Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Восстановительные процессы в легком и их регуляция природными эндогенными соединениями (экспериментально-клиническое исследование)

РГ6 0°

- а ПАК 1993

ЮСХОЗСГЛЯ {-ЕЛЬЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ км. И. М. СЕЧЕКОЗА.

На правах рукописи

КОРНИЛОВА Зуягфця Хусаиповна

Взсстенсзиталъньв процесса в дзгком и их регуляция природными эндогенными соединениями (зкспэримзктельга-клиническое исследование)

14.00.43 - пульмонология 14.00.15 - патологическая анатомия

А з т о р з е р а т диссертации ;;а соискание ученой степени доктора гаднцински?! н-аук

Мзсхва 1893

Работа выполнена на кафедре фггизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, г.Москва.

Научный консультант академик РАЖ профессор М.И. Перельман

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор J1.K. Романова доктор медицинских наук профессор И.Г. Даниляк доктор медицинских наук гл. науч. сотр. А.Д. Куничан

Ведущее учреждение - Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАЖ.

Защита состоится " "._"_1993 г. в 14 часов

на заседании специализированного Совета Д. 084.59.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора медицинских наук при Научно-исследовательском институте пульмонологии. МЗ РФ по адресу: 105077, Москва, ул. И^ая Парковая, 32/61.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

НИИ пульмонологии. Автореферат разослан февраля 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

Т. А. Чеглакова

" Природные силы внутри нас -истинные врачеватели будущего," Гиппократ.

Оо^ая керзкгеристапа работа.

Актуальность. В последнее десятилетие отмечается . четкая тенденция роста заболеваемости и смертности от болезней, Легких (Чучалин А.Г. , 1991). Наряду с этим прогресс хирургической техники, развитие трансплантологии требует уточнения возможностей компенсации утраченных тканей и обеспечение анатомической состоятельности пересаженного органа. В этих условиях особую значимость приобретает исследования механизмов регенерации поврежденного легкого и способов регуляции восстановительных реакций организма. Различны® аспекты проблемы регенерации постояннно изучаются. Установлено, что при заживлении ран легкого в 1,ясте дефекта мотет формироваться непропорционально малый рубец (Давыдовский И.В., 1969, Мэг^йоиегу С.Ь., 1944). В работах Есиповой И.К.С1976), Биркун А.А.(1981), Романовой Л.К. (1984), Ерохина В.В. (1987).показано, что легкие -многокомпонентный орган со способностью регенерировать за счет митотического деления основных клеточных элементов эпителиальной выстилки бронхов и альвеол. Особенно важное значение имеет изучение состояния альвеолоцитов 2 типа, которые учавствуют в формировании эпителиальной выстилки альвеол и секретируют сурфактант. Исследуя закономерности пострезекционной гипертрофии легких, Романова Л.К. считает перспективным изучение условий, способствующих сокращению продолжительности деструктивно-реактивной фазы регенерационных реакций и обеспечивающих полное восстановление ультраструктур поврежденных клеток. Принципиально важным является уточнение характера клеточных и внутриклеточных источников репаративной регенерации легкого. Положения Саркисова Д.С. (1987) о внутриклеточной регенерации и гиперплазии ультраструктур, являющихся структурными основами адаптации и компенсации нарушенных функций, внесло существенный вклад в наше понимание процессов взаимодей-

ствия и взаимовлияния структуры и функции поврежденной клетки. В области изучения ультраструктурных основ патологии клеток легкого достигнуты определенные успехи. Однако исследование молекулярных механизмов регенерации поврежденных клеток находится пока на стадии накопления отдельных фактов. Анатомические особенности легких диктуют необходимость изучения прежде всего мембранозависимых процессов. Известно, что ряд важных функций легких регулируется адренергическои и холинергической рецепцией (Голиков С.Н., 1985; Сыромятникова Н. В., 1987: Широков Ю. А., Долго-Сабуров В.Б., 1989; Bruch R..Thayer W. .1983: Jackson M., Jones D., 1984). Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению в основном адренергических рецепторов, вопрос о спектре нейрорецепторов паренхимы легких при различных патологических состояниях-и принципах их взаимодействия остается нераскрытым. Исследование рецепторов легких является многообещающим также, с точки зрения пептидергической регуляции рецепторных каскадов в клетках-мишенях. Одним из ценных методов изучения механизмов регенерации является культура ткани (Мэттсон П.. 1982). Исследование морфокинетики клеточных элементов в культуре переживающих легочных эксплантатов при туберкулезе, раневом процессе показало, что метод воспроизводит особенности межклеточных взаимодействий, свойственных той или иной паталогии (Куничан А.Д., 1974: Бурое A.A., 1981; Корнилова З.Х., Зурабян М.С., 1991). Возможность подсчета клеточных элементов, выселяющихся из культивируемого кусочка легких, позволяет дать количественную оценку.регенера-ционных потенций поврежденного легкого in vitro. Наряду с этим с помощью метода первичной эксплантации легких можно изучить действие лекарственных средств, регулирующих репаративные процессы в органе, и подобрать их оптимальные дозы. Возбудить и изменить функцию клеток способно значительное число природных средств, но наибольший интерес представляют регуляторные пептиды в связи с их участием в различных физиологических процессах организма с обеспечением многих жизненно важных функций. В настоящее время создан массив информации об эндогенных олиго-петидах, разработана их классификация по первичной структуре

(Замятшн A.A., 1991X Исследованиями последних лет установлено, что легкие являются пептидергической системой, продуцирующих довольно широкий спектр пептидных соединений ССыромятаико-ва Н.В. , 1987: Чучалин А.Г., 1989: Булгаков С.А., Гомогоров И.В.,1991: Barnes P.J., 1984, 1987; Barta V.K. et al., 1990). Синтезированные отечественные пептиды бомбезин, даларгин, фактор роста нервов, карнозин рассматриваются в .качестез потенциальных лекарственных средств. Однако недостаточно изучена биологическая активность исследуемых соединений, не определены условия их введения и оптимальные дозы.

Неменьший интерес представляют липиды. В исследованиях Singh G., Kotyal S. С1980) показано, что липИды, депонируемые аз крови, а также из перфузата, используются легкими для синтеза сурфактанта. По данным Shelley S.A., (1982) поверхнос-гно-активная фракция сурфактанта состоит на 80 % из фосфати-цилхолина и на 8 % из фосфатидилглицерола. Источник фосфолипи-цов - альвеолоциты 2 типа, которые пополняют запасы собствен--гаго фосфатидилхолина за счет экзогенных липидов (Finkelsteln ].М., 1983). Наряду с этом липиды, являясь одним из основных сомпонентов клеточных мембран, выполняют регулирующую роль в 1роцессах .перекисного окисления липидов (Бурлакова Е.Б., L990). Вышеизложенное позволяет рассматривать липиды в качес-гве ценного лекарственного средства при любых повреждениях гегких. В настоящее время уже имеются несколько препаратов на тапидной основе, которые с успехом используются при гепатите, :ахарном диабете, бронхите С Швец В.И., 1990). Поэтому ¡альнейшая разработка лекарственных препаратов на основе раз-шчных комбинаций липидов с подбором доз и оптимальных усло-1Ий их введения является весьма перспективной.

Таким образом, исход восстановления поврежденных легких )ависит от суммарного взаимодействия различных регулирующих :истем. В связи с этим представляется важным выявление нанбо-iee активных клеточных и внутриклеточных источников регенера-1ии поврежденного легкого, определение состояния органелл кле-■ок паренхимы легкого в процессе восстановления, сопоставле- [ ine этих данных с состоянием рецепции легких при различных па- '

тологических состояниях, создание условий наиболее благоприятного течения компенсаторно-восстановительных реакций организма путем использования различных комбинаций эндогенных регуля-торных веществ. Решение этих задач актуально и значимо, так как в конечном итоге направлено на ликвидацию последствий повреждения и обеспечение выздоровления.

Цвль исследования :

- изучение механизмов регенерации поврежденного легкого и регуляция этих процессов с помощью пептидов и новых комбинаций природных эндогенных соединений.

Задачи исследования :

- разработка экспериментальных моделей ран легкого на мелких животных;

- изучение процессов заживления поврежденного легкого на ультраструктурном уровне:

- выявление наиболее активных клеточных и внутриклеточных источников регенерации поврежденного легкого!

- изучение динамики морфокинетических параметров клеточных элементов в культуре поврежденных легких:

- изучение адрененергических и М-холинергических рецепторов паренхимы легкого при раневом процессе,- туберкулезе, пневмонии и раке:

- проведение скрининга среди ряда амнокислот, пептидов, фосфолипидов по качеству их ростостимулирующего влияния на процессы заживления поврежденного легкого и отбор наиболее эффективных из них:

- изучение биологической активности карнозина, фосфати-дилхолина 80-90% чистоты и смеси липидов, которая содержит 45-50% фосфатидилхолина, 30% фосфатидилэтанола-мина и в качестве минорных компонентов холестирин и сфингомиелин,а также смеси карнозина и фосфолипидов, оценка эффективности их различных концентраций'.

Научная новизна. На клеточном, ультраструктурном и молекулярном уровнях установлено взаимозависимое участие всех клеточных элементов в процессах заживления паренхимы легких. Наиболее активны при восстановлении поврежденного легкого альвео-

лоцита 2 типа, обеспечиваадта регенерацию альвеолярной выстилки и продукции сурфактанта легких. Установлены корфокинетические параметры клеточных популяций в культура легких при ■ раневой процессе и выяснены условия, необходимые для сокрсшэния продолжительности фазы некротических реакций, а именно, увеличение в зона повреждения числа лимфоцитов и их контактов с макрофагами, усиление пролифэративной активности фибробластов. Показана корреляционная зависимость между структурными нарушениями и изменениям в состоянии нейрорецепции клеток паренхимы легких: чем вырагеннее анатомические повреждения легких, тем значительнее падение числа адренергических рецепторов и тенденция повышения числа М-холинорецепторсв. Выявлена стереотипность рецепторньи нарушений при раневом процессе, пневмонии, туберкулезе, что свидетельствует о единстве патофизиологических механизмов развития болезни, а, следовательно, некоторых подходов в их лечении. Впервые установлено сопряженное изменение^-адренорецепторов и М-холинергических рецепторов при раке, раскрывающее один из игхонизмов активации клеточной пролиферации.

. Разработано новое направление фармакологической регуляции восстановительных процессов в легком'с помощью природных эндогенных соединений. Осуществлен подбор препаратов с учетом метаболических потребностей поврежденного легкого. Впервые при повреждении легкого применены фактор роста нервов, инсулин, даларгин, карнозин и комбинация карнозина с липидами. Обоснованы иммуномодулируклцие и ростостимулирующие свойства карнозина, проявлявшиеся в ускорении заживления поврежденного легкого в 2 раза с формированием нежного рубца. Доказано, что липи-ды по сравнению с карнозином способствуют значительному снижению явлений эмфиземы и септального отека в околораневой зоне. Смесь карнозина и фосфолипидов обеспечивает наиболее полноценное восстановление архитектоники легкого.

Теоретическая значимость.

- построена логическоая цепь исследований от структуры к функции: поврежденное легкое -> оценка структурных нарушений на уровне тканевых процессов, клеток и клеточ-

ных органелл -> состояние нейрорецепторов легких -> регуляция клеточного метаболизма с помощью пептидов, ли-пидов;

- выявлены обще закономерности изменения нейрорецепторов легких при различных патологических состояниях".

- изучено влияние карнозина на JJ-эдренорецепторы и активность аденилатциклазы при заживлении раны легкого -первая попытка анализа взаимодействия пептида с нейро-рецепторами легких;

- изучены механизмы лечебных эффектов пептидов как-то активация пролиферации фибробластов, усиление клеточной и внутриклеточной регенерации поврежденных легких, появление ассоциации иммунокомпетентных клеток.

Положения, вшосишв на защиту. В процессе регенерации поврежденного легкого принимают зависимое участие клеточные элементы паренхимы легких и периферической крови. В раневом дефекте активны альвеолярные макрофаги, лимфоциты и фиброблас-ты в краях его - альвеолоциты 2 типа и эндотелиоциты. Наиболее полноценная регенерация поврежденных легких возможна при условии усиления активности иммунокомпетентных клеток, восстановления цитофосфолипосом альвеолоцитов 2 типа и повышения пролиферативной способности фибробластов.

Имеется параллелизм реакции in vitro и in vivo. .В культуре поврежденных легких также наиболее активны макрофаги, лимфоциты и фибробласты. Показана возможность пептидергической регуляции процессов заживления in vitro и ее регистрации по активности иммунокомпетентных клеток и фибробластов.

Структурные изменения (степень выраженности воспаления и пневмосклероза) в паренхиме легких коррелирует с изменениями адренергической и холинергической рецепции. Стереотипность ре-цепторных нарушений при различных повреждениях и патологических состояниях свидетельствует о единых патогенетических подходах в координации этих "нарушений..

Для лечения ран легкого использованы аминокислоты, пептиды, обладавшие белковосинтезируюшими свойствами, а также фос-фолипиды, способствующее стабилизации альвеол. Выделены, как

наиболее эффективные, карнозин, фосфолипиды. Создан новый препарат на основе комбинации карнозина и смеси фосфолипидов с высокой биологической активностью, ускоряющий процесс заживления экспериментальной раны легкого в 2 раза.

; Практическая ценность. Разработана модель колото-резаной и операционной ран легкого на мелких животных с 98-100% выживаемостью их. Предложена новая методика комбинированного эндотра-хеального наркоза с предварительной атропинизацией и использованием смеси эфира и гексенала или тиопентала, или калипсола. Созданы атравматические легочные щипцы для проведения хирургических вмешательств на мелких животных, получено авторское, свидетельство N 48014000/14 (015127).

Установлены качественные и количественные клеточные характеристики процесса заживления с помощью культивирования легочных эксплантатов, что может найти применение в клинической медицине, особенно в связи с развитием эндоскопических исследований и возможностью культивирования биопсийного материала. Разработана тест-система для оценки действия лекарственных препаратов, в частности, пептидов на клеточном уровне. Определены оптимальные дозы карнозина. Разработана новая группа лекарственных препаратов на основе природных соединений, оценена их специфическая активность, проведены доклинические исследования. На два препарата подготовлены документы для фармакологического комитета. На три средства получены авторские свидетельства. Продолжается разработка новых препаратов на основе карнозина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на рабочем заседании кафедры биохимии МГУ "Компоненты аденилатциклаз-ной системы" (Москва, 1985), на ученом совете МНИИТ КЗ РСФСР (Москва, 1986), на конференции, посвященной открытию Российского общества пульмонологов (Москва. 1986), на рабочем совещании морфологов по экспериментальной фтизиатрии (Москва, 1986), на III межвузовской конференции "Перспективы проведений совместных научных исследований МГУ и ММА" (Москва, 1987), на рабочих заседаниях кафедры биохимии МГУ, посвященных изучению свойств карнозина и его влияния на различную патологию

(Мэсква, 1987 - 1990), на научно - практической конференции врачей-пульмонологов (Барнаул, 1989). на Всесоюзном симпозиуме "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" (Нижний Новгород, 1990), на Всесоюзной конференции "Местное лечение ран" (Москва, 1991), на Всесоюзном конгрессе по болезням органов дыхания (Челябинск, 1991), на Всесоюзной конференции биохимиков "Карнозин: биологическая роль и применение в медицине" (Москва, 1992), на Всесоюзном съезде химиков " Антиоксиданты и их применение в медицине" (Москва, 1992), на совещании "Морфоген - III" ИБК-РАН (Пушино, 1992).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 20-ти опубликованных работах й 4-х авторских свидетельствах.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 209 страницах машинописного текста и состоит из"введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Во введении отражены актуальность проблемы, цель, задачи, научная и теоретическая значимость работы. В 1 главе наряду с описанием методов исследования дан первичный анализ собственного материала. Все остальные главы построены по единому принципу - краткий обзор по тематике и изложение полученных данных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 100 рисунками. Библиография : 310 названий.

Идея и общий план настоящего исследования были предложены академиком РАЖ Перельманом М.И.. В-выполнении работы принимал участие большой научный коллектив: Приймак A.A., Соловьева И.П., Бойков А.К., Пауков B.C., Селищева A.A., Бу-ларгина Т.В., .Кондратенко Т.Я., Северин Е.С., К.уничан А.Д., Коган А.Х., Загерман В.Г., а также наши ученики: Абдулла бин Абдулла, Зурабян М.С., Скурат A.B., Кирилловская Э., Ставраки Е., Тихомирова Э.В.

Посвящаю свой труд- своему научному консультанту М.И.Перельману и всем, оказавшим помощь в нашей работе выражаю самую глубокую признательность.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования.

В работе использованы легкие морских свинок, кроликов, а также резецированные кусочки легких людей, оперированных по поводу различных заболеваний. Объектом комплексного изучения служили: удаленная легочная паренхима с фокусом поражения, участок рядом с ним, а у животных - дополнительно симметричный участок ткани противоположного здорового легкого. Исследования выполнены на морских свинках - самцах, массой 300-320 г в возрасте 5-6 месяцев, а также кроликах - самцах породы шиншилла массой 1500-1700г в возрасте 10-11 месяцев.

I. Морфологические исследования проведены в 5 этапов. На 1 этапе (4 серии опытов, 230 животных) изучены анатомо-то-пографические и структурные особенности органов дыхания морских свинок. Разработаны модели асептической колото-резаной и операционной ран легких. В стерильных условиях 50 животным, под местной анестезией сзади по 6 межреберью делали разрез кожи, мышц, далее специальным скальпелем с ограничителем прокол .нижней доли правого легкого глубиной 10 мм и шириной 5-6 мм. Под обшим наркозом 52 животным проводили частичную сегментарную резекцию легкого: после разреза кожи, мышц спереди по 4 межреберью вскрывали плевральную полость, выводили передний сегмент верхней доли левого легкого, отсекали клиновидный кусочек высотой 10-12 мм и основанием 5-6 мм, на рану легких накладывали 3-4 шва. Наряду с этим 72 животным в нестерильных условиях под недозированньм эфирным наркозом .в область нижней цоли правого легкого наносили штампованное повреждение специальным пробойником, или отсекали ножницами клиновидный кусочек высотой 10-12 мм и основанием 5-6 мм. Число гнойных ослож-«ний у этих животных достигло 58% (при асептической ране -1:7%). На этих группах животных изучены особенности репаратив-юй регенерации легких у морских свинок. На 2 этапе (3 серии 1пытов, 394 животных) проведен скрининг среди 10 природных :оединений, влияющих на внутриклеточный метаболизм, и выделены [ля дальнейших исследований наиболее эффективные из них. Ле-ебную дозу препарата растворяли в 1 мл физиологического рас-

твора: шприцом однократно в момент повреждения легкого 0,6 мл вводили внутрилегочно, 0,4 мл в 3-4 местах в мышцу и кожу. Для каждого препарата использовали 12-14 морских свинок. Забой всех животных проводили через 1-5 суток после повреждения в одни и те же часы суток (10-11 часов утра). Изучали характер макроскопических изменений и степень уменьшения раневой поверхности с помощью планиметрического метода Л.Н. Поповой. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1

Оценка действия стимуляторов репаративной регенерации с учетом % уменьшения площади раны за 1 сутки.

Препараты Кол-во животных Разовая доза мг/кг Площадь (Б) раны в мм2 % уменьшения Б раны за сут Достовер ность различия

1 сут 5 сут

Амшо кислоты 38

3 -аланин 13 2 28,5 21,0 6,5

11-гистидин 13 0.7 24,9 20,8 4.1

Триптофан 12 0.4 25,8 18,6 7,7

Пептиды 62

Карнозин 13 20 18,1 2,0 22,3 Р<0,001

Гомокарнозин 13 20 18,2 4,8 18,0 Р<0,001

Даларгин 12 0,3 24,5 19,1 5,5 Р< 0,005

Инсулин 12 0,2 Ед 22,6 14,2 9,3

Фактор роста 12 0,1 20,0 8,4 14,0 Р<0,002

нервов

Антиоксиданты 24

и. -токоферол 12 6 23,4 15,9 8.0 Р<0,05

Ретинол 12 3 27,4 21,0 5,9

Контроль

(без препарата) 12- - 24,2 19,2 5,2 Р<0,005

Наиболее эффективным оказался карнозин. На 3 этапе (3 серии опытов, 90 животных) изучено влияние на регенерационные процессы оптимальной дозы карнозина - 20 мг препарата в область повреждения, а также оценены эффективность инъекционного раствора и порошковой формы карнозина. кратность его. введения, действие синтетического препарата и природного происхождения. На 4 этапе (2 серии опытов, 100 животных) изучено влияние фос-фатидилхолина 8.0-90% чистоты на регенерацию поврежденных легких (2мг и 20 мг препарата в область раны). На 5 этапе (4

- и -

серии опытов, 140 животных) изучено влияние смеси карнозина и фосфолипидов (з.жсилен-Р), а также смеси карнозина, Фосфолипи-дов. диацилглицерола С ДАТ) на заживление ран легких.

Эвтаназию проводили под гексаналовым наркозом через 1. 3. 7, 14, 30 суток, 2. 4. 12 месяцев' по 6-7 животных в каждый срок. Кусочки легких исследовали гистологически С окраска парафиновых срезов гематоксилином и эозином и по ван-Гизону) и олектронно-микроскопически с помощью электронного микроскопа Tecla BS - 500. Морфометрические исследования проводили по методике Автандилова Г.Г.(1973) с помощью закрытой квадратной сетки, вмонтированной в окуляр микроскопа. В процессе заживления раны легкого определяли удельный объем следующих компонентов: альвеол, стромы, сосудов, бронхов, лимфатической ткани.

11. Кулътуральные исследования проводили по методу первичной эксплантации кусочков легкого морских свинок и кроликов из зоны раневого дефекта. Животным проводили частичную резекцию верхней доли левого легкого, на 1, 3, 7, 14 сутки после операции их забивали под гексеналовым наркозом. В стерильных условиях брали материал из левого легкого здорового 'животного (контрольная группа) и участок шириной 3-4 мм из краевой зоны операционной раны (опытная группа). Из полученно-ч го материала готовили кусочки ткани (эксплантаты) размером 1,5-2,0 мм. В контрольной группе было исследовано 20 эксплантатов из здорового легкого, в опытной 150 эксплантатов из области раны легкого. Эксплантаты промывали в растворе Хенкса и помещали на покровные стекла камер конструкции Куничана А.Д. и фиксировали гомологической плазмой крови. В'камеру вводили по 5 мл среды 199 на растворе Хенкса (рН 7,2) с добавлением 10 ед/мл калиевой соли бензилпенициллина. На верхнее отверстие камеры накладывали второе покровное стекло, герметизировали камеру парафином и помещали в термостат с температурой 37°С. Исследование жизнедеятельности клеток в культуре ткани проводили с помощью инвертированного микроскопа МБИ-13 (ЛОМО), предназначенного для визуальных наблюдений и микрофотосъемок в фазовом контрасте. Объектом наблюдения были клеточные элементы. выселяющиеся из эксплантата в плазменный сгусток. Для ко-

личественной характеристики состояния эксплантата подсчитывали процентное соотношение клеток в плазменном сгустке. С этой целью по всей толщине сгустка в 3-4 полях зрения, при увеличении объектива х40 считали все клетки до 100. Наблюдение проводили в течение 10 суток культивирования.

III. Изучение оеиепторной системы легких проведены в 2 этапа. На 1 этапе оценены изменения количестваß -адренергичес-ких рецепторов (£-АР) и активность аденилатциклазы САЦ) в препаратах мембран из паренхимы легкого при туберкулезе " и раневом процессе морских свинок; на 2-ом этапе - количество з - и ¿¿.-адренергических (¿.-АР) и М-холинергических рецепторов (М-ХР) при туберкулезе, хроническом неспецифическом заболевании легких (XH3JD и аденокарциноме человека.

Способ получения материала. 90 неинфицированным морским свинкам в паховую область подкожно вводили 0,01 мг чистой культуры (на 1 животное) вирулентного штамма микробактерий туберкулеза H37RV: животных забивали на стадиях минимальных изменений в легких (1 ст.), умеренного распространения очагов (2 ст.) и прогрессирующих казеозно-некротических изменений (3 ст.). Для оценки динамики раневого процесса у 20 морских свинок формировали колото-резаную рану легких и у 20 - операционную. Исследовали долю легкого с раневым дефектом на 1, 3, 4, 7, 10, 14 сутки после операции. Контроль - легкие 10 здоровых свинок. Кусочки легких человека получили во время торакальных операций у 43 курящих мужчин в возрасте 20-60 лет: у 10 больных имелся туберкулез, у И - ХНЗЛ, у 12 - аденокарцинома, у 10 большых брали кусочек легкого в пределах здоровой ткани при операциях по поводу туберкуломы.

Далее получили фракции цитоплазматических мембран по методу Norman Р. (1987). Для этого кусочек легкого гомогенизировали в буфере, гомогенат фильтровали, далее центрифугировали: затем проводили повторное центрифугирование и переосаждение. Полученную суспензию мембран хранили при t= -70°С. Анализ связывания соответствующих лигандов с рецепторами ^Н-дигид-роальпренолол (^Н-ДГА) дляß -адренергических рецепторов, аН-празозин (^H-PRZ) для об-адренергических рецепторов, ^Н-хи-

нуклидиннил бензилат C^H-ONB) для М-холинергических рецепторов, проводили инкубированием мембранных белков при различных концентрациях указанных радиолигандов. Специфическое связывание определяли как разницу мэкду связыванием в присутствии и отсутствии 10 мкМ альпренолола, прозозина и атропина соответственно. Разделение свободного и связанного с мембранами ли-ганда проводили фильтрацией проб на фильтрах GF/C ("Wiatman", Англия). Фильтры высушивали и просчитывали на жидкостном радиоспектрометре "Rack-beta" ("LKB", Швеция).

При оценке изменений количества рецепторов учитывались, в основном, их известные функции:J, -АР - влияние на бронходила-тацию, активация аденилатциклазы, о£-АР - влияние на бронхокос-трикцию, М-ХР - влияние на бронхокострикцию и ингибирование аденилатциклазы (Долго-Сабуров В.Б., Шорохов Ю.А., 1989). Активность АЦ определяли по количеству образовавшегося iS£9/ цАМР за 10 мин. при 37°С по методу Сапомона И. С1975) и Коуни-са Ф. С1951). '

Рвпвраггивная рэгенорсция легких.

Базовым процессом для регенерации в условиях патологии является непрерывное восстановление и обновление поврежденных клеток, специфических органелл и более мелких молекулярных структур. Репаративная регенерация легких характеризуется взаимозависимым участием всех клеточных элементов паренхимы легких. Однако модификация клеточных и внутриклеточных реакций в зоне повреждения весьма несовершенна. Дефект ткани замещается рубцом, который лишь в некоторых случаях может подвергаться резорбции. Чем выраженнее повреждение, тем грубее структурные нарушения. Через год при резаной операционной ране восстановление архитектоники легких морских свинок в краях дефекта отмечали в 33% случаев, а при травматических повреждениях пробойником - 8% случаев. Дистрофические процессы в клетках в виде вакуолизации органелл и снижения числа митохондрий и рибосом свидетельствует об истощения собственных резервов. Однако регенерационный процесс динамичен и продолжителен. Уже на 3 сутки после повреждения легкого отмечается усиление процессов внутриклеточной регенерации как в околораневой зоне,

так ив противоположном здоровом легком. Морфометрические данные показывает1, что несмотря на значительное снижение воздушности поврежденного легкого на ранних этапах (до 14 суток), в последующем наблюдается постепенное улучшение аэрации зоны повреждения за счет увеличения числа альвеол и тенденции нормализации соотношения альвеол и стропы, восстановления числа сосудов и бронхов на единицу площади среза (см.табл. 2).

Таблица 2.

Изменение соотношения структур поврежденного легкого морских свинок в процессе заживления ( % к площади легкого М*т)

Группы наблюдения Число наблюдений Компоненты легкого

альвеолы строма бронхи сосуды лимфоид-ная ткань

Здоровое легкое

10 45*2,1 46*4,2 3,8*0,5 2,4*0,3

Легкое после повреждения

14 сут 32 25*3,4 68*4,1 2,3*0,3 1,8*0,2

4 мес 28 33*3,5 60*1,4 2,1*0,2 2,6*0,3

1 год 24 35*2,5 58*4,4 3,0*0,2 2,8*0,3

2,8*0,5

1,9*0,5 2,3*0,3 2,2*0,3

Альвеолоциты 2 типа (А-2) действительно можно назвать камбиальной клеткой и наиболее активным. источником регенерации альвеол. На ранних этапах после повреждения легкого появляется большое число А-2 с гигантскими опустошенными тельцами или с -частично сохраненным в них материалом, что свидетельствует об усилении выброса сурфактанта в альвеолы и обеспечении восстановления их поверхностного натяжения. В связи с этим в альвеолярном пространстве наблюдается электронно-светлая зона шириной 20- 30 нм, которая появляется в результате наличия поверхностно-активных веществ около А-2 и гидрофобнос-ти фосфолипидов сурфактанта. В дальнейшем в А-2 выявляется увеличение числа осмиофильных телец и содержащихся в них пластин. На 7-8 сутки после повреждения на , полутонких срезах в краях дефекта возникают скопления А-2 в виде "почек", состоящих из 4-6, позже - 15-20 клеток, далее в центре скоплений А-2

определяются участки разряжения, а также расположение А-2 в один ряд на базальноя мембране. В некоторых "почках" 1/4 - 1/3 часть их окружности свободна от А-2, что, по-видимому, связано с трансформацией А-2 в А-1. Не исключено, что это последовательные фазы новообразования альвеолоподобных структур. Вопрос о формировании новых альвеол по-прежнему дискутируется в литературе. Доказательства этого процесса получены только у растущих организмов (Соколова Т.Н., 1968, Романова Л.К., 1971).

Характерны изменения осмиофильных телец А-2. В 1-3 сутки после операции они увеличиваются в размерах и содержимое их становится менее электронно-плотным, на 7-8 сутки в них появляются пластины, а на 14 сутки количество параллельно расположенных пластин становится значительно больше. В последующем продолжается процесс восстановления осмиофильного материала в осмиофильных тельцах А-2. Однако сохраняются А-2 с опустошенными осмиофильными тельцами. Таким образом фиксируется два параллельных процесса - с одной стороны, недостаточность осмиофильного материала в альвеолоцитах 2 типа, с другой стороны, восстановление его в части клеток. С учетом значимости осмиофильного материала в восстановлении сурфактанта легких понятна необходимость пополнения его из дополнительных источников в целях улучшения качества заживления.

Не менее активны эндотелиоциты, в которых наряду с умеренно выраженными дистрофическими изменениями наблюдается усиление процессов внутриклеточной регенерации. В них увеличивается количество митохондрий, рибосом и цистерн эндоплазмати-ческого ретикулума. В капиллярах аэрогематического барьера эндотелиоциты образуют выросты. По данным морфометрического анализа, большее число сосудов в околораневой зоне способствует формированию более нежного рубца.

В раневом дефекте отмечается смешанная клеточная инфильтрация с высокой активностью макрофагов, очищающих рану, •лимфоцитов и позже фибробластов. Увеличение контактов между макрофагами, лимфоцитами и фибробластами, постепенное снижение числа активированных макрофагов и появление плазматическим клеток, лаброцитов, пролиферирующих и продуцирующих-колла-

ген фибробластов свидетельствует о целесообразной кооперации иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих адекватный ответ на раздражитель. Таким образом, случаи резорбции рубца в сочетании с его аэрацией и появлением альвеолоподобных структур в краях раневого дефекта, увеличение числа капилляров с высокой синтетической активностью эндотелиоцитов создают предпосылки для регенерации легкого с минимальными Рубцовыми изменениями. Активация А-1 и пополнение их осмиофильных телец в первую очередь фосфолипидами, увеличение числа активных макрофагов и пролиферируюших фибробластов, усиление внутриклеточной регенерации за счет белково-синтезирующих веществ позволит сократить продолжительность деструктивно-реактивной фазы регенера-ционных реакций и обеспечить более полноценное восстановление структур поврежденного легкого.

Морфо кинетические параметры клеток в культуре поврежденных легких.

Морфологические исследования показали, что ведущею роль в очищении раны играют макрофаги, лимфоциты, а в формировании грануляционной и далее рубцовой ткани - фибробласты, поэтому мы считали целесообразным провести более детальное изучение этих клеток с помощью культуральных исследований. В связи со сходством морфокинетических параметров клеток, выселяющихся из эксплантатов легких кроликов и морских свинок, ниже приводим их общую характеристику.

Лшфда^аои в некротической фазе раневого процесса , выселяясь- из эксплантата с довольно значительной скоростью, выполняют фагоцитарную функцию. С помощью псевдоподий они интенсивно захватывают клеточный детрит.'В процессе фагоцитоза большие макрофаги увеличиваются в размерах, замедляя движение (с 10,1*0,3 до 1,3*0,1 мкм/мин) и образуют скопления. Этот феномен Буров А.Н. (1981) объясняет приобретением макрофагами способности накапливаться в очаге поражения для интенсификации процесса фагоцитоза. На 3-4 сутки после ранения появляются многочисленные контакты макрофагов не только между собой, но и с лимфоцитами, фибробластами, что свидетельствует об активации иммунного ответа и переходе раневого процесса в фазу про-

лиферативных реакций.

Ашд>®циты. в 1 сутки после повреждения выселяются в небольшом числе. На 3 сутки отмечается относительное увеличение числа лимфоцитов и повышение их способности взаимодействовать с макрофагами. При этом лимфоциты приближаются к макрофагам, плотно прилегают к их поверхности или сначала кружатся около плазматической мембраны и далее прикрепляются к ним хвостовым концом. Время взаимодействия от нескольких секунд до 25 мин. Одновременно макрофаг может контактировать с 3-8 лимфоцитами. На 8 сутки после повреждения число лимфоцитов остается относительно неизменным. Увеличивается количество контактов с фибробластами. Возможно, что лимфоциты выполняют определенную роль регуляции регенерационных процессов в ране, стимулируя деятельность макрофагов и пролиферацию фибробластов.

Рибрлбоисты, являющиеся основным пластическим материалом для заживления поврежденного легкого, в 1 фазе раневого процесса практически отсутствуют. С 3 суток после повреждения число их постепенно увеличивается за счет интенсификации мито-тического деления клеток. Наиболее интенсивный рост фибробластов обычно происходит в участках скопления макрофагов и лимфоцитов. Фибробласты активно вступают в контакт с макрофагами и лимфоцитами. Клеточные взаимодействия свидетельствуют о возможности регуляции процесса фибробластообразования иммуноком-петентными клетками.

Последовательность выселения и роста клеток из эксплантата в культуре легочной ткани здорового кролика характеризуется преобладанием макрофагов и лимфоцитов на начальных этапах культивирования и активным ростом фибробластов с 3 суток культивирования С см.табл. 3).

В 1 сутки после ранения и на 1 сутки культивирования так же. как в контрольной группе, происходит выселение значительного количества макрофагов, но в отличие от контрольных значений их число не снижается в течение всего периода культивирования (см.табл. 4.1). Выселение и рост Фибробластов наблюдали позже с 4-5 суток культивирования, и даже на 10 сутки культивирования число фибробластов (48,7*1,5%) не достигает

контрольного значения С60,6*1,150 (Р<0,001). С 1 суток культивирования отмечается более интенсивное выселение лимфоцитов, чем в контрольной группе, что скорее всего направлено на активацию пролиферации фибробластов (Wahl S.H., Wahl L.L., McCarthy J.B., 1978). Следовательно, в 1 сутки после ранения, доминирующими и длительно сохраняющими активность клетками являются макрофаги и лимфоциты. Зибробластическая активность поврежденного легкого значительно снижена. Полученные результаты вполне закономерны, так как следствием повреждения легкого является образование некротизированных тканей и основная роль первой фазы раневого процесса заключается в их расплавлении и удалении (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1981).

На 3 сутки после повреждения легкого и в течение всего периода культивирования эксплантатов отмечается снижение числа выселяющихся макрофагов по сравнению с их числом в 1 сутки после ранения и контрольными значениями (см.табл. 4»3).

Таблица 3.

Характер выселения клеток из эксплантата интактного легкого кролика (в %) .

Сутки Макрофаги Лимфоциты Фибро- Ветвис- Гигант-

культи- бласты тые ские

вирова- клетки клетки

ния

1 85,0*1,0 9,1*0,6 _ 5,9*0.4 _

2 86,5*1,1 7,0*0,5 2,4*0,8 4,1*0,4 —

3 71,2*2,2 4,3*0,4 21,4*2,2 3,1*0,3 —

4 55,7*2,2 3,3*0,3 38,4*2,4 1,8*0,2 0,8*0,1

5 45,5*1,5 2,9*0,2 48,7*1,7 1,5*0,1 1,4*0,2

Интенсивность выселения лимфоцитов, а также фибробластов значительно повышается по сравнению с их числом в 1 сутки после ранения и контрольными значениями. Рост фибробластов из эксплантатов по сравнению с контролем наблюдали с 1 суток культивирования с постепенным нарастанием их процентного со-

держания к 10 суткам (соответственно 7,2*1,5% и 79,7*1,9%, Р<0,0001). Таким образом, снижение количества макрофагов обусловлено тем, что к этому периоду заживления раны, процессы очищения раневого дефекта от некротизированных тканей в основном завершаются и на смену воспалительной фазы раневого процесса приходит пролиферативная. Увеличение количества выселяющихся лимфоцитов, по сравнению с контролем, более чем в 2 раза свидетельствует об интенсификации иммунологических процессов, активирующих пролиферацию фибробластов. Более высокая интенсивность роста фибробластов по сравнению с 1 сутками после ранения и контрольными значениями соответствует периоду формирования грануляционной ткани в области повреждения.

Таблица 4.

Характер выселения клеток из эксплантата поврежденного легкого кролика (в %)

Сутки Сутки Клеточные элементы

плА па куль-

после

ране- тиви-

ния. рова- Макрофаги Лимфоциты Сибробласта

ния

1 1 87,4*0,8 12,6*0,8

2 89,8*0,8 10,2*0,7 —

3 91,4*1,0 5,0*0,6 3,6*0,6

4 87,7*2,0 4,8*0,5 7,5*1,4

5 82,9*2,1 3,5*0,3 13,6*2,2

3 1 74,2*3,0 17,6*2,5 8,2*1,5

2 60,7*3,7 16,9*1,9 22,4*2,6

3 46,2*2,3 16,6*1,3 37,2*1,8

4 38,8*2,0 12,3*0,9 48,9*2,1

5 38,9*1,8 5,5*0,7 55,6*1,6

8 . 1 65,9*1,5 12,9*0,9 21; 2*0,7

2 61,9*3,0 10,2*1,0 27,9*3,2

3 46,0*2,6 14,0*0,4 39,1*2,9

4 39,5*2,2 2,3*0,3 58,2*2,4

5 35,0*1.0 1,4*0.2 63,6*1.2

На 8 сутки после ранения интенсивность выселения макрофагов почти не отличается от таковой на 3 сутки после повреждения. Число, выселяющихся лимфоцитов снижается, а фибробластов повышается почти в 2 раза с 1 суток культивирования , что свидетельствует о продолжении формирования грануляций в ране Сем.табл. 4.8).

Клеточные реакции в культуре эксплантатов поврежденных легких отражают динамику и этапность восстановительных процессов в раневом дефекте и доказывают, что между процессами, происходящими In vitro и in vivo, существует параллелизм. Появляется возможность количественной оценки^клеточных взаимодействий и ответов при использовании факторов, регулирующих рост и развитие тканей.

Изменение едренергичеосих й холинвргичесюш рецепторов и свойств адвнилвщиклазы лапам при повреждении лагких.

В легких достоверно присутствуют и изучаются' адренере-гические, мускариновые, гистаминовые, серотониновые, инсулино-вые, опиатные рецепторы (Сергеев П.В., Шимановский H.J1., 1987: Бергельсон Л.Д., 1987). Поскольку в каждой клетке имеется набор различных рецепторов, взаимодействие с первичным мессен-джером приводит к изменению состояния других рецепторов . Мвжрецепторные взаимодействия выполняют важную физиологическую функцию по селекции поступающих сигналов в клетку и выбору наиболее адекватного ответа (Долго-Сабуров В.Б., Шорохов Ю.А., 1989). Этот факт определяет значимость изучения состояния рецепторов при различных повреждениях легких.

I. Туберкулез у морских свинок вызывает существенное увеличение количества связывающих центров на цитоплазматических мембранах клеток в легких, зависящее от стадии процесса. В контрольной группе животных величина Вшах составляла 400 фмоль/мг белка. В 1 ст. туберкулеза существенных изменений не наблюдалось (Вшах = 380 фмоль/мг белка). Однако, количество связывающих /^Н/ДГА центров во 2 и 3 ст. туберкулеза составляло соответственно 70% ( Вшах=280 фмоль/мг белка) и 30% (Вшах = 128 фмоль/мг белка) от контрольного значения.

Базальная активность аденилатциклазы легких в кон-

трольной группа и в 1 ст. заболевания оставалось постоянной (V равна 161 и 156 пмоль/мг белка в 1 мин, соответственно). Однако Ео 2 ст. туберкулеза наблюдалось увеличение активности фермента на 20% (V = 208 пмоль/мг белка в 1 мин), а в 3 - ее уменьшение (V = 131 пмоль/мг белка в 1 мин).

Таким образом, по мере прогрессирования туберкулезного процесса наблюдается постепенное уменьшение числа^ -едреноре-цепторов. Активность АЦ снижается- лишь при значительных поражениях легких. Если сравнить описанные в' нашей работе изменения параметров аденилатциклазной системы при туберкулезе с изменениями тех же параметров при бронхиальной астме, описанными в литературе, то можно обнаружить аналогию между 2 ст. туберкулезного процесса и астмой. Показано, что в легких морских свинок, больных бронхиальной астмой, на 30% снижено количество^ -рецепторов, увеличена базальная активность аденилатцик-лазы, но ни кажущаяся константа активации, ни максимальная степень стимуляции изопротеренолом не изменяются (Barnes H.J. et ál., 1980). Аналогичные изменения происходят з легких морской свинки во 2 стадии туберкулеза. Известно, что одним из факторов, способствующих уменьшению количества^ -рецепторов в легких, является заражение некоторыми видами бактериальных инфекций. Вакцинация морских свинок некоторыми видами грамотри-цательных бактерий вызывает падение количества^ -рецепторов в легких на 20% (Schreurs A., Verhoef I., 1989). Предполагают, что такой эффект обусловливается нейтральными полисахаридами бактериальной клеточной стенки. Так как использованный в работе возбудитель туберкулеза является грамотрицягельным штаммом, можно предполагать, что компоненты клеточной стенки возбудителя туберкулеза вносят определенный вклад в уменьшение количества^ -рецепторов при данной патологии.

Парадоксальным является то, что наблюдающееся уменьшение количества^-рецепторов на 70% не приводит к изменениям в степени стимуляции аденилатциклазы легких изопротеренолом в 3 ст. туберкулеза. Объяснением таких результатов может быть значительное количественное преобладание^-рецепторов над остальными компонентами аденилатциклазной системы в мембранах легких.

Содержаниеß-рецепторов в легких превосходит их количество в других тканях (Rugg E.L., et al., 1978; Minneman K.P. et al., 1979; Barnes P.J. et al., 1980). Считают, что/ -рецепторы в легких участвуют в таких процессах, как релаксация гладкой мускулатуры трахеи и бронхов, секреции слизи (Phipps R.J., 1980), освобождение сурфоктанта из клеток CDobbs L.G. et al., 1979), модуляция выброса медиатора из тучных клеток (Orange R.H. et al., 1971). С уменьшением количества^ -рецепторов при туберкулезе может происходить нарушение этих функций клеток паренхимы легких.

II. Раневое повреждение легких вызывает существенное уменьшение связывающих центров в легких, зависящее от вида нанесенной раны и степени повреждения ткани. В контрольной группе здоровых животных величина Вшах составляет 400 фмоль/мг белка. Через 20 часов после повреждения количество связывающих /Щ/ ДГА центров составляет для операционной раны 60% (Вшах » 240 фмоль/мг белка), для колото-резаной - 48% (Вшах » 192 фмоль/мг белка), от контрольного значения. Наиболее значительное падение числа £ -адренергических рецепторов соответствует выходу из некротической фазы раневого процесса (4 сутки после повреждения). Заживление раны сопровождается выходом показателей ß -АР на плато (10-14 сутки после повреждения). Соответственно для операционной раны Вшах на 4 сутки составляет 184 фмоль/мг белка (46% от контрольного значения), 10 сутки - 380 фмоль/мг белка, 14 сутки - 420 фмоль/мг белка.

Базальная активность аденилатциклазы повторяет кривую изменений числаJ) -АР: 4 сутки после повреждения для операционной раны V - 128 пмоль/мг в 1 мин, 10 сутки - 156 пмоль/мг в 1 мин, 14 сутки - 180 пмоль/мг в 1 мин. Наибольшее снижение ба-зальной активности АЦ отмечается в воспалительной стадии раневого процесса. С 10 суток (фаза пролиферации) после ранения базальная активность АЦ существенно не отличается от контрольных значений.

Таким образом, установленная динамика изменений свойств аденилатциклазы и количества^-адренергических рецепторов при раневом процессе у морских свинок отражает течение и фазность

регенерационных реакций, а также свидетельствует о стереотипности нарушений клеточного метаболизма при различных повреждениях ткани, а именно при туберкулезе и раневом процессе.

III. Следующий этап исследований связан с оценкой состояния рецепторов при различных патологических состояниях человека. Больные, оперированные по поводу туберкулеза, разделены на 2 подгруппы. В 1 подгруппе анализировали кусочки легочной ткани с очаговыми и малыми фиброзными изменениями. Снижение J -АР было незначительно, а параметры связывания «¿-АР и М-ХР существенно не отличались от контроля Ссм.табл. 5а.1). Близость параметров связывания рецепторов к норме, бессимптомность течения заболевания свидетельствует о биохимической компенсации имеющихся малых структурных нарушений в паренхиме легких. Во 2 подгруппе анализировали кусочки легочной ткани с казеоэ-но-некротическими и цирротическими изменениями. Анализ уровня связывания рецепторов выявил значительное снижение популяции J?-AP иоб-АР. Число мест связывания 3H-PRZ снизилось по сравнению с контролем почти в 5 раз. Параметры связывания М-ХР существенно не изменились. Более детальное исследование материала показало, что процессы с цирротическими изменениями и полной или частичной облитерацией легочных сосудов сопровождаются резким снижением количества^-АР. При казеозном процессе и бронхоэктазах превалирует снижениеß-АР. Средние данные уров-. ня связывания рецепторов приближены к показателям второй, наибольшей по количеству подгруппы больных Сем.табл. 5а.2, 3).

Больные с ХНЗЛ также были разделены на 2 подгруппы. Мэрфологически в 1 подгруппе больных выявляли ограниченный пневмосклероз преимущественно в одной доле легкого. В ней отмечали результаты, аналогичные 1 подгруппе при туберкулезе, а именно: умеренное уменьшение количества_/-АР, параметры связывания/-АР, М-ХР соответствовали норме Ссм.табл. 5.6,1 ). По-видимому при частично сохранившихся структурах паренхимы легкого происходит компенсация изменений уровня связывания рецепторов. Подгруппа 2 имела классическую картину тяжелого хронического неспецифического заболевания легких с обширным сеп-тальным фиброзом, значительной деформацией бронхиального дере-

ва, буллезными изменениями. В этой подгруппе наблюдали более значительное снижение количества^-АР по сравнению с хроническим туберкулезом , что совпадает с выраженным обструктивным синдромом и морфологически значительными изменениями в структуре бронхов. Снижение уровняв-АР не столь значительно, как при туберкулезе, что может свидетельствовать о большей сохранности микроциркуляторного русла и лучшем состоянии сосудов. Косвенным подтверждением этого факта является менее выраженные рестриктивные изменения прй- пневмотическом процессе. Тенденция роста числа М-ХР при тяжелых ХНЗЛ совпадает с более выраженным обструктивным синдромом и атипизацией эпителиальных клеток бронхов, альвеол. Тенденция увеличения числа М-ХР у больных хроническим туберкулезом и ХНЗЛ имеет сходство с увеличением их числа при аденокарциноме, что позволяет отнести эти заболевания к предраковым. Средние параметры £ -АР свидетельствуют об общей закономерности падения их при хронических процессах С см.табл. 56.3).

Таблица 5.

Изменение количествам - и .¿-адренергических и М-холинергических рецепторов паренхимы легких при различных заболеваниях человека Сфмоль/мг белка)

Заболевание £ -АР «¿-АР М-ХР

а - Туберкулез 1 подгруппа 2 подгруппа 3 - средние данные б - ХНЗЛ 1 подгруппа 2 подгруппа 3 - средние данные 308,4 92,1 244,3*32 231 98,6 113,8*10. 199,5 27 51,1*6 240 122,1 188,5*12 90,5 123,6 110,5*10 105,4 202 120,3*9

в - Аденокарцинома 84,1*14 380*52 377,5*45

г - Контроль 456,7*73 273,5*10 108,9*12

Клиническая карта- периферической аденокарциномы -2-3 стадии (больные 3 группы) проявлялась в кашле с , кровохарканьем, интоксикационном синдроме., В этой группе ¡.анализировали кусочки легкого непосредственно из^патологического очага. Обращает на себя внимание резкое падение -. параметров; связыва-ния_/-АР и увеличение М-ХР более, чем в 3 раза относительно контрольных значений.. Отмечена тенденция повышения числа „¿-АР, что,.по-видимому, связано с новообразованием сосудов в опухоли.

, В сравнении с группами ТБС и ХНЗЛ падение,/-АР . цри раке самое значительное, . что может быть обусловлено нарушением . структуры клеток и их-рецепции. Отмечается постепенное . нарастание параметров связывания рецепторов в зависимости от хрони-зации и атипизации процесса.

Таким образом степень снижения количества -АР и $ -АР определяется тяжестью течения, распространенностью деструктивных и фиброзных изменений, деформацией и облитерацией сосудов, независимо от вида повреждения и воспалительного заболевания легких. Параметры связывания^ -АР, М-ХР при ограниченных воспалительных изменениях и малых повреждениях существенно не изменяются. Чем более выражена острота процесса, его распространенность, тем более выражено падение параметров связывания ^-АР и тенденция повышения М-ХР. При туберкулезе особенно значительно снижается количество ¿-АР, что, по-видимому, связано с обедненностью туберкулезной тканей легких сосудами. Рак характеризуется резким повышением уровня М-ХР и падением уровня ^З-адренорецепторов, что свидетельствует об активации неконтролируемого пролиферативного роста. Стереотипные изменения рецепторов при раневом процессе, туберкулезе, пневмонии позволяют наметить единые патогенетические подходы в лечении поврежденных легких. Важным представляется применение средств, восстанавливающих клеточный метаболизм, микроциркуляторные и обструктивные нарушения, улучшающих мембранные"процессы. Роль природных эндогенных соединений в регуляции восстановительных процессов в повреэдэнном легкой. В настоящем исследовании проведена оценка действия ряда природных эндогенных соединений. Подбор средств осуществляли

по принципу от простого к сложному: аминокислоты - аланин, гистидин, триптофан: олигопептиды - карнозин, гомокарнозин, даларгин: полипептиды - фактор роста нервов (ФРН), инсулин. Экспериментальная модель для всех препаратов - колото-резаная рана легкого морских свинок.

Уже макроскопически на основании оценки состояния раны легкого карнозин можно было выделить как наиболее эффективный препарат. Последующие микроскопические исследования раневого процесса с морфометрическим анализом легочных структур в области дефекта позволили выделить ешр 2 препарата: ФРН и инсулин. Свойства ряда апробированных препаратов приведены ниже.

-. 1. Юактвр. глота нв{&в& способствует увеличению числа кровеносных сосудов в зоне поврежденного легкого и активации пролиферации фибробластов. Электронно-микроскопически в альвеоло-цитах 1 и 2 типов, в эндотелиоцитах отмечается увеличение числа рибосом, митохондрий, выраженная маргинация хроматина в ядре и изрезанность его контуров, что свидетельствует об усилении внутриклеточных синтетических процессов. В капиллярах аэрогематического барьера эндотелиоциты формировали выросты, перегораживающие капилляры. Высокая синтетическая активность эндотелиоцитов и перицитов тесно связана с усилением пиноцито-за и пролиферации фибробластов. Известно, что цитоплазматичес-кие выросты и капилляры являются основой, по которой Сили из которой) происходит миграция фибробластов и развитие грануляционной ткани (Шехтер А.Б.). Восстановление кровообращения в зоне повреждения, улучшение оксигенации обеспечивает в последующем более полноценную регенерацию легких в околораневой зоне.

2. Цноудин оказывает благоприятное влияние на течение раневого процесса в легком. Электронно-микроскопически в эндотелиоцитах и альвеолоцитах отмечается набухание митохондрий, расширение и фрагментация канальцев эндоплаэматической сети, ведущих к увеличению числа липидных гранул. Большинство альвеолоцитов 2 типа имеют хорошо контурируемую плазматическую мембрану и сохраненные микроворсинки, мембраны органелл также интактны. Отмечали активный выход осмиофильного материа-

ла d альвеолярное пространство, при этом осмиофильные тельца увеличены в размерах и количестве с сохранением в них осмио-фильного материала. Следовательно, инсулин усиливает внутриклеточные синтетические процессы и стабилизирует клеточные меьбраны. Исследование малонового диальде гида и уровняв-токоферола в сыворотке крови животных, получивших инсулин, показали, что на фоне инсулина в процессе регенерации повреждённого легкого ПОЛ снижается,«¿-токоферол повышается интенсивнее, чем в контрольной группе. То есть имеет место некий антиоксидан-тный эффект инсулина, существование которого требует однако более убедительных доказательств.

3. JDwiwunuff KajiHeaiiH С^-аланил-Ь-гистидин) был открыт Гу-левичем B.C. и Амираджиби С. в 1900 г. в составе, так называемого, либиговского экстракта, полученного из мышц крупного рогатого скота. С 1939 г. исследование свойств карнозина проводилось под руководством Северина С.Е..

Для отбора оптимальной дозы карнозина на культуре повреж-

Таблица 6.

Влияние различных концентраций карнозина на макрофаги, лимфоциты и фибробласты культуры эксплантатов легких в 1 сутки после повреждения СЗ сутки культивирования).

Доза карнозина Смкг/мл)

Соотношение клеток в зоне их выселения из эксплантата (%%)

Макрофаги

Лимфоциты

Фибробласты

Контроль -препарата ' 5 10 20 50 100 200 300 500

без

91 73 68 58 36

35

36

37 39

,4*1,0 ,1*2,2 ,6*3,4 ,3*3,0 ,4*2,6 ,6*2,2 ,5*2,2 ,3*3.1 .4*3,5

5,0*0,6 7,3*0,6 7,4*0,5 9,8*0,6 9,3*0,8 9,5*0,6 9,7*0,6 9,2*0,6 9,2*0,6

3,6*0,6 19,6*2,0 24,0*2,1 31,9*0,2 54,3*3,1 54,9*2,1 53,8*2,1 53,5*3,0 51,4*3,2

денных легких провели оценку эффективности различных его концентраций (см.табл. 6.).

Концентрация карнозина от 5 до 100 мкг/мл через 1 сутки после повреждения легкого по сравнению с контролем вызывают отчетливое снижение числа выселяющихся макрофагов, существенное повышение числа фибробластов и некоторое - лимфоцитов. Дальнейшее увеличение дозы препарата не меняет ситуации. В культуре легкого через 3 суток после повреждения и через 8 суток под влиянием различных концентраций карнозина сохраняется та же тенденция клеточных соотношений, однако в процессе заживления потребность в карнозине снижается. Наиболее высокие концентрации карнозина (50-100 мкг/мл) необходимы в момент повреждения: на 3 сутки после повреждения оптимальная доза карнозина снижается до 20 мкг/мл, на 8 сутки - 10 мкг/мл.

Одним из основных механизмов действия карнозина на поврежденное легкое является значительное повышение числа выселяющихся фибробластов (см. табл. 7.). Клетки появляются в зоне выселения, начиная с 1 суток после повреждения легкого, их в 4-10 раз больше, чем в контрольной группе в зависимости, от суток культивирования. Число их продолжает нарастать на 3, 8 и 14 сутки после повреждения легкого. Количество митозов фибробластов повышается в 4-5 раз. Таким образом, увеличение числа фибробластов обусловлено двумя причинами: более активным их выселением из эксплантата в связи с их большей подвижностью и интенсификацией пролиферации клеток. Следует отметить, что активация пролиферации фибробластов была отмечена и после введения ФРН, даларгина, но она была менее выражена по сравнению с эффектом карнозина.

Под действием карнозина уже в 1 сутки после операции отмечается более интенсивное выселение лимфоцитов из эксплантата, чем в контроле. Через 3, 8 сутки после повреждения число лимфоцитов продолжает повышаться, но более умеренно, чем в контроле. Через 14 суток после повреждения легкого их- количество нормализуется, в то время, как в контрольной группе число лимфоцитов остается повышенным (см. табл. 7.). Известно, что при длительном сохранении в зоне повреждения активности лимфо-

цитов наблюдается более выраженное Фиброзирование легких.

Таблица 7.

Динамика выселения фнбробластов и лимфоцитов из эксплантата легких при дозе 20 мкг/мл карнозина. 3 сутки.культивирования.

-1-

Клетки Сутки после повреждения легкого

1 1 з I 8 14

Число клеток в зоне выселения С%%)

Фибро-бласт контроль карнозин 3,6*0,6 37,2*1,8 39,1*2,9 65,6*3,1 31,9*0,2 63,2*4,5 72,3*5,6 76.3*0,3

Лимфоцит контроль карнозин 5,0*0,6 16,6*1,3 14,0*0,4 13,5*0,6 9,8*0,2 13,6*0,2 12,5*0,2 4,6*0,1

Несмотря на снижение числа макрофагов под действием карнозина. количество контактов макрофагов и лимфоцитов, макрофагов и фнбробластов, макрофагов, лимфоцитов и Фнбробластов увеличивается в 4-5 раз. Увеличение числа лимфоцитов, клеточных взаимодействий уже на ранних этапах повреждения свидетельствует об усилении иммунных процессов. Появление в 1 сутки поело повреждения значительного числа Фнбробластов С в контроле лишь на 3 сутки) в сочетании с уменьшением интенсивности некротических реакций на гистологических препаратах свидетельствует о смещении пролнФеративнои Фазы раневого процесса на более ранние сроки после повреждения.,что обеспечивает ускорение процессов заживления поврежденного легкого в 2 раза.

Морфологически установлено, что карнозин с 1 суток после _ повреждения обеспечивает высокую функциональную активность всех клеточных элементов легкого. Альвеолоцит 2 типа более активно накапливает осмиофильный материал, за счет чего создаются лучшие условия для пополнения сурфактанта легких. Однако в зоне раны повышено число' альвеолоцитив 2 типа с опустошенными осмиоФилышми тельцами. Гиперплазия ультраструктур и гипертрофия клеток, с однои стороны, свидетельствует о завершенности

компенсаторных реакций в зоне раневого дефекта, с другой стороны, о продолжающихся регенерационных процессах, направленных на восстановление утраченных ультраструктур. На гистологических препаратах показано раннее (с 1 суток после повреждения и введения карнозина) увеличение объема лимфоидной ткани в виде лимфоидных скоплений и узелков, что в контроле не было выражено.

Раннее появление в зоне раны значительного числа проли-ферируюших фибробластов ( в опыте на 1-3 сутки после повреждения, в контроле - на 7-14 сутки), заполнение легочного дефекта клеточной массой, состоящей из макрофагов, лимфоцитов, фибробластов, активное взаимодействие всех клеточных элементов может обеспечить качественно новый уровень восстановления структуры легких с возможностью безрубцового заживления. Тенденция увеличения числа альвеолоподобных образований, выявленных при морфометрических исследованиях, в сочетании с повышением частоты резорбции рубцовой соединительной ткани в краях раневого дефекта по сравнению с контролем, увеличение числа капилляров с высокой синтетической активностью эндотелиоцитов свидетельствует о такой возможности.

Изучение влияния карнозина на уровень^?-адренергических рецепторов при операционной ране легких показала, что через 20 часов после повреждения количество связывающих /3Н/ДГА центров при введении карнозина и без препарата соответственно составляет 70% (Вшах - 280 фмоль/мг белка) и 60% ( Вшах - 240 фмоль/мг белка) от контрольных значений. Под действием карнозина наиболее значительное падение £ -адренорецепторов отмечается на 2 сутки после операции, в то время как без препарата - на 4 сутки (на фоне карнозина Вшах - 248 фмоль/мг белка, без препарата - 184 фмоль/мг белка). Выход показателей£-АР на плато при введении карнозина отмечено на 6-8 сутки, без препарата - на 12-14 сутки. Базальная активность аденилациклазы повторяет кривую изменений^-АР: чеоез 20 часов после повреждения при введении карнозина У=150 пмоль/мг белка в 1 мин., без препарата - 142 пмоль/мг белка в 1 мин., на 4 сутки после повреждения на фоне карнозина У=137 пмоль/мг в 1 мин., без

препарата - 128 пмоль/мг белка в 1 мин. В процессе заявления раны легкого при введении карнозина отмечается повышение ба-зальной активности АЦ до контрольных значений на 6-8 сутки после повреждения, без препарата - на 12-14 сутки. Таким образом введение карнозина при раневом процессе способствует менее значительному падению^-АР и снижению активнисти АЦ. Наряду с этим отмечается более ранний выход числа^Д-АР и активности фермента на плато, что коррелирует с морфологическими и культуральными данными, которые также фиксируют ускорение процесса заживления под влиянием карнозина.

4. Р&сфолтлды. 3 эксперименте применили ряд препаратов производства Харьковского завода бактерийных препаратов: фос-фатидилхолин 80-90% чистоты, смесь липидов из желтка яйца, который содержит 45-50% фосфатидилхолйна, 30% фосфатидилэтанола-мина, в качестве минорных компонентов холестерин и сфингомие-лин: лиофилизированный препарат "Липин", аминофосфатид (20-25% фосфатидилхолина, 50-60% фосфатидилэтаноламина). Источник выделения - спинной мозг крупного рогатого скота.

Скрининг доз фосфолипидов показал,что дозы 2, 6, 12 мг/кг массы животных при раневом.повреждении -легких малоэффективны. Существенной разницы в процессах заживления операционной, колото-резаной ран легкого в опытной и контрольной группах не получено. Основной опит проведен с дозой фосфолипидов 25 мг/кг массы. При местном однократном внутрилегочном введении препарата в момент повреддения органа выявлено несколько положительных эффектов: полноценное восстановление легочной паренхимы в околораневой зоне без эмфизематозных и воспалительных изменений; активизация процессов репаративной регенерации за счет усиления роста сосудов и увеличения лимфоидных элементов. Однако применение фосфолипидов на качество формирующегося рубца не.влияет.

5. Залсиовн-У - новый препарат, созданный на основе оптимальной комбинации карнозина и фосфолипидов. Результаты предыдущих исследований действия карнозина и фосфолипидов животного происхождения на процесс заживления ран легкого морских свинок свидетельствует о высокой эффективности исследуемых

препаратов. Однако применение карнозина имеет ряд недостатков, которые могут быть коррегированы фосфолипидами, а применение липидов затруднено в связи с их способностью окисляться кислородом воздуха. С учетом этого факта был проведен скрининг ряда соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, добавление которых к липидам привело бы к стабилизации разрабатываемого препарата. В качестве антиоксидантов были использованы ионол, токоферол, карнозин, среди которых карнозин оказался достаточно эффективным.

При морфометрических исследованиях зоны раны _ легкого морских свинок показано, что под действием заксилена-Р через 14 суток после повреждения удельная объемная плотность альвеол и стромы приближена к аналогичным показателям для здорового легкого: альвеолы и строма составляли - 44% и 48% соответственно для легкого в контроле, 45% и 44% для оперированного легкого (Р<0,001), обработанного заксиленом-Р. Наряду с этим через 14 суток после повреждения легкого в околораневой зоне отмечено увеличение числа кровеносных сосудов, которое значительно превышало их число в контроле (соответственно при действии заксилена-Р - 3,6%, контроль - 2,4%, Р<0,0001). Карнозин сам по себе способен активизировать развитие микроциркуля-торного русла и это его свойство сохраняется в составе заксилена-Р. Важно отметить, что новым свойством смеси по сравнению с чистыми фосфолипидами и карнозином является увеличение числа ветвей регенерирующих бронхов, что улучшает аэрацию зоны повреждения и создает лучшие условия для эпителизации ткани (число бронхиальных структур составляло соответственно: при действии заксилен-Р - 4,0%, карнозина - 2.4%, фосфолипидов -2,3%, контроль - 2,4%, Р<0,002).

Некоторое снижение числа лимфоидных образований в околораневой зоне на фоне действия заксилена-Р и большая их очерченность на гистологических препаратах по сравнению с реакцией на карнозин говорит.о более умеренных реакциях иммунологической защиты. При анализе полутонах срезов и электрограмм легких животных на фоне заксилена-Р отмечали сохранность клеточных мембран и внутриклеточных структур. В альвео-

лоцитах 2 типа осмиофильные тельца бьши преимущественно заполнены осмиофильным материалом при активном выходе его в альвеолярное пространство, в то время как для животных, получавших один карнозин, было характерно наличие в зоне повреждения "опустошенных клеток" - альвеолоцитов 2 типа без осмиофильного материала или с изменением его структуры. Именно сохранностью осмиофильного материала можно объяснить меньшую эмфизематоз-ность легочной ткани у животных получавших заксилен-Р (альвеолы составляют при действии заксилена-Р - 43,4%, карнозина -49%, в контроле - 30%, Р<0,002). Важно отметить, что на фоне заксилена-Р, как и карнозина, наблюдали формирование клеточной массы в зоне повреждения: в основном это лимфоциты, фибробласты, в меньшей степени макрофаги. Снижение числа клеток в раневом дефекте, наблюдаемое в дальнейшем при введении заксилена-Р, сопровождалось образованием зон аэрации, в области которых наблюдали постепенное восстановление структуры легких. На фоне карнозина более длительно сохранялся септальнкй отек, эозинофильная инфильтрация, что свидетельствует о менее полноценном восстановлении архитектоники легких и сохранении компонентов воспаления. В контроле формируется компактный рубец.

Таким образом, введение заксилена-Р приводит к восстановлению структуры поврежденных легких за счет следующих эффектов:

- стимуляции лимфоидных образований:

- восстановления капиллярного кровотока в зоне раны:

- улучшения аэрации околораневой зоны, связанной с более активной регенерацией мелких бронхов;

- стабилизации целостности мембран и цитоплазматических структур альвеолоцитов 2 типа, что способствует ограничению развития эмфиземы и ателектазов в'околораневой области:

- активации пролиферации фибробластов без выраженного коллагенообразования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе ультраструктурных исследований вскрыты меха-

низмы повреждения и компенсации клеточных и внутриклеточных структур легкого. Установление взаимозависимое участие в процессах заживления поврежденного легкого всех клеточных элементов паренхимы легкого.

Альвеолоцит 2 типа является основным пластическим материалом, обеспечивающим новообразование альвеолоподобных структур в зоне дефекта. Характер изменений осмиофильных телец альвеолоцитов 2 типа на различных стадиях раневого процесса свидетельствует о необходимости своевременного пополнения ос-миофильного материала альвеолоцитов 2 типа, что создаст условия для совершенного восстановления альвеолярных структур и сурфактанта легких. Нарушения ультраструктурной организации клеток, явление гидропической дистрофии после нанесения повреждения требуют использования средств, усиливающих биосинтетические процессы в клетках.

Мэрфокинетические параметры клеточных элементов в культуре поврежденной ткани легкого соответствуют динамике клеточных реакций, выявленных при морфологических исследованиях. На ранних этапах после повреждения наиболее активны выселяющиеся из эксплантата макрофаги (91,4*1%) и лимфоциты (10,2*0,7%). На 3-8 сутки после ранения клеточные ассоциации относительно стабильны и представлены активированными фибробластами (12*1,8%), макрофагами (2*2,3%) и лимфоцитами (16,6*1,3%). Следовательно, модификация процесса заживления раны возможна при управлении двумя процессами: усиление деятельности иммунокомпетентнкх клеток и повышение активности фибробластов.

Структурные нарушения коррелируют с изменениями адре-нергической и холинергической рецепции паренхимы легких. Чем выраженнее повреждение паренхимы легких, тек значительнее снижение количества £ -адринергических рецепторов и тенденция повышения М-холинергических рецепторов. Уменьшение числа сосудов в очаге поражения сопровождается снижением «¿-адренергичес-ких рецепторов. Запуская ряд внутриклеточных эффекторных систем (аденилатгуанилатциклазные системы, кальциевые каналы, система образования инозитфосфатов, ДАТ и др.), адренергичес-ие и М-холинергйческие рецепторы генерируют точные и коорди-

нированные ответы клеток на повреждение. Однако, прогрессирую-. щее падение количества^-адренорецепторов и резкое повышение М-холинорецепторов, выявленное при раке, свидетельствует о разбалансировке в системе клеточных ответов. Дефектность ре-цепторной системы клетки инициирует возникновение необычных внутриклеточных реакций. Один из вариантов ответов, а именно, падение активности аденилатциклазы, снижение уровня цАМФ, активация С-протеинкиназ в конечном итоге изменяет структуру синтезируемых белков и соотношение процессов пролиферации и клеточной дифференциации, что. может стать одним из источников злокачественной трансформации.

Правомочно мнение о стереотипности рецепторных нарушений в ответ на разные раздражители. Так,повреждения паренхимы легких. вызванные ранением. ХНЗЛ. туберкулезом, раком сопровождаются уменьшением количества ^й-адренергических рецепторов. Острые и относительно ограниченные процессы, как-то колото-резаная рана, очаговый туберкулез, ХНЗЛ характерезукггся умеренным снижением количества £ -адренергических рецепторов (на Зф-40% от контрольных значений) и активности аденилатциклазы с последующим выходр$ показателей на плато. При не^етании деструктивных и цирротических изменений в легких наблюдается более значительное уменьшение числар -адренергических рецепторов и тенденция к некоторому повышению числа ^ -адренергических и увеличение числа М-холинергических рецепторов. То есть состояние рецепторов при грубой деформации анатомических структур легкого весьма напоминает таковые при опухолях, что позволяет трактовать длительно текущие воспалительные заболевания легких как предраковые. Резкое падение количества <=6-адренергических рецепторов при туберкулезе и особенно при его цирротических формах, по-видимому, связано с повреждением эндотелия сосудов в связи с их деформацией и облитерацией. Следовательно, необходимость координированных стимулирующих и ингибируюших воздействий на синтез рецепторов не вызывает сомнений.

Установленные факты позволили определить направление Фармакологической регуляции восстановительных процессов в пов-

режденном легком. На модели раны легкого морских свинок апробированы аминокислоты, пептиды, обладающие иммуномодулируюши-ми и белковосинтезирующими свойствами, а также фосфолипиды, способствующие стабилизации альвеол и вторичный мессенджер ДАТ, который через активацию протеинкиназы-С и механизм обмена ионов запускает процесс размножения клеток. Привлекательность ДАТ заключается еще и в том, что он принимает участие в синтезе фосфадитилхолина - основного фосфолипида сурфак-татнта легких. '

С помощью морфологического скрининга и морфометричес-кого анализа гистологических препаратов отобраны наиболее эффективные лекарственные средства, созданы оптимальные комбинации из них. Карнозин, фосфолипиды, комбинация карнозина и фос-фолипидов, а также карнозина, фосфолипидов и ДАТ - новая группа препаратов, регулирующих на различных уровнях внутриклеточный метаболизм и запускающих механизм наиболее полноценного восстановления анатомических структур поврежденного легкого. Показано, что карнозин обладает иммуномодулируюшими, антиокси-дантными и стимулирующими развитие сосудов и клеточную пролиферацию свойствами, за счет чего обеспечивается сокращение продолжительности первой фазы раневого процесса, ускорение процесса заживления приблизительно в 2 раза и формирование у большинства животных нежного рубца, который в 25% случаев через год почти редуцируется. Однако при применении карнозина наряду с положительными фармакологическими эффектами наблюдаются процессы, свидетельствующие в первую очередь. о недостатке строительного материала, необходимого для восстановления как отдельных клеточных элементов, так и паренхимы в целом. В околораневой зоне отмечали большое число альвеолоцитов 2 типа с опустошенными осмиофильными тельцами, утолшение аэро-гематического барьера за счет гидропической дистрофии и гипертрофических процессов, а, как следствие, формирование ограниченных участков пневмосклероза и эмфиземы. Применение фосфолипидов способствовало уменьшению эмфизематозности и нормализации внутриклеточных структур альвеолоцитов 2 типа в околораневой зоне. Однако формирование рубца наблюдали у всех животных

и резорбция его была редким исключением. С учетом полученных данных была применена лекарственная смесь из карнозина и фос-фолипидов - заксилен-Р. Ценность этого препарата заключается в том, что в нем не только сохранены положительные эффекты обоих компонентов, но и выявлены новые положительные свойства. Увеличение числа кровеносных сосудов и ветвлений бронхов в зоне повреждения, большая полноценность структуры альвеолоцитов 2 типа при активном выходе осмиофильного материала в альвеолярное пространство для образования ■сурфактанта, преобладание клеточных ассоциаций над коллагенообразованием в раневом дефекте - все это создает условия для восстановления нативной структуры поврежденной паренхимы. Почти у 1/4 животных в зоне операционной раны через месяц после получения препаратов отмечали формирование паренхимы с почти нормальной структурой. Вместе с тем имело место некоторое утолщзние аэрогематическо-го барьера преимущественно за счет увеличения клеток интерсти-ция, явления гипертрофии и гиперплазии. ДАТ вошел в состав следующего лекарственного препарата, представленного смесью карнозина, фосфолипидов и ДАГ. Присоединение ДАТ коррегирова-ло дефекты предыдущей смеси и значительно увеличило число животных с восстановлением структуры легких в зоне повреждения. Однако, настораживает гиперхромность ядер почти всех клеточных элементов и особенно эндотелиоцитов. С одной стороны - это свидетельство усиления синтетических процессов. С другой стороны, высокий индекс пролиферации не исключает ситуации неконтролируемого роста и аномального онкотрансформируюшрго изменения клеток. Поэтому дальнейшие исследования в первую очередь включают изучение канцерогецрости и мутагенности ДАТ.

Таким образом, для регуляции восстановительных процессов в легких применена последовательно подобранная группа природных эндогенных соединений с учетом метаболических потребностей паренхимы легких. Полученные результаты создали предпосылки для организации дальнейших как теоретических, так и практических исследований.Возникла необходимость изучения механизма внедрения пептидов в клетку, оценки влияния пептидов на внутриклеточную рН, в первую очередь легочных фибробластов и

альвеолоцитов 2 типа, а следовательно, на их биосинтетическую активность. Важным является продолжение исследований 'панорамы нейрорецепторов паренхимы легких при различных патологических состояниях и выявление взаимосвязи рецепторных изменений.с обменом липидов и уровнем активности внутриклеточных мессендже-ров (цАМР, ДАТ, ионы кальция и т.д.). Это позволит более полно охватить каскад регуляторных механизмов - от первичного раздражителя до внутриклеточного ответа. Наряду с этим продолжается проведение комплекса доклинических и клинических исследований по созданию новой группы препаратов на основе природных эндогенных соединений.

ВЫВОДЫ

1. Заживление операционных и колото-резаных ран легких морских свинок имеет те же закономерности течения, которые отмечены у человека и ряда млекопитающих животных (крыс, кроликов, собак). В ранней фазе раневого процесса происходят активация макрофагов, лимфоцитов и фибробластов, которые мигрируют в область дефекта и принимают участие в формировании рубца. В зонах, прилежащих к краю раны, активируется' пролиферация альвеолоцитов 2 типа, что со временем способствует образованию альвеолоподобных структур в области рубца, а также пополнению альвеолярного сурфактанта, секретируемого этими клетками. Большую роль в заживлении раневого дефекта играет новообразование кровеносных сосудов.

2. В околораневой зоне поврежденного легкого морских свинок параллельно с репаративными процессами протекают ультраструктурные дистрофические изменения-в части альвеолоцитов 2 типа, выражающееся в уменьшении числа митохондрий и рибосом, чрезмерном везикулообразовании, а также утрате электронноплот-ного материала с нарушением четкой осмиофильной структуры ос-миофильных телец, являющихся местом внутриклеточного синтеза и накопления фосфолипидов, идущих на построение альвеолярного сурфактанта.

3. Особенностью репаративного раневого' процесса в легких морских свинок является Формирование в околораневой зоне скоп-

лений лимфоидных клеток, что можно оценить как реакцию местной иммунной системы легких на повреждение

4. Характер миграции клеточных элементов из эксплантата поврежденного легкого морских свинок.и кроликов имеет много общего с прижизненными клеточными реакциями в раневом дефекте легкого этих животных: на раннем этапе наиболее активны макрофаги, а позже - лимфоциты, фибробласты. В связи с этим культура эксплантатов поврежденного легкого может служить моделью для скрининга различных модуляторов раневого процесса и стимуляторов репаративной регенерации органа, позволяющей дать количественную оценку масштабам выселения клеток при заживлении раны.

5. Независимо от вида повреждения легкого в эксперименте, а также при наличии легочной патологии у.человека характер морфологических изменений в органе коррелируют с уровнем изменений адренергических и М-холинергических мембранных клеточ-

-у

ных рецепторов. Число£ -адренергических рецепторов снижается по мере нарастания дистрофических и некротических процессов, и в условиях развития фиброза, а число«¿-адренергических рецепторов - по мере нарастания деформации и облитерации кровеносных сосудов.

6. При туберкулезе легких происходит наиболее значительное падение числа Л- -адренергических рецепторов в зонах фиброза, что обусловлено выраженными микроциркулярными нарушениями и обедненностью ткани кровеносными сосудами.

?. Для рака легких характерно резкое падение числа ^-адренергических рецепторов и значительное повышение числа М-холинорецепторов, что иллюстрирует сопряженность эффектов реакции рецепторной системы легочной паренхимы и свидетельствует об активации клеточной пролиферации.

8. Целенаправленное изучение влияние различных доз карно-зина на заживление операционных и колото-резаных ран легкого морских свинок показало, что благоприятное действие этого препарата осуществляется благодаря его способности влиять как на все звенья раневого процесса, так и на рецепторные свойства клеточных мембран легкого. V

9. Карнозин способствует значительному увеличению числа лимфоидных скоплений в околораневой зоне поврежденных легких морских свинок. Через 14 суток после ранения легкого в контроле лимфоидные скопления занимают 1,8*0,3%, при действии карно-зина - 5,2*0,4% по отношению к другим структурен легкого СР<0,001).

10. Под влиянием оптимальных доз карнозина, введенных внутрилегочно, в околораневой зоне легкого уменьшаются дистрофические изменения в альвеолоцитах 2 типа и эндотелиоцитах кровеносных сосудов, а также стимулируется внутриклеточная регенерация (гиперплазия и гипертрофия органелл) в клетках поврежденного легкого.

11. Карнозин способствует более ранней миграции клеток (макрофагов, лимфоцитов, фибробластов) из эксплантатов поврежденного легкого, что сопровождается увеличением их абсолютного числа в зоне выселения, а следовательно и в ране легкого 1п vivo.

12. При действии карнозина в поврежденном легком наблюдается более раннее восстановление числа/ -адренергических рецепторов и активности аденилатциклазы.

13. Смесь фосфолипидов, основным компонентом которой яв- ' ляется фосфатидилхолин, примененная внутрилегочно, способствует нормализации ультраструктурной организации большинства альвеолоцитов 2 типа на ранних этапах заживления операционных и колото-резаных ран легкого морских свинок, а также уменьшению числа эмфизематозно-измененных альвеол в околораневой зоне. На качество рубца фосфолипиды существенно не влияют.

14. Заксилен-Р (комбинация карнозина и фосфолипидов) обладает положительными эффектами обоих компонентов. Наряду с этим препарат способствует увеличению числа кровеносных сосудов и бронхиальных ветвлений в зоне повреждения, появлению активных иммунокомпетентных клеток , а также стимулирует пролиферацию фибробластов.

15. При внутрилегочном действии 1п vivo как карнозина, так и заксилена-Р, в результате уменьшения выраженности дистрофических изменений поврежденного легкого и активации кле-

точной пролиферации ускоряется заживление раны (в контроле полное заживление раны легкого морских свинок завершается на 14 сутки, а при действии препарата - на 7 сутки). Оба препарата способствуют формированию более нежного рубца в области дефекта.

16. Для ускорения заживления операционных и колото-резаных ран легких целесообразен подбор препаратов, стимулирующих репаротивную регенерацию в области раны, коррегирующих обмен фосфолипидов в альвеолоцитах 2 типа, способствующих увеличению ассоциаций клеточных элементов в зоне раневого дефекта легкого и улучшающих состояние рецепторов легкого. Таким препаратом является заксилен-Р.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изменение свойств аденилатциклазы легких морской свинки при туберкулезном процессе//Биохимия. - 1985. - Т.4. N4.-С.589-594 Ссоавт. Перельман М.И., Буларгина Т.В., Скурат A.B., Северин Е.С.).

2. Регенерация легких в эксперименте/УБрлл. зксп. биологии и медицины.- 1989.- N5.- С.612-615 Ссоавт. Перельман М.И., Бойков А. К., Пауков В. С., Приймак А. А., Буларгина Т. В., Северин С.Е.).

3. Влияние карнозина на заживление раны легкого//Бюлл. эксп. биологии и медицины. - 1989. - N9. - С.352-355 Ссоавт. Перельман М.И., Бойков А.К., Пауков B.C., Приймак А.А, Буларгина Т;В., Северин Е.С.).

4. Мэрфокинетические параметры клеточных популяций в культуре поврежденных легких//Сб. трудов конф. физиологов. -Каунас, 1989. - С.117-119.

5. Карнозин в лечении ран//Сб. трудов науч.-практ. конф. пульмонологов Сибири. - Барнаул, 1989. - С.195-196 Ссоавт. Перельман М.И., Пауков B.C.).

6. Применение пептидов при патологии легких//Мат. III Всес. симпозиума "Физиологическое и клиническое значение регу-ляторных пептидов" - ЬЬикний Новгород, 1990. - С.94 Ссоавт. Перельман М.И.).

7. Влияние карнозина на динамику клеточного состава в культуре ткани поврежденного легкого//Мат. III Всес. симпозиума " Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" - Ниж.Новгород, 1990.- С.95 Ссоавт. Зарубян М.С.).

8. Экспериментальная хирургия легких на мелких животных -депонирована. - 1990. - N Ссоавт. Перельман М.И., Абдулла бин Абдулла, Коган A.A.).

9. Динамика репаративных процессов в культе бронха в. эк-сперименте//Проблемы туберкулеза. - 1990. - С.57-68 Ссоавт. Перельман М. И., Абдулла бин Абдулла, • Бойков А. К.).

10..£-адренергические и мускариновые рецепторы при раке легких//Мат. I Всес. конгресса по болезням органов дыхания:

16.резше.- Киев, 1990. - N3.- С.19 (соавт. Кондратенко Т.Я.).

11./ -адренергические и мускариновые ацетилхолиновые ре-{епторы паренхимы легких человека при злокачественных новооб->азованиях//Вопросы мед. химии. - 1991,- N7. - С.20-21 Ссоавт. Ьрельман М.И., Кондратенко Т.Я., Кузина Н.В., Северин Е.С.).

12. Изменения/ -адренергических рецепторов в - паренхиме югких человека при хронической пневмонии и раке//Вопрйсы мед. :имии.- 1991. - N2. - С.20-21 (соавт. Перельман М.И., Кондратенко Т.Я., Северин Е.С., Тихомирова Э.В.).

13. «¿-адренергические рецепторы паренхимы легких челове-:а при деструктивном туберкулезе//Вопросы мед. химии. - 1991. -[4.- С. 69-70 (соавт. Перельман М.И., Кондратенко Т.Я., Севе-ин Е.С., Тихомирова Э.В.).

14. Влияние пептидов на регенерацию поврежденного легко-о//Мат. II Всес. конгресса по болезням органов дыхания. -ёлябинск, 1991. - С.301 (соавт. Перельман М.И.).

15. Пептиды в лечении ран легких//Мат. Всес. конф. Мзстное лечение ран". - М., 1991. - С.38-39 (соавт. Перельман

:.и.).

16. Изменение рецепторов легких при некоторых патологи-еских состояниях человека//Проблемы туберкулеза. - 1992. -7-8. - С. 4.

17. Регуляция восстановительных процессов в поврежденном эгком//Онтогенез. - 1992. - Т.22. - N3. - С. 301-302.

18. Влияние карнозина на внутриклеточный рН в эмбриональ-ах фибробластах легких человека//Сб. трудов РАН, институт лм. физики им. Н.Н.Сеченова. - М., 1992. - С.115-116 (соавт. момирова Э.В., Оглоблина Т. Д.).

19. Карнозин и восстановительные процессы в поврежденном згком//Сб. трудов РАН, институт хим. физики им. Н.Н.Сеченова, f., 1992. - С. 26-28.

20. Human lung adrenergic and muscarinuc cholinergic :ceptors in cancer and previous airways diseases, tondratenko Т., Kuzina N., Perelman M. et al.) Biochemistry iternatlonal) Vol.26., N6. May 1992, P.1043-1052.

21. Авторское свидетельство N 4755971/14 (112129) пр-т

07.02.90 г. "Ранозаживляющве средство" Ссоавт. Перельман М.И. Селищэва А. А., Абдулла бин Абдулла).

22. Авторское свидетельство N 480i400/14 (015127) пр^ 06.02.90 г., заявитель МЖИТ КЗ РСФСР "Легочные шипцы" (соавт Перельман М.И., Абдулла бин Абдулла, Коган А.Х., Прийиак A.A. Лосев Н.И.).

23. Авторское свидетельство N 4799572/14 (005696) пр-10.01.90 г. "Средство профилактики рубцовой ткани" (соавт Перельман М.И., Селищвва A.A., Дупин А.М., Болдырев A.A. Северин С.Е.).

24. Авторское свидетельство N 4916854/14 (124555) пр-29.12.90 г. "Средство, обладающее регенерирующим действием н поврежденную ткань животных" (соавт. Селищзва A.A., Соловье ва И.П.). •

Зак. тип. 105, Тир. 120 экз.