Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Гепатопротекторная активность милиацина при метотрексат-индуцированном повреждении печени (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Калинина Ольга Вячеславовна

ГЕПАТОПРОТЕКТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ МИЛИАЦИНА ПРИ МЕТОТРЕКСАТ - ИНДУЦИРОВАННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 Патологическая физиология 14.01.12 Онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 4 ЯНВ 2013

Москва - 2013

005048703

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Оренбург.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник отдела экспериментальной хирургии НИИ фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения России

доктор медицинских наук, профессор, профессор отделения химиотерапии гемобластозов ФГБУ "Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина" РАМН

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов.

Защита диссертации состоится 4 февраля 2013 г. на заседании Диссертационного Совета Д.208.072.05 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан 29 декабря 2012 г.

Фролов Борис Александрович Штиль Александр Альбертович

Савчук Вера Игоревна

Ларионова Вера Борисовна

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук, доцент

Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Структурно-функциональные поражения печени, наряду с нефротоксичностью и угнетением костно-мозгового кроветворения, являются наиболее распространенным и тяжелым осложнением противоопухолевой терапии (O.P. Грек с соавт., 2002; О.П. Молодых с соавт., 2006; А.А. Иванова, 2009; G. Ramadori, S. Cameron, 2010), что служит серьезным препятствием к достижению должного лечебного эффекта. В связи с этим изучение механизмов медикаментозных поражений печени и разработка на этой основе подходов к предупреждению и (или) ограничению таких поражений является одной из актуальных задач, имеющих отчетливое прикладное значение (Т.А. Богуш с соавт., 2002; Ю.А. Кинзирская с соавт., 2003; И.А. Куркумов, 2010; L. Rubbia-Brandt, 2010; P. Pessaux, 2010).

Это положение в полной мере относится и к метотрексату, химиотерапевтический эффект которого обусловлен антиметаболической активностью, тогда как его гепатотоксичность связывают с интенсификацией процессов свободно-радикального окисления (R.M. Babiak et al., 1998; N. Jahovic et al., 2003; A. Cetinkaya et al., 2006). Исходя из этих представлений, очевидно, что протекция гепатотоксического действия метотрексата может быть эффективной на основе использования средств, обладающих антиоксидантной активностью. В настоящее время в арсенале таких средств все более заметное место занимают тритерпеноиды и их производные (O.P. Грек с соавт., 2005; J. Gao et al., 2004; R, Saravan et al., 2006), демонстрирующие способность ограничивать повреждения печени при действии различных токсических факторов (Н.А. Жукова с соавт., 2005; X. H. Tang et al., 2005; И.В. Сорокина с соавт., 2006; S. Kinoshita et al., 2007; Е.Д. Гольдберг с соавт., 2008), в том числе - антибластомных лекарственных препаратов (C.B. Позднякова, 2007; И.В. Шарапов, 2009). К числу таких веществ относится и милиацин - пентациклический тритерпеноид растительного происхождения, защищающий гепатоциты при отравлении CCl^ (М.А. Павлова, 1984) и проявляющий мембранопротекторную активность (А.Н. Чернов с соавт., 1983; Б.А. Фролов, А.В. Кириллова, 2011). Вместе с тем вопрос о защитном влиянии милиацина в отношении гепатотоксичности метотрексата оставался открытым.

Актуальность данной работы определяется тем, что до начала ее выполнения не была проведена оценка защитного эффекта милиацина при метотрексат -индуцированном повреждении печени; не было установлено влияние тритерпеноида на фармакокинетику метотрексата и его противоопухолевую активность; не был определен механизм протективного действия милиацина, связанный с его влиянием на

интенсивность окислительного стресса и экспрессию генов, контролирующих продукцию про- и антиоксидантных факторов. Отсутствие ясности в этих вопросах не позволяло оценить перспективы использования милиацина в качестве гепатопротектора, что с учетом его доступности, крайне низкой токсичности (LD50 > 1000 мг/кг) и отсутствия побочных эффектов в широком диапазоне доз (JI.E. Олифсон с соавт., 1991) могло бы иметь важное прикладное значение.

Цель настоящего исследования - экспериментальная оценка милиацина как гепатопротектора при токсическом поражении печени метотрексатом.

Основные задачи исследования

1. Изучить влияние милиацина на структурно-функциональную реорганизацию печени и динамику восстановления органных нарушений у мышей, подвергшихся воздействию метотрексата.

2. Провести сравнительный анализ эффективности защитного действия милиацина и официального гепатопротектора - карсила.

3. Определить особенности фармакокинетики метотрексата в условиях его сочетанного применения с милиацином.

4. Оценить влияние милиацина на противоопухолевый эффект метотрексата (на модели эпидермоидной карциномы легких Льюис).

5. Установить механизм протективного действия милиацина путем изучения его влияния на интенсивность окислительного стресса и экспрессию генов (сур 2е1 и glured), контролирующих редокс-баланс клетки, в условиях применения метотрексата.

Научная новизна. Впервые определено протективное влияние милиацина в отношении гепатотоксичности метотрексата. В экспериментах на мышах (СВА х С57В1б)р! установлена способность тритерпеноида ограничивать метотрексат-индуцированные дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, ослаблять гиперферментемию (АлАТ, АсАТ, у-ГТ), снижать частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменять депрессию клиренсной функции печеночных макрофагов. Показан позитивный эффект милиацина на процесс восстановления структурных повреждений печени и нормализацию показателей пигментного обмена.

Установлено, что гепатопротекторная активность милиацина не связана с нарушением фармакокинетики метотрексата и с ослаблением его антибластомной активности. Впервые показана способность милиацина повышать терапевтическую эффективность метотрексата по показателям торможения роста опухоли и увеличения продолжительности жизни животных с перевиваемой карциномой Льюиса. Впервые

Теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о диапазоне протективного влияния милиацина и раскрывают новые аспекты его биологического действия. Отсутствие влияния милиацина на фармакокинетику метотрексата исключает возможность рассмотрения данного механизма в реализации протективного действия тритерпеноида. Сведения о способности милиацина отменять метотрексат - индуцированную экспрессию гена прооксидантного белка сур 2е1 и восстанавливать экспрессию гена, кодирующего один из ведущих факторов антиокси-дантной защиты glured, существенно углубляют знания о механизмах реализации ан-тиоксидантного эффекта тритерпеноида.

Практическое значение работы. Результаты работы определяют новые возможности ограничения побочного действия цитостатической терапии и повышения эффективности реабилитации больных после ее проведения на основе использования милиацина или его аналогов. Установленные в работе способность милиацина повышать противоопухолевую активность метотрекста и отсутствие влияния тритерпеноида на фармакокинетику химиопрепарата позволяют рассматривать тритерпеноид в качестве эффективного гепатопротектора. По материалам работы получен патент на изобретение РФ № 2411947 «Средство, повышающее противоопухолевый эффект метотрексата».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин оказывает защитный эффект при метотрексат - индуцированном поражении печени, предотвращая падение массы органа, минимизируя повреждения гепатоцитов, снижая частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменяя депрессию клиренсной функции печеночных макрофагов и ускоряя восстановление структуры органа.

2. Протективное влияние милиацина не связано с нарушением фармакокинети-ки метотрексата и со снижением его противоопухолевой активности

3. Милиацин повышает терапевтическую эффективность метотрексата по показателям торможения роста опухоли и продолжительности жизни животных.

4. Механизм протективного влияния милиацина обусловлен его способностью предотвращать окислительный стресс, индуцируемый метотрексатом и нормализовать экспрессию генов сур 2е1 и glured в печени, контролирующих редокс баланс клетки.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, Оренбург, 2005, 2011; региональной научно-практической конференции «Ак-

туальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии», Оренбург, 2006; V и IX конференциях иммунологов Урала, Оренбург, 2006; Челябинск, 2011; IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Нижний Новгород ,2010; III Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2011; XI Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2011.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 15 научных работах, в том

числе в 5 статьях, опубликованных в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент на изобретение РФ № 2411947 «Средство, повышающее противоопухолевый эффект метотрексата».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, главу «Материалы и методы исследования», 3 главы собственных исследований, обсуждение, выводы и указатель литературы, включающий 155 отечественных и 119 зарубежных источников.

Иллюстрации представлены 11 таблицами и 24 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 696 мышах-самцах (СВАхС57В16)Рь 63 мышах -самцах гибридов I поколения ВОР, (С57В1/6 х ЭВА/2) массой 18-22 г, а также на 84 крысах-самцах Вистар массой 350-400 г, поставленных из питомника АМН РФ «Столбовая». Животных содержали при комнатной температуре, двухразовом питании натуральным кормом по суточным нормам при неограниченном доступе к воде. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985). Эвтаназию мышей осуществляли церви-кальной дислокацией или декапитацией под эфирным наркозом; выведение из эксперимента крыс - передозировкой наркотизирующего препарата.

Метотрексат (МТХ) австрийской фирмы-производителя «ЕЬеуе» вводился вну-трибрюшинно однократно в дозе 10 мг/кг массы тела животного.

Милиацин, получен из кристаллов просяного масла, выпадающих при его от-

стаивании на холоду и очищен перекристаллизацией из хлороформа. На основании изучения масс-, ЯМР- и ИК-спектров, хроматографической однородности и качественного состава (Л.Е. Олифсон с соавт., 1991) подтверждена принадлежность используемого вещества к группе пентациклических тритерпеноидов, имеющих структуру 3-Р-метоксигерманицена (3-р-метокси-Д18-олеанен). Рис. 1.

Н|С СЛ1

HIC * "с Hl

Рис.1. Химическая структура пентациклического тритерпеноида - милиацина

Применение милиацина осуществлялось путем его трехкратного внутрибрю-шинного введения в разовой дозе 2 мг/кг массы тела животных на протяжении 3 дней: через 1 час, 24 и 48 часов после инъекции MTX.

Изучение гепатопротекторного влияния милиацина проведено на 4 группах мышей (СВА х CsyBlfJFj: I-интактные (положительная группа сравнения); II-получавшие внутрибрюшинно однократно MTX - 10 мг/кг (отрицательная группа сравнения); Ш-получавшие MTX с последующим трехкратным введением растворителя для милиацина: твин 21 в конечной концентрации 1,6 х 10"7 моль/кг (контроль); IV-получавшие MTX с последующим трехкратным введением милиацина - 2мг/кг (опыт). Животных II, III и IV групп выводили из эксперимента на 4, 7, 10, 14 и 21 сутки после введения MTX. В эти же сроки осуществляли эвтаназию интактных мышей.

Печень животных фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующим изготовлением по стандартной методике гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином-эозином. Морфологический анализ препаратов выполняли при увеличении микроскопа в 600 раз, а морфометрию - в 400 раз, определяя плотность гепато-цитов и количество двуядерных клеток по результатам подсчетов в 10 выборочных полях зрения (окулярная сетка 70x70 мкм) (Г.Г. Автандилов, 1973).

Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и у-глутамилтранспептидазы (у-ГТ) в сыворотке крови исследовали на спектрофотометре GENEZIS 5 (длина волны 340 нм), или на автоматическом биохимическом анализаторе Vitalit 1000, используя стандартные наборы реактивов CORMAY.

Желчные пигменты в моче определяли полуколичественным методом с помощью тест-полосок IKTO-PHAN (Lachema, Чехия), или Радуга Пи-10 (Россия).

Оценку клиренса крови проводили на наркотизированных (уретан, 1г/кг) крысах Вистар после введения в бедренную вену (0,26 мл/100 г) суспензии туши на желатине с последующим забором крови из предварительно катетеризированной яремной вены: через 15 и 30 секунд, а также через 1, 3, 6, 9 и 12 минут после введения туши. Наличие туши в пробах определяли на спектрофотометре APEL PD-303 UV при длине волны 650 нм. Результат выражали в процентах от исходного количества туши, приняв за нулевую точку показатель экстинции плазмы через 15 сек после введения туши.

Общетоксическое действие MTX и защитный эффект милиацина изучали по показателям падения массы тела, массы печени, тимуса и селезенки, а также по содержанию гемоглобина в крови в указанные сроки у животных всех групп. Содержание гемоглобина оценивали унифицированным гемиглобинцианидным методом (Р.П. Золотницкая с соавт., 1987) на СФ-46 при длине волны 500-560 нм, стандартизируя результаты по калибровочному раствору гемиглобинцианида «Имуна» (Чехия).

Оценка эффективности гепатопротекторного влияния милиацина проведена путем сопоставления защитного действия тритерпеноида и лекарственного препарата - карсила при MTX - индуцированной гепатотоксичности. Критериями гепатотоксич-ности MTX и защитного эффекта применяемых веществ служили показатели фермен-темии (АлАТ, АсАТ) и пигментного обмена (уробилиноген и билирубин в моче).

Влияние милиацина на противоопухолевую эффективность MTX изучено на мышах - BDF] (С57В1/6 х DBA/2) на модели перевиваемой эпидермоидной карциномы легких Льюис - LLC. Для трансплантации опухоли использован штамм LLC третьего пассажа (лаборатория экспериментальной терапии метастазов НИИ ЭДиТО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН; руководитель - профессор З.С. Смирнова). Эксперименты проведены на четырех группах животных с трансплантированными опухолевыми клетками: I - нелеченные; II - получавшие через 48 часов после инокуляции опухоли однократно MTX (10 мг/кг); III - получавшие MTX с последующим трехкратным введением растворителя милиацина; IV - получавшие MTX с последующим трехкратным введением милиацина. Милиацин и растворитель вводили внутрибрюшинно через 60 минут, 24 и 48 часов после введения MTX. Критериями оценки противоопухолевого эффекта служили показатели (Е.М. Трещалина с соавт., 2005): торможения роста опухоли (ТРО,%) и увеличения продолжительности жизни (УПЖ,%) животных. Объем опухоли измеряли на 5, 7, 12, 17 и 19 сутки после введения MTX и оценивали ТРО по формуле: ТРО (%) = [(Ук - Vo)/ Ук] х 100, где Ук - средний объем (мм3) опухолей в

нелеченной группе (I), Vo - средний объем опухолей (мм3) в сравниваемых леченных группах (II, III, IV). УПЖ оценивали во временном диапазоне (23-41 сутки), соответствующем срокам начала и завершения гибели нелеченых животных от опухолевого процесса. УПЖ (%) = [(СПЖо - СПЖк)/ СПЖк] х 100, где СПЖк - средняя продолжительность жизни животных в нелеченной группе, СПЖо - средняя продолжительность жизни животных в сравниваемых леченных группах. Минимальные критерии активности: ТРО > 50%; УПЖ > 25%.

Фармакокинетические параметры MTX изучали в свободных от белка образцах плазмы крови и супернатантах гомогенатов печени и селезенки на хроматографе Gilson с ультрафиолетовым детектором при длине волны 313 нм. Колонка - Zorbax С8, 4,6x250 мм, подвижная фаза - ацетонитрил: вода (10 : 90), скорость потока - 1 мл/мин, объем анализируемой пробы - 50-100 мкл. Время удерживания MTX (RT- Retention Time) - 10-11 мин, чувствительность метода - 10-50 нг/мл образца. Анализ образцов осуществляли по величине площади пика (S) MTX на хроматограмме с помощью калибровочной кривой с применением программы STATGRAPH. Неизвестная концентрация (Сх) MTX в образце определялась по уравнению: Сх=0,055 + l,004xl0"sS. Фармакокинетический анализ проведен с применением программы WinNonLin. Данный раздел работы выполнен на базе лаборатории молекулярно-биологических методов исследования (руководитель - профессор A.C. Ягубов) и лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток (руководитель - доктор медицинских наук A.A. Штиль) ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

При изучении влияния милиацина на окислительный стресс в ткани печени животных, подвергнутых воздействию MTX, дополнительно использованы еще две группы мышей: получавших только растворитель (группа V) или только милиацин (группа VI). Маркером окислительного стресса служили продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, определяемые в гомогенатах печени с использованием стандартных реактивов ТБК - АГАТ («Агат-Мед», Россия) на спектрофотометре APEL PD-303 UV при длинах волн 535 нм и 570 нм. Расчет ТБК-РП проводили в мкмолях на 1 г общих липидов (о.л.), концентрацию которых определяли спектрофо-тометрически с использованием реактивов «Lachema» (Чехия). Исследования выполнены на 4 сутки после введения MTX.

На этом же сроке исследовалась экспрессия генов cyp-2el и glured в ткани печени животных I, II, III и IV групп. кДНК получали в реакции обратной транскрипции (реактивы Fermentas, Литва) со «случайными» гексануклеотидами («Хеликон», Россия). Экспрессию генов cyp-2el и glured определяли в полимеразной цепной реакции

(ПЦР). Праймеры синтезированы фирмой «Хеликон» (Россия), остальные реактивы приобретены в фирме Fermentas. ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе «Терцик» («ДНК-технологии», Россия) по следующей схеме: денатурация для первого цикла - 1 мин. (94°С), для каждого последующего - 10 сек. (94° С), отжиг праймеров - 10 сек. (60°С), элонгация - 30 сек. (72°С). Число циклов ПЦР установлено в предварительных опытах по линейному приращению продуктов реакции (24-27 циклов). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле (0,5 M трис-боратный буфер, рН 8,0). Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Полуколичественную оценку экспрессии генов cyp-2el и glured проводили по интенсивности полосы соответствующего продукта ПЦР, отнесенной к величине экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gapdh).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методами вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Excel, рассчитывая среднюю арифметическую, доверительный интервал и стандартное отклонение (Е.В. Гублер, А.А. Генкин, 1973; В.Ю. Урбах,1975; Г.Ф. Лакин,1990). Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стью-дента и непараметрических методов: критерия Манна-Уитни и критерия согласия Хи -квадрат Пирсона. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Гепатопротекторная активность милиацина при токсическом поражении печени метотрексатом

Установлено (табл. 1), что МТХ на 4 сутки вызывает снижение массы печени (на 34,3±3,9%) на фоне ее венозного полнокровия, очаговой дистрофии гепатоцитов с пикнотическим изменением их ядер и повышением плотности клеток (на 61,8±1,6%). В последующие сроки (7, 10 сутки) выявленные нарушения нарастали, достигая своих максимальных проявлений к 14 дню, когда дистрофия гепатоцитов приобретала диффузный характер, с обилием очагов некроза и некробиоза в сочетании со значительной мелкоочаговой паренхиматозной лейкоцитарной инфильтрацией и отеком межбалочного пространства (рис. 2Б). В этот период плотность клеточного инфильтрата была минимальной. Регенераторные изменения обнаруживались на 21 сутки в виде значимого нарастания плотности клеточного инфильтрата (на 25,9±6,1%), увеличения количества двуядерных клеток (на 44,8±4,5%) и восстановления компактного расположения гепатоцитов в центрах долек. Вместе с тем, даже к указанному сроку в печени сохранялись диффузные очаги гидропической дистрофии и очаги некроза.

Таблица 1

Влияние милиацина на весовые и клеточные показатели печени мышей (СВА х С57В16)Р1) подвергнутых воздействию метотрексата

Группы животных срок после введения MTX Исследуемые показатели

Масса органа (М ± ш) мг Плотность клеток (в 1 поле зрения) Двуядерные клетки (%)

Интактные - 1232,4±62,7 (7)1 80,72+0,86 (5/50)2 7,60+0,4 (5)

MTX 4 809,0±43,7* (12) 130,62+1,30* (5/50) 7,56+0,50 (5)

МТХ+растворигель 788,0+29,0* (9) 122,44+2,90* (5/50) 7,33+0,60 (5)

МТХ+милиацин 1214,2+40,3Ло(12) 80,62±0,80io (5/50) 6,23+0,30* (5)

MTX 7 1106,0+44,7(20) 95,22+1,50*(5/50) 4,10+0,10*(5)

МТХ+растворгаель 1127,7±55,1(12) 93,16+2,40*(5/50) 4,05±0,40*(5)

МТХ+милиацин 1199,9+23,3(15) 82,20+0,604 "(5/50) 6,20+0,32*л°(5)

MTX 10 1360,0+32,4(15) 69,56+0,64*(5/50) 5,0+0,30*(5)

МТХ+раствср петь 1331,6+64,3(15) 67,20+1,45*(5/50) 4,73+0,45 *(5)

МТХ+милиацин 1297,2+39,4(13) 77,48+1,10*Ло(5/50) 6,60+0,40л°(5)

MTX 14 1351,8+60,0(13) 61,72±1,70*(5/50) 5,52+0,50*(5)

МТХ+растаоргаель 1178,8+37,5(11) 64,26+2,80*(5/50) 5,48±0,20*(5)

МТХ+милиацин 1250,4+74,9(8) 77,12+l,30*io(5/50) 6,50+0,50(5)

MTX 21 1166,8+45,9(12) 101,60+4,89*(5/50 11,0+0,34*(5)

МТХ+растворитель 1459,6±31,3*(12) 98,0±2,00*(5/50) 10,14±0,50*(5)

МТХ+милиацин 1346,8±20,9Д(12) 85,0±2,15д (5/50) 8,78±0,30*До(5)

Примечание: в скобках указано количество животных; в числителе указано количество животных, в знаменателе - количество исследованных полей зрения;

"-достоверность с группой I (при р<0,05); л-достоверность между группами IV и II (при р<0,05); ° -достоверность между группами IV и III (при р<0,05).

Применение растворителя на фоне введения MTX не сказывалось на выраженности и динамике выявленных изменений массы органа, а также его морфометриче-ских (табл. 1) и морфологических (рис. 2В) параметров. В противоположность этому, милиацин предотвращал снижение массы органа и значимые изменения плотности клеточного инфильтрата на протяжении первых 7 суток наблюдения. Структурные нарушения печени у данной группы мышей также выявлялись на 4 сутки, но были минимальными и характеризовались наличием единичных гепатоцитов в состоя-

Рис. 2. Микроструктура печени исследуемых групп мышей (CBAxCsvBI^Fj на 14 сутки эксперимента (окраска гематоксилин-эозин). Увеличение (хбОО).

А) интактные; Б) MTX; В) МТХ+ растворитель; Г) МТХ+милиацин. Дистрофические (1) и некротические (4) изменения в ткани печени животных, получавших MTX [Б] и МТХ+растворитель [В]. Гидропическая дистрофия отдельных гепатоцитов (1) в сочетании с единичными микронекрозами (4) при сохраненной микроструктуре органа и его балочного строения у животных, получавших МТХ+милиацин [Г].

нии гидропической гидратации (рис 2Г). К 7 суткам эта дистрофия приобретала очаговый, а к 14 суткам - диффузно-очаговый характер в сочетании с единичными очагами микронекрозов и лейкоцитарной инфильтрации. К 21 суткам структура печени у мышей данной группы восстанавливалась при возрастании количества двуядерных гепатоцитов (на 15,5±3,5%).

В полном соответствии с полученными данными находились и результаты определения ферментемии (рис. 3). MTX индуцировал резкое увеличение активности ферментов на 4 сутки после его введения с превышением значений интактных мышей в 4,45 раза (АлАТ), в 2,59 раза (АсАТ) ив 1,76 раза (у-ГТ). С 7 суток регистрировалось

интактные 4 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки Сроки наблюдения

Рис. 3 Влияние милиацина на показатели ферментемии в сыворотке крови мышей (СВА х C57BI6)F! в различные сроки после введения метотрексата

*-достоверность с группой I (при р<0,05); 4-достоверность между группами IV и II (при р<0,05); °-достоверность между группами IV и III (при р<0,05).

снижение исследуемых показателей, однако даже к 21 дню уровни активности АлАТ и АсАТ сохранялись повышенными (на 45,2±4,83% и 23,6±4,8%). Восстановление активности у-ГТ происходило в более ранний период - уже на 14 сутки наблюдения.

В группе животных, получавших на фоне введения MTX растворитель, динамика изменений активности ферментов и ее выраженность были практически идентичны установленным для животных, получавших только MTX.

Группа мышей, получавших на фоне введения MTX милиацин, характеризовалась, во-первых более медленным нарастанием активности АлАТ и АсАТ с достижением максимума не на 4, а лишь на 7 сутки; во-вторых, существенным снижением выраженности гиперферментемии, максимальный прирост которой для данных ферментов составил, соответственно, 73,7±8,6% и 28,2±8,6%; в-третьих, более быстрой нормализацией показателей ферментемии (к 21 суткам); в четвертых, отсутствием значимого повышения активности у-ГТ на всех сроках наблюдения.

Нарушения пигментного обмена под влиянием MTX проявлялись наличием прямого билирубина и уробилиногена в моче на 4 и 7 сутки у 100% животных при максимальном уровне этих пигментов на 7 сутки (рис. 4). Обратное развитие обнаруженных сдвигов протекало с 14 суток и до конца наблюдения.

14

Билирубин

интактные 4 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки интактные 4 сутки 7 сутки 14 сутки

Сроки наблюдения Сроки наблюдения

Рис.4. Влияние милиацина на частоту выявления желчных пигментов в моче и их среднее содержание у животных с положительной пробой в различные сроки после введения метотрексата. Группы животных: □ -интактные; Ei -MTX ; □ -MTX + растворитель ; 0 -MTX + милиацин ; д -достоверность между группами IV и II (при р<0,05);0 -достоверность между группами IV и III (при р<0,05).

Использование растворителя на фоне MTX не оказало сколь-либо выраженного влияния на частоту обнаружения и содержание желчных пигментов а также на их динамику. В противоположность этому милиацин демонстрировал явно выраженный защитный эффект. Последний характеризовался значительно меньшей частотой обнаружения прямого билирубина и уробилиногена в моче на всех сроках исследования и менее существенным повышением содержания в ней желчных пигментов, что наиболее отчетливо проявлялось на пике выявленных нарушений (7 сутки).

Милиацин реализовывал защитный эффект и в отношении макрофагальной системы печени восстанавливая нормальные параметры скорости очищения крови от частиц туши у животных, подвергнутых воздействию MTX, на 10 и 14 сутки после применения химиопрепарата (рис. 5).

Милиацин снижал и общетоксическое действие MTX, предотвращая падение уровня гемоглобина, массы тела, а также ограничивая снижение массы лимфоидных органов и способствуя их более быстрому восстановлению. Эти эффекты тритерпе -

10 сутки

□ I интактные а II мтх

ED III МТХ+растзоритель Ш IV МТХ+мишацин

14 сутки

Рис. 5. Влияние милиацина на МТХ-индуцированную депрессию клиренса крови крыс (Вистар)

"-достоверность с группой I (при р<0,05); "^-достоверность между группами IV и II (при р<0,05); ° -достоверность между группами III и IV (при р<0,05).

ноида могли играть позитивную роль в реализации его гепатопротекторного влияния, в частности, через поддержание уровня функционирования иммунной системы, участвующей в регуляции восстановительных процессов в печени (Б.Г. Юшков с соавт., 2006; А.Г. Бабаева с соавт., 2009).

Анализ эффективности гепатопротекторного влияния милиацина (2,0 мг/кг) в сравнении с карсилом, проведенный по показателям гиперферментемии, позволил установить, что эта эффективность не только сопоставима с аналогичным действием карсила (2 мг/кг и 6 мг/кг), но и превосходит ее по способности тритерпеноида ограничивать рост АлАТ и АсАТ под влиянием MTX (рис. 6). В отношении ограничения ед/л АлЛТ , АсАТ

интактные 4 сутки 7 сутки интактные 4 сутки 7 сутки Сроки наблюдения

Рис. 6. Влияние милиацина и карсила на показатели ферментемии

у мышей (СВА х С57В16)Р1, подвергнутых воздействию метотрексата

*-достоверность с группой I (при р<0,05); *'- (при р< 0,01); Л -достоверность с группой II (при р<0,05); (при р<0,01);0 -достоверность между группами V и III (при р<0,05); "'- (при р<0,01); п-достоверность между группами V и IV (при р<0,01.

нарушений пигментного обмена эффективность милиацина была аналогичной эффективности карсила в дозе 6 мг/кг.

2. Влияние милиацина на фармакокинетику метотрексата и его противоопухолевую активность

Изучение влияния милиацина на фармакокинетику MTX определялось необходимостью выяснения вопроса о возможной роли такого влияния как механизма про-тективного действия тритерпеноида. Были исследованы три группы животных: получавшие только MTX (I); MTX с последующим введением растворителя (II) или милиацина (III). Установлено, что фармакокинетические параметры MTX в сыворотке крови, в печени и в селезенке животных всех групп характеризовались практически одинаковыми или близкими значениями (табл. 2.).

Таблица 2.

Влияние милиацина на параметры фармакокинетики метотрексата в сыворотке и органах мышей (СВА х CsvBIeJF!

Фармакокинетические параметры Объекты исследования

Сыворотка крови Ткань печени Ткань селезенки

Группы животных

I II III I II III I II III

ТО.5 а, ч 0,05 0,05 0,05 0,36 0,32 0,44 0,19 0,17 0,17

ТО.5 р, ч 29,6 25,9 31,4 39,6 35,9 31,4 33,6 36,8 34,1

Kel, мин 0,31 0,39 0,33 0,62 0,78 0,53 0,35 0,32 0,36

MRT, ч 32,5 24,8 32,0 42,5 44,8 42,0 34,9 35,9 39,6

Vc, мл 5,0 4,5 4,6 - - - - - -

С1, мл/мин 0,25 0,27 0,24 0,05 0,07 0,04 0,14 0,08 0,06

AUC 13,5 13,1 15,3 110,0 83,3 93,4 34,5 35,7 38,6

Cmax 4,94 5,11 4,98 35,4 34,9 36,4 15,4 15,8 15,6

Тмах, ч 0,17 0,16 0,16 0,26 0,23 0,24 - - -

Примечание:

То,5а - период полувыведения, соответствующий быстрой фазе распределения препарата по органам и тканям

To.sß - период полувыведения метотрексата из организма Ке1 - константа скорости выведения

MRT - mean residence time - среднее время удерживания метотрексата в организме Vc - объем распределения

С1 - скорость выведения метотрексата из сыворотки крови

AUC - area under curve - площадь под фармакокинетической кривой, мкг/мл х ч (мкг/г х ч) Стах - максимальная концентрация метотрексата в крови и органах, мкг/мл (мкг/г) Тмах - время достижения максимальной концентрации

Полученные результаты свидетельствуют о том, что милиацин не оказывает существенного влияния на биораспределение MTX, включая ткань печени, что дает основание для заключения об отсутствии участия данного механизма в реализации гепатопротекторного действия тритерпеноида.

При изучении влияния милиацина на противоопухолевую эффективность MTX у мышей BDFj с транплантированной эпидермоидной карциномой легких Льюис (LLC) установлено, что во всех группах мышей, получавших MTX (II, III, IV), препарат вызывал замедление роста опухолей по сравнению с нелеченными животными (рис 7).

12000

f. 10000 2

=1 8000 >s" 0>

о 6000 ><

с

| 4000 а> J

§ 2000 0

5 7 12 17 19

Сутки

Рис. 7. Динамика роста опухоли LLC в исследуемых группах животных

*-достоверность с группой I (при р<0,05);А -достоверность между группами IV

и II (при р<0,05); 0 -достоверность между группами IV и III (при р<0,05).

При этом у животных, получавших только MTX (группа II), или MTX с растворителем (группа III), значимое ТРО наблюдали лишь на 5 и 7 сутки после введения MTX (ТРО = 77%, 54% и 83% , 59%, соответственно). В противоположность этому у мышей IV группы, которым вводили MTX + милиацин, значимое ТРО отмечали в течение всего периода наблюдения (ТРО = 91%, 89%, 84%, 63%, 60%, соответственно срокам измерения опухоли). Обращает внимание, что даже на 19 сутки после лечения, ТРО у мышей IV группы сохранялось высоким и соответствовало таковому у животных II и III групп на 7 сутки после введения MTX.

MTX оказывал выраженное токсическое влияние, вызывая гибель 33% мышей в

—♦— 1 группа

—> - II группа

-*- -III группа

-IV групп а

течение первых 5 суток. Введение растворителя не ослабляло токсичности MTX (гибель 27% животных). В то же время милиацин уменьшал токсическое действие химио-препарата, снижая показатель гибели мышей до 13%.

Снижение токсического действия MTX под влиянием милиацина позволило получить высокий противоопухолевый эффект у выживших мышей IV группы, продолжительность жизни которых, в среднем, на 36% была выше по сравнению с нелечеными животными (рис. 8). При этом значение УПЖ в IV (опытной) группе мышей было выше минимального статистически значимого критерия (25%). В то же время у мышей с LLC II и III групп увеличения продолжительности жизни: 9% и 0%, соответственно, не выявлено.

CVTKH

Рис. 8. Динамика гибели мышей BDFi в исследуемых группах животных с карциномой легкого LLC в интервале с 23 по 41 сутки после трансплантации опухоли

*-достоверность с группой I (при р<0,05).

Таким образом, 3-х кратное применение милиацина после введения MTX повышает противоопухолевую эффективность последнего в отношении карциномы легких LLC, снижая при этом острую летальную токсичность MTX.

3. Антиоксидантная активность милиацина как основа реализации его гепатопротекторного влияния

Заключительный раздел работы был направлен на выяснение вопроса о механизмах защитного действия милиацина в отношении MTX - индуцированной гепатоток-сичности. С этой целью было изучено влияние милиацина на индукцию окислительного стресса в печени животных, подвергнутых воздействию MTX, а также оценена роль cyp-2el и glured в реализации защитного эффекта тритерпеноида по экспрессии генов, кодирующих указанные белки.

Установлено (рис. 9), что введение MTX (группа II) вызывало значительное (в среднем в 5,7 раза) накопление продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) по сравнению с интактными мышами (группа I): с 0,11±0,015 мкмоль/г о.л. до 0,63±0,023 мкмоль/г о.л. Использование растворителя (группа III) не отменяло этого эффекта MTX: уровень ТБК-РП у данной группы превышал таковой у интактных мышей в 5,4 раза, составляя 0,59±0,046 мкмоль/г о.л.

с

ч о

3 5 S s

□ I интактные и II MTX

□ III МТХ+растворитель El IV МТХ+милиацин

О V растворитель В VI милиацин

Группы животных

Рис. 9. Влияние милиацина на содержание ТБК-реагирующих продуктов в печени мышей (СБА х C57B16)Fi, подвергнутых воздействию MTX

^-достоверность с группой I (при р<0,05); А-достоверность между группами IV и II (при р<0,05); 0 -достоверность между группами IV и III (при р<0,05).

В противоположность этому, применение милиацина на фоне действия MTX (группа IV) приводило к существенному снижению содержания ТБК-РП в печени животных до уровня (0,16±0,010 мкмоль/г о.л.), близкого к показателю у интактных мышей. Существенно, что введение растворителя (группа V) или милиацина (группа VI) животным, не получавшим MTX, не сказывалось на содержании ТБК-РП в печени по сравнению с интактными мышами (группа I). Это означает, что сам тритерпеноид не изменяет редокс-баланс интактных гепатоцитов, но протектирует его нарушения в условиях индукции окислительного стресса.

Изучение экспрессии генов (cyp-2el и glured), контролирующих синтез белков, участвующих в регуляции редокс - баланса, позволило установить ряд важных особенностей. В частности, конститутивная экспрессия гена изоформы цх Р450 cyp-2el (рис.10 А) у интактных животных (К) не выявлена. MTX вызывал ее значительную

glared

gapdh

Рис. 10. Влияние милиацина на экспрессию генов cyp-2el (А) и glured (Б) в печени мышей (СВА х С57В16) Fb подвергнутых воздействию MTX

индукцию. Такая индукция носила закономерный характер, поскольку регистрировалась у всех особей, получавших цитостатик. Использование растворителя - (МТХ+Р) не отменяло МТХ-опосредованную индукцию cyp-2el ни в одном случае. Напротив, применение милиацина на фоне MTX (МТХ+М) подавляло индуцированную экспрессию cyp-2el у 6 мышей (пробы 1-6) и значимо ослабляло эту экспрессию еще у 1 особи (проба 7). Экспрессия контрольного гена gapdh не изменялась.

При изучении экспрессии гена glured (рис. 10 Б) обнаружено, что в отличие от гена cyp-2el, он конститутивно экспрессирован у интактных мышей (К). MTX полностью ингибировал эту экспрессию у всех животных. Растворитель (МТХ+Р) не отменял ингибирующего влияния MTX. Милиацин (МТХ+М) ограничивал вызванное MTX подавление экспрессии glured, полностью восстанавливая экспрессию этого гена у 2 животных (пробы 1, 2) и частично - еще у трех (пробы 3-5).

Полученные результаты не только подтвердили способность MTX индуцировать окислительный стресс в печени и способность тритерпеноида к ограничению активации ПОЛ, но и продемонстрировали важное положение о том, что индукция окислительного стресса при действии MTX и гепатопротекторное влияние милиацина реализуются в условиях разнонаправленных изменений экспрессии генов cyp-2el и glured, контролирующих окислительно-восстановительный потенциал клетки.

Выводы

1. Однократное внутрибрюшинное введение метотрексата (10 мг/кг) мышам (CBAxCS7B16)F1 приводит к развитию токсического гепатита, проявляющегося снижением массы органа, формированием в нем дистрофических и некротических процессов, гиперферментемии (АлАТ, АсАТ, у-ГТ) и нарушением пигментного обмена. Токсичность метотрексата в отношении клеток Купфера реализуется через угнетение их клиренсной функции.

2. Динамика токсического поражения печени под влиянием метотрексата характеризуется постепенным нарастанием явлений дистрофии и некроза гепатоцитов с достижением их максимальной выраженности к 14 суткам после введения цитостати-ка. Регенераторные процессы в органе в виде возрастания числа двуядерных клеток и увеличении плоидности ядер регистрируются к концу 3 недели наблюдения. При этом нормализация активности ферментов (АлАТ, АсАТ) к указанному сроку отсутствует.

3. Милиацин в разовой дозе 2 мг/кг при трехкратном последовательном (на протяжении 3 дней) внутрибрюшинном введении после применении метотрексата ослабляет гепатотоксический эффект цитостатика, предотвращая падение массы органа, минимизируя морфологические показатели повреждения гепатоцитов, ослабляя гиперферментемию, снижая частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменяя депрессию клиренсной функции печеночных макрофагов и обеспечивая восстановление структуры печени к концу 3 недели наблюдения.

4. Гепатопротекторная эффективность милиацина (2 мг/кг) превосходит гепа-топротекторную эффективность карсила (6 мг/кг) по ограничению гиперферментемии (АлАТ, АсАТ) и соответствует эффективности карсила (6 мг/кг) по ограничению нарушений пигментного обмена.

5. Протективное влияние милиацина не сопровождается нарушением скорости всасывания и биораспределения метотрексата в сыворотке крови, ткани печени и селезенки и, таким образом, не связано с нарушением фармакокинетики химиопрепарата.

6. Протективное влияние милиацина не сопровождается снижением противоопухолевой активности метотрексата. Милиацин повышает терапевтическую эффективность метотрексата: их сочетанное применение вызывает высокое торможение роста LLC в течение 12 дней после введения цитостатика (ТРО=91-84%), обеспечивает сохранение статистически значимого ТРО в течение длительного срока наблюдения (на 19 сутки ТРО=60%) и увеличивает продолжительность жизни мышей с LLC на 36%, в то время как метотрексат в монотерапии - на 9%.

7. Механизм протективного влияния милиацина связан с его способностью предотвращать окислительный стресс, индуцированный метотрексатом, и нормализовать экспрессию генов, кодирующих изоформу сур 2е1 цитохрома Р - 450 и глутати-онредуктазу в печени.

Практические рекомендации

Свойства соединения природного происхождения милиацина, установленные в настоящем исследовании, позволяют рекомендовать его к доклиническим испытаниям в качестве малотоксичного эффективного гепатопротектора в комбинации с противоопухолевым препаратом метотрексатом.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Калинина, О.В. Влияние милиацина на выживаемость мышей (CBAxC57Bl6)F1, подвергнутых воздействию токсической дозы метотрексата / А.Д. Железнова, О.В. Калинина // Сб. материалов региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Оренбург, 2005. - Ч. 2. - С. 8-9.

2. Калинина, О.В. О защитном действии милиацина в условиях применения токсической дозы метотрексата / А.Д. Железнова, О.В. Калинина, Б.А. Фролов // Матер. IV конференции иммунологов Урала.- Уфа, 2005.- Иммунология Урала,- 2005. -№1 (4).- С.129-130.

3. Калинина, О.В. Влияние милиацина на структуру печени мышей (СВА х C57B16)F|, подвергнутых воздействию метотрексата / О.В. Калинина, Т.Г. Солнышко-ва, Б.А. Фролов // Материалы к научно-практической конференции онкологов и врачей общей лечебной сети «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии». - Оренбург, - 2006 г. - С. 111-115.

4. Калинина, О.В. Экспериментальная оценка милиацина как средства реабилитации при вторичном иммунодефиците, индуцированном метотрексатом / А.Д. Железнова, О.В. Калинина // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3-1. - С. 63-66.

5. Калинина, О.В. Гепатопротекторное действие милиацина при токсическом поражении печени метотрексатом / О.В. Калинина, С.И. Красиков, A.M. Шехтман и др. // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8. - № 1. - С. 48-54.

6. Калинина, O.B. Влияние милиацина на противоопухолевую активность метотрексата на модели перевиваемой карциномы легких Льюис / О.В. Калинина, Б.А. Фролов, A.A. Штиль и др. II Российский биотерапевтический журнал. -2009. - Т. 8. - № 4. - С. 45-48.

7. Калинина, О.В. Фармакокинетика метотрексата в комбинации с орга-нопротектором милиацином / О.В. Калинина, A.C. Сингин, Б.А. Фролов и др. // Вестник Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

- 2009. - Т. 20. - № 4. - С. 33-37.

8. Калинина, О.В. Диагностическое значение гиперферментемии в оценке гепатотоксичности метотрексата и гепатопротекторного действия милиацина // Тематический сборник по аллергологии и иммунологии. Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 2/1 (29). - С. 143-144.

9. Калинина, О.В. Экспрессия генов CYP - 2Е1 и GLU RED в механизме протективного влияния милиацина при метотрексат-индуцированной гепатотоксичности / О.В. Калинина, A.A. Штиль, Е.С. Колотова и др. // Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -№ 2/2 (35). - С. 30-31.

10. Калинина, О.В. Предупреждение оксидативного стресса как механизм гепатопротекторного эффекта милиацина при действии метотрексата / Калинина О.В., Панфилова Т.В., Фролов Б.А. // Труды XI Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии». Российский аллергологический журнал. - 2011. - № 4, вып.1. - С. 162-163.

11. Калинина, О.В. Влияние метотрексата на клиренсную функцию мак-рофагальной системы печени / О.В. Калинина, Т.В. Панфилова, Б.А. Фролов II Труды XI Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии». Российский аллергологический журнал.

- 2011. - № 4, вып.1. - С. 164-165.

12. Калинина, О.В. Защита милиацином клиренсной функции макрофагальной системы печени в условиях «химического стресса», индуцированного метотрексатом / Б.А. Фролов, О.В. Калинина, Т.В. Панфилова // Материалы III Международного симпозиума «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии». -Санкт-Петербург. - 2011. - С. 13 5 -13 6.

13. Патент на изобретение РФ № 2411947.

«Средство, повышающее противоопухолевый эффект метотрексата». Калинина О.В., Фролов Б.А., Штиль A.A., Перетолчина Н.М., Смирнова З.С.

Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 февраля 2011 г.

14. Калинина, О.В. Сравнительная оценка защитного действия милиацина на гепатотоксичность метотрексата и его депрессивное влияние на костномозговое кроветворение // Вестник Оренбургского Государственного университета. -2011.-№ 16. (135)-С. 284-285.

15. Калинина, О.В. Милиацин как гепатопротектор: механизм зашиты и ее сравнительная эффективность / О.В. Калинина, Т.В. Панфилова, С.И. Красиков, Б.А. Фролов // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. -№2 (39).-С.88-89.

16. Калинина, О.В. Развитие вторичного иммунодефицита при воздействии на организм ксенобиотика с иммуносупрессивной активностью / О.В.Калинина, А.Д. Железнова, Т.В.Панфилова, Б.А.Фролов // Гигиена и санитария. - 2012. - № 3. - С. 73-75.

Структурно-функциональные поражения печени, наряду с нефротоксич-ностыо и угнетением костно-мозгового кроветворения, являются наиболее распространенным и тяжелым осложнением противоопухолевой терапии [45; 58; 131; 241]. Данное обстоятельство служит серьезным препятствием к достижению должного лечебного эффекта, поскольку определяет необходимость увеличения интервалов между курсами химиотерапии и снижения дозировки препаратов, вплоть до их полной отмены. В связи с этим изучение механизмов медикаментозных поражений печени и разработка на этой основе подходов к предупреждению и (или) ограничению таких поражений является одной из актуальных задач, имеющих отчетливое прикладное значение [40; 72; 126; 227; 246].

Это положение в полной мере относится и к метотрексату, химиотера-певтический эффект которого обусловлен его антиметаболической активностью, тогда как гепатотоксичность цитостатика связывают с интенсификацией процессов свободно-радикального окисления [218; 219; 222]. Исходя из этих представлений, очевидно, что протекция гепатотоксического действия метотрексата может быть эффективной на основе использования средств, обладающих антиоксидантной активностью. В настоящее время арсенал таких средств достаточно широк и представлен как синтетическими, так и природными антиоксидантами [55]. Среди последних все более важное значение преобретают препараты растительного происхождения [7], доступность, безопасность и биологическая активность которых определили их широкое использование в медицинской практике, включая протекцию повреждений печени в условиях применения антибластомных лекарственных средств [39; 52].

Интерес к дальнейшему поиску гепатопротекторов не ослабевает, что связано с необходимостью повышения избирательности защиты печени от ксенобиотиков, оптимизации репаративно-регенераторных процессов в поврежденном органе и сокращения сроков восстановления его функциональной активности.

В последние годы в рамках решения этой проблемы внимание исследователей привлекают тритерпеноиды и их производные, демонстрирующие значительную антиоксидантную активность [63; 123; 151; 193; 194; 247; 248] и способность ограничивать повреждения печени при действии различных токсических факторов [31; 59; 98; 105; 161; 192], в том числе - антибластом-ных лекарственных препаратов [36; 106; 148]. К числу этих веществ относится и милиацин - пентациклический тритерпеноид растительного происхождения, защищающий гепатоциты при отравлении СС14 [99] и проявляющий мембранопротекторную активность [128; 141]. Вместе с тем вопрос о защитном влиянии милиацина в отношении гепатотоксичности метотрексата оставался открытым.

Актуальность данной работы определяется тем, что до начала ее выполнения не была проведена оценка защитного эффекта милиацина при метот-рексат - индуцированном повреждении печени; не было установлено влияние тритерпеноида на фармакокинетику метотрексата и его противоопухолевую активность; не был определен механизм протективного действия милиацина, связанный с его влиянием на интенсивность окислительного стресса и экспрессию генов, контролирующих продукцию про- и антиоксидантных факторов. Отсутствие ясности в этих вопросах не позволяло оценить перспективы использования милиацина в качестве гепатопротектора, что с учетом его доступности, крайне низкой токсичности (ЬО50 > 1000 мг/кг) и отсутствия побочных эффектов в широком диапазоне доз [144] могло бы иметь важное прикладное значение.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась экспериментальная оценка милиаци-на как гепатопротектора при токсическом поражении печени метотрексатом.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить влияние милиацина на структурно-функциональную реорганизацию печени и динамику восстановления органных нарушений у мышей, подвергшихся воздействию метотрексата.

2. Провести сравнительный анализ эффективности защитного действия милиацина и официального гепатопротектора - карсила.

3. Определить особенности фармакокинетики метотрексата в условиях его сочетанного применения с милиацином.

4. Оценить влияние милиацина на противоопухолевый эффект метотрексата (на модели эпидермоидной карциномы легких Льюис).

5. Установить механизм протективного действия милиацина путем изучения его влияния на интенсивность оксидативного стресса и экспрессию генов {сур 2е1 и glured), контролирующих редокс-баланс клетки, в условиях применения метотрексата.

Научная новизна исследования

Впервые определено протективное влияние милиацина в отношении ге-патотоксичности метотрексата. В экспериментах на мышах (СВА х G^B^Fi установлена способность тритерпеноида ограничивать метотрексат индуцированные дистрофические и некротические изменения гепатоцитов, ослаблять гиперферментемию (АлАТ, АсАТ, у-ГТ), снижать частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменять депрессию кли-ренсной функции печеночных макрофагов. Показан позитивный эффект милиацина на процесс восстановления структурных повреждений печени и нормализацию показателей пигментного обмена.

Установлено, что гепатопротекторная активность милиацииа не связана с нарушением фармакокинетики метотрексата и с ослаблением его антибла-стомной активности. Впервые показана способность милиацина повышать терапевтическую эффективность метотрексата по показателям торможения роста опухоли и увеличения продолжительности жизни животных с перевиваемой карциномой Лыоиса. Впервые определен механизм протективного влияния милиацина, реализуемый на уровне регуляции экспрессии генов сур 2е1 и фи'ей.

Теоретическое значение работы Полученные данные расширяют представления о диапазоне протективного влияния милиацина и раскрывают новые аспекты его биологического действия. Отсутствие влияния милиацина на фармакокинетику метотрексата исключает возможность рассмотрения данного механизма в реализации протективного действия тритерпеноида. Сведения о способности милиацина отменять метотрексат - индуцированную экспрессию гена прооксидантного белка сур 2е1 и восстанавливать экспрессию гена, кодирующего один из ведущих факторов антиоксидантной защиты glured, существенно углубляют знания о механизмах реализации антиоксидантного эффекта тритерпеноида.

Практическое значение работы Результаты работы определяют новые возможности ограничения побочного действия цитостатической терапии и повышения эффективности реабилитации больных после ее проведения на основе использования милиацина или его аналогов. Установленные в работе способность милиацина повышать противоопухолевую активность метотрекста и отсутствие влияния тритерпеноида на фармакокинетику химиопрепарата позволяют рассматривать три-терпеноид в качестве эффективного гепатопротектора. По материалам работы получен патент на изобретение РФ № 2411947 «Средство, повышающее противоопухолевый эффект метотрексата».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин оказывает защитный эффект при метотрексат - индуцированном поражении печени, предотвращая падение массы органа, минимизируя повреждения гепатоцитов, снижая частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменяя депрессию клиренсной функции печеночных макрофагов и ускоряя восстановление структуры органа.

2. Протективное влияние милиацина не связано с нарушением фармакокине-тики метотрексата и со снижением его противоопухолевой активности

3. Милиацин повышает терапевтическую эффективность метотрексата по показателям торможения роста опухоли и продолжительности жизни животных.

4. Механизм протективного влияния милиацина обусловлен его способностью предотвращать окислительный стресс, индуцируемый метотрексатом, и нормализовать экспрессию генов сур 2е1 и %1игес{ в печени, контролирующих редокс - баланс клетки.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов, Оренбург, 2005, 2011; региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии», Оренбург, 2006; V и IX конференциях иммунологов Урала, Оренбург, 2006; Челябинск, 2011; IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Нижний Новгород , 2010; III Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2011; XI Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2011.

Декларация личного участия автора Автором определены цель, задачи и объем исследования, сформирована и использована методическая база проведения запланированных экспериментов, самостоятельно проведен анализ литературы по профилю диссертации. Определяющим является вклад автора в выполнении всех разделов работы, включая экспериментальную реализацию поставленных задач (85%), статистическую обработку и анализ полученных результатов (100%), а также подготовку научных публикаций, в которых доля личного участия автора составляет не менее 80%.

Материалы диссертации обобщены в 14 научных работах, в том числе в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах. Получен патент на изобретение РФ № 2411947 «Средство, повышающее противоопухолевый эффект метотрексата».

121 Выводы

1. Однократное внутрибрюшинное введение метотрексата (10 мг/кг) мышам (СВАхС57В16)Р1 приводит к развитию токсического гепатита, проявляющегося снижением массы органа, формированием в нем дистрофических и некротических процессов, гиперферментемии (АлАТ, АсАТ, у-ГТ) и нарушением пигментного обмена. Токсичность метотрексата в отношении клеток Купфера проявлялась угнетением их клиренсной функции.

2. Динамика токсического поражения печени под влиянием метотрексата характеризуется постепенным нарастанием явлений дистрофии и некроза гепатоцитов с достижением их максимальной выраженности к 14 суткам после введения цитостатика. Регенераторные процессы в органе в виде возрастания числа двуядерных клеток и увеличения плоидности ядер регистрируются к концу 3 недели наблюдения. При этом нормализация активности ферментов (АлАТ, АсАТ) к указанному сроку отсутствует.

3. Милиацин в разовой дозе 2 мг/кг при трехкратном последовательном (на протяжении 3 дней) внутрибрюшинном введении после применении метотрексата ослабляет гепатотоксический эффект, предотвращая падение массы органа, минимизируя морфологические показатели повреждения гепатоцитов, ослабляя гиперферментемию, снижая частоту выявления и выраженность нарушений пигментного обмена, отменяя депрессию клиренсной функции печеночных макрофагов и обеспечивая восстановление структуры печени к концу 3 недели наблюдения.

4. Гепатопротекторная эффективность милиацина (2 мг/кг) превосходит гепатопротекторную эффективность карсила (6 мг/кг) по ограничению гиперферментемии (АлАТ, АсАТ) и соответствует эффективности карсила (б мг/кг) по ограничению нарушений пигментного обмена.

5. Протективное влияние милиацина не сопровождается нарушением скорости всасывания и биораспределения метотрексата в сыворотке крови, ткани печени и селезенки и, таким образом, не связано с нарушением фарма-кокинетики химиопрепарата.

6. Протективное влияние милиацина не сопровождается снижением противоопухолевой активности метотрексата. Милиацин повышает терапевтическую эффективность метотрексата: их сочетанное применение вызывает высокое торможение роста LLC в течение 12 дней после введения цитостатика (ТРО=91-84%), обеспечивает сохранение статистически значимого ТРО в течение длительного срока наблюдения (на 19 сутки ТРС)=60%) и увеличивает продолжительность жизни мышей с LLC на 36%, в то время как метотрексат в монотерапии - на 9%.

7. Механизм протективного влияния милиацина связан с его способностью предотвращать окислительный стресс, индуцированный метотрексатом, и нормализовать экспрессию генов, кодирующих изоформу сур 2е1 цитохро-ма Р - 450 и глутатионредуктазу в печени.

123

Заключение

Главное положение, вытекающее из проведенных исследований, заключается в том, что тритерпеноид растительного происхождения милиацин снижает гепатотоксичность метотрексата, не влияя при этом на фармакоки-нетику последнего и его антибластомную активность. Изучение механизма такого протективного действия милиацина позволило установить, что в его основе лежит ограничение тритерпеноидом выраженности окислительного стресса, индуцированного метотрексатом, который рассматривается как ведущее звено повреждающего действия цитостатика на печень [219; 222].

Как известно, окислительный стресс обусловливает нарушение редокс -баланса клетки, определяемого как соотношение ее прооксидантных и анти-оксидантных систем [56]. Прооксидантные системы (прооксиданты) - системы генерации активных форм кислорода (АФК), представляющих собой продукты неполного восстановления его молекул: свободные радикалы, перекиси и другие метаболиты, обладающие высокой реакционной способностью. Благодаря этой способности АФК выполняют ряд важных физиологических функций [113], включая синтез биологически активных веществ (лейкотрие-ны, простагландины), цитотоксичность в отношении патогенов и опухолевых клеток, репрограммирование процессов клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптоза. В настоящее время в клетках млекопитающих установлено более 20 т.н. «редокс-чувствительных» транскрипционных факторов [134; 224], отвечающих на изменение редокс-баланса, в том числе NF-kB, АР-1, р-53, Nrf, служащих ключевыми элементами жизнеобеспечения и клеточной функции.

Необходимость АФК для жизнедеятельности клеток связывают также с образованием при их участии электронно-возбужденных состояний биомолекул - триггеров всех последующих биоэнергетических реакций. Колебательный режим таких реакций способствует ритмичному протеканию биохимических процессов на более высоком уровне [118].

Наконец, АФК обеспечивают обновление и функциональную лабильность мембран клеток и субклеточных структур, определяя такие жизненно важные процессы, как проницаемость, ионный транспорт, энергетику, синтез белка и др. Подобное обеспечение обусловлено способностью АФК инициировать активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) при взаимодействии с входящими в состав клеточных мембран полиненасыщенными жирными кислотами. Представляя собой саморазвивающуюся цепную реакцию, ПОЛ постоянно протекает в клетке, поскольку является нормальным процессом метаболизма и служит необходимым звеном её жизнедеятельности, включая адаптационные реакции. Благодаря ПОЛ, реализуемому в клеточных мембранах, меняется их липидный состав, а тем самым - активность ли-пидзависимых мембранных ферментов. Таким образом, образование АФК и инициируемое ими свободнорадикальное окисление являются естественным физиологическим процессом, постоянно протекающим в организме.

Иная ситуация складывается при избыточном уровне АФК в живой клетке, когда они могут выступать как повреждающий фактор, нарушающий структуру и функционирование внутриклеточных компонентов (липидов, белков, ДНК), что сопровождается развитием патологии [30; 50; 75; 94]. При этом деструктивная роль АФК зачастую связана не столько с их прямым действием на клеточные структуры, сколько с избыточной активацией каскада процессов свободнорадикального окисления, сопровождающихся образованием продуктов (гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот, альдегиды, кетоны), повреждающих клеточные структуры [51]. Возможность такого развития событий предполагает необходимость существования в клетке сдерживающих механизмов (антиоксидантной системы, антиоксидантов), лимитирующих образование АФК и защищающих клетку от несвоевременной и бесконтрольной активации свободнорадикальных процессов. Т.е. антиоксидант-ная система (система антиоксидантной защиты) - «многокомпонентная система, которая позволяет поддерживать интенсивность свободнорадикальных процессов на оптимальном уровне, без угрозы их резкой активации и участия в развитии различных патологических состояний» [113]. Очевидно, что атрибутивным условием функционирования такой системы также является ограничение ее избыточности, поскольку в противном случае она будет препятствовать реализации физиологической роли АФК.

Таким образом, сбалансированное (равновесное) соотношение между прооксидантами и антиоксидантами, т.е. редокс-баланс клетки имеет основополагающее значение в ее жизнедеятельности. Изменение этого баланса служит отправной точкой в развитии различных форм патологии. Такое изменение может быть достигнуто избыточным образованием АФК, дефицитом факторов антиоксидантной защиты либо путем сочетанной реализации обоих сдвигов.

Основным источником образования АФК в клетке служат ее ферментные системы: митохондриальная цитохром-С-оксидаза, НАДФН-оксидаза фагоцитов, ксантиноксидаза и микросомальные монооксигеназы [30; 125]. Поскольку ксантиноксидаза принимает непосредственное участие в биотрансформации MTX, ее роль как механизма индукции АФК под влиянием цитостатика представляется достаточно очевидной. Используя молекулярный кислород в качестве акцептора электронов, этот фермент способствует образованию супероксид-анион-радикала (02~), перекиси водорода Н202, а также (в отдельных случаях) - гидроксильного радикала (ОН'). Роль ксантиоокси-дазы в генерации АФК может также быть обусловлена способностью этого фермента повышать уровень свободного железа путем его мобилизации из ферритина печени [195].

Вместе с тем, известно, что для печени главным источником АФК и в частности, 02~, служат микросомы [170]. Однако до проведения настоящего исследования вопрос о роли микросомальных монооксигеназ в формировании окислительного стресса под влиянием MTX оставался открытым. Такое положение в значительной степени было обусловлено хорошо известным фактом о непричастности системы цитохрома Р450 к биотрансформации MTX, а также о незначительной способности последнего модулировать экспрессию и активность различных изоформ этой системы в культуре гепато-цитов. Установленное в нашей работе стимулирующее влияние MTX на экспрессию гена важнейшей прооксидантной Цх Р450-зависимой монооксигена-зы - сур 2е1с большой вероятностью может свидетельствовать о ее вовлеченности в механизм формирования окислительного стресса под действием MTX. Есть основание полагать, что такая активация генной экспрессии носит опосредованный характер и сопряжена с изменением редокс-состояния клетки как следствия генерации АФК при участии ксантиноксидазы, и (или) с прямым действием АФК на фактор транскрипции соответствующего гена.

МТХ-опосредованная индукция прооксидантных систем (ксантиноксидазы и сур 2е1) способна приводить к избыточной генерации АФК и активации свободнорадикального окисления, регистрируемого в наших исследованиях в виде повышения содержания в ткани печени ТБК-реагирующих продуктов на 4 сутки после введения цитостатика. Негативные последствия такой активации в соответствии с существующими представлениями [173; 204; 222; 250] реализуются через окисление тиоловых (сульфгидрильных) групп белков, накопление продуктов липопероксидации и уменьшение стабильности липидного бислоя мембран. В свою очередь окисленные белки легко подвергаются деградации под влиянием протеаз, а окисление фосфолипидов увеличивает их подверженность гидролизу фосфолипазой А2 в результате возрастания сродства к ферменту. Таким образом формируется определенная последовательность включения механизмов повреждения биомембран, при которой активация ПОЛ обеспечивает действие фосфолипаз, после чего нарушения в мембранном бислое происходят уже независимо от уровня ПОЛ и даже при его подавлении [113].

Указанные нарушения определяют утрату функциональной активности клеточных белков (ферментов, встроенных в мембрану), формирование энергетического дефицита, избыточное накопление в клетке ионов Са2+, а в конечном счете - электрический пробой мембраны, цитолиз и гибель клетки. В наших экспериментах показателем деструкции мембран гепатоцитов служило увеличение активности в сыворотке крови индикаторных ферментов (АлАТ, АсАТ, у- ГТ) этого процесса, а также билирубинурия и уробилино-генурия. Повреждение мембран под действием MTX затрагивало как сарколемму, так и, по-видимому, мембраны внутриклеточных структур: эндоплаз-матического ретикулума, митахондрий и микросом. На это указывает возрастание активности АсАТ (являющейся не только цитозольным, но и митохон-дриальным ферментом), обнаружение в моче прямого билирубина (образующегося в гладком эндоплазматическом ретикулуме) и уробилиногена (как проявление несостоятельности микросомального окисления мезобилиноге-на). Выявленные нарушения носили не только выраженный, но и продолжительный характер, о чем свидетельствует сохранение деструктивных изменений в органе и гиперферментемии на протяжении трех недель наблюдения.

В контексте обсуждаемой проблемы важно отметить, что липиды печени легко окисляются и имеют более высокую чувствительность к АФК-индуцированному окислению по сравнению с другими органами [113], хотя именно печень является эндогенном депо витамина Е и, следовательно, должна обладать наибольшей защитой от свободнорадикального окисления. Парадоксальность данной ситуации обусловлена тем, что гепатоциты в отличие от других клеток, хотя и запасают витамин Е в микросомальных мемеб-ранах, не используют его как антиоксидант [214], а поставляют через кровоток в другие органы для предупреждения их АФК-опосредованного повреждения [256]. Такая избирательно высокая чувствительность паренхиматозных клеток печени к липопероксидации по всей видимости определяет возможность более раннего (на 4 сутки) выявления их структурно-функциональных нарушений по сравнению с клетками Купфера, депрессия функциональной активности (поглотительной способности) которых выявлялась нами в более поздний период (на 10-14 сутки) после введения MTX. Не исключено участие в этой депрессии свободных жирных кислот, концентрация которых в условиях катаболизма глицерофосфолипидов должна закономерно возрастать. Правомерность такой оценки обоснована данными о способности жирных кислот не только подавлять хемотаксис и фагоцитарную активность макрофагов [183], но и индуцировать их гибель [176]. При этом строгого соответствия между цитотоксичностыо жирных кислот и числом двойных связей в их молекулах не обнаружено.

Что касается последствий нарушения функциональной активности печеночных макрофагов, то, как отмечалось выше (глава 3), эти нарушения могли иметь непосредственное отношение к замедлению репаративных процессов в органе, в регуляции которых клеткам Купфера отводится центральная роль [81]. Эта роль способна реализоваться в нескольких направлениях, включая продукцию и секрецию различных факторов роста: ТФР Р (трансформирующий фактор роста (3) и ИФР-I (инсулиноподобный фактор роста I); нейтральных протеиназ (эластазы, коллагеназы), отменяющих эффект контактного торможения и повышающих чувствительность клеток-мишеней к факторам роста; фибронектина - центральной адаптерной молекулы самосборки тканей [87]. С репаративной функцией печеночных макрофагов связана их способность к рекрутированию в орган и к активации лимфоцитов, оказывающих стимулирующее воздействие на пролиферацию паренхиматозных клеток печени, в том числе при действии гепатотропных токсинов [15].

Патогенез органных нарушений при избыточной активации ПОЛ мог быть связан и с запуском апоптотического каскада с участием его «митохон-дриального» механизма. Основу этого процесса составляет последовательное развитие внутриклеточных событий, включающих окислительную модификацию кардиолипина под действием продуктов ПОЛ [78], приводящую к утрате его молекулярного взаимодействия с цитохромом С; выход цитохрома С в цитозоль вследствие повышения проницаемости внешней мембраны митохондрий при участии проапоптотических белков (Вах, Bad, Bid и др.); вовлечение цитохорома С в формирование апоптосомы - APAF-1 (апоптотический протеазо-активирующий фактор), активацию каспазы 9 и трансдукцию сигнала на терминальную каспазу 3. Не исключается также развитие апоптоза и при участии Fas/APO-1 механизма, о чем свидетельствует высокая чувствительность гепатоцитов к CD 95-опосредованному сигналу [16]. При этом существенно, что апоптоз клеток печени в ответ на воздействие различных факторов, включая мембраноактивные соединения, не является синхронным процессом. Его продолжительность может составлять до 7 суток [77], внося свой вклад в динамику структурно-функциональных нарушений органа, достигавших своего максимума на 10 - 14 сутки после введения МТХ.

Поражение печени МТХ не носило изолированный характер и реализо-вывалось на фоне системных проявлений токсического действия цитостатика в виде снижения массы тела, редукции органов системы иммуногенеза (тимуса, селезенки), и развития анемии. Представляется, что эти нарушения могли оказывать усугубляющее действие на выраженность поражения печени, в том числе, через развитие вторичного иммунодефицита [54] и гемиче-ской гипоксии.

Как показали результаты нашего исследования, среди механизмов, индукции метотрексатом окислительного стресса и активации свободноради-кальных процессов важное место могло принадлежать способности цитостатика подавлять экспрессию гена глутатиоредуктазы (glured). Этот фермент является одним из компонентов глутатионовой антиоксидантной системы, обеспечивающей (совместно с НАДФН) поддержание в клетке должного уровня восстановленного глутатиона (GSH). Последний, будучи главным водорастворимым антиоксидантом [271], участвует в работе ряда ферментов, в том числе глутатионпероксидазы (локализована в цитозоле и матриксе митохондрий) и многофункциональных белков - глутатионтрансфераз (локализованы преимущественно в цитозоле клеток) в качестве донора протонов, переходя при этом в окисленную форму (GSSG). Коныогаты GSH с токсическими метаболитами, включая и МТХ, облегчают их MRP-1 (multidrug resistance protein - 1) - зависимый транспорт из клетки. Таким образом, в условиях ок-сидативного стресса GSH, обеспечивая инактивацию гидроперекисей и других токсических продуктов окисления путем их восстановления и глутатио-нилирования, защищает клеточные структуры и белки от повреждений [56].

Очевидно, что подавление метотрексатом экспрессии гена глутатионредукта-зы, как возможного проявления гепатотоксичности избыточного образования АФК, формирует дефицит данного фермента, способный привести к истощению внутриклеточного пула GSH и, как следствие - к ослаблению функционирования одной из важнейших внутриклеточных систем антиоксидантной защиты. Подобное развитие событий усугубляется прямым ингибирующим влиянием MTX на активность глутатионредуктазы, равно как и на активность у-глутамилцистеинсинтетазы, участвующей в клеточном синтезе самого глу-татиона [219].

Изучение влияния милиацина на гепатотоксичность MTX позволило установить что тритерпеноид обеспечивал ослабление структурных повреждений гепатоцитов,снижение выраженности гиперферментемии и нарушений пигментного обмена, а также предотвращение депрессии клиренсной функции печеночных макрофагов. Указанные сдвиги имели место на фоне ослабления и системных проявлений токсичности MTX в виде ограничения падения массы тела, гипоплазии лимфоидных органов (тимуса, селезенки) и анемии. Эти результаты могли иметь в своей основе, как минимум, два различных механизма. Во-первых, они могли являться отражением нарушения под влиянием милиацина фармакокинетики метотрексата и (или) непосредственного ингибирующего влияния тритерпеноида на биологическую активность цитостатика. В пользу этого предположения свидетельствуют данные [128; 141] о мембраностабилизирующем действии милиацина, которое могло повлиять на процессы абсорбции, биораспределения и выведения MTX из организма. Второй механизм позитивного действия милиацина мог быть связан с его ограничивающим влиянием на цитотоксичность MTX без воздействия на фармакокинетику и (или) специфическую антиметаболическую активность последнего, определяющих лечебный эффект химиопрепарата.

Как показали наши исследования, милиацин не влиял на фармакокине-тические параметры MTX, и не только не ослаблял, но, напротив, усиливал его противоопухолевую активность. Такое усиление выражалось повышением терапевтической эффективности МТХ при его совместном применении с милиацином в виде высокого торможения роста эпидермоидной карциномы Льюиса и увеличения продолжительности жизни животных. Эти результаты позволили прийти к заключению, что ограничение милиацином структурных, биохимических и функциональных нарушений, индуцируемых МТХ, демонстрирует именно протективный эффект тритерпеноида в отношении локальной (гепатопротекция) и системной токсичности цитостатика.

Оценка механизмов протективного эффекта милиацина позволила установить их связь с антиоксидантными свойствами тритерпеноида. Следует отметить, что антиоксидантная активность является одной из достаточно распространенных биологических характеристик тритерпеноидов [220; 231], которая определена у ряда из них, включая агликон глицирризина: 18р-глицирретиновую кислоту [194], каффеоловую кислоту [268], азиатскую кислоту [216], уросоловую и олеаноловую кислоты [240; 258], дипептид бету-лоновой кислоты [64] и др. Проявлением такого защитного влияния служит уменьшение степени падения внутриклеточного пула восстановленного глу-татиона и лимитирование снижения активности ферментных систем антиок-сидантной защиты: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-8-трансфера-зы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы [215] снижение накопления в клетке вторичных радикалов (липидных перекисей) и диеновых конъюгатов [247], уменьшение генерации и активности супероксид-анион-радикала: Ф [194; 217] и гидроксильного радикала: ОН' [193]. О потенциальной мощности антиоксидантной активности тритерпеноидов свидетельствует возможность проявления их ингибирующего действия даже в отношении АФК (Ф и Н202), индуцированных в лейкоцитах при стимуляции последних форбол-12-миристат-ацетатом [161].

Исходя из полученных в работе данных о способности милиацина восстанавливать экспрессию гена глутатионредуктазы, подавленную МТХ, нам представляется, что антиоксидантный эффект тритерпеноида мог быть связан с его активирующим воздействием на регуляторный сайт - ARE (antioxidant responsive element), под контролем которого находится функционирование этого гена. Основанием для такого предположения служат сведения об индуцирующем влиянии на ARE синтетического аналога олеановой кислоты -CDDO [189; 228; 234; 235; 261]. Как известно, ARE наряду с Nf-kB и АР -1 относится к числу редокс-чувствительных элементов, но в отличие от последних, отвечающих на внешние сигналы, участвующим в поддержании внутриклеточного гомеостаза при апоптозиндуцирующих [185], канцерогенных [196] и стрессорных воздействиях. Регионы ARE выявлены в промотор-ных участках многих генов, продукты которых выполняют или непосредственно защитную роль (микросомальная гемооксигеназа, тиоредоксин, селеновая глутатионпероксидаза-2, глутатионредуктаза), или восполняют уровень расходуемых низкомолекулярных интермедиатов (цистин-глутамат-транспортная система), или обеспечивают репаративную функцию важнейших макромолекул в клетке в ситуациях с нарушением клеточного редокс-баланса. Последнее, в частности, проявляется участием системы Nrf-2 - ARE в регуляции транскрипции митохондриальной ДНК, стабилизации транскрипта и инициации репликации в условиях действия эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [35]. Посредством индукции синтеза MRP-1 -ключевого белка АТФ-зависимого транспорта ксенобиотиков из клеток, ARE может участвовать и в регуляции множественной лекарственной резистентности [272]. Именно поэтому контролируемая сеть ARE-регулирующих генов рассматривается как универсальная система клеточной защиты в условиях окислительного стресса.

В связи с изложенным допустимо полагать, что активация ARE под влиянием милиацина могла бы служить существенным звеном в реализации его антиоксидантного эффекта. Что касается конкретных механизмов такой активации, то существующие представления о них прежде всего связаны с мобилизацией фактора транскрипции Nrf-2 (NF-E2 - related factor 2). Последняя обеспечивается индуцибильной или усиливающейся конститутивной деградацией комплекса Nrf-2 - Кеар-1, в котором Кеар-1 (Kelch-like ECH associating protein-1) отводится роль негативного регулятора (супрессора). Такой эффект установлен, в частности, для CDDO [189]. Следует однако отметить, что необходимым условием разрушения комплекса Nrf-2 - Кеар-1 в любом случае служит изменение конформации Кеар-1 в результате окислительной модификации его молекулы. Поскольку милиацин ослабляет выраженность окислительного стресса, такой механизм его влияния на высвобождение Nrf-2 представляется маловероятным. Однако это не исключает возможного индуцирующего действия милиацина на активность трансляции белка Nrf-2, установленного для других антиоксидантов [237]. Это повышает свободный (мобильный) пул данного фактора транскрипции в цитозоле, транслоци-рующегося в ядро для последующего связывания с рецепторным сайтом ARE. Другой механизм активации ARE милиацином мог быть сопряжен с его прямым индуцирующим влиянием на ARE, установленным в отношении многих ароматических или гетероциклических соединений растительного происхождения, включая тритерпеноиды [184].

Отменяя MTX - индуцированную супрессию гена glured, милиацин мог способствовать возрастанию внутриклеточного пула GSH и, соответственно, повышению эффективности всей глутатионзависимой системы антиокси-дантной защиты. При этом может осуществляться еще один механизм активации ARE, определяемый соотношением окисленных и восстановленных тиолов, в поддержании баланса которых глутатиону (наряду с тиоредокси-ном и пероксиредоксином) принадлежит центральная роль [56].

Очевидно, что снижение милиацином выраженности окислительного стресса способно положительно влиять на экспрессию и других факторов ан-тиоксидантной защиты, в том числе - через ослабление генотоксического эффекта АФК с одновременным снижением АФК - индуцируемой активации экспрессии генов проапоптотических факторов, включая ген сур 2е1. Угнетение последнего могло быть обусловлено и прямым действием милиацина, установленным, как отмечалось выше (глава 5), в отношении других тритер-пеноидов.

Наряду с влиянием на экспрессию генов ведущих факторов поддержания редокс-баланса клетки, защитный эффект милиацина при активации окислительного стресса, как было показано ранее [101], опосредуется также повышением устойчивости клеточных мембран к повреждающему действию АФК и продуктов липопероксидации. Такой эффект тритерпеноида связан с его гидрофобностыо, обеспечивающей возможность встраивания в липидный бислой мембраны. Подобное встраивание способно экранировать полиненасыщенные жирные кислоты от атаки радикал-частицами и (или) укреплять прочность упаковки фосфолипидов мембран, противодействуя детергентопо-добным эффектам [141]. В результате ограничиваются нарушения фосфоли-пидного состава мембран в виде уменьшения содержания в них наиболее метаболически активной фракции фосфотидилсерина, снижения доли фосфати-дилхолина и фосфатидилэтаноламина и возрастания метаболически инертного сфингомиелина [87]. Таким образом, оказывая модифицирующее воздействие на липидные компоненты мембран, милиацин выступает и как «структурный мембранопротектор», способный в условиях генерации АФК поддерживать жидкостные характеристики мембран на уровне, обеспечивающем необходимую активность мембраносвязанных процессов.

В рамках данной работы определенный интерес представляет вопрос о влиянии милиацина и на процесс восстановления структурных, биохимических и функциональных параметров клеток печени после воздействия MTX. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование тритерпеноида обусловливало меньшую продолжительность этого процесса. При анализе такой ситуации безусловного внимания заслуживает оценка изначальной выраженности формирующихся нарушений, которые у животных, подвергавшихся воздействию MTX без последующего применения милиацина, были более глубокими, чем в условиях его применения. Соответствующий вывод заключается в том, что меньшая степень депрессии исследуемых показателей определяла в последующем и меньшую продолжительность их восстановления. Вместе с тем не исключается, что интенсивность подобной регенерации» при использовании милиацина обусловливалась и его непосредственным влиянием на восстановление клеточных популяций в органе. В основе такого прямого эффекта милиацина могла лежать известная способность тритерпеноидов к пренилированию белков (путем присоединения с помощью пренилтрансфераз к белковым молекулам пренильной группы фарнезила или геранилгеранильного остатка), обеспечивающая последним приобретение липофильных свойств, встраивание в мембрану и реализацию функциональной активности [103]. Спектр этой активности достаточно широк и включает модуляцию сигнальных систем, в том числе ответственных за рост и диференцировку клеток [157].

Полученные результаты о гепатопротекторном влиянии милиацина и об антиоксидантном механизме этого влияния поставили перед необходимостью оценки эффективности защитного действия тритерпеноида по сравнению с официальными гепатопротекторами растительного происхождения с антиоксидантными свойствами. Выполнение этого раздела работы с использованием карсила, содержащего флавоноиды расторопши, позволило установить что милиацин в используемой разовой дозе (2 мг/кг) при трехкратном внутрибрюшинном введении превосходит карсил по способности ограничивать МТХ-индуцируемую гиперферментемию. В отношении ограничения нарушений пигментного обмена эффективность милиацина соответствовала эффективности карсила в разовой дозе 6 мг/кг.

В целом, результаты работы, отражающие защитное влияние милиацина в отношении гепатотоксичности MTX, раскрывают новый аспект биологического действия тритерпеноида и определяют возможность его использования в комбинации с MTX при химиотерапии опухолей.