Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Пролиферативная активность легочных фибробластов и ее регуляция дипептидом карнозином

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

р грско^щя МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМ. И. М. СЕЧЕНОВА

■1 .

' ' На правах рукописи

ТИХОМИРОВА Элла Валериевна

ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕГОЧНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ * И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ ДИПЕПТИДОМ КАРНОЗИНОМ

14.00.25 - фармакология 14.00.43 - пульмонология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994

Работа выполнена на кафедре фтиэиопульмонологии Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова.

Научные руководители: академик РАМН М. И. Перельман

Научный консультант : доктор медицинских наук 3. X Корнилова Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Б. И. Любимов доктор медицинских наук С. И. Овчаренко Ведущее учреждение: РоссийскиЯ государственный медицинский

университет

Защита состоится "4/ " ¿1 с/Яшь. г. в //^часов на

васедании специализированного Совета К 074.05. 02 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук в Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова ( г. Москва, ул. Б. Пироговская, Ду/р.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова.

доктор медицинских наук К П. Омсенко

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного Совета,

доктор медицинских наук, профессор

В. П. Фисенко

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К настоящему времени накоплен обширный материал, посвященный изучению репаративной регенерации легких ( Романова JL К., 1987, Есипова И. К , 1976, Перельман М. И. , Бойков А. К., Корнилова 3. X, 1989, Fisher J. М. , Simnett J. D. , 1973). Показано, что несмотря на значительные компенсаторно - приспособительные возможности легких, их регенерация характеризуется лишь частичным восстановлением архитектоники поврежденного органа с формированием в области дефекта рубцовой ткани. Поиск способов регуляции восстановительных процессов в легочной ткани позволил установить, что наиболее перспективным является использование в терапевтических целях регуляторных пептидов, принимающих участие в осуществлении физиологических процессов организма (Ашмарин И. П., Обухова М.Ф. , 1986, Замятнин A.A., 1989, Иванов ET., 1981, Полонский Е М., Булгаков С. А. , Титов М. И. , 1981, . Rogers D., Barnes P.D., 1989, Корнилова 3. X., 1993).

О целью коррекции процессов заживления ран легких был изучен ряд пептидов (инсулин, даларгин, карнозин, фактор роста нервов), среди которых наиболее эффективным окаэался дипептид карнозин (Корнилова 3. X , Перельман М. И., Пауков ЕС., 1989, Перельман М. И. , Корнилова 3. X , 1991). Местное введение карноэина в область раны легкого в момент повреждения приводило к ускорению процессов заживления и формированию минимальных Рубцовых изменений, благодаря ранней активации пролиферации фибробластов. Этот факт позволил предположить наличие ростостимулирующих свойств у дипептида карно-зина, которые требовали доказательств.

До настоящего времени неизвестны также внутриклеточные механизмы действия карнозина на процессы активации пролиферации фиб-робластов, не отработаны оптимальные довы пептида и сроки его введения. Изучение этой проблемы представляется особенно важным, так как открывает пути целенаправленной регуляции функциональной активности фибробластов, определяющих направление и исходы восстановительных процессов в поврежденных тканях.

Цель работы. Изучение ростостимулируюшлх свойств дипептид; карнозина и отдельных аспектов внутриклеточного механизма его действия i n vi tro.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние карнозина на митотическую активность куль тивируемых лёгочных эмбриональных фибробластов человека (ФЛЭЧ)..

2. Определить влияние карноэина на синтез ДНК в растущих покоящихся клетках культуры ФЛЭЧ.

3. Изучить влияние различных концентраций карнозина на состо яние внутриклеточного рН (рНк) культивируемых'фибробластов и выя вить концентрацию препарата и сроки его введения в клетки культур ФЛЭЧ, при которых изменения рНк максимальны.

4. Установить влияние степени химической очистки карнозина t состояние рНк фибробластов.

Научная новизна. Впервые на модели культуры лёгочных эмбрис нальных фибробластов человека, доказаны ростостимулируклцие свойст! карнозина Показано, что череэ 24 часа после введения карнозина среду обитания культивируемых фибробластов их митотическая актш

ность возрастает в среднем в полтора раза. Отмечено, что под действием карновина в растущей культуре фибробластов происходит увеличение синтеза ДНК.

Впервые показано, что карнозин вызывает увеличение рНк, типичное для действия других митогенных факторов и приводит к активации пролиферативных процессов в фиброОластах.

Выявлено, что препарат в концентрации 10 мкг/мл вызывает максимальное увеличение рНк фибробластов. Оптимальными сроками воздействия карнозина на фибробласты следует считать 1 и 7 сутки культивирования клеток.

Показано, что карнозин, содержащий примеси тяжёлых металлов, вызывает неспецифическую реакцию культивируемых фибробластов в виде снижения рНк, которая нарастает по мере увеличения количества примесей в препарате.

Теоретическая значимость. На клеточном уровне доказана способность карнозина выступать в качестве фактора роста, что дополняет имеющиеся представления о его спектре действия и является обоснованием для применения карнозина в качестве средства, улучшающего заживление ран.

Показано, что увеличение внутриклеточного рН культивируемых фибробластов является одним из ввеньев механизма активирующего действия ¡сарнозина на пролиферацию этих клеток. Представление о процессах, происходящих в клетках при введении карнозина, создает теоретическую основу для научно обоснованного применения препарата.

Практическая ценность работы. Показано, что метод прижизненной рН-метрии индивидуальных клеток является быстрым и удобным

способом определения оптимальной концентрации пептида на уровне клетки. Этот метод может найти применение в клинической фармакологии при оценке эффективных дов препарата. Наряду с этим метод может использоваться как экспресс-тест для оценки качества исследуемого пептида, в частности, наличия в нём примесей металлов.

Апробация. Основные положения диссертации доложены на Всесою-ном совещании " Биоантиоксидант'Ч Москва, 1992), а также на научных конференциях кафедры фтивиопульмонологии ММА им. И. М. Сеченова (1992, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Она состоит иэ введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 17 рисунками. Библиография содержит 102 источника на русском языке и 135 источников на иностранных явыках.

Материал и методы исследования

Объектом исследования являлись клетки монослойной диплоидной культуры лёгочных эмбриональных фибробластов человека, 12 - 20 пассажей, любезно предоставленной ст.н.с. Т. М. Хижняковой (Институт вирусологии РАН).

Клетки выращивали по стандартной методике (Конки Д., Эрба Э. и соавт., 1989) на покровных стёклах в флаконах объемом 10 мл на

среде "Игла" или среде "Игла" со средой 199 в равных соотношениях с добавлением 10 % фетальной сыворотки и антибиотиков (пенициллина или гентамицина - 100 ед/мл). Подсчёт посевной довы клеток производили в камере Горяева, посевная дова - 100 ООО клеток на 1 флакон. Фиксировали время посадки клеток.

Всего было исследовано 464 покровных стекла с культурой ФЛЭЧ.

В работе был использован карноэин, очищенный до 98%. Для иеу-чения состояния внутриклеточного рН фибробластов наряду с очищенным карн08ин0м использовали препарат, содержащий до 13% примесей: аминокислоты - аланин, гистидин, а также металлы - железо, медь, свинец, хром, марганец, молибден. Последний был условно обозначен как карновин-Н.

Митотическую активность культивируемых фибробластов исследовали вначале в интактных клетках в 1 - 7 сутки роста культуры клеток. Для этого клетки фиксировали в 96 этаноле, далее окрашивали гематоксилином Караччи и производили подсчёт митотического индекса в каждом обравце не менее, чем на 1000 клеток.

Изменение митотической активности фибробластов под действием карнозина определяли следующим образом. Нестерильный раствор кар-нозина добавляли к клеткам в концентрации 10 мкг/мл инкубационной среды на 2 сутки роста культуры. Стекла с клетками фиксировали в

о

96 этанол© через 30 минут, 2, 4, 6, 10, 18 и 24 часа после введения препарата. Окрашивание стекол с клетками и подсчёт митотического индекса в фибробластах производили, как указано выше.

Синтез ДНК в культуре покоящихся и растущих фибробластов оце-

3

нивали с помощью метода жидкостного сцинтилляционного счета с Н -тимидином.

Перевод фибробластов в состояние покоя производили черев 24 часа пооле пересева: среду с 10 %-ной сывороткой удаляли и заменяли на среду "Игла", содержащую 0,1 %-ную сыворотку. Зибробласты инкубировали в течение 24 часов в атмосфере воздуха с 5 % Это приводило к остановке клеток в периоде клеточного цикла, блокированию их перехода в Б-фаэу и способствовало постепенному переходу фибробластов в состояние покоя (6-0 период). По окончании срока инкубации среду удаляли и стёкла с клетками распределяли на 4 группы. В 1 группе к клеткам добавляли 1 мл среды "Игла" с 10% сывороткой. Во 2 - 1 мл среды "Игла" с О,IX сывороткой, в 3 и .4 - 1 мл среды "Игла" с 0,1% сывороткой и 10 мкг/мл и 50 мкг/мл карнози-на соответственно. Черев 8 часов добавляли Н-тимидин (удельная радиоактивность 7,5 мкКю/мл) ц инкубировали клетки в течение ^..часов. По окончании срока инкубации клетки промывали в 3-х сменах 2,5 мл охлажденной 5 % трихлоруксусной кислоты при 4°С для удаления не включенного в ДНК клеток тимидина, в двух сменах дистиллированной воды и ливировали в 1 мл 0,5 М НаОН в течение 2-х часов

о

при 37 С. Радиоактивность измеряли в жидкости Брэя в сцинтилляци-

онном счётчике "РаскЬеЬа" ("ШЗ",Швеция)' и выражали в имп/мин. За

з

100% принимали интенсивность включения Н -тимидина в клетки, инкубировавшиеся в присутствии 10% сыворотки. Далее расчитывали процент включения Н3-тимидина в клетки, инкубировавшиеся в присутствии 0,1% сыворотки (контроль) и карнозина в концентрации 10 и 50 мкг/мл соответственно.

Для оценки интенсивности синтеза ДНК в популяции растущих фибробластов клетки после пересева инкубировали в течение 24 часов в среде с 10% сывороткой. Далее инкубационную среду заменяли на

свежую бе8 карнозина и содержащую карновин в концентрации 10 и 50

з

мкг/мл соответственно. Через 5 часов инкубации добавляли Н-тимидин и клетки метили в течение 18 часов. Дальнейший ход эксперимента не отличался от описанного выше.

Прижизненное измерение внутриклеточного рН (рНк) в культивируемых фибробластах производили в индивидуальных клетках с помощью

-Б

флуоресцеиндиацетата (ФДА) в концентрации 1 х 10 М на цит.о-рН-флу-ориметре (Литинская Л.Л., 1989).

Для исследования состояния рНк использовали культуру ФЛЭЧ в 1, 2, 3 и 7 сутки роста культуры. ФДА добавляли в среду обитания фибробластов на 1,5 минуты, затем, отмывали стёкла с клетками в свежей порции кондиционной среды. Далее стекла с культурой монтировали на специальную камеру (клетками вниз), составленную из предметного стекла с наклеенными на нем на расстоянии 10 мм двумя полосками предметного стекла. Это позволяло вводить под покровное стекло к [теткам- среду или. необходимый реагент, протягивая их с помощью фильтровальной бумаги, не вынимая стекло из-под микроскопа.

Исходный раствор карновина готовили из расчета 2 мг на 1 мл физиологического раствора, из которого в процессе работы получали необходимые концентрации карнозина. Использовали карновин в концентрациях 1, 5,' 10, 50 и 100 мкг/мл среды. Измерение рНк производили вначале в течение 20-30 минут в интактных фибробластах, а затем в течение 1 часа после замены исходной среды на содержащую {арнозин. Обработку результатов производили, используя критерий ' тьюдента.

- 8 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучение митотической активности интактных культивируемых фибробластов показало, что в 1 сутки величина митотического индекса (М. И.) в клетках составляет в среднем 15,3 ¿3,08 %,.

На 2-е сутки наблюдается максимальное количество митозов в популяции фибробластов - в среднем 34,2 ± 2,3 %..

К началу 3 суток М. И. продолжает оставаться высоким - 29%. ± 1,85 и постепенно снижается с 4 к 7 суткам соответственно до 9,5+1,06 Z.и 3,5+1,43%.

Полученные данные показывают, что период наибольшей пролифе-ративной активности фибробластов приходится на 1 - 3 сутки роста культуры, достигая максимума в 2-х суточной культуре ФЛЗЧ, что. хорошо согласуется с данными С. Б. Алексеева (1989). Постепенное снижение митотического индекса в фибробластах связано с переходом их в стационарную фазу роста. Причиной этого является и так называемый механизм контактного (или плотностного) торможения, связанный с нарастанием количества клеток на единицу площади, уменьшением количества питательных веществ в среде культивирования и выработке клетками факторов, тормозящих клеточное деление ( Harel L., Chatel ai n G. , Gol de A. , 1984).

Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии обших тенденций между особенностями пролиферации фибробластов при их культивировании и в процессе заживления ран в условиях организма. Так, показано, что фибробласты появляются в зоне раневого дефекта уже в первые сутки после повреждения (Серов В. В., Шэхтер А/Б., 1981). Активно пролиферирующие фибробласты заполняют бону поврек-

дения на 3 сутки. К 6 - 7 суткам преобладают зрелые фибробласты, составляющие основную массу соединительной ткани и почти неспособные к делению (Романова Л. К , 1987, Перельман М. И. , Корнилова 3. X. , Бойков А. К , 1989). Этому соответствуют и данные о снижении синтеза ДНК в фибробластах к 7 суткам при заживлении экспериментальных кожных ран (Колокольчикова Е. Г. , 1981).

Таким образом, подтверждается возможность использования метода культуры клеток для оценки различных факторов, оказывающих влияние на процессы заживления ран.

Полученные данные позволяют также предположить, что для получения наиболее эффективного воздействия введение стимуляторов роста фибробластов целесообразно осуществлять в такие сроки после повреждения, когда имеется усиление функциональной активности этих клеток. В этом случае сочетание исходных ростовых свойств клеток с воздействием стимула может способствовать получению максимального пролиферативного ответа фибробластов.

Далее были неучены ростостимулирующие свойства карнозина. Для этого исследовали влияние препарата на митотическую активность и синтез ДНК в культуре фибробластов. Для изучения митотической активности культивируемых фибробластов под действием карнозина препарат вводили в 1-суточную культуру ФЛЭЧ.

При введении карнозина в концентрации 10 мкг/мл инкубационной среды черев 30 минут, 2, 4, 6, 10 и 18 часов после добавления карнозина к клеткам изменений в значениях М. И. не отмечается (Табл. 1).

Как следует И8 таблицы 1, различия между контролем и опытом недостоверны.

Таблица 1

Митотический индекс в культуре, фибробластов при введении карноэина в концентрации 10 мкг/мл

6.0 10,0 18,0

Продолжительность воздействия карнозина ! Величина митотического индекса ! 1 в промилле (М+т) ! ' - - — — — — —'

(час) 1 контроль ! 1 1 карновин !

0,5 1 » ! 18,6+2,7 1 * ! 19,5+1,77 ! * ! 22,3+1,87 ! * ! 26,0+1,41 1 * !

2,0 1 21,6+2,16

4,0 1 26,0+2,65 1 1

26,3+2,95 28,0±3,25 29,6+4,03

25,8+2,88 I * I

28,3+4,63 I л !

29,3+1,47 I

Примечание: * - различия между опытом и контролем недостоверны, Р > 0,05.

Через 24 часа от момента введения препарата митотический индекс в опыте превышает контрольные значения в среднем в 1,5 раза (Табл.2), различия статистически значимы, Р < 0,05. Отличия среди величин митотического индекса контрольной и опытной групп обуслов лены свойствами клеточной культуры, номером пассажа и временем года, в которое проводили эксперимент (июнь - июль - октябрь).

и

Митотический индекс в культуре фибробластов черев 24 часа после введения карнозина в концентрации 10 мкг/мл

N серии эксперимента

Величина митотического индекса в промилле (М±ш)

контроль

карнозин

*

1 34,6+2,23 51,0±1,41

*

2 37,0±1,41 62,012,06

*

3 25,6±2,68 37,6+1,47

Средние 32,3+1,3 50,2+6,19

данные

Примечание: * - различия между опытом и контролем достоверны, Р < 0,05.

Таким обравом, карнозин вызывает усиление пролиферативной активности культивируемых фибробластов. При этом введение препарата

позволяет увеличить число делящихся клеток в период, совпадающий с максимумом пролиферативной активности интактных культивируемых фибробластов. Тот факт, что в более короткие сроки воздействия карнозина (0,5-18 час.) отличия в значениях М. И. между опытом и контролем отсутствуют, позволяет предположить, что карнозин не оказывает влияния на длительность клеточного цикла в фибробластах. По - видимому, препарат стимулирует клетки к вступлению в Б-период.

Для выяснения вопроса о том, способен ли дипептид карнозин самостоятельно стимулировать пролиферацию фибробластов, было изучено его влияние на синтез ДНК в клетках, находящихся в состоянии покоя. Как иввестно, покоящимися называются клетки, которые характеризуются сниженным уровнем метаболических процессов и отсутствием способности к делению (Епифанова 0. И. , Терских В. К , Шлуновс-кий Е А., 1981). Однако, под действием адекватного стимула такие клетки могут переходить И8 состояния покоя в состояние активной клеточной пролиферации.

Через 24 часа после добавления карнозина к покоящимся фиброб-ластам в концентрации 10 мкг/мл процент клеток с включенной ради-

з

оактивной меткой Н - тимидином составил в среднем 8,68 ± 1,13 X , что не имело достоверных отличий от покоящихся фибробластов, к которым не добавляли препарат - 8,10+1,037. (Р > 0,05) . При введении

э

50 мкг/мл препарата процент клеток с включенным Н- тимидином составил в среднем 9,28±3,31%, что также не отличалось от контроля, (Р > 0,05) (Табл.3).

Интенсивность 3 включения Н - тимидина в культивируемые фибро-

бласты в зависимости от состава инкубационной среды

1 ) 3 Интенсивность включения Н - тимидина

Инкубационная ! (М+т)

среда !

4" имп/мин 1x10 клеток ! В процентах (%) ! 1 !

1 !

10% сыворотка ! 1 ) 1 ! 55154+4461,3 ! 100 I

0,1% сыворотка 1 4474±279,4 1 8,10+1,03 !

(контроль) ! 1 I 1 1

0,1% сыворотка ! 1 1 1 1

+ карноэин 1 ! * !

(10 мкг/мл)

0.1% сыворотка ! + карнозин I (50 мкг/мл) I

4790±558,5

5123,5±б1б,3

8,68±1,13 I ---------- } **

*

9,28+3,31

* - различия меаду опытом и контролем недостоверны, Р > 0,05.

**- различия меэду 2-мя опытными группами недостоверны, Р > 0,05.

Эти данные свидетельствуют о том, что карнозин не обладает способностью стимулировать переход клеток из состояния покоя к пролиферации, что, однако, не исключает ростовых свойств препарата. Ряд авторов указывает, что для длительной и эффективной стимуляции пролиферации в покоящихся клетках не достаточно введения какого-то одного фактора. Епифанова О. И. (1979) отмечает совместное действие факторов роста как один из общих принципов регуляции размножения у многоклеточных организмов.

Поскольку увеличение митотической активности фибробластов было обнаружено нами при введении карнозина в среду культивирования, содержащую сыворотку, то не исключена возможность того, что мито-генный эффект препарата был реализован в присутствии сыворотки. Некоторые авторы специально указывают на необходимость использования сыворотки для усиления действия факторов роста (Gospodaro-vrtcz D. , Moran J. S. , 1974, Ross S. P. , Pruss R. M. , Hershman H. R. , 1975)..

В связи с этим на следующем этапе было исследовано влияние карнозина на синтез ДНК в растущей культуре ФЛЭЧ.

При инкубации фибробластов в среде с сывороткой, содержащей карнозин в концентрации 10 мкг/мл, черев 24 часа после добавления препарата отмечалось увеличение числа клеток, синтевирующих ДНК, в среднем до 125i8,5% (Р<0,05). Увеличение концентрации карнозина до 50 мкг/мл также приводило к нарастанию числа клеток, включавших метку, в среднем до 129+5,0% (Р<0,05). Следует отметить, что обе исследованные концентрации препарата оказывали практически одинаковое влияние на синтетическую функцию фибробластов (Табл.4).

Влияние карновина на интенсивность включения Н - тимидина в растушую культуру фибробластов

имп/мин 1 х 10 клеток ¡В процентах (%)

10% сыворотка (контроль)

10% сыворотка + карноэин (10 мкг/мл)

10% сыворотка + карнозин (50 мкг/мл)

87282+5268

109252+7795

112763±4464

100

12518,5

129+5,0

}**

А

*

* - различия между опытом и контролем достоверны,, Р < 0,05.

** - различия между 2-мя опытными группами недостоверны, Р > 0,05.

Таким образом, введение карнозина в растущую культуру фибробластов оказывало стимулирующее влияние на синтетические процессы в клетках, причем, по -видимому, это явилось следствием однонаправленного действия исследуемого препарата и сыворотки.

Следует отметить, что уровень стимулирующего'эффекта карноэи-на в отношении уровня синтеза ДКК в фиброблаетах оказался относительно невысоким по сравнению с влиянием дипептида на митотич^екуи

активность клеток. Поскольку жизнеспособность штаммов культивируемых клеток ограничена во времени, то исследования проводились с использованием различных штаммов фибробластов. В связи с этим необходимо подчеркнуть, что пролиферативный потенциал диплоидных фибробластов человека tn vi tro характеризуется индивидуальной изменчивостью (Терехов С. М. и соавт., 1984). Кроме того, в зависимости от свойств культуры уровень пролиферативного ответа при смене среды на свежую с 10%-ной сывороткой может быть различным: от

16 до 80Z меченых клеток (Brown К. D. , Hoi ley R. V. , 1976). Проник-

3

новение в клетки меченого Н -тимидина и включение его в ДНК клеток является также pH-зависимым процессом (Мурашова МИ. и соавт., 1981). Следовательно, суточные и околочасовые колебания pH культивируемых клеток будут оказывать влияние на величину пула меченого предшественника.

Увеличение митотической активности фибробластов под действием карнозина в сочетании с увеличением синтеза ДНК в растущей популяции этих клеток свидетельствует о ростостимулирующих свойствах препарата.

Далее закономерно возник вопрос о том, каков возможный внутриклеточный механизм•активирующего влияния карнозина на процессы пролиферации фибробластов.

В последние годы убедительно показана роль внутриклеточного pH (рНк) как пускового фактора размножения клеток под влиянием разнообразных факторов роста ( Burns С. Р. , Rozengurt Е. , 1983, Burroní D. , Ceccarini С., 1984, L Allerrain G. , Paris S. , Pouyssegur J. , 1984). Изменения рНк относятся к числу наиболее ранних событий, развивающихся в клетке после воздействия пролиферативных стимулов, и сопровождают перестройку клеточного метаболизма. Поэтому мы предполо-

жили, что в качестве одного иэ звеньев в механизме активации пролиферации фибробластов под действием карновина, определенную роль может играть внутриклеточный рН.

Изучение динамики рНк фибробластов в процессе роста культуры ФЛЗЧ показало, что в 1 сутки популяция этих клеток характеризуется слабокислыми значениями рНк, которые в среднем составляют 6,8 ± 0,04, что может объясняться адаптацией клеток и незавершенными процессами распластывания их на стёклах. Ко 2- 3 суткам отмечается достоверное увеличение значений рНк в среднем до 7,04 + 0,06 и 7,00 + 0,03 соответственно (Р < 0,05). В этот период большинство клеток находится в S-фазе. Увеличение рНк в S - периоде описано и другими авторами '(Литинская Л. Л. , 1989, Божкова В. П. , Литинская Л.Л., Сидорова В. П. , 1986, Ge'rson D. F. , Burton А. С., 1977). При переходе фибробластов в стационарную фаву роста рНк популяции постепенно снижается с 4-х суток (6,9 ± 0,04) и на 7 сутки составляет в среднем 6,65 ± 0,03 . При сопоставлении значений внутриклеточного рН и уровня митотической активности интактных фибробластов можно сделать вывод о том, что между этими параметрами имеется определенный параллелизм: максимальным значениям митотического индекса в фибробластах соответствуют максимальные значения рНк. С одной стороны, это дает возможность установить пути для целенаправленной регуляции пролиферации фибробластов. С другой стороны, на клеточном уровне объясняется необходимость устранения метаболического ацидоза в тканях при их повреждении различного генева с целью оптимизации репаративных процессов.

Для объяснения возможного механизма ростостимулирующих свойств карновина было изучено его влияние на рНк фибробластов.

Карнозин в концентрации 1 мкг/ мл не вызывал изменений рНк независимо от сроков роста культуры фибробластов.

Б 1 сутки роста культуры фибробластов препарат в концентрации 5 мкг/мл увеличивал рНк в среднем на 0,20 ед. , во 2 сутки - в среднем на 0,09 ед. , на 3 сутки - на 0,11 ед., а на 7 сутки в среднем на 0,18 ед.

Карноаин в концентрации 10 мкг/мл в суточной культуре фибробластов способствовал нарастанию рНк в среднем на 0,30 ед. Добавление препарата на 2 и 3 сутки роста клеток вызывало менее выраженное увеличение рНк - в среднем на 0,11 и 0,15 ед. соответственно. Введение карнозина в 7-суточную культуру фибробластов приводило к увеличению рН клеток в среднем на 0,25 ед.

Использование препарата в концентрации 50 мкг/мл приводило к менее выраженному увеличению рНк фибробластов: так, в суточной культуре ФЛЭЧ отмечали увеличение рНк в среднем на 0,07 ед. Добавление карнозина к клеткам на 2 и 3 сутки роста культуры приводило к увеличению рНк в среднем на 0,06 и 0,09 ед. соответственно. На 7 сутки рНк увеличивался в среднем на 0,08 ед.

Карнозин в концентрации 100 мкг/ мл увеличивал вначения рНк в одинаковой степени как в суточной, так ив 2-х суточной культуре ФЛЭЧ в среднем на 0,06 ед. При введении препарата б этой же концентрации на 3 сутки роста культуры фибробластов увеличение рНк клеток происходило в среднем на 0,08 ед. Отмечались также ' единичные случаи отсутствия зф|юкта. На 7 сутки роста культуры ФЛЭЧ карнозин в концентрации 100 мкг/мл увеличивая рНк в среднем на 0,07 ед.

Таким образом, введение ' карнозина вызывает возрастание рН фибробластов с первых минут после введения. По-видимому, эти изменения могут являться одной из причин активации пролифэрации фибробластов, вызываемой карнозином. Максимальный сдвиг рН фибробластов в щелочную сторону достигался при

использовании препарата в концентрации 10 мкг/мл, что позволяет считать её оптимальной и подтверждает точку 8рения о целесообразности использования пептидов в малых до8ах для активации пролифе-. ративных процессов. Полученные результаты свидетельствуют также о том, что выраженность изменений рНк фибробластов зависит от возраста культуры клеток. Так, более выраженное увеличение рНк фибробластов отмечено в 1 и 7 сутки роста культуры ФЛЭЧ В этот , период исходные значения рН клеток характеризуются более кислыми значениям!, что могло создавать оптимальный фон для "защелачива-ющего" действия карноэина.

В процессе выделения природного карнозина из мыиц крупного рогатого скота конечный препарат может содержать то или иное количество примесей. В связи с этим была изучена реакция внутриклеточного рН фибробластов, как высокочувствительного объекта, на введение карнозина, содержащего примеси, который мы условно обозначили как карноэин-Н.

При использовании карнозина-Н в концентрации 1 мкг/мл изменений рНк не отмечали независимо от сроков введения препарата в культуру'фибробластов.

При использовании препарата в концентрации 5 мкг/мл в 1 сутки • наблюдали в основном снижение рНк в среднем на 0,09 ед. В двух случаях регистрировали отсутствие аффекта. Введение карно8ина-Н в этой же концентрации в 2-х суточную культуру ФЛЭЧ вызывало "эакис-ление" в среднем на 0,12 ед. На 3 и 7 сутки роста культуры фибробластов отмечалось снижение рНк в среднем на 0,13 ед. В двух случаях при введении карнозина-Н в 3-х суточную культуру фибробластов происходило увеличение рН клеток в среднем на 0,14 ед.

При введении карнозина-Н в концентрации 10 мкг/мл в 1, 3 и 7

»

сутки роста культуры фибробластов отмечали нчакисление клеток в

среднем на 0,14 ед. Было выявлено и увеличение рНк фибробластов,-однократно в суточной культуре клеток в среднем на 0,17 ед. и в одном случае в 3-х суточной культуре в среднем на 0,23 ед.

Препарат в концентрациях 50 и 100 мкг/мл вызывал почти всегда уменьшение рНк фибробластов. При введении карнозина-Н в концентрации 50 мкг/мл происходило снижение рНк в среднем на 0,12 ед. , причем на 2, 3 и 7 сутки это снижение было более выражено по сравнению с 1-ми сутками роста культуры фибробластов. При возрастании содержания дипептида в инкубационной среде до 100 мкг/мл эффект "вакисления" практически не усиливался, рНк снижался в среднем на 0,14 ед.

Таким образом, в малых концентрациях неочищенный карнозин вызывал различные типы ответа клеток: увеличение рНк, снижение рНк и отсутствие изменений рНк, что, по-видимому, было связано с наличием примесей тяжелых металлов в препарате. Присутствие последних приводило к неспецифической реакции фибробластов в виде ^вакисле-ния. Наблюдаемое при использовании неочищенного карнозина в малых концентрациях увеличение рНк фибробластов было обусловлено, вероятно, непосредственным действием препарата. В этом случае концентрация примесей в карнозине-Н была достаточно низкой, что давало клеткам возможность быстро адаптироваться. При введении больших конентраций препарата количество примесей оказывалось небеэраэлич-ным для фибробластов и приводило к стойкому снижению рН этих клеток.

Полученные результаты позволяют заключить, что метод рН-мет-рии создает возможность быстрой оценки качества используемого препарата и наличия в нем примесей металлов. Наряду с этим метод представляется полезным для определения оптимальной концентрации пептидов.

- 21 -Выводы

1. Карноэин вывывает увеличение митотического индекса в культуре легочных эмбриональных фибробластов человека в 1,5 рава по сравнению с контролем.

2. Нарнозин приводит к увеличению синтеза ДНК в растущих фиброблаетах и не оказывает влияния на синтез ДНК в покоящихся клетках.

3. Одним из механизмов стимулирующего действия карноэина на пролиферативную активность фибробластов является увеличение внутриклеточного рН этих клеток.

4. Максимальное увеличение внутриклеточного рН достигается при концентрации 10 мкг/мл и наступает в 1 и 7 сутки куьльтивиро-вания фибробластов.

5. Увеличение митотического индекса, нарастание числа клеток, синтезирующих ДНК, увеличение рН клеток, возникающее при использовании карновина, свидетельствуют о ростостимулирующих свойствах препарата.

6. Отмечен параллелизм мевду увеличением. рН-и повышением ми-тотической активности фибробластов.

7. Наличие примесей тяжелых металлов в карнозине вызывает

9

неспецифическую реакцию клеток в виде^вакисления : этот эффект находится в прямой зависимости от количества примесей в препарате.

zz -

Практические рекомендации

1. Для оценки качества карнозина и выбора его оптимальной дозы необходимо использовать метод прижизненной внутриклеточной рН-метрии.

2. В процессе получения природной формы карновина следует добиваться его тщательной очистки от примесей тяжелых металлов, оказывающих неблагоприятное влияние на метаболизм клеток.

Описок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изменение внутриклеточного рН в культивируемых эмбриональных фибробластах человека при введении карнозина. // Тез. докл. 2 Всесоюзн. конгресса по болезням органов дыхания. - Челябинск, 16 -19 сентября, 1991.- С. 359. Соавт. Корнилова 3. X, Оглоблина Т. А.

2. Влияние карнозина на внутриклеточный рН в эмбриональных фибробластах легких человека // Сб. трудов FAH, институт химической физики им. И. Н. Сеченова. М. ,1992. - С. 115 -116. Соавт. Корнилова 3. X , Оглоблина Т. А.

3. Влияние карнозина на состояние внутриклеточного рН в легочных эмбриональных фибробластах человека // Бюлл. эксперим. 6и-ол. и медицины. - 1993. - N. 8 - С. 218-220. Соавт. Корнилова 3. X. , Оглоблина Т. А. и Перельман М. И,