Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Технология и исследование парентральных лекарственных форм карпозина ранозаживляющего действия

На правах рукописи

МАЙДЫКОВА ЭЛЛА ЕВГЕНЬЕВНА

ТЕХНОЛОГТШ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРЕНТЕРАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ КАРПОЗИНА РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕГО

ДЕЙСТВИЯ

15.00.01. — технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иа соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Московской медицинской академии

им. И.М. Сеченова

Научные руководители :

доктор фармацевтических наук, профессор Т.С.Кондратьева доктор медицинских наук З.Х.Корнилова

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор С.П.Гладких

кандидат фармацевтических наук, ; ¡.Л.\■

Ведущее учреждение:

Научно — исследовательский институт фармации — НИИФ

Защита состоится "' е " 1995 г. в 15 часов на

заседании диссертационного Совета Д 074.Q5.0o прн Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова ( г. Москва, Суворовский бульвар, д. 13 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии ( Зубовский бульвар, д.37/1 )

Автореферат разослан " №" 1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 074.05.06, кандидат фармацевтических наук, доцент

Н.П. Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В последнее десятилетие отмечается четкая тенденция роста заболеваемости и смертности от болезней легких ( Чучалин А.Г., 1991 ). В этих условиях особую значимость приобретают поиск, разработка и внедрение в медицинскую практику эффективных отечественных препаратов, способных сократить продолжительность некротической фазы процесса заживления и обеспечить более быстрое и полное восстановление поврежденных клеток легких. Наибольший интерес с этой точки зрения представляют регуляторные пептиды, способные участвовать в различных физиологических процессах организма с обеспечением многих жизненно важных функций. Исследованиями последних лет установление, что легкие являются пептидершческон системой, продуцирующей довольно много пептидных соединений ( Сыромятникова Н.В.,1987;Чучалин А.Г.,1989; Булгаков СЛ., 1991 ), поэтому синтезированные отечественные пептиды ( бомбезин, даларгин, фактор роста нервов, карнозин и др. ) можно рассматривать в качестве потенциальных лекарственных средств, способных влиять на регенерацию тканей легких. В ходе скрининга 10 природных соединений, влияющих на внутриклеточный метаболизм, установлено, что наиболее эффективно влияет на регенерационные процессы дипептид карнозин, ускоряя процесс заживления экспериментальной раны легкого в 2 раза ( Корнилова З.Х., 1991,1992 ). В связи с высокой биологической активностью карнозина открываются новые возможности его использования в пульмонологии в качестве ранозажнвляющего средства.

В настоящее время на С.-Петербургском заводе мед.препаратов разработана оригинальная технология субстанции карнозина из отходов производства АТФ, а также из мышц крупного рогатого скота

( A.c. 4695347,1989 ). Однако до настоящего времени какие-либо лекарственные формы карнозина отсутствуют. В связи с этим, разработка и внедрение в медицинскую практику эффективных отечественных лекарственых форм карнозина является актуальной проблемой.

При разработке лекарственной формы карнозина отдано предпочтение инъекционным растворам, поскольку они обеспечивают более длительное сохранение высоких концентраций карнозина в очаге поражения за счет замедления процессов его расщепления. Кроме того, инъекционные растворы наиболее универсальны в плане использования при различных патологических состояних.

Цель и задачи исследования. Целыо настоящего исследования явилось теоретическое обоснование и экспериментальная разработка составов и технологии стабильных, эффективных, безвредных инъекционных растворов карнозина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- теоретически и экспериментально обосновать составы комплексных стабилизаторов растворов карнозина, выявить факторы, влияющие на их устойчивость на всех стадиях технологического процесса;

- узучитъ возможность проведения дополнительной очистки карнозина;

- апробировать имеющиеся, а при необходимости разработать новые физико-химические методики оценки качества инъекционных растворов;

- исследовать стабильность разработанных растворов карнозина в процессе хранения, установить сроки их годности;

-изучить специфическую активность инъекционных растворов карнозина в качестве ранозаживлягощего средства;

-составить проект ВФС на инъекционный раствор карнозина для представления в Фармакологический комитет Минздравмедпрома РФ России.

Научная новизна исследований. На основании экспериментального изучения веществ с различным механизмом ангиоксидантного действия обоснованы комбинации стабилизаторов, обеспечивающие стабильность 5% раствора карнозина в течение 2-х лет хранения (время наблюдения ).

Впервые изученено влияние чистоты субстанции на стабильность 5% раствора карнозина. Теоретически обоснованы и экспериментально разработаны технология изготовления и методики анализа 5% раствора карнозина. Показана возможность повышения качества карнозина, выпускаемого С.-Петербургским заводом, путем осуществления дополнительной очистки субстанции методом переосаждения и с использованием селективных для металлов ионообменных смол. Экспериментально установлены оптимальные условия разделения основного действующего вещества - карнозина и примесей аминокислот р - аланина и Ь -гистиднна при их совместном присутствии хроматоспектрофотометрическим методом.

Впервые в ходе экспериментальных исследований выявлен антиоксидантный эффект раствора карнозина разработанного состава, по силе действия сходный с ионолом. В опытах на животных изучено ранозаживляющее действие 5% растворов карнозина с различными значениями рН ( 8,3 и 5,4 ). Установлена выраженная специфическая активность, биологическая безвредность и стабильность в процессе длительного хранения предложенного для ВФС 5% раствора карнозина.

Практическая значимость работы. Разработаны составы, методы анализа и воспроизводимая технология эффективных и стабильных 5% растворов карнозина. Составлен проект ВФС на 5% инъекционный раствор карнозина, изготовляемый из заводской субстанции.

Разработана хроматоспектрофотометрическая методика количественного определения карнозина в присутствии сопутствующих примесей аминокислот.

В связи с выявленным, сходным с ионолом, антиоксидантным эффектом предложенного для ВФС состава раствора карнозина даны рекомендации по возможному его использованию для стабилизации липидов и фосфолипидов с целью предотвращения процессов липопероксидации.

С целью получения субстанции карнозина с более высоким содержанием основного действующего вещества, разработана методика проведения дополнительной очиски карнозина в лабораторных условиях.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Всесоюзной конференции биохимиков " Карнозин - биологическая роль и применение в медицине " ( Москва, февраль, 1992 ), на научных конференциях кафедры технологии лекарственных форм ММ А им. И.М.Сеченова ( май 1992, октябрь 1992 ), на межкафедральной конференции кафедр технологии лекарственных форм, фармацевтической химии и фтизиопульмонологии ММА им.И.М.Сеченова (декабрь 1992 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ММА

им.И.М.Сеченова по теме : " Разработка рациональных лекарственных форм и их исследование относящиеся к проблеме 10.06. Фармация.

Положения выдвигаемые на защиту. На защиту выносятся результаты исследований по теоретическому обоснованию и разработке составов и технологии 5% инъекционных растворов карнозина в зависимости от степени чистоты субстанции; результаты разработки методов контроля качества и изучения стабильности 5% инъекционных растворов карнозина , а также результаты исследования их специфической активности и биологической безвредности.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав экспериментального исследования, общих выводов, библиографии и приложений. Работа изложена на страницах, содержит 29 таблиц, 23 рисунка. Список Л1ггературы включает 260 источников, из которых 77 на иностранных языках.

Во введении сформулированы актуальность темы, научная новизна исследований и практическая значимость результатов работы.

Глава 1 содержит обзор литературы, в котором представлены данные о современном состоянии проблемы использования антиоксидантов и регулягорных олигопептидов в качестве ранозаживляющего средства. Показана перспективность применения карнозина с целью стимуляции регенерационных процессов. Обобщены методы получения высокоочищенных органопрепаратов.

В главе 2 представлены характеристика объектов исследования; разработка методик качественного и количественного определения карнозина в инъекционном растворе, а также методика предварительной оценки доброкачественности инъекционного раствора при выборе условий его стабилизации.

е

В главах 3,4,5 изложены результаты исследования по стандартизации заводской субстанции карнозина; разработки составов и технологии инъекционных растворов в зависимости от чистоты субстанции. Показана эффективность 5% инъекционных растворов карнозина в качестве ранозаживляющего средства.

Структура диссертационной работы основана на логической последовательности раскрытия цели и оптимальном изложении полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовали карнознн 3-х серий, полученный биологическим путем из мышц крупного рогатого скота на С.-Петербургском заводе мед. препаратов; карнозин ( по 3 серии ), полученный нами после проведения дополнительной очистки заводских образцов. В качестве вспомогательных веществ использовались: кислоты - хлористоводородная, лимонная; тиомочевина, трилон Б. Лекарственные, вспомогательные вещества и упаковочные материалы отвечали требованиям нормативной документации.

Карнозин-дипептид ( Р - аланил - Ь-гистидин ) по физико-химическим свойствам представляет собой кристаллический порошок белого цвета, легко растаоримын в воде, нерастворимый в хлороформе, 96% этаноле, эфире.

Идентификацию карнозина проводили спекгрофотометрическим и хроматографическим методами. В УФ области спектр карнозина аналогичен спектру поглощения гистидина. Спектр, снятый в видимой области после диазореакции на карнозин, имел один максимум поглощения при длине волны 490 ± I нм. Хроматографирование проводили в тонком слое сорбента на пластинках "Снлуфсш" в системе

растворителей ( 96% этанол - 25% раствор аммония гидроксида - вода в соотношении 7:2:1). Пятна идентифицировали по характеру окрашивания и условиям детектирования веществ. Кариозны проявлялся без нагревания в виде коричневого пятна, гистидин - при нагревании пластинки при 70° С в течение 15 мин в виде фиолетового пятна. Средняя величина ИХ для карнозина составляла 0,54 ± 0,02; для гистидина - 0,69 ± 0,01. Предел обнаружения карнозина - 0,5 мкг.

В связи с наличием в заводской субстанции карнозина примесей аминокислот, для количественного определения дипептнда в инъекционном растворе апробирована спектрофотометрическая методика в видимой области при длине волны 490 ± 1 нм. Подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера наблюдалось в диапазоне рабочих концентраций от 1 до 5 мкг I мл. Чувствительность методики составляла I мкг / мл. Относительная ошибка отдельного определения не превышала 3,22%. При использовании данной методики количество примесей аминокислот, из-за их незначительного содержания в пробе, не оказывало влияния на точность определения карнозина. Данный факт был установлен хроматоспекгрофотометрическим методом.

Для количественного определения карнозина также была рассмотрена возможность применения спеюрофотометрни в УФ области. Несмотря на многие положительные стороны данного метода, выявлены объективные причины, ограничивающие его использование для количественного определения дипептнда.

Обнаружено, что нестабилизнрованные растворы карнозина при хранении подвергались процессам деструкции. В результате образовывались продукты, вызывающие изменение окраски раствора и характер поглощения в УФ области. Установлена зависимость между появлением продуктов деструкции - изменением окраски раствора -

изменением характера попгащения в УФ области. Исходя из установлено» зависимости, решить вопрос о стабильности растворов карнознна можно уже по изменению одной из указанных величин. Поэтому методикой прямого спехтрсфстометрнческсгс определен»« можно воспользоваться для проведения предварительной оценки доброкачественности инъекционного раствора карнозина на стадии выбора условий его стабилизации.

Определение значения рН и окислнтсльно-восстановш'ельного потенциала раствора проводили потенциометрически на рН-мстре 340 и рН-метре 121 соответственно.

Окраску и прозрачность раствора оценивали визуально и путем определения оптической плотности на КФК-2 при длине волны 315 нм и светофильтре 4. Допустимым пределом изменения окраски растворов карнозина, заложенных на хранение, служила величина светопропускания эталона № 5а .

Для определения совместимости компонентов раствора, его стабильности при хранении, выявления возможных примесей в субстанции использовали метод тонкослойной хроматографии на пластинках " Сшгуфол УФ-254 " в двухмерной системе растворителей: 1-я система - 96% этанол: 25% раствор аммония гидроксида (4 : 1 ), 2-я - 96% этанол : вода (7:3). Детектирование проводили 0,25 % спиртовым раствором нингидрина. Чувствительность методики - 0,5 мкг карнозина.

Для выявления примесей металлов в субстанции карнозина использовали метод атомно-абсорбционной спектроскопии на приборе ААЗ-З ( Карл-Цейс-Йена, Германия ).

Испытания на стерильность проводили в соответствии с ГФ X1.

Антиоксндантную активность предложенных составов раствора карнозина устанавливали по скорости образования малонового

э

диальдегила в лнпосомальнон ткани по методики ОНка\уа Н.,ОЫбЬ| N.. Килю а, 1973.

Специфическую активность инъекционного раствора изучали на модели операционной раны легких и кожи на морских свинках. Результаты оценивали планиметрически и гистологически на 1,3,7, 14 сух после ранения.

Стандартизация субстанции карнозина

При изготовлении парентеральных препаратов необходимо использовать максимально очищенные от балластных лекарственные вещества, ввиду возможности оказания примесями побочных действий на организм и их влияния на стабильность лекарственной формы.

Предварительные хроматографические исследования карнозина, полученного методом экстракции, показали наличие примесей аминокислот ( Ь - гистидина и р - аланина ), отсутствующих в паспорте на данную субстанцию. Исходя из этого, возникла необходимость стандартизации субстанции ( выявления наличия, природы и количества примесей в выпускаемом С.-Петербургским заводом каркознне), а также в изучении возможности их удаления.

Учитывая способ получения дипептида ( А.с. 4695347,1989 ), наличие предполагаемых свободных аминокислот и фосфолипидных комплексов определяли хроматографическими методами. В результате исследований установлены примеси следующих аминокислот : Ь-гистидина, р - аланина. тирозина, фенилаланина, лизина. Выявление примесей аминокислот в исходной субстанции, особенно Ь-гистидина и р -аланина имело важное значение, поскольку помимо изначального присутствия они образуются в результате гидролиза карнозина.

Для определения количественного содержания аминокислот и дипептида при одновременном их присутствии разработана хроматоспектрофотометрическая методика. Для более полного разделения этих веществ выбран метод двухмерной тонкослойной хроматографии с описанными выше системами растворителей. Оптимальная десорбция определяемых веществ наблюдалась при элюировании на магнитной мешалки в течении 60 мин. Поскольку в течение одного часа десорбция карнозина постоянно была одинаковая ( 84%), то это позволило ввести поправочный коэффициент 1,19 на полноту элюирования веществ. Относительная ошибка определения с учетом поправочного коэффициента не превышала 3,72 %. В результате разработанной хроматоспектрофотометрической методики в заводской субстанции карнозина обнаружено 87,44% основного действующего вещества и 11,31% суммы аминокислот. Поскольку молекулы обнаруженных аминокислот не содержали хромофорные 1руппы, их присутствие в растворе не могло влиять на изменение его окраски.

С целью установления природы примесей, способных изменять окраску растворов, заводская субстанция карнозина исследована на содержание ионов металлов в лаборатории микрозлементного анализа фармацевтического факультета ММА им.И.М.Сеченова. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии установлено наличие примесей следующих тяжелых металлов : Сг - 0,669 мкг/мл; РЬ - 2,738 мкг/мл; Си -0,726 мкг/мл; Ре - 1,301 мкг/мл; Мп - 0,060мкг/мл; № - 1,084 мкг/мл; 2п -0,065 мкг/мл. В ходе последующих исследований установлено их отрицательное влияние на стабильность растворов карнозина в процессе хранения. В связи с этим проведены исследования возможности повышения качества заводской субстанции карнозина.

Для освобождения от примесей аминокислот использовали метод осаждения, заключающийся во введении перегнанного этанола в

насыщенный раствор карнозина с последующим охлаждением системы до 3-5° С. Данный метод ( 1 ) очистки позволял освободиться от примесей аминокислот и малоэффективен для удаления ионов металлов. Для очистки карнознна от последних использовали ионообменную смолу " СЬе1ех - 100 селективную для удаления 2-х и 3-х валентных ионов металлов. Поэтому второй способ очистки совмещал использование ионита с последующим осаждением карнознна перегнанным этанолом ( II ). Полученные в процессе очистки ( I и II ) пробы карнозина, анализировали с использованием хроматографических и атомно-абсорбционных методов. Результаты анализа представлены в табл. 1.

Таблица 1

Влияние дополнительной очистки на качество заводской субстанции карнозина_____

Показатели качества Заводской карнозин Карнозин, очишеннын осаждением Карнознн.очище нный через нонит с послед.осажден.

Содержание карнозина, мкг/мл 37,49 96,29 91,79

Содержание аминокислот, мкг/мл 11,32 3,13 2,74

Наименование элемента, мкг/мл:

Сг 0,669 0,507 0.501

РЬ 2,738 1,050 0,493

Си 0,726 0,516 «0,05

Ре 1,30! 0,762 0,442

Мп 0,069 0,212 «0,05

№ 1,084 0,589 0,437

7п 0,065 0,046 «0,05

Сй 0,033 «0,05 «0,05

Из данных табл.1 видно, что предлагаемые способы очистки позволили получить субстанцию карнозина более высокого качества за счет снижения содержания примесей с 11,3% доЗ%.

Таким образом, использование предложенных методов очистки повышало качество заводской субстанции карнозина. Поэтому их можно применять в лабораторных условиях при получении высокоочищенной субстанции.

Разработка составов и технологии инъекционных растворов карнозина

Для обоснования оптимальной концентрации растворов карнозина проведено экспериментальное изучение терапевтической эффективности инъекционных растворов карнозина 0,1%; 03%; 0,5%; 1%; 3%; 5%; 10%; 20% концентраций на кафедре фтизиопульмонолоши ММА им.И.М.Сеченова. Об эффективности инъекционных растворов карнозина судили по скорости регенерационных процессов в зоне повреждения с учетом динамики клеточных изменении в 1,7,14 сут, а именно по снижению числа выселяющихся макрофагов и повышению числа фнбробластов и лимфоцитов. В результате исследования установленно, что проявление терапевтического действия находилось в прямой зависимости от концентрации раствора и достигало максимума при концентрации 5%. Дальнейшее увеличение концентрации существенно не усиливало терапевтического действия карнозина.

Исследования показали, что карнозин в водном растворе при хранении подвержен процессам деструкции, протекающим по гидролизно-окисиительному типу. Продукты деструкции физиологически неактивны, некоторые ( гистидин ) оказывали нежелательное действие на организм. Поэтому с целью получения устойчивых инъекционных растворов карнозина были использованы разлнчииые стабилизаторы, а также изучено влияние на стабильность действия температуры, значения рН и чистоты исходной субстанции карнозина.

С целью обеспечения стерильности изучена возможность термической стерилизации, как наиболее доступного и надежного метода. Поскольку использование данного вида стерилизации сопровождалось изменением окраски раствора, то применение термической стерилизации для растворов карнозина невозможно.

Таблица 2

Влияние значении рН на стабильность раствора карнозина

Используемые для подкисления вещества Значение рН Время появления окраски раствора, суг Концентрация карнозина через 14 сут хран. при 57+2° С, %

Буферный раствор (рН 1,0 ) 7,6 ±0,1 9 87+2,57

Буферный раствор (рН 1,2 ) 7,6 + 0,1 9 87 ± 2,38

К-та НС1, конц. 6,8 ± 0.2 10 87 ± 1,97

К-та лимонная 5,4 ±0,2 12 92 ± 2,39

Р-р карнозина без подкисления 8,3 ±0, 1 3 81+ 1,89

В процессе работы установлена зависимость между появлением окраски в растворе дипептида и происходящих в нем деструктивных процессах. Об окислительном характере деструкции судили по изменению величины окислительно-восстановительного потенциала раствора карнозина в процессе стерилизации и хранения. Продукты гидролиза определяли методом ТСХ . Поскольку гидролиз и окисление являются рН зависимыми процессами, было изучено влияние рН среды на стабильность растворов карнозина. Введение 0,1 моль/ л раствора кислоты хлористоводородной или буферных смесей не обеспечивало сдвиг значения рН раствора в кислую область. Это объясняется тем, что

в структуру карнозина входит кислота Ь-гистидин с основными свойствами и обладающая сильной буферной емкостью. Изменить значения рН растворов карнозина удалось путем введения растворов со значением рН шоке 2,0. Для этого были выбраны: буферные растворы со значением рН 1,0 и 1,2; кислоты хлористоводородная концентрированная и лимонная . Результаты экспериментальных исследований, представленные в табл.2, показали, что наибольший сдвиг рН до 5,4 наблюдался при введениии лимонной кислоты, при этом скорость появления окраски в растворе карнозина меньше, а содержание днпептида выше по сравнению с неподкисленным раствором. Кроме того, учитывая, что лимонная кислота обладает способностью к комгшексообразованию,( за счет чего и относится к группе антиоксндантных синергистов ), то ее использование в качестве закнсляющего компонента наиболее обосновано.

Дальнейшие исследования показали, что для получения длительно стабильного в процессе хранения раствора карнозина одного изменения значения рН недостаточно. Поэтому для стабилизации препаратов были использованы ингибиторы свободно-радикальных реакций относящихся к разным группам: анальгин, кислота аскорбиновая, натрия сульфит, натрия метабисульфит, тномочевина, цистеин, гексаметилентетрамин, диоксидин, унитиол, трилон Б, твин 80, полившшлпирролидон в концентрациях 0,05-1%. Скрининг антиоксидантов в 5% растворе карнозина стабилизированном лимонной кислотой, проводили методом " ускоренного хранения " при 40° С . В процессе хранения качество препаратов оценивали по следующим показателям : прозрачность, окраска, отсутствие продуктов разложения, концентрации раствора карнозина. Установлено, что из 12 - ти соединений наибольшей стабилизирующей активностью обладали вещества из группы

безрадикально разлагающих гидроперекисей : натрия сульфит, тиомочевина, цистеин, гексаметилентетрамин, а также комплексен трилон Б. Эти вещества позволяли в максимальной степени предотвратить изменение окраски исходных растворов, значений рН и сохранить не менее 90% действующего вещества в процессе хранения.

Однако ни одно из изученных соединений не обеспечивало стабильность раствора карнозина при длительном хранении ( ни менее 2-х лет ). Исходя из этого, проведен поиск сннергической композиции стабилизаторов, включающий вещества с различным механизмом антиокислительного действия за исключением группы, реагирующей со свободными радикалами. Наилучшие результаты были достигнуты при комбинации тиомочевины, цистеина, натрия сульфита с трилоном Б. Использование таких комплексных стабилизаторов позволило сохранить исходную окраску , рН и концентрацию 5% раствора карнозина в интервале допустимых отклонений после 180 дней " ускоренного хранения " при температуре 40° С, что эквивалентно 2-м годам хранения в естественных условиях.

Учитывая физиологический механизм действия карнозина при выборе оптимальнго состава инъекционного раствора, изучили влияние композиции стабилизаторов на биологическую стабильность по способности предохранять липиды от липопероксидации. В результате проведенных исследований установлено, что состав : карнозин - тиомочевина - трилон Б - кислота лимонная проявлял близкий с ионолом антиоксидантный эффект ( снижение малонового диальдегида при использовании ионола и данного состава наблюдалось на 75'% и 71% соответственно ; снижение диеновых конъюгатов - на 65% и 61% соответственно ). Кроме того, введение комплексного стабилизатора способствовало снижению скорости

образования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в 265 раз по сравнению с нестабилизированньши растворами карнозина.

Проведенные исследования позволили обосновать выбор эффективного и стабильного в процессе длительного хранения состава 5% раствора карнозина для инъекций, изготовленного из заводской субстанции.

Т. Состав: карнозин (в пересчете на 100% содержание дипептида )

5,0

тиомочевина

(ГОСТ 6344-73) 0,2

трилон Б

(ФС 42- 1173-78 ) 0,05

кислота лимонная ( ГФ X изд., с.888 ) 2,0

вода для инъекций

(ФС 42-2620-89) до 100 мл

Для выявления влияния качества исходной субстанции дипептида сравнивали условия создания стабильных растворов карнозина, изготовленных из субстанций различной чистоты. Для сравнения использовали карнозин, полученный путем очистки описанными выше способами. Стабилизацию растворов проводили путем изменения значений рН в более кислую сторону, используя для этого кислоту лимонную и введения тиомочевины с трплоном Б.

В процессе исследований установлено, что оптимальным значением рН, задерживающим процессы деструкции в растворах, изготозленных из карнозина , полученного после дополнительной очистки, можно считать 7,6 против 5,4 при использовании заводской субстанции. Кроме того, добавление только трилона Б к раствору, изготовленного из карнозина очищенного вторым способом ( с применением ионообменной смолы и последующим осаждением ), уже достаточно для предотвращения процессов деструкции и получения

сп Сильных растворов. В растворах, изготовленных из карнозииа очищенного первым способом ( путем осаждения перегнанным этанолом ), для предотвращения процессов деструкции при значении рН 7,6 кроме введения трилона Б требуется еще добавление автиоксиданта - тиомочевины в концентрации 0,1%, что в 2 раза ниже, чем при использовании заводской субстанции. Проведенные исследования подтвердили зависимость стабильности растворов от чистоты исходной субстанции и показали положительное влияние описанных выше методов очистки на повышение качества заводского карнозина ( чем меньше различных примесей в субстанции, тем меньше требуется введения стабилизаторов в раствор).

В результате научно обоснованы стабильные в процессе хранения составы 5% раствора карнозина, изготовленные из субстанций различной чистоты.

ЛГ. Состав : карнозин, очищенный с применением ионо обменной смолы с последующим осаждением перегнанным этанолом в пересчете на 100% - 5,0 трнлонБ

(ФС-42-1173-73) -0,05

кислота лимонная

(ГФ X изд., с.888 ) - 1,0

вода для инъекций

( ФС 42- 2620 - 89 )

- до 100 мл

Ж. Состав : карнозин, очищенный осаждением перегнанным этанолом в пересчете на 100% тиомочевина

-5,0

( ГОСТ 6344 - 73 )

-0,1

трилон Б

(ФС-42- 1173-73)

-0,05

кислота лимонная

( ГФ X изд., с.888 ) вода для инъекции ( ФС 42 - 2620 -89)

- до 100 мл

- 1,0

Технологическая схема производства и контроля 5% раствора карнозина представлена на рис. I. Особенностью технологического процесса являлось введение карнозина в уже готовый раствор стабилизаторов.

Для освобождения от механических включений и стерилизации выбран метод стерилизующей фильтрации с использованием шприц-насадки через бактериальлные фильтры " Мнллипор " с размером пор 0,22 мкм и подложенным предфильтром с диаметром пор 0,45 мкм. Растворы разливали по 4 мл во флаконы ( ФИ - 5 ). Упаковку и оформление проводили в соответствии с требованиями НД.

Изучение стабильности растворов карнозина, изготовленных из субстанций различной чистоты, проводили при различных температурах : при температуре 3 - 5 °С ( 277 К ); при комнатной температуре не выше 25° С ( 293 К ); а также методом " ускоренного хранения " при повышенных температурах - 30° и 40° С ( 313 К ). Критериями стабильности растворов служили : прозрачность, окраска, отсутствие механических включений, концентрация раствора дииептида, значение рН, стерильность, величина Rf карнозина и отсутствие дополнительных пятен на хроматограммах (в трех системах растворителей ). Контроль качества инъекционных растворов по всем показателям проводили через промежутки времени, эквивалентные б, 12,18,24 месв обычных условиях (табл. 3 и 4 ).

Результаты исследований показали, что в течении всего срока наблюдения при указанных выше температурах, инъекционные растворы карнозина сохраняли стерильность, оставались бесцветными и прозрачными, значение рН и концентрация растворов дипептида изменялись в пределах ошибки методики.

Рис. I Схема технологического процесса 5% инъекционного раствор карнозина

Полученные данные свидетельствовали о стабильности исследуемых инъекционных растворов карнозина в процессе указанных сроков хранения. Срок годности разработанных составов инъекционных растворов составил 2 года в естественных условиях, а также 4 -е года в условиях холодильника.

Полученные экспериментальные данные легли в основу проекта ВФС на 5% раствор карнозина, изготовленный из заводской субстанции.

Специфическая активность 5% инъекционного раствора карнозина

Ранозаживляющее действие карнозина в виде 5% раствора для инъекций определяли на морских свинках массой 300 - 320 г., используя модели асептической колото-резанной и операционной ран легких. О характере воздействия карнозина на течение раневого процесса судили по скорости заживления ран, данным гистологических и макроскопических исследований. Площадь сокращения раны оценивали в динамике с помощью планиметрического метода, разработанного Л.Н.Поповон через 1 - 5 сут и по гистологическим изменениям на 3-й, 7-е, 14-е, сут ( табл. 5).

Таблица 5

Процент уменьшения площади раны кожи при введении различных составов расгвора карнозина

Состав инъекционного р-ра карнозина Площадь раны, мм ; через 1 сут Площадь раны, мм; через 5 сут Процент уменьшения площади раны за 1 сут

Свежеприготовлен ный р-р карнозина без стаб. (рН 8,3 ) 18,1 2,0 22,3

Р-Р карнозина (со стаб., рН 5,4) 23,4 4,8 20,9

Контроль- физ. р-р 24,2 19,2 5,2

Таблица 4.

Результаты анализа инъекционных растворов карнозина в процессе хранения в стеклянных флаконах при 293 и 313 К

Пропись инъекционного раствора карнозина Показатели качества Свежепри готовлен — ный раствор Время храпения в обычных усювиях, эквивалентное сроку экспериментального хранения, мес

293 К 313 к

6 12 13 24 6 12 18 24

I окраска раствора не выше эталона 5а то же

значение рН 5,410.1 5,310,1 5,310,1 5.3Ю, 1 5,410,1 5,410,1 5,410,1 5,ЗЮ, 1 5,310,1

концентрация р—ра карнозина. % 5,11±0,46 4,9810,27 4,9910,37 5,0210,49 5,0910,37 5,1210,13 5.0410,46 5,0210,49 5,0910,37

стерильность стерильно то же

II окраска раствора не выше эталона 5а то же

значение рН 7,6±0,1 7.6+0,1 7,610.1 7,610,1 7,5Ю,1 7.5Ю.1 7,610,1 7,610,1 7,6+0,1

концентрация р —ра карнозина, % 5,0410,37 5,0410,42 5,0910,37 5,0910,37 5,0110,48 5,1210,27 5,1110,37 5.09Ю.37 5,0110,48

стерильность стерильно то же

111 окраска раствора не выше эталона 5а то же

значение рН 7,610,1 7,610,1 7(5Ю.1 7,610,1 7,6Ю,1 7,610,1 7,510,1 7,б±0,1 7,510,1

концентрация р —ра карнозина, % 5,01±0,48 4,9810,57 5,0910,27 5,1310,54 5,0710,48 5,1310,19 5,0410,27 5,1310,54 5,0710,48

стерильность стерильно то же

Примечание: в таблице указаны средние значения 3-х — 5—та измерений.

Таблица Д

Результаты анализа инъекционных растворов карнозина в процессе хранения в стеклянных флаконах при 276 и 3)3 К

Пропись инъекци — онного раствора карнозина Показатели качества Свежепри готовлен — ный раствор Время хранения в условиях холодильника, эквивалентное сроку экспериментального хранения, мес

277 ТС 313 К

6 12 18 24 6 12 18 24

I окраска раствора не выше эталона 5а то же

значение рН 5,410,1 5,310,1 5,4Ю,1 5,410,1 5,310,1 5,ЗЮ,1 5,410.1 5,410,1 5,310,1

концентрация р —ра карнозина, % 5,05±0,34 5,0510,46 4,9810,56 5,08±0,35 4,9910,67 5,1310,32 5,0210,46 5,08+0,35 4,9910,67

стерильность стерильно то же -" — — " — --" — — " — — " — — " —

II окраска раствора не выше эталона 5а то же

значение рН 7,610,1 7,6±0,1 7,610.1 7,510,1 7,510,1 7,6Ю,1 7,610,1 7,610,1 7,610,1

концентрация р —ра карнозина, % 5,1±0,52 5,110,34 5,1310,46 5,1310,44 5,0310,54 5,0110,28 4,9810,37 5,1310,44 5,0310,54

стерильность стерильно то же

Ш окраска раствора не выше эталона 5а то же

значение рН 7,6±0,1 7,610,1 7,6±0,1 7,510.1 7,610,1 7,510,1 7,610,1 7,610,1 7,610,1

концентрация р —ра карнозина, % 5,0710,38 5,0110,46 4,93Ю,31 5,1110,13 5,0710,24 4,0810,48 5,0810,43 5,11Ю,13 5,0710,24

стерильность стерильно то же

Примечание: к таблице указаны средние значения 3-х — 5—ти измерений. Прописи растворов указаны на следующей странице.

Данные, представленные в табл. 5, показывают положительное влияние растворов карнозина на скорость ранозажнвления. Независимо от значения рН, оба раствора карнозина к 5-м сут вызывали значительное снижение площади раны, превышающее контроль в 5 - 10 раз. При этом, использование раствора карнозина ( свежеприготовленного, нестабнлизированного со значением рН 8,3) вызывало некоторое уменьшение площади раны уже в первые сут, по сравнению со стабилизированным раствором карнозина со значением рН 5,4. Однако к 5-м сут повреждения существенной разницы в уменьшении площади раны при использовании растворов карнозина с рН 8,3 и 5,4 не наблюдалось. Основываясь на проведенных исследованиях, можно заключить, что введение стабилизаторов и подкисление раствора карнозина приводили к задерживанию его действия на ранних стадиях заживления. В тоже время использование раствора карнозина с рН 5,4 приводило к формированию более нежного рубца, который в 25% случаев через год полностью редуцировался.

Данные морфомстрических исследований свидетельствовали об улучшении васкуляризации поврежденной ткани при лечении карнозином ( число сосудов на фоне дипептида в 2 раза больше по сравнению с контролем ). Кроме того, карнозин достоверно увеличивал число лимфоидной ткани, что свидетельствовало об иммуномодулнругощем эффекте препарата.

В результате изучения биологической безвредности 5% инъекционного раствора карнозина не выявлено патологических изменении в органах животных, в том числе н аллергических реакций.

Таким образом, установлена высокая специфическая активность инъекционного раствора карнозина.

На основании результатов комплексных исследований составлена нормативная документация на 5% инъекционный раствор карнозина (проект ВФС и сопровождающая документация).

Выводы

1. На основании результатов физико-химических и технологических исследований проведена стандартизация субстанции карнозина, выпускаемой С.-Петербургским заводом мед.пренаратов. Изучен характер примесей; они представлены свободными аминокислотами : Ь - гистидин, р - аланин, лизин, тирозин,

2' г< ¿> 2.* I*

фенилаланин и ионами металлов : Сг ; N1; РЬ ; Си; 2!п; Са ; Мп; Ре . С целью снижения содержания примесей предложена дополнительная очистка , с использованием метода осаждения перегнанным этанолом и селективной для металлов ионообменной смолы " СЬе1ех - 100

2. Разработана хроматоспектрофотометрическая методика количественного определения дипептида-карнозина при совместном присутствии с аминокислотами. Методика позволяет получить воспроизводимые результаты, относительная ошибка определения составляет ±3%.

3. Разработаны состав и технология 5% инъекционного раствора карнозина, стабилизированного 0,2% тиомочевины и 0,05% трилона Б. Оптимальное значение рН раствора 5,4 достигалось введением 2% кислоты лимонной. Стерильность инъекционных растворов обеспечивалась методом стерилизующей фильтрации через бактериальные фильтры " Милли пор " с размером пор 0,22 мкм и предфильтр с размером пор 0,45 мкм.

4. Установлена зависимость стабильности инъекционных растворов карнозина в процессе хранения от чистоты исходной субстанции. Теоретически обоснованы и экспериментально

разработаны составы стабильных инъекционных растворов, изготовленных из субстанций различной чистоты.

5. Разработанные составы 5% инъекционных растворов карнозина, укупоренные во флаконы ( ФИ -5) и закрытые пробками из резины марки 52-599/1 под обкатку алюминиевыми колпачками стабильны в естественных условиях хранения в течение 2-х лет, при температуре 4° С - в течение 4-х лет ( время наблюдения ). Качественные и количественные показатели инъекционных растворов в процессе хранения изменяются в пределах ошибки методик.

6. Установлена способность растворов карнозина снижать образование продуктов перекисного окисления липидов в липосомах, по силе аитиоксидантного действия сходная с ионолом. В связи с этим даны рекомендации по использованию карнозина для стабилизации разрабатываемых в настоящее время препаратов фосфолипидов.

7. Установлена высокая специфическая активность 5% раствора карнозина на лабораторных животных, которая выражается в более ранней и полной , по сравнению с контролем (в 2 раза ), регенерации с последующим восстановлением структур в зоне рубца.

8. На основании результатов исследования разработан проект ВФС и соответствующая нормативная документация на 5% инъекционный раствор карнозина для представления в Фармакологический комитет МЗМП России с целью рассмотрения вопроса о проведении клинических испытаний.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Исследование стабильности инъекционных растворов карнозина/Кондратьева Т.С., Майдыкова Э.Е., Краснюк И.И.// Би

охимия.-1993-Т.58 ,вып.5.-с.772-779.

2. Влияние поверхностно-активных веществ на высвобождение карнозина из раствора/Майдыкова Э.Е., Кондратьева Т.С., Краснюк

И.И./,ЛГез.докл. научно-практической конф., посвященной 15 летаю фарм. фак-та Таджикского мед.ин-та..1992.-С.45.

3. Разработка и исследование 1% раствора глазных капель карнозина/Кондратьева Т.С.Драснкж И.И., Майдыкова Э.Е.// Тез. докл. научно-практической конф.- Чимкент, 1991 .-С. 108-109.