Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Антиоксидант карнозин как фактор защиты организма в условиях окислительного стресса при хронической алкогольной интоксикации

На правах рукописи

ЯРЫГИНА ЕКАТЕРИНА ГРИГОРЬЕВНА

АНТИОКСИДАНТ КАРНОЗИН КАК ФАКТОР ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 ¡и 2014

Томск-2014

005556641

005556641

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Прокопьева Валентина Даниловна Официальные оппоненты:

Шилова Инесса Владимировна, доктор фармацевтических наук, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга», лаборатория фитофармакологии, старший научный сотрудник

Суханова Галина Алексеевна, доктор биологических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра биохимии и молекулярной биологии, профессор кафедры

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «Х^ » 2015 года в •// часов на

заседании диссертационного совет^ Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга» (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга» и на сайте: pharmso.ru

Автореферат разослан « Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

г.

Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Формирование в организме патологического процесса часто сопровождается окислительным стрессом [Дубинина Е.Е., Пустыгина A.B., 2007; Меньшикова Е.Б. и др., 2008; Поляков И.А. и др., 2009; Антонеева И.И. и др., 2010; Шаку-ла A.B. и др., 2012; Васенина Е.Е., Левин О.С., 2013; Калинченко С.Ю. и др., 2014]. У больных алкоголизмом дополнительным фактором, способствующим развитию окислительного стресса, является биотрансформация этанола и связанный с ней широкий спектр метаболических нарушений и соматических осложнений [Бохан H.A., Прокопьева В.Д., 2004; Индутный A.B. и др., 2004; Зиновьева O.E., 2006; Бардина JI.P. и др., 2010; Сиволап Ю.П., 2012; Панченко Л.Ф. и др., 2013]. Известно, что хроническое поступление в организм этанола приводит к окислительной модификации липидов и белков крови [Прокопьева В.Д. и др., 2003; Паначев И.В. и др., 2012] и печени [Бабанин A.A. и др., 2008; Белковец A.B. и др., 2009; Панченко Л.Ф. и др., 2013]; негативно влияет на активность антиоксидантных ферментов крови [Красиков С.И. и др., 2005; Бойко Е.Р. и др., 2006; Высокогорский В.Е. и др., 2006]. Исследования последнего десятилетия показали, что ацетальдегид (основной метаболит этанола) способен связываться с SH- и NH2- группами белков и приводить к росту продуктов ПОЛ, модифицировать белки и липиды, образуя альдегидные аддукты, что играет важную роль в патогенезе этанол-индуцированных повреждений различных органов больного [Nakamura К. et al., 2003; Niemela О., 2007; Лущак В.И., 2007; Setshedi М. et al., 2010; McCaskill M.L. et al., 2011; Сиволап Ю.П., 2012; Swaminathan K. et al., 2013]. Приведенные данные показывают, что в терапию больных алкоголизмом целесообразно включать антиокси-дантные препараты, способные защищать биомолекулы от окислительного повреждения под действием этанола и ацетальдегида.

В терапии алкоголизма используют как натуральные, так и синтетические антиоксиданты. Первые, как правило, представляют собой комплекс натуральных компонентов (фитосборы): «Алкофоб» [Даши-намжилов Ж.Б., 2011], «Депромил» [Павельев Е.В. и др., 2008]; препараты на основе экстрактов растений — «Антип красный» [Нужный В.П. и др., 2002] и «Антип зеленый» [Нужный В.П. и др., 2005], силимарин (мнн) [Salle R. et al., 2001]; комплексы — белково-минерально-витаминный «Винибис С» [Шакирзянов Г.З., Закирова Г.И., 2009] и полипептидных фракций, выделенных из головного мозга крупно-рогатого скота, кортексин (мнн) [Бохан H.A., Иванова С.А., 2010; Бохан H.A. и др., 2012] и др. Синтетические антиоксиданты, применяемые в клинической практике алкоголизма: мексидант® [Дудко Т.Н. и др., 2004], берли-

тион® [Панченко Л.Ф. и др., 2009], реамберин®, ремаксол® [Мандель А.И. и др., 2013] и др. Зачастую антиоксиданты имеют невысокую эффективность и обладают побочными эффектами: вызывают аллергические реакции, токсичны. В определенных условиях (в зависимости от используемой дозы) они могут проявлять прооксидантные свойства и т.д. [Хайруллина В.Р., 2005; Меньшикова Е.Б. и др., 2006]. В связи с этим поиск эффективного природного антиоксиданта, хорошо растворимого в воде, не оказывающего побочные эффекты и способного защищать белки и липиды от окислительного повреждения при действии этанола и ацетальдегида, остается крайне актуальной задачей.

В качестве такого антиоксиданта может рассматриваться природный гистидинсодержащий дипептид карнозин ф-аланил-Ь-гистидин), который содержится в возбудимых тканях человека (скелетные мышцы, мозг, сердце). Известно, что он обладает антиокси-дантными, мембраностабилизирующими [Стволинский С.Л., 2006; Беляев М.С., 2008; Болдырев А.А., 2011] и антигликирующими свойствами [Szwergold В.S., 2005; Alhamdani M.S. et al., 2007], водорастворим, является регулятором рН [Skulachev V.P., 1978; Скулачев В.П., 1992; Абе X., 2000], хелатором металлов с переменной валентностью [Vladimirov Y.А., 1996; Mozdzan M. et al., 2005; Grasso G.I. et al., 2011], иммуномодулятором [Невидимова Т.И. и др., 2004], регулятором го-меостаза [Болдырев А.А., 2000; Болдырев А.А. и др., 2007], нейропро-тектором [Федорова Т.Н. и др., 2002, 2008, 2009], способен повышать устойчивость эритроцитов к кислотному и окислительному гемолизу [Prokopieva V.D. et al., 2000].

Для использования в клинической практике в настоящее время создаются биологически активные добавки (БАД), содержащие карнозин. Одним из них является севитин®, который мы использовали при проведении исследований в группах больных алкогольной зависимостью.

Степень разработанности темы. Существуют данные об использовании антиоксидантов при лечении абстинентных и постабстинентных расстройств у больных алкогольной зависимостью (A3) как дополнение к стандартной терапии [Пирожков C.B., Панченко Л.Ф., 2006]. В клинической практике алкоголизма большинство антиоксидантов используется в качестве гепатопротекторов [Дашинамжилов Ж.Б. и др., 2005; Дашинамжилов Ж.Б., 2008, 2011; Цыганков Б.Д., Кру-чинская Ю.Н., 2011; Мандель А.И. и др., 2013]. Исследовано также влияние антиоксидантов на процесс элиминации этанола, тяжесть алкогольного опьянения, на ослабление выраженности вегетативных и психоэмоциональных проявлений [Нужный В.П. и др., 2002, 2005; Пирожков C.B., Панченко Л.Ф., 2006; Павельев Е.В. и др., 2008; Бохан

H.A. и др., 2012]. Изучена способность антиоксидантов снижать выраженность окислительного стресса (ОС) при абстинентном [Бишева И.В. и др., 2007; Куреков И.В., Долгих В.Т., 2009; Мандель А.И. и др., 2013] и постабстинентном [Бохан H.A., Иванова С.А., 2010] состояниях. На этапе формирования ремиссии влияние антиоксидантов на параметры ОС не изучалось, хотя для стойкой ремиссии у больных алкоголизмом важно поддерживать основные метаболические и окислительные процессы в норме.

В исследованиях других авторов карнозин оказался эффективным для профилактики и лечения глазных заболеваний [Boldyrev A.A. et al., 1987; Babizhaev M.A., 2011, 2012], воспалительных заболеваний пародонта [Селезнев Д.А., 2006], в комплексной терапии хронической дисциркуляторной энцефалопатии [Беляев М.С., 2008] и болезни Пар-кинсона [Федорова Т.Н. и др., 2009]. Так как карнозин является природным компонентом тканей человека, он обладает высокой биодоступностью, к нему нет привыкания при длительном применении, он не дает побочных эффектов (за исключением индивидуальной непереносимости), не накапливается в тканях, его избыток выводится с мочой [Северин С.Е. и др., 1984; Болдырев A.A., 1998, 2009].

Представленные данные позволяют прогнозировать эффективность карнозина для купирования ОС у больных алкоголизмом. Успешность использования антиоксидантов в наркологической практике во многом определяется их способностью купировать токсические эффекты этанола и ацетальдегида. Поэтому было важно исследовать способность карнозина снижать окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови, индуцированную этанолом и ацетальдегидом.

Цель исследования: изучение эффективности карнозина при коррекции окислительного стресса у больных алкогольной зависимостью и защите биомолекул от окислительного повреждения, вызванного действием этанола и ацетальдегида.

Задачи исследования:

1. Провести оценку эффективности коррекции окислительного стресса у пациентов с алкогольной зависимостью после курсового приема карнозина на этапе формирования ремиссии.

2. Оценить влияние карнозина на клинические и биохимические показатели крови у больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии.

3. Изучить динамику окислительной модификации белков и липидов плазмы крови под действием разных концентраций этанола и ацетальдегида in vitro.

4. Оценить защитное действие карнозина при окислительном повреждении липидов и белков плазмы крови этанолом и ацетальдегидом.

Научная новизна. Впервые у больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии применен природный дипептид карнозин. Обнаружено, что курсовой прием карнозина больными приводит к купированию ОС: понижению уровня карбонилов белков, ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) и повышению активности суперок-сиддисмутазы (СОД) в плазме крови. Прием карнозина пациентами приводит к более эффективному снижению активности аминотрансфе-раз сыворотки крови.

Исследование влияния этанола и ацетальдегида на белки и ли-пиды плазмы крови здоровых лиц позволило установить, что как этанол, так и ацетальдегид индуцируют окислительную модификацию этих биомолекул. Инкубация крови как с этанолом (0,5% и 1,0%), так и с ацетальдегидом (0,01%) приводит к повышению уровня карбонилов белков и ТБК-РП в плазме крови. В концентрации 0,1% ацетальдегид индуцирует образование высокомолекулярных белковых агрегатов в плазме крови, что свидетельствует о кросс-линкинге белков. Этанол таким «сшивающим» действием не обладает.

Впервые продемонстрировано, что карнозин защищает белки и липиды плазмы крови от окислительной модификации, вызванной этанолом (Э) или ацетальдегидом (АА) in vitro. Полученные данные расширяют представления о механизмах повреждающего действия этанола и ацетальдегида на белки и липиды плазмы крови и защитного действия карнозина этих биомолекул от такого повреждения.

Теоретическая н практическая значимость исследования.

Проведенные клинико-биологические исследования позволяют рекомендовать карнозин к применению в наркологической практике как дополнение к базисной терапии для уменьшения выраженности ОС и более эффективного снижения активности аминотрансфераз сыворотки крови у больных A3 на этапе формирования ремиссии.

Результаты исследования являются основой для разработки диагностических критериев, позволяющих оценивать уровень ОС для дальнейшего назначения антиоксидантной терапии, а также для создания тест-системы, которая позволит проводить скрининг антиоксидан-тов для выявления наиболее эффективных препаратов, необходимых при назначении персонализированной терапии пациентов A3.

Разработанные подходы для изучения эффективности антиокси-дантного действия карнозина у больных A3 используются в лабораториях ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН при исследовании действия других антиоксидантов.

Результаты работы включены в курсы лекций для студентов, клинических ординаторов, аспирантов и врачей-психиатров кафедры

психиатрии, наркологии и психотерапии ГБОУ ВПО «СибГМУ» Минздрава России и ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН.

Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам выбраны современные методологические подходы. В плацебо-контролируемом исследовании участвовали пациенты с A3 мужского пола. В экспериментальной части in vitro участвовали здоровые доноры (мужчины). Отбор пациентов осуществлял психиатр-нарколог в соответствии с Международной классификацией болезней (МКБ-10). Клинический диагноз квалифицировали как «Психические расстройства и расстройства поведения, связанные с употреблением психоактивных веществ», шифр Flx.2: синдром зависимости - период воздержания, ремиссия. Использовали спектрофотометрические методы (определение содержания карбонилов белков, ТБК-РП, активности СОД и каталазы в плазме крови), метод электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ ПААГ), лабораторные методы определения клинических (эритроциты, лейкоциты, СОЭ, гемоглобин) и биохимических (глюкоза, ACT, AJ1T) показателей, статистический анализ результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. У всех пациентов с A3 после стандартной терапии на этапе формирования ремиссии сохраняется состояние ОС, о чем свидетельствует повышенный по сравнению с показателями у здоровых доноров уровень карбонилов белков и ТБК-РП в плазме крови. Курсовой прием карнозина в течение 1 месяца уменьшает выраженность ОС у пациентов группы «карнозин»: снижается содержание карбонилов белков и ТБК-РП, повышается активность СОД в плазме крови. У пациентов из групп «плацебо» и «без лечения» через один месяц уровень карбонилов белков и ТБК-РП, как и активность СОД, в плазме крови не изменяется.

2. Курсовой прием карнозина способствует снижению активности аминотрансфераз сыворотки крови у больных A3 на этапе формирования ремиссии.

3. Инкубация крови здоровых лиц как с этанолом (0,5% и 1,0%), так и с ацетальдегидом (0,01%) приводит к повышению в плазме крови содержание карбонилов белков и ТБК-РП. Этанол не приводит к кросс-линкингу белков плазмы крови, в то время как после инкубации с ацетальдегидом (0,1%, 1 час) обнаружены белковые агрегаты, что свидетельствует о кросс-линкинге белковых молекул под действием АА.

4. Добавление карнозина (5 мМ) в исследуемые образцы крови как с этанолом, так и с ацетальдегидом препятствует окислительной модификации белков и липидов: достоверно снижается уровень карбонилов белков и ТБК-РП. Карнозин препятствует образованию агрегатов белков при инкубации крови с ацетальдегидом.

Степень достоверности н апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается репрезентативным количеством исследований, использованием современных методов и адекватными методами статистической обработки.

Результаты исследований были доложены и обсуждены на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), на XIV и XV съездах психиатров России (Москва, 2005, 2010); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной психиатрии и наркологии» (Омск, 2005); на Всероссийской научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск, 2006); на XIII, XIV, XV и XVI научных отчетных сессиях НИИПЗ СО РАМН «Актуальные вопросы психиатрии и наркологии» (Томск, 2007, 2009, 2011 и 2013); на 17-м Европейском симпозиуме по нейрохимии (Саламанка, Испания, 2007), на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); на 16-м Европейском конгрессе психиатров (Ницца, Франция, 2008); на II и III Всероссийских конференциях с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008, 2013); на научно-практической конференции «Онтогенетические аспекты психического здоровья населения» (Омск, 2010); на научно-практической конференции «Биологическая психиатрия — клинической психиатрии» (Москва, 2010); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы психиатрии», посвященной 125-летию клиники психиатрии им. С.С. Корсакова (Москва, 2012); на 27-м Европейском конгрессе нейропсихофармакологии (Берлин, Германия, 2014).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них 5 — в журналах, рекомендованных ВАК РФ и в медицинской технологии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 359 источников, из них 187 отечественных и 172 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В первой главе «Окислительный стресс и основные подходы к его коррекции» (литературный обзор) проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по теме исследования. В первом разделе описана роль активных форм кислорода в патогенезе различных патологических состояний организма, рассматриваются основные механизмы формирования ОС. Подробно анализируется литература, касаю-

щаяся ОС при алкоголизме и осложнениях, вызванных алкогольной интоксикацией. Во втором разделе дана характеристика антиоксидан-тов, приведены данные об их использовании в клинической и наркологической практике. Третий раздел посвящен характеристике карнозина и его применению в экспериментальных исследованиях и клинической практике.

Вторая глава диссертации «Материал и методы исследования» посвящена описанию материала и методов, используемых в работе. Материалом служила гепаринизированная венозная кровь больных алкоголизмом и здоровых лиц, из которой получали плазму. Плазму крови хранили при -82°С до использования. Всего было обследовано 140 человек (все мужчины в возрасте от 25 до 60 лет). Из них 77 - пациенты с A3, находящиеся на этапе формирования ремиссии (вне стационара), которые непосредственно перед исследованием прошли курс стандартной терапии, включающей дезинтоксикационное, психофармакологическое и симптоматическое лечение в отделении аддиктив-ных состояний ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН (руководитель отделения -к.м.н. Ляшенко Г.П.). Контрольная группа была сформирована из 30 относительно здоровых мужчин. Кровь других 33 здоровых мужчин добровольцев использовали в экспериментах in vitro. Здоровые доноры не состояли на учете у психиатра или нарколога, не имели хронических соматических заболеваний в стадии обострения и не употребляли алкоголь, по крайней мере, 10 дней перед исследованием. Все участники исследования были проинформированы о нем и дали письменное согласие на участие. Было получено разрешение экспертной комиссии локального этического комитета ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН на проведение данного исследования.

Все больные алкоголизмом были разделены на 3 группы: «кар-нозин» (32 человека, средний возраст 40,6± 1,9), «плацебо» (20 человек, средний возраст 42,9±2,0) и «без лечения» (25 человек, средний возраст 42,7±2,0). Средний возраст участников исследования достоверно не различался между группами.

При изучении влияния карнозина на показатели ОС у больных алкогольной зависимостью использовали БАД севитин®, предоставленный производственно-торговым предприятием «Медтехника» (фармацевтические и пищевые препараты), г. Казань. Активная субстанция L-карнозин, используемая для производства севитина®, вырабатывалась из аминокислот L-гистамина и р-аланина фирмой «Yonezawa Hamari Chemicals, Ltd», Япония. Плацебо был предоставлен той же фирмой, идентичен по составу и внешнему виду севитину®, но не содержал карнозин.

Пациенты группы «карнозин» на этапе формирования ремиссии принимали БАД севитин® в дозе 1,2 г/сутки (1 таблетка 0,5 г содержала 150 мг карнозина) в течение 1 месяца по 2 таблетки 4 раза в день за 30 мин до еды. Пациенты группы «плацебо» на этапе формирования ремиссии принимали плацебо в течение одного месяца по той же схеме. Пациенты, вошедшие в группу «без лечения», никаких препаратов на этапе формирования ремиссии не принимали. Все больные проходили обследование дважды: первый раз после лечения в стационаре, до исследования (1-я точка), и второй раз через 1 месяц (2-я точка).

Карбонизированные белки определяли по реакции взаимодействия карбонильных производных с 2,4-динитрофенилгидразином (Levine R.L., 2002). Оптическую плотность образцов регистрировали на спектрофотометре «SHIMADZU» (Япония).

Продукты ПОЛ (ТБК-реактивные продукты) определяли по суммарным перекисным продуктам в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Коробейникова Э.Н., 1989). Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре «SHIMADZU» (Япония).

Активность супероксиддисмутазы определяли по реакции ау-тоокисления адреналина в щелочной среде (рН= 10,65) (Сирота Т.В., 1999) на спектрофотометре «SHIMADZU» (Япония).

Активность каталазы определяли по реакции перекиси водорода с молибдатом аммония (Королюк М.А. и др., 1988). Оптическую плотность в пробах измеряли на фотометре КФК-5М.

Определение клинических (СОЭ, гемоглобин, эритроциты, лейкоциты) и биохимических (аспартатаминотрансфераза (ACT), аланина-минотрансфераза (AJIT), глюкоза) показателей сыворотки крови проводили общепринятыми методами в специализированных лабораториях ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН. Использовали диагностический набор Cormay (Польша).

Для оценки динамики окисления белков и липидов плазмы крови под действием Э и АА in vitro кровь инкубировали при температуре 37°С с Э в концентрациях 0,5% и 1,0% или АА в концентрации 0,01%. В процессе инкубации из проб отбирали аликвоты через 0, 1, 2 и 3 часа, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин для получения плазмы. В плазме определяли содержание карбонилов белков и ТБК-РП.

Для определения действия этанола или ацетальдегида на белковый спектр плазмы крови проводили инкубацию крови при температуре 37°С с 0,5% этанолом или 0,1% ацетальдегидом в течение 1 часа. Белки полученных образцов плазмы крови разделяли методом ЭФ ПААГ (Laemmli U.K., 1970). Анализ молекулярной массы белков проводили с помощью пакета компьютерных программ Alliance 2.7 Uvitec

Cambridge (США). Молекулярная масса каждой белковой полосы рассчитывалась автоматически относительно стандартного белкового маркера фирмы Fermentas Scientific в диапазоне 5-250 кДа.

Для оценки действия карнозина в пробы с кровью в присутствии этанола или ацетальдегида перед инкубацией добавляли карнозин в конечной концентрации 5 мМ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 8,0». Данные представлены в виде медианы (Me) и межквартильного интервала (Ql— Qu), а также М±т, где М - среднее значение, т - стандартная ошибка среднего значения. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (MannWhitney U test), для зависимой выборки тест Вилкоксона (Wilcoxon). Статистически значимыми различия считались при р<0,05.

Третья глава «Результаты собственных исследований» включает два основных раздела. В первом разделе работы представлены результаты исследования влияния карнозина на показатели крови, характеризующие ОС, а также на клинические и биохимические показатели крови больных A3 на этапе формирования ремиссии. Они позволяют сделать заключение, что карнозин снижает выраженность ОС у пациентов. Второй раздел посвящен изучению эффективности защиты кар-нозином белков и липидов плазмы крови здоровых лиц от окислительной модификации, вызванной Э или АА in vitro. Показано, что карнозин защищает белки и липиды плазмы крови от этанол- и ацетальде-гид-индуцированного окисления. Полученные результаты представлены в виде рисунков и таблиц.

Четвертая глава «Обсуждение результатов» посвящена анализу полученных результатов исследования с привлечением данных литературы.

Влияние карнозина на выраженность окислительного

стресса у больных алкогольной зависимостью на этапе формирования ремиссии

О том, что при A3 формируется ОС, при котором происходит окислительное повреждение белков и липидов крови, сообщают многие авторы [Bondy S.C., 1992; Wu D., Cederbaum A.I., 2003; Бохан H.A., Прокопьева В.Д., 2004; Бишева И.В. и др., 2007; Huang М.С. et al., 2009; Бардина JI.P. и др., 2010; Паначев И.В. и др., 2012; Панченко Л.Ф. и др., 2013; Цейликман В.Э. и др., 2013]. В связи с этим представляло интерес изучить способность антиоксиданта карнозина защищать от ОС белки и липиды плазмы крови у больных A3 на этапе формирования ремиссии.

Влияние карнозина на уровень карбоншов белков и ТБК-реактивных продуктов в плазме крови больных алкоголизмом.

У всех пациентов с АЗ после стандартной терапии (до исследования) во всех группах («карнозин», «плацебо» и «без лечения») в 1-й точке содержание карбонилов белков (Рисунок 1) и ТБК-РП (Рисунок 2) в плазме крови достоверно повышено по сравнению с соответствующими значениями здоровых доноров (р<0,01)

Содержание карбонилов белков: здоровые доноры - 0,37±0,01 нмоль/мг белка, «карнозин» - 0,50±0,03 нмоль/мг белка, «плацебо» -0,47±0,01 нмоль/мг белка, «без лечения» - 0,48±0,02 нмоль/мг белка (Рисунок 1). ТБК-РП: здоровые доноры - 3,62±0,17 нмоль/мл, «карнозин» - 4,90±0,18 нмоль/мл, «плацебо» - 4,77±0,15 нмоль/мл, «без лечения» - 4,81±0,17 нмоль/мл, (р<0,01) (Рисунок 2).

Рисунок 1 - Влияние карнозина на содержание карбонилов белков в плазме крови у пациентов с алкогольной зависимостью. Примечание: * - р<0,01 - по сравнению с показателями у здоровых доноров; # — р<0,01 — по сравнению с показателями в 1-й точке.

Эти результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на проведенное лечение в стационаре, состояние ОС у больных алкоголизмом сохраняется, что согласуется с литературными данными [Прокопьева В.Д., 2003; Осадчая О.И. и др., 2009].

Курсовой прием карнозина в течение месяца на этапе формирования ремиссии (2-я точка) приводит к достоверному снижению как содержание карбонилов белков - до 0,39±0,02 нмоль/мг белка (Рисунок 1), так и ТБК-РП - до 3,90±0,17 нмоль/мл по сравнению с показателями в 1-й точке (р<0,01) (Рисунок 2). При этом оба показателя достоверно не отличаются от соответствующих показателей здоровых доноров. В группах «плацебо» и «без лечения» во 2-й точке показатели карбонилов: 0,44±0,01 и 0,45±0,02 нмоль/мг белка, соответственно (Рисунок 1)

и ТБК-РП: 4,63±0,11 и 4,55±0,25 нмоль/мл, соответственно, значимо не отличались от значений в 1-й точке и были достоверно выше показателей здоровых лиц (р<0,01) (Рисунок 2).

Полученные данные о положительном влиянии карнозина на окислительно модифицированные белки и липиды в условиях ОС согласуются с результатами других авторов [Болдырев A.A., 1998; Ство-линский С.Л., 2006; Hipkiss A.R., 2000].

Рисунок 2 - Влияние карнозина на содержание ТБК-реактивных продуктов в плазме крови у пациентов с алкогольной зависимостью. Примечание: * - р<0,01 - по сравнению с показателями у здоровых доноров; # -р<0,01 - по сравнению с показателями в 1-й точке.

В экспериментальных работах было доказано, что карнозин оказывает положительный эффект за счет непосредственного взаимодействия с продуктами ПОЛ [Болдырев A.A., 1998; Стволинский С.Л., 2006] и карбонилами белков [Hipkiss A.R. et al., 1998; Hipkiss A.R., 2000] с образованием нетоксичного комплекса окисленных биомолекул с карнозином, так называемого «карнозинового аддукта».

Таким образом, курсовой прием карнозина снижает выраженность ОС в организме у больных A3 на этапе формирования ремиссии, о чем свидетельствует снижение содержания карбонилов белков и ТБК-РП в плазме крови пациентов группы «карнозин». «Плацебо» таким действием не обладает.

Влияние карнозина на активность антиоксидантных ферментов плазмы крови у больных алкоголизмом. Известно, что нарушение или недостаточная эффективность системы антиоксидантной защиты является одной из важнейших причин развития ОС [Halliwell D.B., Gut-teridge J.M.C., 1999; Ланкин В.З. и др., 2000; Меньшикова Е.Б. и др., 2006]. Согласно литературным данным, активность ферментов антиоксидантной защиты у больных A3 неодинакова и зависит от стадии и

тяжести заболевания, соматических осложнений и эффективности проведенной терапии, от органа, от сезона года и других факторов [Koechling U.M. et al., 1995; Красиков С.И. и др., 2005; Bogdanska J. et al., 2005; Высокогорский В.Е. и др., 2006; Куреков И.В., Долгих В.Т., 2009; Бохан H.A., Иванова С.А., 2010]. Активность антиоксидантных ферментов в плазме крови у больных A3 на этапе формирования ремиссии ранее не изучалась. Мы провели исследование влияния карно-зина на активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы у больных A3 на этапе формирования ремиссии (Таблица 1).

Обнаружено, что в 1-й точке (до исследования) во всех трех группах больных («карнозин», «плацебо», «без лечения») активность СОД была достоверно повышена, а активность каталазы не отличалась от показателей здоровых доноров (р<0,05) (Таблица 1).

Таблица 1 - Влияние карнозина на активность антиоксидантных ферментов плазмы крови у пациентов с алкогольной зависимостью на эта_пе формирования ремиссии (М±т)_

Группы Супероксиддисмутаза (ед.акт/мг белка) Катал аза (мккат/мг белка)

До исследования (1-я точка) Через 1 месяц (2-я точка) До исследования (1-я точка) Через 1 месяц (2-я точка)

Здоровые доноры 3,38±0,08 (п=30) - 2,11±0,13 (п=30) -

Карнозин 3,74±0,12+ (п=32) 4,36±0,25+* (п=27) 2,21 ±0,19 (п=32) 2,08±0,14 (п=27)

Плацебо 3,73±0,11+ (п=20) 3,71±0,14+ (п=16) 2,21±0,20 (п=20) 2,23±0,19 (п=16)

Без лечения 3,79±0,14+ (п=25) 3,77±0,24+ (п=22) 2,22±0,13 (п=25) 2,24±0,18 (п=22)

Примечание: * - р<0,05 — по сравнению с показателями в 1-й точке; + — р<0,05 - по сравнению с показателями у здоровых доноров; п — количество пациентов в группах.

Курсовой прием карнозина в течение месяца (2-я точка) привел к дальнейшему увеличению активности СОД в плазме крови в группе «карнозин» до значений, достоверно превышающих показатели СОД как в 1-й точке, так и у здоровых доноров, а активность каталазы не изменилась (Таблица 1). В группах «плацебо» и «без лечения» активность как СОД, так и каталазы практически не изменилась по сравнению с 1-й точкой (Таблица 1). Полученные результаты о повышении

активности СОД в плазме крови у пациентов, получавших карнозин, согласуются с литературными данными.

Так, в условиях ОС, вызванного острой летальной гипобариче-ской гипоксией, в плазме крови крыс обнаружено увеличение активности СОД в полтора раза, а курсовое введение карнозина приводило к дальнейшему увеличению активности СОД [Стволинский СЛ., 2006]. Достоверное повышение активности СОД в эритроцитах при приеме карнозина на фоне базисного лечения отмечалось и у пациентов, страдающих болезнью Паркинсона [Федорова Т.Н. и др., 2009]. В настоящее время считают, что карнозин способен регулировать активность и обеспечивать защитное действие молекулы СОД [Юнева М.О., 2001; Стволинский С.Л., 2006]. Не исключено, что механизм активации СОД карнозином связан со способностью дипептида взаимодействовать с Си2+ и Zn2+, находящимися в активном центре данного фермента [Болдырев A.A., 2009]. На наш взгляд, повышение активности СОД в плазме крови у больных A3 является хорошим прогностическим фактором, поскольку этот фермент переводит супероксид-анион в менее активное соединение - перекись водорода.

Таким образом, курсовой прием карнозина приводит к повышению активности СОД в плазме крови у пациентов с A3 на этапе формирования ремиссии. Это способствует мобилизации антиоксидантной защиты организма. «Плацебо» таким действием не обладает.

Влияние карнозина на клинические и биохимические показатели крови у больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии.

В группе «карнозин» за 1 месяц формирования ремиссии было выявлено достоверное снижение двух аминотрансфераз сыворотки крови (р<0,01) (данные представлены в виде Me (QL-Qu). ACT: 1-я точка - 27,28 (15,40-34,76) Е/л, 2-я точка - 19,36 (14,08-28,16) Е/л и АЛТ: 1-я точка - 34,32 (20,24-45,54) Е/л, 2-я точка - 19,36 (7,04-33,0) Е/л. В группе «без лечения» за месяц формирования ремиссии достоверно снизалась только активность ACT: 1-я точка - 28,16 (25,5243,12) Е/л, 2-я точка - 22,88 (17,60-28,16) Е/л, р<0,01), при этом активность АЛТ осталась практически на том же уровне, что и до исследования: 1-я точка - 32,88 (21,78^4,46) Е/л, 2-я точка - 31,68 (27,7238,60) Е/л. В группе «плацебо» значимо не изменилась ни одна из активностей аминотрансфераз относительно 1-ой точки.

Другие измеряемые показатели (эритроциты, лейкоциты, СОЭ, гемоглобин, глюкоза) практически не изменились во всех группах пациентов за 1 месяц формирования ремиссии.

Полученные результаты позволяют предполагать, что снижение активности аминотрансфераз сыворотки крови у больных A3 на

этапе формирования ремиссии обусловлены тем, что пациенты в этот период воздерживаются от употребления алкоголя. Курсовой прием карнозина способствует более эффективному снижению активности этих ферментов, что можно интерпретировать как мембраностабилизи-рующее действие карнозина на клетки печени. Это согласуется с литературными данными, в которых был показан положительный эффект карнозина на активность аминотрансфераз сыворотки крови мышей и крыс, у которых ОС и гепатотоксичность индуцировали этанолом [Liu W.H. et al., 2008; Artun B.C. et al., 2010; Baykara B.L. et al., 2014]. В этих работах было показано восстановление карнозином не только биохимических показателей крови, но и морфологических показателей клеток печени, поврежденных этанолом, что подтверждает мембраноста-билизирующие свойства карнозина при токсическом воздействии Э.

Защита кариозииом белков и липидов плазмы крови от окислительной модификации, вызванной этанолом или ацетальде-

гидом In vitro

При алкоголизме формирование и поддержание ОС связано с токсическими эффектами этанола, его метаболита ацетальдегида и побочных продуктов их метаболизма [Bondy S.C., 1992; Wu D., Cederbaum A.I., 2003; Бохан H.A., Прокопьева В.Д., 2004; Setshedi М. et al., 2010]. Мы провели оценку способности Э и АА оказывать окислительное действие на белки и липиды плазмы крови здоровых лиц in vitro и возможности защиты карнозином этих биомолекул.

Влияние карнозина на окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови в присутствии этанола. Использовали две концентрации этанола: 0,5% и 1,0%. Концентрация карнозина во всех опытах составляла 5 мМ. Результаты экспериментов представлены в таблицах 2 и 3.

В контрольных образцах (без Э и АА) при инкубации крови здоровых лиц показатели содержания карбонилов белков между пробами без карнозина и в присутствии карнозина достоверно не отличались между собой (Таблица 2). При этом в пробах без карнозина по мере увеличения времени инкубации (через 3 часа) наблюдалось достоверное повышение уровня карбонилов относительно начала (0 часов) инкубации, что свидетельствует о спонтанном окислении белков в этих пробах (р<0,05) (Таблица 2). В контрольных пробах с карнозином с увеличением времени инкубации, достоверного повышения содержания карбонилов белков не происходило (Таблица 2). Это позволяет предполагать, что карнозин тормозит процесс спонтанного окисления белков плазмы крови.

При добавлении к крови 0,5% Э сразу (в 0 часов инкубации) наблюдается достоверный рост содержания карбонилов белков относительно контрольных значений (р< 0,01). Через 1 час и 3 часа инкубации их содержание оставалось практически на том же уровне (как в 0 часов инкубации) (Таблица 2). Аналогичные изменения происходили и в присутствии 1,0%-го раствора Э. При добавлении карнозина в пробы как с 0,5%-м, так и с 1%-м Э уже через 1 час инкубации обнаруживалось достоверное снижение уровня карбонилов относительно значений в пробах с Э (р< 0,01) (Таблица 2). Дальнейшая инкубация (2 и 3 часа) с Э (как с 0,5%-м, так и с 1%-м) в присутствии карнозина приводила к снижению содержания карбонилов белков до контрольных значений (Таблица 2). То есть карнозин оказался эффективным протектором белков плазмы крови от окислительного повреждения, вызванного Э.

Таблица 2 - Влияние карнозина на содержание карбонилов белков (нмоль/мг белка) в плазме крови здоровых лиц при инкубации крови с _этанолом (М±т)_

Время инкубации Контроль Этанол, 0,5% Этанол, 1,0%

Без карнозина (п=20) Карнозин 5 мМ (п=20) Без карнозина (п=15) Карнозин 5 мМ (п=15) Без карнозина (п=15) Карнозин 5 мМ (п=15)

0 часов 0,27±0,01 0,27±0,01 0,32±0,02* 0,31±0,02* 0,35±0,02* 0,32±0,02*

1 час 0,28±0,01 0,28±0,01 0,35±0,02* 0,29±0,02# 0,36±0,02* 0,30±0,02#

2 часа 0,29±0,01 0,29±0,01 0,35±0,02* 0,28±0,02# 0,36t0,01* 0,29±0,02#

3 часа 0,31±0,0Г 0,29±0,01 0,35±0,02* 0,28±0,02# 0,36±0,01* 0,29±0,02#

Примечание: * — р< 0,01 — по сравнению с контрольными значениями; # — р< 0,01 — между соответствующими значениями в пробах: без карнозина и в присутствии карнозина; + — р<0,05 — по сравнению со значениями в 0 часов инкубации; п — количество доноров.

Результаты измерения ТБК-РП в тех же пробах представлены в таблице 3. Содержание ТБК-РП в плазме крови в контрольных пробах без карнозина достоверно превышало исходный уровень уже через 2 часа инкубации (р<0,05). Через 3 часа происходил их дальнейший рост, что подтверждает спонтанное окисление липидов в плазме крови. В контрольных пробах в присутствии карнозина достоверного повышения ТБК-РП не происходило в течение всего периода наблюдения (3 часа). Это говорит о способности карнозина сдерживать процесс спонтанного окисления липидов.

Присутствие в крови как 0,5%, так и 1,0% Э приводит к достоверному росту ТБК-РП по сравнению с контрольными показателями во всех временных точках. Кроме того, по мере увеличения времени инкубации также наблюдается достоверный рост ТБК-РП (р<0,05). Это свидетельствует об активации этанолом ПОЛ в плазме крови in vitro.

Добавление карнозина в пробы как с 0,5%-м, так и 1,0%-м этанолом приводило к снижению содержания ТБК-РП. По мере роста времени инкубации уровень ТБК-РП снижался, и через 3 часа он был ниже контрольных значений (р< 0,01) (Таблица 3).

Таблица 3 - Влияние карнозина на содержание ТБК-реактивных продуктов (нмоль/мл) в плазме крови здоровых лиц при инкубации крови с

этанолом (М±ш)

Время инкубации Контроль Этанол, 0,5% Этанол, 1,0%

Без карнозина (п=15) Карнозин 5 мМ (п=15) Без карнозина (п=12) Карнозин 5 мМ (п=12) Без карнозина (п=12) Карнозин 5 мМ (п=12)

0 час 2,50±0,10 2,50±0,11 2,86±0,14* 2,70±0,15 2,94±0,10* 2,72±0,15

1 час 2,56±0,11 2,55±0,10 3,31±0,06*+ 2,44±0,11# 3,39±0,09*+ 2,47±0,11#

2 часа 2,65±0,1Г 2,63±0,10 3,36±0,10*+ 2,32±0,10# 3,40±0,12*+ 2,4(Ш),11#

3 часа 2,73±0,10+ 2,69±0,10 3,45±0,09*+ 2,23±0,09*# 3,51±0,11*+ 2,26±0,11 *U

Примечание: * — р< 0,05 — по сравнению с контрольными значениями; # — р< 0,01 — между соответствующими значениями в пробах: без карнозина и в присутствии карнозина; + — р<0,05 — по сравнению со значениями в 0 часов инкубации; п — количество доноров.

Таким образом, проведенные исследования показали способность Э индуцировать окислительную модификацию, как белков, так и липидов плазмы крови человека. При этом, если окисление белков происходит сразу после добавления Э в пробу, а затем уровень карбо-нилов не изменяется, то процесс окисления липидов продолжается на протяжении всех 3-х часов, в течение которых велось наблюдение.

Карнозин оказывает протекторный эффект, препятствуя этанол-обусловленному окислению белков и липидов в плазме крови.

Влияние карнозина на окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови в присутствии аиетапьдегида. В данных опытах использовали ацетальдегид в концентрации 0,01%, карнозин - 5 мМ.

Результаты представлены в таблицах 4 и 5. Для данной серии опытов контролем служили те же показатели, что и для опытов с этанолом (Таблица 2 и 3 соответственно).

При добавлении АА в пробы с кровью было обнаружено существенное повышение содержания карбонилов белков в плазме. При этом, в отличие от образцов с этанолом, количество карбонилов белков снижалось по мере увеличения времени инкубации, оставаясь достоверно выше контроля (р<0,01) (Таблица 4). Известно, что АА, благодаря своей высокореакционной карбонильной группе, вступает во взаимодействие со многими биологическими молекулами крови (гемоглобин, белковые факторы свертывающей системы и т.д.), образуя с ними токсичные аддукты [Нужный В.П., Огурцов П.П., 2011].

Таблица 4 - Влияние карнозина на содержание карбонилов белков (нмоль/мг белка) в плазме крови здоровых лиц при инкубации крови с _ацетальдегидом (М±т)_

Время инкубации Контроль Адетальдегид, 0,01%

Без карнозина (п=20) Карнозин 5 мМ (п=20) Без карнозина (п=18) Карнозин 5 мМ (п=18)

0 час. 0,27±0,01 0,27±0,01 - -

1 час 0,28±0,01 0,28±0,01 3,78±0,21* 1,73±0,14*#

2 часа 0,29±0,01 0,29t0,01 3,00±0,17*л 1,36±0,12*#л

3 часа 0,31±0,01+ 0,29±0,01 2,52±0,16*л 1,10±0.09*#л

Примечание: * — р<0,01 — по сравнению с соответствующими контрольными значениями; # — р<0,01 - между соответствующими значениями в пробах: без карнозина и в присутствии карнозина; + - р<0,05 -по сравнению со значениями в 0 часов инкубации; л — р<0,01 - по сравнению со значениями в 1 час инкубации; п — количество доноров.

Вероятно, снижение содержания карбонилов при увеличении времени инкубации происходит вследствие образования таких аддуктов. Уменьшение содержания карбонилов могло происходить и в результате кросс-линкинга белков, инициированного АА [Gaines К.С. et al., 1977; Tyulina O.V. et al., 2002; Бохан H.A., Прокопьева В.Д., 2004].

Добавление карнозина в пробы с АА эффективно снижало содержание карбонилов белков по мере увеличения времени инкубации (р<0,01), однако уровень карбонилов оставался достоверно повышенным по сравнению с контрольными значениями (р<0,01) (Таблица 4).

Таким образом, карнозин защищает белки плазмы от окислительной модификации под действием ацетальдегида.

Действие карнозина на содержание ТБК-РП в плазме крови здоровых лиц при инкубации крови с АА представлено в таблице 5. В пробах с АА содержание ТБК-РП существенно увеличилось по сравнению с контролем во всех временных точках. Причем в нулевой временной точке уровень ТБК-РП был максимальным, через час инкубации он достоверно снизился, и через 3 часа оставался на том же уровне. Из литературы известно, что продукты ПОЛ, в частности малоновый диальдегид, легко взаимодействуют с белками крови с образованием гибридных альдегидных аддуктов, которые могут состоять из различных комбинаций малонового диальдегида, ацетальдегида и белковых комплексов, которые играют важную роль в патогенезе этанол-индуцированных заболеваний [ЗйБЬесН М. а1., 2010; МсСаБкШ М.1. й а1., 2011; МаЬисЫ Я. а1., 2012]. Это позволяет предположить, что снижение ТБК-РП в плазме крови по мере увеличения времени инкубации связано с образованием таких альдегидных гибридных аддуктов.

Таблица 5 - Влияние карнозина на содержание ТБК-реактивных продуктов (нмоль/мл) в плазме крови здоровых лиц при инкубации крови с __ацетальдегидом (М±ш)_

Время инкубации Контроль Ацетальдегид, 0,01%

Без карнозина (п=15) Карнозин 5 мМ (п=15) Без карнозина (п=12) Карнозин 5 мМ (п=12)

0 часов 2,50±0,10 2,50±0,11 4,08±0,11 * 4,06±0,11*

1 час 2,56±0,11 2,55±0,10 3,67±0,10*+ 3,93±0,08*#

3 часа 2,73±0,10+ 2,69±0,10 3,62±0,11*+ 3,26±0,08*Г

Примечание: * - р<0,01 - по сравнению с контрольными значениями; # - р<0,05 - между соответствующими значениями в пробах: без карнозина и в присутствии карнозина; + - р<0,05 - по сравнению со значениями в 0 часов инкубации; п- количество доноров.

Карнозин в данном случае в нулевой временной точке на уровень ТБК-РП заметного влияния не оказывал. Через 1 час инкубации в пробах с карнозином содержание ТБК-РП достоверно превышало его уровень в пробах с АА без карнозина (р<0,05) (Таблица 5). Можно предположить, что в это время карнозин препятствовал образованию аддуктов из продуктов ПОЛ и АА, что и приводило к увеличению ТБК-РП в пробах с карнозином. Через 3 часа инкубации уровень ТБК-РП был достоверно сниженным как по сравнению с пробами АА без карнозина, так и по сравнению с нулевой временной точкой с карнози-

ном (р<0,05) (Таблица 5). То есть в данных экспериментах также наблюдалась выраженная защита карнозином липидов плазмы крови от окисления под действием ацетальдегида.

Молекулярный механизм защиты карнозином биомолекул от окислительной модификации был изучен Хипкисом и соавт. [Hipkiss A.R., Chana Н., 1998; Hipkiss A.R., 2000]. Они доказали, что защита осуществляется в результате взаимодействия аминогруппы карнозина с карбонильной группой модифицированного белка или альдегида с образованием карнозинового аддукта.

Таким образом, как Э, так и АА приводят к окислительной модификации белков и липидов плазмы крови. У АА окислительный потенциал более выражен, чем у Э, что хорошо согласуется с данными литературы [Прокопьева В.Д. и др., 2000; Зиматкин С.М., 2007; Нужный В.П., Огурцов П.П., 2011]. Карнозин эффективно защищает и белки, и липиды плазмы крови от окислительного повреждения, индуцированного как этанолом, так и ацетальдегидом.

Влияние каунозина на белковый спектр плазмы крови после инкубации крови с этанолом или ацетальдегидом.

Результаты исследования белкового спектра плазмы крови после инкубации крови с Э (0,5%) и АА (0,1%) без карнозина и в его присутствии (5мМ) представлены в таблице 6 и на рисунке 3. Видно, что Э заметного влияния на белковый спектр не оказывает (Таблица 6 и Рисунок ЗВ). Это согласуется с данными литературы, в которых было показано, что этанол не влияет на белковый спектр мембран эритроцитов [Прокопьева В.Д., 2003].

После инкубации крови с АА на электрофореграмме появляется полоса в высокомолекулярной области, соответствующая белку с молекулярной массой 334 кДа (Таблица 6 и Рисунок ЗГ), которая отсутствует как в контрольном (Таблица 6 и Рисунок ЗБ), так и в образце с Э (Таблица 6 и Рисунок ЗВ). При этом в образце с АА отсутствуют полосы, соответствующие белкам с массой от 50 до 80 кДа. Этот факт свидетельствует об ацетальдегид-индуцируемом кросс-линкинге белков. Аналогичные результаты были получены при изучении действия АА на белковый спектр мембран эритроцитов другими авторами (Туи-lina O.V. et al., 2002; Бохан H.A., Прокопьева В.Д., 2004).

В присутствии карнозина в образце с ацетальдегидом белковой полосы в высокомолекулярной области не обнаружено (Таблица 6 и Рисунок ЗД). То есть карнозин препятствует ацетальдегид-индуцируемому кросс-линкингу белков плазмы крови.

Таблица 6 - Молекулярная масса белковых полос исследуемых образцов плазмы крови, кДа

Белковые стандарты

250

150 100

70

50

40

30 20

Контроль

162

100

79 70 59 57 48 42

34 24

Этанол 0,5%

179

105

82

59

48 40

37

21

Ацетальдегид 0,1%

334

204

112

46

32

В

Рисунок 3 - Электрофореграммы белков плазмы крови исследуемых образцов: А - белковые стандарты (5-250 кДа); Б - плазма крови контрольного образца; В - плазма после инкубации крови с 0,5%-м этанолом; Г - плазма после инкубации крови с 0,1%-м ацетальдегид ом; Д -плазма после инкубации крови с 0,1%-м ацетальдегидом в присутствии 5 мМ карнозина.

Полученные данные свидетельствуют о способности ацетальде-гида сшивать белковые молекулы плазмы крови, что подтверждает сделанное ранее (см. таблицу 4) предположение о том, что снижение уровня карбонилов белков в присутствии АА по мере увеличения вре-

мени инкубации может происходить в результате образования белковых агрегатов при сшивке белков под действием АА. Карнозин препятствует ацетальдегид-индуцируемому кросс-линкингу.

Таким образом, проведенные исследования показали, что карнозин может рассматриваться как фактор защиты организма в условиях ОС при хронической алкогольной интоксикации. Важной составляющей защитного механизма является способность карнозина предотвращать окислительное повреждение белков и липидов под влиянием этанола и ацетальдегида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования продемонстрировали, что антиокси-дант карнозин снижет выраженность ОС у пациентов с A3 на этапе формирования ремиссии, что следует из снижения содержания карбо-нилов белков и ТБК-РП в плазме крови пациентов, принимавших карнозин, но не плацебо. Карнозин повышает активность СОД в плазме крови и способствует снижению активности аминотрансфераз сыворотки крови у больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии. Способность этого дипептида защищать белки и липиды от окислительной модификации, вызванной этанолом и ацетальдегидом, позволяет использовать карнозин для лечения больных с алкогольной зависимостью.

ВЫВОДЫ

1. Курсовой прием карнозина эффективно уменьшает выраженность окислительного стресса у больных алкогольной зависимостью: снижается содержание карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов, повышается активность супероксиддисмутазы в плазме крови за 1 месяц формирования ремиссии.

2. В результате приема карнозина наблюдается более эффективное снижение активности аминотрансфераз сыворотки крови у больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии.

3. Инкубация крови с этанолом в концентрациях 0,5% и 1,0% приводит к увеличению содержания карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов в плазме крови здоровых лиц.

4. Инкубация крови здоровых доноров с ацетальдегидом в концентрации 0,01% приводит к существенному повышению уровня карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов в плазме крови, а в концентрации 0,1% — к кросс-линкингу белков плазмы.

5. В условиях in vitro карнозин в концентрации 5 мМ эффективно защищает белки и липиды плазмы крови от окислительной модификации, вызванной влиянием как этанола, так и ацетальдегида.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ярыгина, Е. Г. Изменение стабильности эритроцитов в присутствии различных концентраций этанола и ацетальдегида / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева // Сибирский вестник психиатрии и наркологии.-2005,-№4,-С Л4-16.

2. Ярыгина, Е. Г. Влияние этанола и ацетальдегида на морфологию и стабильность эритроцитов человека / Е. Г. Ярыгина, Т. Л. Моисеева, Е. В. Дубинина, В. Д. Прокопьева // Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - Т. 4. - Приложение 1. - С. 41.

3. Прокопьева, В. Д. Модификация белков плазмы крови и эритроцитов при алкоголизме / В. Д. Прокопьева, Е. Г. Ярыгина, Н. А. Бо-хан // Психиатрия в развитии: проблемы и перспективы: материалы XIV съезда психиатров России (Москва, 15-18 ноября 2005 г.). - М., 2005.-С. 495.

4. Прокопьева, В. Д. Оценка роли ацетальдегида в изменении стабильности эритроцитов при алкоголизме / В. Д. Прокопьева, Е. Г. Ярыгина, Е. В. Дубинина // Актуальные вопросы современной психиатрии и наркологии: материалы межрегиональной научно-практической конференции (Омск, 14-15 декабря 2005 г.). - Омск, 2005.-С. 32-34.

5. Ярыгина, Е. Г. Свободнорадикальные процессы и антиокси-дантная защита при алкоголизме / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2006. - Приложение 41.-С. 317-319.

6. Прокопьева, В. Д. Адаптация мембран эритроцитов к хроническому воздействию алкоголя / В. Д. Прокопьева, Е. Г. Ярыгина // Вестник ТГУ. Механизмы индивидуальной адаптации: сборник материалов Всероссийской научной конференции, посвященной памяти и 100-летию проф. В.А. Пегеля (Томск, декабрь 2006 г.). - 2006. -№ 21. - С. 124-125.

7. Скрипка, Н. Н. Гемолитическая устойчивость эритроцитов как информативный показатель оценки эффективности терапии / Н. Н. Скрипка, Е. Г. Ярыгина, Е. Г. Епанчинцева, Е. М. Абушаева // Современные технологии психиатрического и наркологического сервиса / под научной ред. В. Я. Семке. - Томск, 2006. - Т. 3. - С. 163-164.

8. Прокопьева, В. Д. Оценка выраженности окислительного стресса у больных алкоголизмом и его коррекция с помощью севитина / В. Д. Прокопьева, Н. А. Бохан, Е. В. Патышева, Е. Г. Ярыгина, В. В. Сафиуллина, Л. Г. Молькина, Г. П. Ляшенко // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2007. - № 2 (45). - С. 37-40.

9. Прокопьева, В. Д. Коррекция метаболических нарушений у больных алкоголизмом с помощью природного дипептида карнозина /

B. Д. Прокопьева, Н. А. Бохан, JI. Г. Молькина, Е. В. Патышева, Е. Г. Ярыгина, И. JI. Козлова, Г. П. Ляшенко // Вопросы наркологин. -2007.-№ 5.-С. 17-22.

10. Prokopyeva, V. D. Use of the antioxidant carnosine in rehabilitation of alcoholic patients / V. D. Prokopyeva, L. G. Molkina, V. V. Safiulli-na, E. G. Yarygina, E. V. Patysheva // 17th European Society for Neuro-chemistry (ESN) Meeting - 3rd Conference on Advances in Molecular Mechanisms in Neurological Disorders. - Salamanca, Spain, May 19-22, 2007. — PS 1-03, P. 21-22.

11. Прокопьева, В. Д. Влияние севитина на выраженность окислительного стресса и патологическое влечение к алкоголю у больных алкоголизмом / В. Д. Прокопьева, Е. В. Патышева, JI. Г. Молькина, И. JI. Козлова, Е. Г. Ярыгина // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии: материалы XIII научной отчетной сессии ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН, посвящ. 100-летию со дня рождения акад.

0.В. Кербикова (Томск, 4 октября 2007 г.). - Томск, 2007. — Вып. 13. -

C. 173-175.

12. Prokopyeva, V. D. The influence of the antioxidant carnosine on the intensity of the alcoholic patients pathological addiction to alcohol during rehabilitation period // E. G. Yarygina, E. V. Patysheva, L. G. Molkina,

1. L. Kozlova, N. A. Bokhan // European Psychiatry (The Journal of the Association of European Psychiatrists).- Abstract book: 16th European Congress of Psychiatry (Ed.: Cyril Hoschl, Philippe H. Robert).-Nice, France, April 5-9, 2008. - Vol. 23, Suppl. 2.-P.S317-S318.

13. Бохан, H. А. Использование севитина при реабилитации больных алкоголизмом / Н. А. Бохан, Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева, Е. В. Патышева, И. И. Багаутдинов // XV Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов конгресса (Москва, 14-18 апреля 2008 г.). - М., 2008. - С. 485.

14. Ярыгина, Е. Г. Антиоксидантная терапия при алкоголизме / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева, JI. Г. Молькина // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии: материалы XIV научной отчетной сессии НИИ психического здоровья СО РАМН (Томск, 7 октября 2009 г.). -Томск.-2009.-Вып. 14.-С. 158-159.

15. Ярыгина Е. Г. Рандомизированное плацебо-контролируемое исследование эффективности применения севитина у больных алкоголизмом на этапе формирования ремиссии / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева, М. Б. Аржаник, JI. Г. Молькина, Н. А. Бохан // Сибирский медицинский журнал.-2010.-Т. 25, №4.-Вып. 1.-С. 84-88.

16. Ярыгина, Е. Г. Применение севитина для купирования окислительного стресса у больных с алкогольной зависимостью / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева // Онтогенетические аспекты психического здоровья населения: тезисы докладов научно-практической конференции (Омск, 19-20 апреля 2010 г.). - Томск: изд-во «Иван Федоров», 2010. -С. 236-238.

17. Ярыгина, Е. Г. Применение антиоксиданта севитина при оказании реабилитационной помощи больным алкоголизмом / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева, JI. Г. Молькина // XV съезд психиатров России: материалы съезда (Москва, 9-12 ноября 2010 г.). — М., 2010. — С. 275276.

18. Прокопьева, В. Д. Коррекция окислительного стресса у больных с алкогольной зависимостью / В. Д. Прокопьева, Е. Г. Ярыгина, Е. В. Патышева, Н. И. Кисель // Психиатрия, 2010. - № 4 (46). - С. 54.

19. Ярыгина, Е. Г. Защита карнозином белков и липидов плазмы крови человека от повреждающего действия этанола / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева, Н. А. Бохан // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2011. - №2. — С. 12-13.

20. Ярыгина, Е. Г. Протективное действие карнозина при повреждении белков плазмы крови этанолом и ацетальдегидом / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии: материалы XV научной отчетной сессии НИИ психического здоровья СО РАМН (Томск, 6-7 сентября 2011 г.). - Томск, 2011. - Вып. 15. - С. 238-240.

21. Ярыгина, Е. Г. Влияние карнозина на белки плазмы крови при действии этанола in vitro и in vivo / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева // Актуальные проблемы психиатрии: сборник тезисов Всероссийской юбилейной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 125-летию клиники психиатрии им. С.С. Корсакова (Москва, 20-21 декабря 2012 г.). - М., 2012. - С. 239-241.

22. Ярыгина, Е. Г. Оценка эффективности защиты липидов плазмы крови человека от действия этанола антиоксидантом in vivo и in vitro / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева // Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии: сборник тезисов III Всероссийской конференции с международным участием (Томск, 5-6 марта 2013 г.). -Томск, 2013.-С. 182-184.

23. Ярыгина, Е. Г. Защита карнозином белков плазмы крови от ацетальдегид-индуцированного кросс-линкинга / Е. Г. Ярыгина, В. Д. Прокопьева // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии: сборник тезисов XVI научной отчетной сессии ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН (Томск, 8 октября 2013 г.). - Томск, 2013. - Вып. 16. - С. 115-116.

24. Prokopieva, V. D. Carnosine protects blood plasma proteins from damaging effect of acetaldehyde / V. D. Prokopieva, E. G. Yarygina, N. A. Bokhan // J. European Neuropsychopharmacology: Abstracts 27-th ECNP (European college of neuropsychopharmacology) Congress, Berlin, Germany, 18-21 october, 2014. - P. S666-667.

25. Прокопьева, В. Д. Технология коррекции окислительного стресса у больных алкогольной зависимостью на этапе формирования ремиссии / В. Д. Прокопьева, А. В. Солонский, Е. Г. Ярыгина, Н. А. Бохан. — Медицинская технология. — Томск: изд-во «Иван Федоров», 2014.- 15с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА — ацетальдегид

A3 - алкогольная зависимость

БАД — биологически активная добавка

ОС — окислительный стресс

ПОЛ — перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

ТБК— РП - суммарные перекисные продукты в реакции с тиобарбиту-ровой кислотой Э - этанол

ЭФ ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле

Подписано к печати 25.11.2014 г. Формат 60х84|/1б. Печать ризографическая. Бумага офсетная № 1. Гарнитура «Times Roman». Тираж 100 экз. Заказ № 1444813 .

Тираж отпечатан в типографии «Иван Фёдоров» 634026, г. Томск, ул. Розы Люксембург, 115/1 тел.: (3822) 78-80-80, тел./факс: (3822) 78-30-80 E-mail: mail@if.tomsk.ru