и др., 1991) и широким спектром иммунотропной активности. Показана способность милиацина стимулировать лимфопоэз, проявлять адъювантную активность и оказывать мембранопротекторный эффект (Кириллова, 2004; Фролов и др., 2005; Панфилова, 2007). Вместе с тем вопрос о защитном влиянии милиацина в отношении иммунодепрессивного влияния метотрексата остается открытым.

Актуальность данной работы определяется тем, что до начала ее выполнения не была проведена оценка защитного действия милиацина при меторексат-индуци-рованных нарушениях клеточных популяций центральных и периферических органов системы иммунитета; не был определен, его протективный эффект в отношении подавления метотрексатом гуморального и клеточного иммунного ответа, а также сформировавшегося вакцинального иммунитета; не было установлено влияние милиацина на состояние цитокиновой регуляции в условиях действия метотрексата; не было выяснено влияние милиацина на фармакокинетику метотрексата в лимфоидных органах, как фактора, способного обусловить проявление защитного действия тритерпеноида.

Цель настоящего исследования - оценка влияния милиацина на нарушения морфо-функциональных параметров иммунной системы и эффективность их восстановления при вторичном иммунодефиците, индуцированном метотрексатом.

Основные задачи исследования

1. Изучить влияние милиацина на клеточные популяции центральных (костный мозг, тимус) и периферических органов (селезенка) системы иммунитета у экспериментальных животных на разных сроках после воздействия метотрексата.

2. Выяснить интенсивность и продолжительность нарушений гуморального и клеточного иммунитета в условиях применения метотрексата и оценить возможность коррекции этих нарушений милиацином.

3. Исследовать особенности продукции цитокинов после воздействия метотрексата и влияние на эту продукцию милиацина.

4. Определить протективное влияние милиацина в отношении депрессии ме-тотрексат-индуцированного поствакцинального иммунитета.

5. Оценить влияние милиацина на фармакокинетику метотрексата в лимфоид-ных органах (селезенке) животных.

Научная новизна. Впервые определено протективное влияние милиацина в отношении лимфотоксичности метотрексата и его ингибирующего эффекта на функциональную активность иммунной системы. В экспериментах на мышах (СВА х С57В16)Р1 установлена способность тритерпеноида ограничивать метотрексат-индуци-рованные нарушения клеточных популяций циркулирующей крови, центральных (тимус, костный мозг) и периферических (селезенка) органов иммунной системы. Показано, что милиацин уменьшает супрессивное влияние метотрексата на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа. Установлено защитное влияние тритерпеноида в отношении продукции цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-12 и у-ИФН), ингибируе-мой метотрексатом. Показан позитивный эффект милиацина на процесс восстановления клеточных и функциональных параметров иммунной системы в виде сокращения сроков этого восстановления при стимуляции костномозгового кроветворения и усилении продукции цитокинов (ИЛ-4). Обнаружена способность милиацина повышать устойчивость вакцинального иммунитета при действии на организм иммунодепрес-санта. Впервые показано, что протективное влияние милиацина на иммунную систему в условиях применения метотрексата не связано с нарушением фармакокинетики препарата в лимфоидных органах (селезенке).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о диапазоне протективного влияния милиацина при действии

на организм дестабилизирующих факторов. Обнаружение защитного эффекта тритер-пеноида в отношении метотрексат-индуцированных нарушений клеточных популяций в органах иммунной системы и ее функциональной активности раскрывает новые аспекты его биологического действия. Отсутствие влияния милиацина на фармакокине-тику метотрексата в селезенке исключает рассмотрение такого эффекта в качестве возможного механизма в реализации протективного действия тритерпеноида в отношении клеточных популяций данного органа и их участия в формировании иммунного ответа. Результаты работы определяют новые возможности ограничения побочного действия цитостатической терапии и повышения эффективности иммунореабилитации после ее проведения на основе использования милиацина или его аналогов. Установленная в работе защита милиацином вакцинального иммунитета при действии на организм иммунодепрессанта, обусловливает перспективность дальнейшей разработки тритерпеноида как средства для поддержания иммунологической и эпидемиологической эффективности вакцинопрофилактики в условиях экстремальных воздействий.

Результаты диссертационной работы включены в учебный курс для студентов Оренбургской государственной медицинской академии. По материалам работы получены: патент на изобретение РФ № 2337693 «Средство, ограничивающее лимфотокси-ческий эффект метотрексата» и положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2008151816/14 (068110) от 08.02.2010г. «Способ защиты поствакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину от депрессии, индуцированной метотрексатом».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин оказывает протек-тивный эффект в отношении лимфотоксического действия метотрексата, что проявляется снижением клеточного опустошения костного мозга, тимуса, селезенки, ослаблением депрессии миелопоэза, лимитированием выраженности лейкоцитопении, лимфо-пении и нейтропении.

2. Милиацин ослабляет индуцированную метотрексатом дисфункцию иммунной системы, уменьшая угнетение гуморального и клеточного (СУН) иммунного ответа, предотвращая депрессию вакцинального иммунитета, а также отменяя (ИЛ-4) и ограничивая (ИЛ-12; у-ИФН) подавление продукции цитокинов.

3. Милиацин обеспечивает более эффективный процесс восстановления клеточных и функциональных параметров иммунной системы после воздействия метотрексата, сокращая сроки их нормализации и повышая выраженность экспрессии в виде стимуляции нейтрофилопоэза, лимфопоэза и усиления продукции ИЛ-4.

4. Протективное влияние милиацина не связано с нарушением фармакокинети-ки метотрексата в лимфоидных органах (селезенке) животных.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Оренбург, 2005; IV и V конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005; Оренбург, 2006; Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008; X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологии», Казань, 2009; II Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2009.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 16 научных работах, в том числе в 5 статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах. Получены патент на изобретение РФ № 2337693 и положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2008151816/14 (068110) от 08.02.2010г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 181 странице машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, главу «Материалы и методы исследования», 3 главы собственных исследований, обсуждение, выводы и указатель литературы, включающий 142 отечественных и 169 зарубежных источников.

Иллюстрации представлены 10 таблицами и 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 37 мышах СВА и 754 мышах-самцах (СВА х CJ7Bl6)Fb массой 18-22 г, поставленных из питомника АМН РФ «Столбовая». Животных содержали при комнатной температуре, двухразовом питании натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам, при неограниченном доступе к воде. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985). Выведение из опыта мышей осуществляли цервикальной дислокацией.

В работе использовали милиацин, любезно предоставленный профессором Л.Е. Олифсоном, получаемый из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаивании на холоду. Очистка препарата проведена путем его перекристаллизации из хлороформа. На основании изучения масс-, ЯМР- и ИК-спектров, хроматографиче-ской однородности и качественного состава (Олифсон и др., 1991) препарат отнесен к группе пентациклических тритерпеноидов (рис.1), имеющих структуру 3-р-метокси-

германицена (З-р-метокси-Д18- олеанена).

Н 1С сн»

Рис.1. Химическая структура пентациклического тритерпеноида - милиацина

Метотрексат (MTX) австрийской фирмы-производителя «Ebeve» вводился внутрибрюшинно однократно в дозе 10 мг/кг массы тела животного.

Для оценки протективной активности милиацина осуществлялось его трехкратное внутрибрюшинное введение в разовой дозе 2 мг/кг массы тела мышей на протяжении 3 дней: через 1 час, 24 и 48 часов после инъекции MTX. Эксперименты проведены на 4 группах животных: 1) интактные (положительная группа сравнения); 2) получавшие однократно MTX - 10 мг/кг (отрицательная группа сравнения); 3) получавшие MTX с последующим трехкратным введением растворителя для милиацина: твин 21 в конечной концентрации 1,6 х 10"7 моль/кг (контроль); 4) получавшие MTX с последующим трехкратным введением милиацина - 2мг/кг (опыт). В сериях опытов по оценке продукции цитокинов и изучению фармакокинетики MTX использованы 3 группы мышей: интактные (1); контрольные (3) и опытные (4).

Морфометрия тимуса и селезенки проводилась в гистологических срезах, окрашенных гематоксилином-эозином, с помощью сетки Автандилова (1973). Клеточный состав костного мозга изучали в мазках, окрашенных по Паппенгейму, приготовленных из суспензии миелокариоцитов, получаемых их вымыванием из бедренной кости средой 199. Абсолютное количество миелокариоцитов и лейкоцитов крови определялось с помощью камеры Горяева. Клеточные показатели периферической крови изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза.

Гуморальный иммунный ответ исследовали путем определения прямых анти-телообразующих клеток (АТОК) по методу Jerne, Nordin (1963) в селезенке внутрибрюшинно иммунизированных эритроцитами барана животных. Оценку клеточного иммунитета проводили на модели локальной реакции «трансплантат против хозяина» (GVH) по методу Woodland, Wilson (1977). Трансплантацию донорских спленоцитов от мышей СВА (108/мл; 0,1 мл) проводили в область подколенных лимфоузлов одной

из задних лапок мышей-реципиентов (СВА х С57В]б)Р1. Результаты учитывали через 7 суток путем сравнительного определения (Д) массы подколенных лимфоузлов опытной и контрлатеральной (интактной) лапок животных.

При исследовании продукции цитокинов, спленоциты (107/мл) культивировали 24 часа в среде RPMI - 1640 с 10% инактивированной фетальной сыворотки, 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина. Для стимуляции продукции цитокинов к культивируемым клеткам добавляли Кон А («Sigma») 5 мкг/мл с последующим определением у-ИФН и ИЛ-4, или ЛПС («Sigma») 5 мкг/мл с последующим определением ИЛ-12 (Симбирцев и др., 2003; Макарова и др., 2005). Концентрацию цитокинов оценивали в культуральной надосадочной жидкости методом иммуноферментного анализа (тест системы: «Bender Med Systems», Австрия) с регистрацией на фотометре «Multiskan».

Защитное действие милиацина в отношении вакцинального иммунитета исследовали путем определения с помощью реакции непрямой гемагглютинации уровня антител в сыворотке крови мышей, подвергнутых воздействию MTX после повторной иммунизации столбнячным анатоксином.

Фармакокинетические параметры MTX в селезенке изучали в свободных от белка супернагантах гомогенатов органа на хроматографе Gilson с ультрафиолетовым детектором при длине волны 313 нм. Колонка - Zorbax С8, 4,6x250 мм, подвижная фаза - ацетонитрил: вода (10 : 90), скорость потока - 1 мл/мин, объем анализируемой пробы - 50-100 мкл. Время удерживания MTX (RT- Retention Time) - 10-11 мин, чувствительность метода - 10-50 нг/мл образца. Анализ образцов осуществляли по величине площади пика (S) MTX на хроматограмме с помощью калибровочной кривой с применением программы STATGRAPH. При этом неизвестная концентрация (Сх) MTX в образце определялась по уравнению: Сх=0,055 + 1,004x10"5S. Фармакокине-тический анализ проведен с применением программы WinNonLin. Данный раздел исследования выполнен на базе лаборатории молекулярно-биологических методов исследования (руководитель - профессор A.C. Ягубов) и лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток (руководитель - доктор медицинских наук A.A. Штиль) ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина.

Статистическую обработку результатов осуществляли методами вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Excel, рассчитывая средние арифметические, доверительный интервал и стандартное отклонение (Урбах, 1975; Лакин, 1990). Достоверность различий между средними величинами при нормштьном распределении оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Протективное действие милиацина при метотрексат-индуцированных нарушениях клеточных популяций периферической крови и органов системы иммунитета

Установлено (рис.2), что MTX на 4 сутки после его применения вызывает значительное падение абсолютного содержания лейкоцитов в крови (на 45,5 ± 5,3%) за счет убыли сегментоядерных нейтрофилов (на 59,6 ± 4,1%) и лимфоцитов (на 40,6 ± 6,3%). Начало восстановления суммарного пула лейкоцитов регистрировалось лишь на 10 сутки после применения MTX, однако даже к концу третьей недели этот показатель сохранялся сниженным.

а

йШШт'"'

WAWMg

—.......—;

хухухухуххх-хуу;;

123456789 xlO'in

2 „ 4 xlO in

Рис.2. Влияние милиацина на абсолютное содержание лейкоцитов (А), сегментоядерных нейтрофилов (Б) и лимфоцитов (В) в периферической крови мышей (СВА х C57BI6)F1, подвергнутых воздействию MTX

Примечание (здесь и далее): Группы животных:

Интактные -П ; MTX -Щ]; MTX + растворитель HD ; MTX + милиацин -0 "■-достоверность с группой 1 (при р<0,05); *'-то же (при р< 0,01);*"-то же (при р< 0,005); •достоверность между группами 4 и 2 (при р<0,05); *'-то же (при р<0,01); *"-то же (при р<0,005); ■-достоверность между группами 4 и 3 (при р<0,05); «'-то же (при р<0,01); и"-то же (при р< 0,005)

Динамика восстановления абсолютного содержания сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов была идентичной и соответствовала таковой для суммарного пула лейкоцитов. Применение растворителя для милиацина не приводило к изменению как глубины депрессии исследуемых показателей на 4 сутки после применения MTX, так и характера их последующих сдвигов вплоть до конца наблюдения (21 сутки). В противоположность этому милиацин оказывал отчетливый протективный эффект, ограничивая редукцию суммарного пула лейкоцитов в крови на 4 сутки (на 33,6 ± 1,2%) за счет снижения падения абсолютного содержания сегментоядерных нейтро-

филов (на 41,5 ± 5,9%) и лимфоцитов (на 30,5 ± 2,7%). Применение милиацина способствовало и большей интенсивности процесса восстановления содержания лейкоцитов в крови, что обеспечивало нормализацию их абсолютного показателя уже к 14 суткам. При этом прирост содержания сегментоядерных нейтрофилов носил опережающий характер по отношению к аналогичному приросту лимфоцитов, что проявлялось как более ранним началом увеличения количества сегментоядерных нейтрофилов в крови (7, а не 10 сутки), так и более коротким сроком нормализации их уровня (10, а не 21 сутки).

Применение MTX приводило на 4 сутки к клеточному опустошению костного мозга (на 40,7 ± 5,7%). К 7 суткам этот показатель восстанавливался и в последующем находился в пределах значений, определяемых у интактных животных (рис.3).

Угнетение миелопоэза проявлялось выраженным и стойким падением содержания в костном мозге миелобластов на 4, 7, 10 и 14 сутки наблюдения. Дефицит абсолютного количества этих клеток сопровождался снижением их относительного содержания и сохранялся на фоне восстановления суммарного пула миелокариоцитов, что свидетельствует о нарушении формирования миелобластов за счет торможения их пролиферации. Изменения со стороны клеток непролиферируюшего пула характеризовались снижением абсолютного содержания палочкоядерных нейтрофилов на 4 сутки, которое не сопровождалось редукцией их относительного уровня и было обусловлено гипоплазией костного мозга. Отсутствие в указанный период значимых изменений абсолютного количества костномозговых сегментоядерных нейтрофилов при возрастании их относительного содержания и уменьшении содержания в крови, могло быть связано с торможением эмиграции данных клеток в циркуляцию. В то же время прирост абсолютного содержания сегментоядерных нейтрофилов в костном мозге к 7 суткам, мог отражать процесс пополнения популяции данных клеток за счет регенераторной реакции, о чем свидетельствует увеличение показателя и их относительного содержания.

Растворитель не влиял ни на выраженность клеточного опустошения костного мозга, ни на динамику изменений нейтрофилопоэза под влиянием MTX.

Милиацин отменял опустошение костного мозга на 4 сутки после введения MTX и обеспечивал его гиперцеллюлярность в последующие сроки. Защитное влияние тритерпеноида в отношении миелопоэза проявлялось также ограничением падения абсолютного содержания миелобластов на 4 сутки и нормализацией этого показа теля уже к 7 суткам. Стимулирующий эффект милиацина на кинетику костномозговых клеток нейтрофильного ряда характеризовался к указанному сроку значимым прирос-

к

и

>s

10

14

Ж-

УХ-УЖ УЖУХУХ нн»

ЛХХЛЛ-

10 15

х 10е

20 25

и н

>s

ЩЩН

10

14

Ш

0,5

1

к 10®

1,5

10

14

8—

0 2 0.4 0,6 0,8 1 X 10®

Е

З1

х 10

х 10'

Рис.3. Влияние милиацина на абсолютное содержание клеток нейтрофильного ряда в костном мозге бедренной кости мышей (СВА х C^Bl^F), подвергнутых воздействию метотрексата

А - миелокариоциты; Б - миелобласты; В - промиелоциты; Г - миелоциты; Д - палочкоядерные нейтрофилы; Е - сегментоядерные нейтрофилы. Группы животных:

Интактные ; MTX - Ш ; MTX + растворитель - 0 ; MTX + милиацин - 0

том относительного и абсолютного содержания промиелоцитов, миелоцитов и палоч-коядерных нейтрофилов. Возрастание к 7 дню суммарного пула сегментоядерных ней-трофилов, сохраняющееся и в последующие сроки, сопровождалось усилением их мобилизации в циркуляцию, о чем свидетельствует увеличение их содержания в крови.

Опустошение костного мозга на 4 сутки после введения MTX сопровождалось падением в органе абсолютного содержания лимфоцитов (на 38,4 ± 4,7%). Дефицит этих клеток сохранялся на 7 и 10 сутки, а их восстановление регистрировалось лишь к 14 дню (рис.4). Сходная динамика обнаруживалась и у мышей, получавших на фоне введения MTX растворитель.

сутки

10

14

ШШШШн^'

:ч>У о.' «у ::<х>, »>•-

к 10°

Рис. 4. Влияние милиацина на содержание лимфоцитов в красном костном мозге мышей (СВА х Cs7BI6)Fi, подвергнутых воздействию метотрексата

А - абсолютное количество лимфоцитов; Б - относительное количество лимфоцитов Группы животных:

Интакгные -□ ; MTX - Ш ; MTX + растворитель - Ш ; MTX + милиацин - 0

Применение милиацина не предотвращало и не ослабляло падения абсолютного содержания лимфоцитов в костном мозге на 4 и 7 сутки после воздействия MTX, однако обеспечивало их полное восстановление уже к 10 суткам. Стимулирующее влияние тритерпеноида на лимфопоэз характеризовалось значимым приростом абсолютного содержания костномозговых лимфоцитов (на 37,8 ± 9,7%) к 14 дню.

Убыль абсолютного количества лимфоцитов под влиянием MTX на 4 и 7 сутки не сопровождалась падением их относительного содержания. В то же время аналогичная убыль в условиях применения MTX с последующим введением милиацина характеризовалась редукцией показателя относительного содержания данных клеток в указанные сроки. Поскольку при МТХ-индуцированной гипоплазии костного мозга поддержание относительного уровня лимфоцитов нельзя связать с усилением дифферен-цировки и пролиферации их предшественников, не исключено, что основу этого феномена в условиях применения MTX или MTX с последующим введением растворителя, составляет эмиграция в костный мозг лимфоцитов из других органов иммунной системы (прежде всего - из тимуса) для стимуляции подавленного гемопоэза (Зимин, Хаитов, 1975; Горизонтов и др., 1983; Гольдберг и др., 1996). Милиацин, уменьшая выраженность подавления гемопоэза, мог лимитировать этот процесс эмиграции.

Применение MTX вызывало резкую гипоплазию тимуса (табл.1), проявляющуюся на 4 сутки уменьшением массы органа (на 72,6 ± 2,3%), площадей его корковой (на 73,7 ± 2,1%) и мозговой (на 57,7 ± 2,6%) зон со снижением в них плотности кле-

Таблица 1

Влияние милнацина на морфометрические параметры тимуса мышей (СВА х С57В16)К11 подвергнутых воздействию метотрексата

Группы животных / срок после введения MTX Масса органа (М ± ш) мг Площадь коркового в-ва1 (М ± ш) мм2 Количество клеток в поле зрения коркового в-ва! Площадь мозгового в-ва1 (М + ш) мм2 Количество клеток в поле зрения мозгового в-ва2

Интактные 55,0 ±2,2 (14 )■ 11,10±0,20 (7/14)6 1315,5±24,6 (5/21) 1,96±0,11 (7/14) 858,5±15,3 (5/20)

MTX 4 сутки 15,1 ±1,3*" (17) 2,89±0,23*" (5/10) 837,2±29,1*" (5/20) 0,83±0,05*" (5/10) 506,6±26,6*" (5/25)

МТХ+раствори-тель 4 сутки 13,9 ±0,8*" (15) 2,95±0,24*" (6/14) 845,9±17,07*" (5/21) 0,85±0,07*" (6/11) 547,4±20,3*" (5/25)

МТХ+милиацин 4 сутки 24,2±0,8*"»"и" (12) 5,0±0,27*"*"в" (6/15) 1057,4±29,5*"«"и" (5/25) 1,0±0,09*" (6/11) 720,7±27,2*'W (5/23)

MTX 7 сутки 21,9±1,4*" (21) 3,19±0,38*" (5/17) 890,8±26,0*" (5/25) 0,91±0,14*" (5/17) 591,1±28,8*" (5/25)

МТХ+раствори-тель 7 сутки 18,25 ±2,5*" (12) 3,27±0,34*" (6/26) 880,6±46,3*" (5/25) 0,90±0,09*" (6/23) 595,0±15,5*" (5/21)

МТХ+милиашш 7 сутки 30,4±1,4*"»"и" (15) 6,60±0,33*"»">" (8/20) 1100,1±29,1*"*"в" (7/35) 1,20±0,10*" (8/25) 733,4±36,2*"*"в" (7/35)

MTX 10 сутки 30,9±2,0*" (15) 5,21±0,26*" (5/17) 1089,1 ±15,9*" (5/16) 0,96±0,03*" (5/10) 635,8±27,4*" (5/25)

МТХ+раствори-тель 10 сутки 26,6 ±2,3*" (15) 5,42±0,26*" (6/15) 1067,6±31,8*" (8/25) 0,99±0,10*" (6/16) 676,6±21,7*" (8/25)

МТХ+милиацин 10 сутки 44,1±2,7*"»"ш" (13) 7,21±0,29*W (6/15) 1143,6±24,8*" (5/22) 1,28±0,07*"*"» (6/16) 782,0±24,5*»"в" (5/25)

MTX 14 сутки 33,9±1,9*" (9) 5,56±0,33*" (7/15) 1228,6±3 2,0* (7/22) 1,09±0,06*" (7/17) 818,7±20,8 (7/19)

МТХ+раствори-тель 14 сутки 36,6 ±2,6*" (12) 5,70±0,50*" (6/16) 1230,8±32,2* (5/25) 1,0±0,07*" (6/13) 821,7±12,1 (5/12)

МТХ+милиацин 14 сутки 49,8±0,9*«"щ" (8) 7,80±0,50*"»"в' (7/8) 1357,2±45,3«в (8/30) 1,30±0,07*" (7/12) 918,0±49,8 (8/25)

MTX 21 сутки 48,3 ±2,3* (12) 9,40±0,69* (5/10) 1251,2±23,3 (5/25) 1,42±0,16* (5/Ю) 831,5±15,1 (5/23)

МТХ+растворптел ь 21 сутки _ 46,1 ± 1,4*" (12) 9,16±0,67*' (5/15) 1247,8±25,4 (5/25) 1,35±0,16*" (5/Ü) 833,0±21,4 (5/25)

МТХ+милиацин 21 сутки 55,9±2,0»в" (12) 10,74±0,60 (5/13) 1315,3±21,9 (5/19) 1,70±0,16 (5/13) 864,2± 12,4 (5/18)

Примечание:

*- количество животных; б- в числителе - количество животных, в знаменателе - количество срезов; 1 - увеличение микроскопа х 50; 2- увеличение микроскопа х 450

точного инфильтрата (на 36,4 ± 1,5% и 41,0 ± 2,5%). Выявленные нарушения сильнее выражены в корковой зоне органа, для которой была характерна не только большая редукция ее площади, но и более продолжительный период восстановления клеточного инфильтрата (21 сутки) по сравнению с мозговой зоной (14 сутки). К концу 3 недели ряд исследуемых параметров: масса тимуса и площади соответствующих зон сохранялись сниженными.

Введение растворителя на фоне MTX не сказывалось на интенсивности нарушений клеточных популяций тимуса на 4 сутки после воздействия цитостатика, равно как и на их последующей динамике.

В противоположность этому, мнлиацин существенно ограничивал лимфоток-сический эффект MTX, что на 4 сутки проявлялось менее выраженной редукцией корковой зоны тимуса (на 51,5 ± 2,4%), менее значимым падением плотности клеточного инфильтрата в корковой (на 19,6 ± 2,8%) и мозговой (на 16,1 ± 3,3%) зонах органа и менее существенным дефицитом его массы (на 56,0 ± 1,5%). Защитное действие милиацина реализовывалось и через сокращение длительности восстановления клеточной популяции в корковой зоне (14 сутки), размеров площадей корковой и мозговой зон (21 сутки) и массы тимуса (21 сутки).

МТХ-индуцированные нарушения клеточных популяций в селезенке, так же как и в тимусе характеризовались падением массы органа (на 36,6 ± 4,0%), уменьшением площадей его Т- (на 77,9 ± 3,8%) и B-зависимой (на 45,2 ± 4,4%) зон, снижением в них плотности клеточного инфильтрата (на 26,6 ± 1,8% и 36,2 ± 1,8%). В отличие от тимуса восстановление этих нарушенных параметров происходило в более короткий промежуток времени и уже к 7 суткам показатели размеров Т-зависимой зоны, а также плотности клеточных инфильтратов в Т- и B-зависимых зонах органа нормализовались. Размеры B-зависимой зоны достигали исходных значений к 10 дню.

Использование растворителя на фоне введения MTX не приводило к сколь-либо существенным изменениям степени нарушений исследуемых показателей и их динамики. Милиацин ослаблял лимфотоксическое действие MTX в селезенке, отменяя на 4 сутки редукцию B-зависимой зоны, уменьшая депрессию Т-зависимой зоны, ограничивая падение в них плотности клеточного инфильтрата (на 16,7 ± 3,3% и 12,2 ± 1,8%) и лимитируя снижение массы органа (на 12,4 ± 4,5%).

2. Протективное действие милиацина при метотрексат-иидуцированных нарушениях функциональной активности иммунной системы

Угнетающее влияние MTX на формирование гуморального иммунного ответа к тимус-зависимому антигену - эритроцитам барана было наиболее выраженным при

иммунизации мышей на 5 сутки после введения цитостатика и характеризовалось существенным падением в селезенках животных относительного и абсолютного содержания АТОК (рис. 5).

сутки-

сутки и

сххххххххк»а—i*"

16

Г

... ■ - " 1-

~—■ ............... I;

100

200

зоо

40ci

АТОК (х 10°)

10000 20000 30000 40000 АТОК на селезенку

Рис. 5. Влияние милиацина на формирование гуморального иммунного ответа у мышей (СВА х C57B16)Fj, подвергнутых воздействию метотрексата, при иммунизации животных в различные сроки после введения цитостатика

При иммунизации в более отдаленном периоде (9 сутки) эффект супрессии сохранялся, хотя и был значительно ослаблен. В условиях иммунизации животных на 16 сутки после введения MTX, угнетение формирования АТОК не выявлялось.

Характеристики иммунного ответа у мышей, получавших на фоне введения MTX растворитель, практически ничем не отличались от тех, которые выявляли у мышей, подвергавшихся воздействию только MTX.

Применение милиацина ослабляло МТХ-индуцированную супрессию гуморального иммунного ответа, ограничивая почти в 2 раза падение абсолютного и относительного содержания АТОК при иммунизации животных на 5 сутки после введения цитостатика. Милиацин обеспечивал и более быстрое восстановление уровня иммунного ответа, которое при использовании тритерпеноида определялось при иммунизации животных уже на 9 сутки после введения MTX.

Наряду с угнетением гуморального иммунного ответа, MTX значительно ослаблял способность спленоцитов мышей родительской линии (СВА) к индукции локальной реакции «трансплантат против хозяина» (GVH) у полусиигенных реципиентов (СВА х C57B16)F, (рис. 6).

Такая супрессия на 4 сутки после применения MTX проявлялась снижением прироста массы подколенных узлов реципиентов (Д) при трансплантации им донорских спленоцитов от мышей, получавших цитостатик, по сравнению с аналогичным приростом от интактных доноров. Эффект супрессии этой формы иммунного ответа

масса лимфоузлов (мг) масса лимфоузлов (мг)

Рис. 6. Влияние милиацина на способность спленоцитов мышей СВА, подвергнутых воздействию метотрексата, к воспроизведению реакции GVH в различные сроки после введения цитостатика

Примечание: а - интактный узел; б - узел в месте полусингенного переноса

носит не только выраженный, но и продолжительный характер, сохраняясь даже на 21 сутки после введения MTX.

Использование растворителя не оказало заметного влияния на выраженность и динамику МТХ-индунированной супрессии способности спленоцитов к формированию GVH.

Применение милиацина ослабляло иммуносупрессивное влияние MTX как на ранних, так и на поздних сроках введения последнего.

В полном соответствии с полученными данными, находятся и результаты исследования защитного действия тритерпеноида в отношении МТХ-индуцированного подавления продукции цитокинов (рис.7).

Рис. 7. Влияние милиацина на продукцию цитокинов (пг/мл) спленоцитами мышей (СВАх С57В16)Г1, подвергнутых воздействию метотрексата

Группы животных:

Интактные -□ ; MTX + растворитель - El; MTX + милиацин -0

Установлено, что спленоциты животных, полученные на 4 сутки после введения им MTX и последующего введения растворителя, демонстрировали ослабленную

митогеннндуцированную продукцию ИЛ-4, ИЛ-12 и у-ИФН. К 21 суткам способность к продукции ИЛ-4 восстанавливалась и даже превосходила (на 33,4 ± 7,2%) уровень интактных животных, при сохранении дефицита продукции ИЛ-12 и у-ИФН.

Применение милиацина предотвращало на 4 сутки после введения MTX депрессию продукции ИЛ-4 и значительно уменьшало снижение продукции ИЛ-12 и у-ИФН. На 21 сутки защитное влияние тритерпеноида характеризовалось почти двукратным увеличением продукции ИЛ-4, нормализацией уровня продукции ИЛ-12 и значимым приростом продукции у-ИФН.

Протективное влияние милиацина реализуется и в отношении поствакциналь' ного иммунитета (рис. 8).

(CBAxC57BI 6)Fj, подвергнутых воздействию метотрексата после повторной иммунизации столбнячным анатоксином

А - 4 сутки после воздействия MTX; Б - 21 сутки после воздействия MTX Группы животных:

Интактные ; MTX - ü ; MTX + растворитель - 0 ; MTX + милиацин - 0

Установлено, что применение MTX на 10 сутки после повторной иммунизации столбнячным анатоксином приводит к падению титра антител в сыворотке крови животных как в ближайший (4 сутки), так и в отдаленный (21 сутки) периоды после введения цитостатика. Использование растворителя не ослабляло иммуносупрессивного влияния MTX. Применение милиацина, напротив, предотвращало эффект супрессии и минимизировало падение уровня антител к 21 суткам по сравнению с предшествующим сроком.

3. Влияние милиацина на фармакокинетические параметры метотрексата в селезенке мышей (СВА х CS7Blä)F,

В заключительном разделе работы исследовалось влияние милиацина на фар-макокинетику MTX в лимфоидном органе (селезенке) животных как возможного механизма реализации протективного действия тритерпеноида. Установлено, что фармакокинетические параметры MTX в селезенках, полученных от разных групп мышей: подвергавшихся воздействию MTX, MTX с последующим введением растворителя и

MTX с последующим введением милиацина, характеризовались практически одинаковыми иди близкими значениями (табл.2).

Таблица 2

Влияние милиацина на параметры фармакокинетики метотрексата в селезенке

Фармакокинетиче-ские параметры Ткань селезенки

Группы животных

MTX МТХ+растворитель МТХ+милиацин

Т0,5а, ч 0,19 0,17 0,17

T0,5ß, ч 33,6 36,8 34,1

Kel, мин 0,35 0,32 0,36

MRT, ч 34,9 35,9 39,6

С1, мл/мин 0,14 0,08 0,06

AUC, мкг/г х ч 34,5 35,7 38,6

Cmax, МКГ/г 15,4 15,8 15,6

Примечание:

Т0.5а - период полувыведения, соответствующий быстрой фазе распределения препарата по органам и тканям

To.sß - период полувыведения метотрексата из организма Ке1 - константа скорости выведения

MRT - mean residence time - среднее время удерживания метотрексата в организме

С1 - скорость выведения метотрексата из сыворотки крови

AUC - area under curve - площадь под фармакокинетической кривой

С та* - максимальная концентрация метотрексата в ткани селезенки

Отсюда следует, что защитное действие милиацина в отношении МТХ-инду-цированных нарушений клеточных популяций селезенки и их участия в иммунных реакциях, не связано с изменением биораспределения MTX в органе и его выведения.

Данное положение обосновывает представление о том, что защитный эффект милиацина в отношении иммунодепрессивного влияния MTX определяется другими механизмами. Учитывая способность MTX индуцировать оксидативный стресс и активацию перекисного окисления липидов (Babiak et al., 1998; Cetinkaya et al., 2006), представляется вероятным, что по крайней мере один из этих механизмов связан с ограничивающим влиянием тритерпеноида на процессы липопероксидации (Панфилова, 2007) и с реализацией его мембраропротекторного действия (Чернов и др., 1983; Кириллова, 2004).

В целом, результаты работы демонстрируют важную особенность биологического действия милиацина как иммунопротектора, что определяет перспективу его использования для ограничения побочных эффектов цитостатической терапии и поддержания эффективности вакцинопрофилактики при неблагоприятных воздействиях.

19

Выводы

1.Установлено, что однократное внутрибрюшинное введение метотрексата (10 мг/кг) мышам (СВА х С57В1б)Р1 приводит на 4 сутки к угнетению миело- и лимфопо-эза, клеточному опустошению костного мозга, тимуса, селезенки, развитию лейкопении, снижению способности к формированию гуморального и клеточного (вУН) иммунного ответа, подавлению продукции цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-12, у-ИФН) и депрессии вакцинального иммунитета.

2. Восстановление клеточных популяций органов иммунной системы и ее функциональной активности реализуется в течение 3 недель после введения цитостатика. При этом нормализация ряда параметров: продукция уИФН, способность к развитию вУН, содержание в крови лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов к концу указанного периода отсутствует.

3. Установлено, что милианин в разовой дозе 2 мг/кг при трехкратном последовательном (на протяжении 3 дней) внутрибрюшинном введении после применения метотрексата ослабляет лимфотоксический эффект цитостатика. Протективное действие милиацина на 4 сутки проявлялось уменьшением убыли миелокариоцитов и костномозговых клеток миелоидного ряда, снижением редукции площадей и плотности клеточного инфильтрата мозгового и коркового вещества тимуса, Т- и В-зависимых зон селезенки, ограничением выраженности лейкоцитопении за счет уменьшения падения содержания в крови сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов.

4. Показано, что милиацин обеспечивает ускорение процесса восстановления клеточных популяций, нарушенных под влиянием метотрексата. Нормализация клеточных параметров тимуса, селезенки и периферической крови происходит на фоне усиления костномозгового кроветворения, сопровождающегося увеличением абсолютного содержания в костном мозге клеток нейтрофильного ряда (7, 10, 14 сутки) и лимфоцитов (14 сутки).

5. Обнаружено, что милиацин ослабляет индуцированную метотрексатом супрессию гуморального и клеточного иммунного ответа. Определено, что тритерпено-ид ускоряет нормализацию уровня гуморального ответа (9, а не 16 сутки) и обеспечивает восстановление~способности к формированию клеточной иммунной реакции к 21 суткам.

6. Выявлена способность милиацина отменять (ИЛ-4) и ослаблять (ИЛ-12, у-ИФН) подавление метотрексатом продукции цитокинов на 4 сутки после применения цитостатика и обеспечивать стимуляцию (ИЛ-4), а также полное (ИЛ-12) или частич-

ное (у-ИФН) восстановление этой продукции в более отдаленном периоде (21 сутки).

7. Показано, что милиацин предотвращает депрессию вакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину как в раннем (4 сутки), так и в отдаленном периоде (21 сутки) после применения метотрексата.

8.Протективное влияние милиацина в отношении метотрексат-индуцированных нарушений клеточных популяций селезенки и их функциональных параметров не связано с нарушением фармакокинетики цитостатика в этом лимфоидном органе.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фролов Б.А., Панфилова Т.В., Штиль A.A., Кириллова A.B., Железнова А.Д., Калинина О.В., Медведева И.П., Беляева Н.М., Цинберг Е.Д. Милиацин как им-мунопротектор. Механизмы защитного влияния при иммуносупрессии в условиях воздействия на организм дестабилизирующих факторов//Сб. научных трудов ученых Оренбургской медицинской академии «Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины». - Оренбург, 2005. - Т. XXXI. - С. 169 - 178.

2. Железнова А.Д., Калинина О.В. Влияние милиацина на выживаемость мышей (CBAxC57Bl6)Fb подвергнутых воздействию токсической дозы метотрексата//Сб. материалов региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Оренбург, 2005. - Ч. 2. - С. 8-9.

3. Железнова А.Д., Калинина О.В., Фролов Б.А. О защитном действии милиацина в условиях применения токсической дозы метотрексатаУ/Матер. IV конференции иммунологов Урала. - Уфа, 2005. - Иммунология Урала. - 2005. - № 1 (4). - С. 129-130.

4. Железнова А.Д., Железное JI.M. Влияние милиацина на морфологические особенности тимуса, селезенки и красного костного мозга мышей (СВА х C57Bl6)Fb подвергнутых воздействию метотрексатаУ/Матер. IX межрегиональной научно-практической конференции онкологов «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии». - Оренбург, 2006. - Изд-во: ОАО «ИПК «Южный Урал». -2006. - С. 116-123.

5. Железнова А.Д. Милиацин как средство, ослабляющее лимфотоксическое действие метотрексата//Матер. V конференции иммунологов Урала. - Оренбург, 2006.

- Иммунология Урала. - 2006. - № 1 (5). - С. 13-14.

6. Железнова А.Д., Калинина О.В. Экспериментальная оценка милиацина как средства реабилитации при вторичном иммунодефиците, индуцированном метотрек-сатом//Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3-1 (14). -С.63-66.

7. Железнова А.Д., Железнов JI.M., Штиль A.A., Фролов Б.А. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в лимфоидных органах при воздействии метотрексата// Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2007. - Т. 144. - № 10. - С.458-463.

8. Железнова А.Д., Фролов Б.А. Влияние милиацина на особенности костномозгового кроветворения у мышей (СВА х C57Bl6)Fb подвергнутых воздействию ме-тотрексата//Труды VIII конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии»,- Москва, 2007. - Российский аллергологический журнал.

- 2007. - № 3, приложение 1. - С.20.

9. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Смолягин А.И., Чайникова И.Н., Штиль A.A., Фролов Б.А. Влияние милиацина на продукцию цитокинов спленоцитами мышей (CBAxC57Bl6)Fb подвергнутых воздействию метотрексата // Матер, объединенного иммунологического форума. - Санкт-Петербург, 2008. - Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11). - №2-3.-С. 313.

10. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Скачков М.В., Калинина О.В., Борисов С.Д., Фролов Б.А. Милиацин предотвращает депрессию иммунитета к столбнячному анатоксину, индуцированную метотрексатом // Эпидемиология и вакцинопрофилакти-ка. - 2009. - № 1 (44). - С. 53-59.

11. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Фролов Б.А. Милиацин как средство, ослабляющее депрессивное влияние метотрексата на способность спленоцитов мышей СВА к воспроизведению локальной реакции GVHZ/Сб.трудов X международного кон-

гресса «Современные проблемы аллергологии иммунологии и иммунофармакологии». - Казань, 2009. - Российский аллергологический журнал. - 2009. - № 3, выпуск 1. -С.238.

12. Фролов Б.А., Панфилова Т.В., Железнова А.Д. Особенности продукции цитокинов в условиях тяжелого «химического» стресса, индуцированного метотрекса-том//Тез. докладов II международного симпозиума «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии». - Санкт-Петербург, 2009. - С. 19-20.

13. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Фролов Б.А. Милиацин ослабляет супрессию гуморального иммунного ответа, индуцированную метотрексатом//Матер. VII конференции иммунологов Урала. - Архангельск, 2009. - Вестник Уральской медицинской академической науки (тематический выпуск по аллергологии и иммунологии). - 2009. - № 2/1 (24). - С.207-208.

14. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Смолягин А.И., Чайникова И.Н., Штиль A.A., Фролов Б.А. Влияние милиацина на дисфункцию иммунной системы у мышей при действии метотрексатаУ/Иммунология. - 2009. - № 5. - С. 298-302.

15. Калинина О.В., Сингин A.C., Фролов Б.А., Железнова А.Д., Штиль A.A. Фармакокинетика метотрексата в комбинации с органопротектором милиаци-ном//Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. - 2009. - Т. 20. - № 4. - С.33-37.

16. Фролов Б.А., Железнова А.Д., Калинина О.В., Панфилова Т.В. Протек-тивное действие милиацина при метотрексат-индуцированных нарушениях содержания и клеточного состава лейкоцитов периферической крови мышей (СВА х C57Bl6)Fb подвергнутых воздействию метотрексата//Матер. национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению». - Москва, 2010.-Российский аллергологический журнал. - 2010. -№ 1,вып.1.-С. 183-184.

Патенты РФ

1. Железнова А.Д., Железное JI.M., Штиль A.A., Фролов Б.А. «Средство, ограничивающее лимфотоксический эффект метотрексата». Патент на изобретение РФ № 2337693. Зарегистр. в Госреестре 19.03.2007.

2. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Скачков М.В., Калинина О.В., Борисов С.Д., Фролов Б.А. Способ защиты поствакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину от депрессии, индуцированной метотрексатом. Решение о выдаче патента на изобретение РФ по заявке № 2008151816/14 (068110). Дата подачи заявки 25.12.2008.

ЖЕЛЕЗНОВА Алла Дмитриевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ МИЛИАЦИНА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ИММУНОСУПРЕССИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ МЕТОТРЕКСАТОМ

Автореферат Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99.

Подписано в печать 01.06.2010 г. Тираж 100 экз. Уч. изд. Л. 1,0 Формат 60x84/16. Набор компьютерный. Заказ № 2215

Отпечатано в ООО Печатный дом «Пресса» 460000, г. Оренбург, ул. Комсомольская, 45.

Метотрексат, будучи классическим иммунодепрессантом, подавляющим практически все звенья иммунной системы [81; 122; 249; 287], широко применяется в клинической практике для лечения аутоиммунных и онкологических заболеваний. Он является золотым стандартом при лечении ревматоидного артрита. Одним из главных негативных последствий применения метот-рексата являются инфекционные осложнения, возникающие вследствие подавления функциональной активности иммунной системы. В связи с этим разработка подходов, направленных на предупреждение и (или) ограничение иммунодепрессивного влияния метотрексата [153; 183; 188; 265] является актуальной задачей, имеющей важное прикладное значение. Однако возможность ее реализации не исследована.

Сформировавшиеся к настоящему времени представления об основных группах иммуномодуляторов, механизмах их действия и принципах использования [84; 85; 87; 117; 118; 119; 131; 132; 133] не ослабили интереса к дальнейшему поиску веществ, обладающих иммунокорригирующей активностью. В сфере этого интереса существенное место занимают естественные метаболиты, включая продукты микробного [7; 98; 106; 187] и растительного происхождения [10; 71; 246; 264], эндогенные пептиды [24; 25; 30; 134] и цито-кины [42; 102]. Необходимость в подобных исследованиях определяется потребностью повышения эффективности иммунокоррекции на основе снижения побочных эффектов, повышения специфичности и точной адресной доставки иммунокорректоров.

Перспективным классом среди таких веществ представляются тритерпе-ноиды и тритерпеноидные сапонины, обладающие широким спектром имму-нотропной активности [147; 252; 267; 305]. Проявляя низкую токсичность, они оказывают модифицирующее влияние на структуру биологических мембран лимфоцитов, обеспечивая усиление их пролиферативного потенциала и функции [94]. Данное положение в полной мере относится к милиацину -тритерпеноиду растительного происхождения, обладающему способностью стимулировать лимфопоэз, проявлять адъювантную активность и оказывать мембранопротекторный эффект [47; 77; 115]. Вместе с тем вопрос о защитном влиянии милиацина: в отношении лимфотоксического и иммунодепрес-сивного влияния метотрексата остается открытым.

Актуальность настоящего исследования определяется тем, что до начала его выполнения не было проведено оценки защитного действия милиацина при меторексат-индуцированных нарушениях клеточных популяций центральных и периферических органов системы иммунитета; не был определен его протективный эффект в отношении подавления метотрексатом гуморального и клеточного; иммунного ответа^ а также сформировавшегося вакцинального иммунитета; не было установлено; влияние милиацина на состояние цитокиновой регуляции в условиях действия метотрексата; не было выяснено влияние милиацина. на фармакокинетику метотрексата в лимфоидных органах, как фактора; способного обусловить проявление защитного действия тритерпеноида.

Ц е ль и задачи и с с л е д о в а н и я Целью настоящей работы являлась оценка влияния милиацина на нарушения морфофункциональных параметров иммунной системы и эффективность их восстановления при вторичном; иммунодефиците, индуцированном метотрексатом.

В соответствии? с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить, влияние милиацина на клеточные популяции центральных (костный: мозг, тимус) и периферических органов (селезенка) системы иммунитета у экспериментальных животных на разных сроках после воздействия; метотрексата.:'/' ^ V •' ■'/.

2. Выяснить интенсивность и продолжительность нарушений гуморального и клеточного иммунитета в условиях применения метотрексата и оценить возможность коррекции этих нарушений милиацином.

3. Исследовать особенности продукции цитокинов после воздействия метотрексата и влияние на эту продукцию милиацина.

4. Определить протективное влияние милиацина в отношении депрессии ме-тотрексат-индуцированного поствакцинального иммунитета.

5. Оценить влияние милиацина на фармакокинетику метотрексата в лимфо-идных органах (селезенке) животных.

Научная новизна исследования Впервые определено протективное влияние милиацина в отношении лимфотоксичности метотрексата и его ингибирующего эффекта на функциональную активность иммунной системы. В экспериментах на мышах (СВА х С57В16)Р ] установлена способность тритерпеноида ограничивать метотрексат-индуцированные нарушения клеточных популяций циркулирующей крови, центральных (тимус, костный, мозг) и периферических (селезенка) органов иммунной системы. Показано, что милиацин уменьшает супрессивное влияние метотрексата на формирование гуморального и клеточного иммунного ответа. Установлено защитное влияние тритерпеноида в отношении продукции цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-12 и у-ИФН), ингибируемой метотрексатом. Показан позитивный эффект милиацина на процесс восстановления клеточных и функциональных параметров иммунной системы в виде сокращения сроков этого восстановления при стимуляции костномозгового кроветворения и усилении продукции цитокинов (ИЛ-4). Обнаружена способность милиацина повышать устойчивость вакцинального иммунитета при действии на организм иммунодепрессанта. Впервые показано, что протективное влияние милиацина на, иммунную систему в условиях применения метотрексата не связано* с нарушением, фармакокинетики препарата в лимфоидных органах (селезенке):

Т е о р е т и ч е с.к о е значение работы Полученные данные расширяют представление о диапазоне протектив-ного влияния милиацина при действии на организм дестабилизирующих факторов. Обнаружение защитного эффекта тритерпеноида в отношении метот-рексат-индуцированных нарушений; клеточных популяций в органах иммунной системы и ее функциональной активности раскрывает новые аспекты его биологического действия. Отсутствие влияния милиацина на фармакокине-тику метотрексата в селезенке исключает рассмотрение такого эффекта в качестве возможного механизма в реализации протективного действия тритерпеноида в отношении клеточных популяций данного органа и их участия в формировании иммунного ответа.

Практическос з н а ч с н и е р а б о ты Результаты работы определяют новые возможности; ограничения побочного действия цитостатичсской терапии; и повышения эффективности имму-нореабилитации после ее проведения на основе использования' милиацина-или его аналогов: Установленная в работе защита милиацином вакцинального иммунитета при действии на организм иммунодепрессанта, обусловливает перспективность дальнейшей^ разработки тритерпеноида как средства для-поддержания; иммунологической- и эпидемиологической эффективности вак-цинопрофилактики в условиях экстремальных воздействий.

Результаты диссертационной работы включены в учебный курс для. студентов Оренбургской государственной медицинскот академии. По материалам работы получены: патент на изобретение РФ № 2337693' «Средство, ограничивающее лимфотоксический эффект метотрексата» и положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2008151816/14 (068110) от 08.02.2010г. «Способ защиты поствакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину от депрессии, индуцированной метотрексатом».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин оказывает протек-тивный эффект в отношении лимфотоксического действия метотрексата, что проявляется снижением клеточного опустошения костного мозга, тимуса, селезенки, ослаблением депрессии миелопоэза, лимитированием выраженности лейкоцитопении, лимфопении и нейтропении.

2. Милиацин ослабляет индуцированную метотрексатом дисфункцию иммунной системы, уменьшая угнетение гуморального и клеточного (ОУН) иммунного ответа, предотвращая депрессию вакцинального иммунитета, а также отменяя (ИЛ-4) и ограничивая (ИЛ-12; у-ИФН) подавление продукции цитокинов.

3. Милиацин обеспечивает более эффективный процесс восстановления клеточных и функциональных параметров иммунной системы после воздействия метотрексата, сокращая сроки их нормализации и повышая выраженность экспрессии в виде стимуляции нейтрофилопоэза, лимфопоэза и усиления продукции ИЛ-4.

4. Протективное влияние милиацина не связано с нарушением фармакокинетики метотрексата в лимфоидных органах (селезенке) животных.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Оренбург, 2005; IV и V конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005; Оренбург, 2006; Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008; X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 2009; II Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2009.

Материалы диссертации обобщены в 16 научных работах, в том числе в 5 статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах. Получены патент на изобретение РФ № 2337693 и положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2008151816/14 (068110) от 08.02.2010г.

141 Выводы

1 .Установлено, что однократное внутрибрюшинное введение метотрексата (10 мг/кг) мышам (СВА х С57В16)Р] приводит на 4 сутки к угнетению миело-и лимфопоэза, клеточному опустошению костного мозга, тимуса, селезенки, развитию лейкопении, снижению способности к формированию гуморального и клеточного (вУН) иммунного ответа, подавлению продукции цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-12, у-ИФН) и депрессии вакцинального иммунитета.

2. Восстановление клеточных популяций органов иммунной системы и ее функциональной активности реализуется в течение 3 недель после введения цитостатика. При этом нормализация ряда параметров: продукция уИФН, способность к развитию ОУН, содержание в крови лимфоцитов и сегментоя-дерных нейтрофилов к концу указанного периода отсутствует.

3. Установлено, что милиацин в разовой дозе 2 мг/кг при трехкратном последовательном (на протяжении 3 дней) внутрибрюшинном введении после применения метотрексата ослабляет лимфотоксический эффект цитостатика. Протективное действие милиацина на 4 сутки проявлялось уменьшением, убыли миелокариоцитов и костномозговых клеток миелоидного ряда, снижением редукции площадей и плотности клеточного инфильтрата мозгового и коркового вещества тимуса, Т- и В-зависимых зон селезенки, ограничением выраженности лейкоцитопении за счет уменьшения падения содержания в крови сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов.

4. Показано, что милиацин обеспечивает ускорение процесса восстановления клеточных популяций, нарушенных под влиянием метотрексата. Нормализация клеточных параметров тимуса, селезенки и периферической крови происходит на фоне усиления костномозгового кроветворения, сопровождающе-госяг увеличением абсолютного содержания в костном мозге клеток нейтро-фильного ряда (7, 10, 14 сутки) и лимфоцитов (14 сутки).

5. Обнаружено, что милиацин ослабляет индуцированную метотрексатом супрессию гуморального и клеточного иммунного ответа. Определено, что три-терпеноид ускоряет нормализацию уровня гуморального ответа (9, а не 16 сутки) и обеспечивает восстановление способности к формированию клеточной иммунной реакции к 21 суткам.

6. Выявлена способность милиацина отменять (ИЛ-4) и ослаблять (ИЛ-12, у-ИФН) подавление метотрексатом продукции цитокинов на 4 сутки после применения цитостатика и обеспечивать стимуляцию (ИЛ-4), а также полное (ИЛ-12) или частичное (у-ИФН) восстановление этой продукции в более отдаленном периоде (21 сутки).

7. Показано, что милиацин предотвращает депрессию вакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину как в раннем (4 сутки), так и в отдаленном периоде (21 сутки) после применения метотрексата.

8. Протективное влияние милиацина в отношении метотрексат-индуциро-ванных нарушений клеточных популяций селезенки и их функциональных-параметров не связано с нарушением фармакокинетики цитостатика в этом лимфоидном органе.

143

Заключение

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о протективном действии милиацина в отношении метотрексат-индуцированных нарушений клеточных популяций в органах системы иммунитета и ее функциональной активности. В связи с этим принципиальное значение приобретает вопрос о механизме (ах) такой протекции. Выполненный в работе сравнительный анализ динамики содержания MTX в лимфоидном органе (селезенке) в условиях применения и без применения милиацина, не позволяет связать протективное действие тритерпеноида с его влиянием на' фармакокинетику MTX. Наряду с этим особенности химической структуры милиацина (фитостероида) делают маловероятной возможность его оппозитной к MTX роли в отношении активности дигидрофолатредуктазьъ и образования тетрагидрофолиевой кислоты. Данные положения обосновывают представления о том, что защитное действие милиацина на проявление цитотоксического и иммунодепрессивно-го влияния MTX определяется не ограничением антиметаболических эффектов последнего, но другими механизмами. При анализе этих механизмов заслуживают внимания данные о способности MTX индуцировать оксидатив-ный стресс и активацию свободнорадикального окисления [144; 154].

Как известно [20; 38; 110; 172] в основе оксидативного стресса лежит генерация в клетке активных форм кислорода (АФК), представляющих собой продукты неполного восстановления его молекул: свободные радикалы, перекиси И! другие метаболиты, обладающие высокой реакционной способностью.

Следует отметить, что в настоящее время АФК рассматриваются не только как побочный продукт клеточного метаболизма, но и как необходимые биомолекулы в регуляции клеточных функций. Прежде всего,,речь идет об участии некоторых АФК в, роли медиаторов в, клеточных сигнальных путях. Такое участие определяется, в.частности, способностью АФК изменять фосфорилирование по тирозину целого спектра белков [66], что может опосредовать действие АФК на различные сигналопередающие системы, включая MAP (mitogen activating protein)-KHHa3Hbm каскад и факторы транскрипции [110; 299]. Такая возможность подтверждается усилением продукции ци-токинов в присутствии АФК [244] и снижением этой продукции [172], равно как и клеточной пролиферации [48] под действием антиоксидантов. По мнению F. Obata et al. (2006) регуляторный эффект АФК в большей степени затрагивает Тх2 - субпопуляцию лимфоцитов, что проявлялось in vivo продукцией ассоциированных с Тх2 — ответом антител классов IgE и IgGb a in vitro - увеличением уровня секреции ИЛ-4 (но не уИФН). Интенсивное изучение сигнальной функции АФК на примере цитокинов и факторов роста [282] тем не менее пока не внесло ясность в понимание специфичности действия АФК и их последующего дистанцирования от молекул-мишеней.

Необходимость АФК для» жизнедеятельности клеток связывают также с образованием при их участии электронно-возбужденных состояний биомолекул - триггеров всех последующих биоэнергетических реакций. Колебательный режим таких реакций способствует ритмичному протеканию биохимических процессов на более высоком уровне [96].

Наконец, АФК обеспечивают функциональную лабильность мембран клеток и субклеточных структур, определяющую такие жизненно важные процессы, как проницаемость, ионный транспорт, энергетику, синтез белка и др. Подобное обеспечение обусловлено способностью АФК инициировать активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) при взаимодействии с входящими в состав клеточных мембран полиненасыщенными жирными кислотами. Представляя собой саморазвивающуюся цепную реакцию, ПОЛ постоянно протекает в клетке, поскольку является нормальным процессом метаболизма и служит необходимым звеном её жизнедеятельности, включая адаптационные реакции. Благодаря ПОЛ, реализуемому в клеточных мембранах, меняется их липидный состав, а тем самым - активность липидзависимых мембранных ферментов, к которым по-существу относятся все ферментные системы организма [63].

Отмечая роль АФК в обеспечении жизнедеятельности клеток, следует подчеркнуть, что они в тоже время представляют собой потенциально опасные продукты метаболизма. Их отличительной особенностью является высокая окислительная способность, создающая существенную угрозу для ре-докс-чувствительных компонентов; клетки; прежде всего — белков, липидов и нуклеиновых кислот [38]. В нормальных условиях содержание АФК лимитируется механизмами антиоксидантной защиты (редокс-буферными системами); включающими ферментативные и неферментативные системы инактивации АФК [96]. Нарушение этого динамического баланса про- и антиокси-дантных механизмов в сторону преобладанияшервых из них, способно вызвать ряд структурно-функциональных нарушений в клетке вплоть до её гибели [6].

В этой связи принципиально важно, что подобный сдвиг генерируется под воздействием MTX. Вопрос о том;, какой именно: механизм определяет индуцирующее влияние MTX, на развитие окислительного стресса остается открытым. Однако можно»предполагать, что такая индукция происходит не просто на фоне снижения механизмов антиоксидантной защиты, но именно снижение некоторых ключевых механизмов это№ защиты под влиянием MTX служит пусковым моментом для накопления АФК в клетке, подвергшейся воздействию цитостатика. В первую очередь это предположение касается редукции, под влиянием MTX. внутриклеточного пула восстановленного* глута-тиона — GSH [144], истощение которого может обусловливаться участием этого небелкового тиола в работе транспортных белков систем множественной^ лекарственной резистентности.

Как. отмечалось выше; (глава 1), GSH взаимодействует своей сульфгид-рйльнош. группой; с. реактивной группой лекарственного: препарата; Такое взаимодействие приводит к образованию конъюгатов, необходимых для peaлизации активности MRP-1 (multidrug resistance protein-1) - транспортера ксенобиотиков, значимо присутствующего и в лимфоцитах [104]. Будучи главным водорастворимым антиоксидантом, концентрация которого в клетке достигает миллимолярных значений [60], восстановленный глутатион играет центральную роль в поддержании в ней окислительно-восстановительного баланса. В связи с этим, снижение содержания GSH и рост удельного содержания его окисленной формы (GSSH), на долю-которой в норме приходится —10% от общего количества данного тиола, существенно влияют на нарушение этого баланса. Подобный вариант развития событий представляется тем более вероятным, что среди ферментов, активность которых ингибируется MTX (глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа, фосфоглюконатдегидрогеназа) присутствуют глутатионредуктаза и у-глютамилцистеинсинтетаза [144]. Первый из них принимает участие в регенерации восстановленного глутатиона из его окисленной формы, тогда как второй необходим для эндогенного синтеза глутатиона. Причем, образование именно у-глутамилцистеина является- лимитирующим звеном этого синтеза- [60]. Очевидно, что блокирование MTX обоих процессов может выступатьжак достаточное условие нарушения, анти-оксидантного статуса клетки. Тем более, с учетом плохой проницаемости клеточных мембран для глутатиона, исключающей (ограничивающей) возможность восполнения его внутриклеточного пула за счет внешних источников.

Негативные результаты нарушения окислительно-восстановительного баланса клетки реализуются прежде всего через усиление процесса перокси-дации липидов (ПОЛ), в который вовлекаются полиненасыщенные жирные кислоты в составе клеточных мембран. Сегодня наиболее изучены три прямых следствия такого усиления [17; ,18; 19; 20]. Во-первых, окисление тио-ловых (сульфгидрильных групп) мембранных белков; приводящее к появлению дефектов в мембране клеток, и митохондрий, увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ и к повреждению клетки. Во-вторых, накопление продуктов липопероксидации, повышающих проницаемость липидной фазы мембран, что обусловливает, в частности, утрату способности митохондрий к синтезу АТФ и, соответственно, приводит к развитию энергетического дефицита. Третьим (и возможно самым важным результатом избыточной активации ПОЛ) является уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны под действием разницы потенциалов, создаваемой самой мембраной.

Очевидно, что несостоятельность в обеспечении матричной- (для белковых молекул, ферментов, ионных каналов, и рецепторов) и барьерной (для ионов и гидрофильных молекул) роли липидным; бислоем мембраны, служит важным звеном нарушений различных клеточных функций. Для клеток иммунной системы подобные нарушения могут реализовываться путем ограничения пространственного-перемещения Т-клеточного рецептора (TCR) в процессе формирования иммунного синапса [235],. или через изменение структуры, липидных микродоменных рафт на плазматической мембране - своеобразных кластеров, отвечающих за сборку сигнальных комплексов-и передачу сигналов с поверхности внутрь клетки [112]. В этой связи обращают на себя внимание данные о важной роли полиненасыщенных жирных кислот - субстрата ПОЛ в пролиферативном ответе лимфоцитов на митогенный стимул [151; 286]; а также о значении уровня содержания этих кислот (арахидоновой или линоленовой) в экспрессии рецепторов хомминга, обеспечивающих распределение лимфоцитов в лимфоидных органах при сингенном переносе [241]. Негативное влияние на функциональную активность лимфоцитов установлено и для продуктов ПОЛ: Так, M.G. Goodman, W.O. Weigie (1980) было продемонстрировано полное подавление пролиферации В-лимфоцитов и их способности к продукции Ig в присутствии гидроперекиси арахидоновой кислоты. По данным Г.Б. Афониной (1989)-повышение уровня конъюгиро: ванных диенов в, мембране лимфоцитовшри'активации ПОЛ-снижало« экспрессию рецепторов на. поверхности Т- и В1- лимфоцитов, что проявлялось снижением их чувствительности к ацетилхолину и способности к розеткооб-разованию.

Влияние АФК и продуктов липопероксидации на функциональную активность лимфоцитов может опосредоваться их участием в сигнальных путях, исходящих не только от рецепторов к гормонам и нейромедиаторам, но и непосредственно от антигенраспознающих рецепторов [186]. В этом случае механизм влияния связан с воздействием на пути трансдукции сигнала от этих рецепторов, осуществляемый при участии белка Src, выполняющего адаптерную. функцию между концевыми цитоплазматическими доменами TCR и BCR - молекулами ITAM' (immunoreceptor thyrosine-based activation motif) и MAP- киназным модулем [121]. Негативное влияние на формирование иммунного ответа под влиянием гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот может обусловливаться-подавлением последними экспрессии молекул адгезии: VCAM, ELAM [64], что- снижает возможность клеточной- кооперации.

Продукты ПОЛ; в' частности биологически активные альдегиды (алкена-ли) способны также модулировать хемотаксис и метаболическую активность гранулоцитов, усиливая эти процессы в низких и ослабляя — в высоких концентрациях [64].

Еще одним следствием избыточной активации ПОЛ является запуск апоптотического каскада с участием его «митохондриального» механизма, который-реализуется и в лимфоцитах, в частности, под действием глюкокор-тикоидов [22]. Начальная стадия развертывания этого процесса связана с отделением цитохрома С от внутренней мембраны митохондрий в связи с утратой молекулярного взаимодействия с кардиолипином, подвергшимся в условиях активации ПОЛ окислительной модификации [59]. Последующее повышение проницаемости внешней мембраны-митохондрий при участии про-апоптотических белков семейства* Bcl-2 (Вах, Bad, Bäk и т.д.), вступающими в соединение с ANT (adenin-nucleotid-translocator), встроенным во внутреннюю мембрану, приводит к выходу цитохрома С в цитозоль и его участию в формировании апоптосомы — APAF-1 (апоптотический протеазоактивирую-щий: фактор). Дальнейшее развитие событий связано с активацией каспазы 9 и трансдукцией сигнала на терминальную каспазу 3. Наряду с цитохром G — обусловленным апоптозом, увеличение проницаемости митохондрий включает еще один механизм апоптоза, осуществляемый при участии AIF-1 (арор-tosis induciry factor 1),. представляющего собой самостоятельный киллерный фактор, дублирующий действие цитохрома С т каспаз при их блокировании [21].

Как известно^ [139; 140; 142] наибольшую чувствительность к апоптозу проявляют незрелые Т- и B-клетки, локализующиеся? преимущественно в центральных органах системы иммуногенеза. Тем не менее, высокая чувствительность» обнаружена и у отдельных субпопуляций периферических лимфоцитов. Так, Е. Marinova et al. (2006) показано, что GD44 С0451Ю+С057' Т-лимфоциты, составляющие основную субпопуляцию Т-хелперов зародышевых центров; подвергаются ¡in vivo апоптозу, который по ответу на апоп-тоз-индуцирующие сигналы, и чувствительность, к. ингибиторам каспаз схо-< ден с апоптозом незрелых тимоцитов. Это означает, что роль апоптотическо-го механизма, индуцируемого MTX вчслеточном опустошении системы иммуногенеза может реализовываться не только на уровне: ее центральных, но и периферических органов.

Такимг образом, продемонстрированная- в ряде исследований способность MTX инициировать оксидативный стресс можно расценивать как значимый механизм цитотоксичности химиопрепарата, определяющий установленные в работе структурные и функциональные, нарушения иммунной системы при его применении. Данный механизм, в частности, мог существенно дополнить антипролиферативный эффект MTX, реализуясь,, однако, не. на уровне блокады путей синтеза ДНК, а через ее прямое оксидативное повреждение в лимфоцитах [251], или ингибирование- основных, сигнальных путей, регулирующих процесс их пролиферации. Последний эффект в первую очередь имеет отношение к МАР-киназному каскаду. Его мобилизация, закономерно наблюдающаяся в присутствии АФК, может быть нивелирована окислительной инактивацией факторов транскрипции (АР-1 и NF-kB), находящихся под контролем этих киназ. Такая инактивация возникает, когда окислительный стресс сопровождается более высоким уровнем подъема АФК, чем тот, который требуется для мобилизации регуляторных систем [110]. Тем более, что в этих условиях возможно формирование своеобразного «порочного круга», обусловливающего нарастание оксидативного стресса, через лимитирование участия АР-1 в. активации механизмов антиоксидантной защиты.

Таким образом, начиная с определенного порогового уровня АФК, мобилизация защитных систем клетки ослабевает, тогда как стимуляция апоп-тоза продолжает нарастать. Очевидно, что реализация этих разнонаправленных процессов играет значимую роль в клеточном опустошении органов сисг • темы иммуногенеза и в развитии иммуносупрессии в условиях применения MTX.

Несостоятельность регуляторных механизмов при действии MTX могла иметь определяющее значение и в установленной в работе депрессии продукции цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-12, уИФН), обусловленной нарушением транс-дукции сигналов при участии факторов транскрипции STAT (ИЛ-4, ИЛ-12), а также STAT и Nf-kB (уИФР). То обстоятельство, что более выраженное и продолжительное снижение цитокинового ответа на митогенную стимуляцию затрагивало ИЛ-12 и уИФН по сравнению с продукцией ИЛ-4, свидетельствует о различной чувствительности клеток-продуцентов этих цитокинов, к действию MTX. В свою очередь, различия в такой чувствительности могли быть обусловлены особенностями экспрессии'фолатных рецепторов на поверхности данных клеток: макрофагах и ДК (для ИЛ-12), ТхГ (для уИФН) и Тх2 (для ИЛ-4). Правомочность подобного предположения подтверждается сведениями [291] о неравномерном распределении одного из подтипов фо-латных рецепторов (FR-4) на мембранах регуляторных Т-лимфоцитов, позволяющим идентифицировать по этому признаку их различные субпопуляции. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что наибольшую чувствительность к действию MTX проявляет Тх1-субпопуляция лимфоцитов. Существенно, что это заключение, основывающееся на данных о продукции цитокинов, находится в полном соответствии с результатами оценки влияния MTX на способность донорских спленоцитов к индукции РТПХ.

Разумеется, МТХ-индуцированная иммуносупрессия in vivo не ограничивается прямым воздействием цитостатика лишь на систему иммунитета. В условиях целостного организма основу такой супрессии составляют и другие механизмы, связанные, в частности, с общетоксическим эффектом MTX при использованной дозе (10 мг/кг) и способе его применения. Мы полагаем, что следствием общетоксического влияния явилось нарушение сформировавшегося вакцинального иммунитета ввиде снижения уровня антител к столбнячному анатоксину у иммунизированных животных после воздействия MTX. Очевидно, что при таком воздействии реализуются и другие факторы, способные оказать супрессивный эффект на систему иммуногенеза. В этом отношении несомненного внимания заслуживает оценка состояния гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАКС) и ее участия в развитии «химического стресса». Тем более, что глюкокортикоиды способны не только индуцировать апоптоз, но и повышать конститутивную продукцию су-прессорного цитокина (ИЛ-10) моноцитами [236].

Возвращаясь к вопросу о механизме (ах) протективного влияния милиацина, мы полагаем, что это влияние обусловлено его антиоксидантными свойствами. В этой связи важно отметить, что антиоксидантная активность является одним из достаточно распространенных проявлений биологических свойств тритерпеноидов [158; 295], которая?определена у ряда из них, включая агликон глицирризина: 18р-глицирретиновую кислоту [195], каффеоловую кислоту [150], азиатскую кислоту [179], уросоловую и олеаноловую кислоты [220; 251], дипептид бетулоновой кислоты [124] и др. Проявлением такого защитного влияния служит уменьшение редукции внутриклеточного пула восстановленного глутатиона и лимитирование падения активности ферментных систем антиоксидантной защиты: супероксиддисмутазы, катала-зы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы [225; 229]; снижение накопления в клетке вторичных радикалов (липидных перекисей) и диеновых конъюгатов [259]; уменьшение генерации и активности супероксид-анион-радикала: Ог [195; 279] и гидроксильного радикала: ОН" [178]. О потенциальной мощности антиоксидантной активности тритер-пеноидов свидетельствует возможность проявления их ингибирующего действия даже в отношении АФК (Ог и Н2О2), индуцированных в лейкоцитах при стимуляции последних форбол-12-миристат-ацетатом [204].

Исследование механизмов антиоксидантного действия тритерпеноидов показало, что они могут быть связаны с индукцией в клетке ARE (antioxidant responsive-element). Такая способность установлена, в частности, для синтетического аналога олеановой кислоты — CDDO [216; 283; 300; 301; 302], активирующего редокс-чувствительный фактор транскрипции Nrf-2 (nuclear respiratory factor). В основе этой активации лежит снижение под влиянием CDDO ингибирующего действия негативного регулятора ARE - Кеар 1 [302], ассоциированного с Nrf-2 в редокс-чувствительный комплекс, функционирование которого зависит от соотношения окисленных и восстановленных тио-лов. Диссоциация данного комплекса служит необходимым условием для транслокации молекул Nrf-2 в ядро и последующего связывания с рецептор-ным сайтом (ARE) в ДНК, усиливающим транскрипцию соответствующих генов. Сегодня ARE рассматривают как важный регулятор редокс-баланса в клетках и индуктора защитных механизмов при окислительном стрессе [60]. Белки многих, контролируемых ARE генов относятся, к числу выполняющих или непосредственно защитную роль (микросомальная- гемооксигеназа, тиоредоксин, селеновая глутатионпероксидаза-2, глутатионредуктаза), или восполняющих уровень расходуемых низкомолекулярных интермедиатов (цис-тин-глутамат-транспортная система), или обеспечивающих репаративную функцию важнейших макромолекул в клетке в ситуациях с нарушением клеточного редокс-баланса. Последнее, в частности, проявляется участием системы Nrf-2 - ARE в регуляции транскрипции митохондриальной ДНК, её стабилизации и инициации репликации в условиях действия эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [26]. Именно поэтому фактор Nrf-2 и контролируемая им сеть ARE-регулирующих генов рассматривается как универсальная система клеточной защиты в условиях оксидативного стресса.

Таким образом, важнейшей особенностью антиоксидантной защиты при участии системы Nrf-2 — ARE является её комплексный характер, не ограничивающийся повышением уровня антиоксидантных механизмов или нейтрализацией возникающих в ходе свободнорадикального окисления» токсичных соединений. Эта защита осуществляется на разных уровнях, с включением-разных структур, в том числе не связанных с прямым антиоксидантным действием [60].

Что касается антиоксидантной активности милиацина, то она выражается в его способности ограничивать выраженность перекисного окисления ли-пидов (в условиях стресса) и, соответственно, обеспечивать менее значимое накопление в крови продуктов липопероксидации, способных вовлекаться в дальнейшие реакции окисления in vitro при использовании двухвалентного железа [75; 76; 115]. Однако этот эффект не был связан с отменой или с ослаблением генерации АФК, индуцированной в модельных экспериментах перекисью водорода [76; 77]. Это означает, что в отличие от CDDO антиокси-дантное действие милиацина не связано напрямую с системой-Nrf-2 - ARE, а реализуется при участии других механизмов. Одним из таких механизмов может служить повышение устойчивости клеточных мембран к повреждающему действию АФК и продуктам липопероксидации за счет встраивания милиацина (в силу его гидрофобности) в липидный бислой мембраны. Очевидно, что такое встраивание способно экранировать полиненасыщенные жирные кислоты от атаки радикал-частицами и (или) укреплять прочность упаковки фосфолипидов мембран, противодействуя детергентоподобным эффектам. Последнее было продемонстрировано A.B. Кирилловой (2004), установившей защитное влияние милиацина на развитие гуморального иммунного ответа в условиях действия на организм детергента (твина 21; 1,6 х 10"6 моль/кг). Мембранотропное действие милиацина способно определять его протекцию и в отношении дексаметазониндуцированного апоптоза лимфоцитов [74], поскольку апоптогенное влияние глюкокортикоидов также связано с реализацией оксидативного стресса [34; 268].

Таким образом, оказывая модифицирующее воздействие на липидные компоненты мембран, милиацин выступает как «структурный мембранопро-тектор», способный в условиях генерации АФК предупреждать (ограничивать) развитие апоптоза иммунокомпетентных клеток и поддерживать жидкостные характеристики их мембран на уровне, обеспечивающем необходимую активность мембраносвязанных процессов.

В рамках данной работы определенный интерес представляет вопрос о влиянии милиацина и на процесс восстановления клеточных и функциональных параметров иммунной системы после воздействия MTX. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование тритерпеноида обусловливало не только меньшую продолжительность этого процесса, но и проводило к повышению некоторых показателей: гиперцеллюлярность костного мозга, усиление нейтрофилопоэза, лимфопоэза, продукции ИЛ-4. При анализе такой ситуации безусловного внимания заслуживает оценка изначальной выраженности формирующихся нарушений, которые у животных, подвергавшихся* воздействию MTX без последующего применения милиацина, были более глубокими, чем в условиях его применения. Соответствующий вывод заключается в том, что меньшая степень депрессии исследуемых показателей определяла в последующем и меньшую продолжительность их восстановления. Вместе с тем интенсивность подобной «регенерации» при использовании милиацина могла обусловливаться и непосредственным влиянием тритерпеноида на восстановление клеточных популяций в органах системы иммунитета и ее функциональную активность. В пользу этого свидетельствуют данные о способности милиацина стимулировать лимфопоэз, увеличивать целлюлярность лимфоидных органов (тимуса и селезенки у крыс и селезенки у мышей), повышать уровень гуморального и клеточного (ГЗТ) иммунного ответа [43; 44; 46; 50; 72; 73]. Исследование механизмов, посредством которых милиацин вызывает эти сдвиги, позволило связать их с его способностью ослаблять антигениндуцированную супрессию и усиливать продукцию цитокинов — ИЛ-1 [113]. Существенно, что реализация этих механизмов могла быть также обусловлена мембранотропными свойствами тритерпеноида. Такое заключение находится в русле современных представлений при оценке влияния- тритерпеноидов, на систему иммунитета [57; 93; 94; 297], исходящих из их способности вызывать изменения структурно-функциональных свойств клеточных мембран. Модифицирующее действие тритерпеноидов на клеточные мембраны приводит к изменению ионного го-меостаза, к увеличению транспорта, в первую очередь ионов и малых молекул, к изменению вязкости мембран, что, очевидно, индуцирует трансмембранные сигналы, модулирует активность клеточных сигнальных систем (JNK, ERK, Nf-kB), ответственных за деление, дифференцировку и апоптоз иммунокомпетентных клеток [292; 305]. Вопрос о проявлении таких эффектов при использовании милиацина остается открытым и может быть предметом дальнейших исследований.

В целом, полученные в работе данные о протективном влиянии милиацина в отношении:лимфотоксичности МТХ и его ингибирующего влияния на I функциональную активность иммунной системы определяет новые возможности ограничения иммунодепрессивного эффекта цитостатической'терапии, повышение эффективности иммунореабилитации после ее проведения, а также поддержание иммунологической и эпидемиологической эффективности вакцинопрофилактики при экологическом неблагополучии, обусловленном заражением среды химическими факторами.