Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Мозговой кровоток и некоторые механизмы антиоксидантной защиты при экспериментальной ишемии мозга у крыс

Г Б ОД > 9 АПР Ш5

На правах рукописи

Куклей Мария Львовна

УДК 615.384:678.015.4:612.143 + 612.827 + 577.1 + 612.822

МОЗГОВОЙ КРОВОТОК и НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МОЗГА У КРЫС

14.00.16 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Лаборатории экспериментальной патолог нервной системы и Лаборатории клинической нейрохимии Научно-ис ледовательского института неврологии Российской АМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

член-корреспондент РАМН

доктор биологических наук, профессор

И.В.ГАННУШ А.А.БОДЦЫРЕЕ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

А.М.ГУРВИЧ А.Н.ЕРИН

Ведущее учреждение -

Российский Государственный Медицинский Университет

_3ащита диссертации состоится ^ддд г.

" -1Ъ " часов на заседании Специализированного Совета Д.001.03 при НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: Моек ул. Балтийская, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института щей патологии и патофизиологии РАМН

Автореферат разослан 2 ~ ^дд5 г_

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат медицинских наук Л:Н.Скуратове

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Лапуальвосшь проблемы

В настоящее время проблема нарушений мозгового кровообращения и метаболизма нервной ткани в условиях ишемии является одной из основных проблем экспериментальной и клинической неврологии. Механизмы ишемических поражений мозга широко обсуждаются в современной литературе (Шмидт Е.В., 1975; Pulsinelli W.A., 1985; Welsh F.А., 1985; Ганнушкина И.В., 1989; Н.В.Верещагин с соавт., 1990, 1993; Суслина З.А., 1990; Halliwell В. et al., 1992).

Показано, что при снижении кровотока по магистральным сосудам головы развиваются различные по тяжести повреждения мозга, которые зависят от длительности ишемии и от того, является ли она полной или неполной, а также от возможностей коллатерального кровообращения и индивидуальной чувствительности особей к ишемии (Hossmann К.-A. and Kleihues P., 1973; Ганнушкина И.В. 1968, 1973, 1994; Rehncrona S. et al., 1981).

В патогенезе ишемии мозга важная роль принадлежит нарушениям в дыхательной цепи митохондрий и увеличению продукции супероксид-аниона кислорода (Владимиров Ю.А. с соавт., 1990; Siesjo

B.K., 1988; Peruche В. and Krieglstein J., 1993). В ишемизирован-ных тканях мозга развивается выраженный ацидоз (Floyd R.A., 1993; Olanow C.W.,1993); активируются процессы гликозилирования липидов и белков (Bergamini Е., 1992; Smith M.Ä. et al, 1995). Кроме того, происходят изменения концентрации глутамата, серотонина и ка-техоламинов (Siesjo B.K., 1988; Szatkowski М. and Attwell D., 1994; ■ Болдырев A.A., 1995). Нарушение целостности мембраны при активации перекисных процессов ведет к их повышенному высвобождению, открыванию ионных каналов, связанных с глутаматными рецепторами и как следствие - к быстрому входу ионов Ca в клетку (Olanow

C.W., 1993; Coyle J.Т. and Puttfarcken P., 1993). В итоге наблюдается активация фосфолипаз, протеиназ, NO-синтазы и кальпаина (Olanow C.W., 1993; Болдырев A.A., 1995), что ведет к избыточной генерации активных форм кислорода в ткани. Совокупность этих процессов в случае отсутствия необходимого контроля со стороны систем антиоксидантной защиты может привести к чрезмерной активации свободнорадикальных реакций и массовому повреждению нейронов ише-мического мозга.

Несмотря на то, что активация свободнорадикального перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) являются одним из основных факторов

повреждения нервной ткани в условиях ишемии (Davis R.J., 1987 Сао W. et al. 1988; Smith М.А. et al., 1992; Olanow C.W., 1993) не до конца ясным остается вопрос о взаимосвязи между степега снижения мозгового кровотока при ишемии, уровнем активации ПОЛ содержанием антиоксидантов в тканях мозга, а также о роли ПОЛ механизме формирования неврологической симптоматики. Для решею этих проблем необходим комплексный подход, позволяющий сочетач патофизиологические и биохимические методы исследования.

С Другой стороны, в последнее время в литературе появилис данные о том, что свободные радикалы обладают двойственным эффез том при ишемии и могут не только участвовать в повреждении мозг; но и способствовать улучшению мозгового кровообращен] ((Darley-Usmar V.et al., 1995; Болдырев А.А., 1995). Оказало! также, что терапия с помощью антиоксидантов была не всегда ycnei ной (Halliwell В., 1992), а открытие "парадокса витамина Е" да привело к мысли о целесообразности периодов пониженной антиокс: дантной защиты мозга (Packer L. et al., 1992). В связи с этим а туальным стал вопрос о поиске противоишемических препаратов, э фект которых был бы направлен не на ингибирование, а на модуляц и поддержание на адекватном уровне свободнорадикальных процесс в мозге.

Кроме того, по-прежнему актуальным остается вопрос о прич нах неодинаковой чувствительности особей к ишемии. Работы в эт области немногочисленны: показано, что различная устойчивость ишемическому повреждению зависит от содержания катехоламинов олигопептидов в -крови и ткани мозга (Исмайлова Х.Ю. с соавт 1992), от уровня энергетического метаболизма мозга и величи мозгового кровотока а также определенным образом коррелирует типом поведения животных (Ганнушкина И.В. с соавт., 1989, 1994 Исследования подобного рода представляют интерес как для экспер ментальной, так и для клинической медицины, и предполагают noi предикторов тяжести течения ишемии и, в конечном итоге, - возмс ность прогнозировать характер развития ишемического поврежде! мозга.

Целью настоящего исследования было изучение изменений моз1 вого кровотока и процессов перекисного окисления липидов в мог крыс при ишемии, выяснение взаимосвязи этих параметров с тга поведения животных и развитием неврологического дефицита, а та} оценка эффективности профилактического применения гистидинсод< жащего дипептида карнозина при экспериментальной ишемии моз]

Поставленная цель предполагала решете следующих задач:

1) изучение изменений мозгового кровотока и ЭЭГ в динамике в ранние сроки ишемии и через 24 ч поражения мозга у крыс с разным типом поведения;

2) оценка тяжести неврологического дефицита у животных через 24 ч ишемии;

3) изучение процессов перекисного окисления липидов и содержания водорастворимых антиоксидантов в коре мозга в норме и через 24 ч ишемии (in vitro) у крыс с разным типом поведения;

4) изучение эффекта природного гистидинсодержащего дипептида карнозина (при его профилактическом применении) на указанные параметры в норме и при ишемии мозга у крыс с разным типом поведения.

Научная новизна.

В настоящей работе на модели двусторонней окклюзии общих сонных артерий у крыс показано, что величина межполушарной разницы мозгового кровотока и уровень индуцибельности процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ткани мозга могут быть прогностическими критериями тяжести течения ишемии мозга наравне с такими параметрами, как величина мозгового кровотока (Ганнушкина И.В. с соавт., 1994) и соотношение концентраций макроэргов (АТФ, креа-тинфосфат) и акцепторов водорода (НАД, НАДН) (Ганнушкина И.В. с соавт., 1989).

В работе показано, что более легкое течение ишемии коррелирует с высокой индуцибельностью процессов ПОЛ в коре мозга через 24 ч ишемии. При этом индуцибельность перекисных реакций не зависит от типа-поведения животных и содержания водорастворимых антиоксидантов, 'таких как глутатион, таурин и гомокарнозин. Эти данные еще раз поднимают ставший в настоящее время актуальным вопрос о том, всегда ли антиоксиданты оказывают благоприятный эффект при ишемии и необходимы для коррекции ишемических поражений мозга.

Принципиально новыми являются полученные в настоящей работе данные о действии природного; гистидинсодержащего дипептида карнозина в норме и при ишемии. Показано, что в норме применение карнозина у крыс ведет к стабилизации мозгового кровотока и электрической активности коры головного мозга. При ишемии карнози:-: способствует менее выраженному снижению мозгового кровотока в ранние сроки и более полному его восстановлению через 24 часа.

В работе впервые показано, что улучшение неврологической симптоматики у крыс на фоне введения карнозина коррелирует с по-

вышением индуцибельности перекисных процессов in vitro. Это пог воляет предполагать, что при ишемии мозга эффект карнозина связг не с его прямыми антиоксидантными свойствами, а со способност! поддерживать гомеостаз клеток мозга.

В работе впервые показано, что эффект карнозина на изучаем* параметры в норме и при ишемии по-разному проявляется у крыс разными поведенческими характеристиками, на основе чего высказав предположение, о наличие у крыс избирательной чувствительности карнозину.

Теоретическое значение работы. ,

Результаты проведенного исследования показали, что при или мии мозга, вызванной двусторонней окклюзией общих сонных apTepi у крыс, снижение мозгового кровотока не сопровождается выражен» активацией свободнорадикальных реакций.

Изучение эффекта природного нейропептида карнозина позволи заключить, что при ишемии мозга у крыс этот дипептид способству улучшению неврологической симптоматики, менее выраженному сниж нию мозгового кровотока, а также - защите мембранных липидов перекисного окисления и поддержанию нормальной концентрации ант оксидантов в мозге. Эффект карнозина проявляется как сразу пос введения, так и в более поздние сроки; при этом его влияние изучаемые параметры мозга неодинаково выражено в группах крыс разными поведенческими характеристиками.

Практическое значение работа.

Полученные в настоящей работе данные о наличии прогностиче ких критериев тяжести течения ишемии в эксперименте позволя предполагать, что и у больных с нарушениями мозгового кровообг щения возможно прогнозировать характер развития ишемического i ражения. .Это свидетельствует о необходимости поиска предикто! тяжести ишемического процесса в клинике.

Результаты проведенной работы поднимают вопрос о целесос разности антиоксидантной терапии при ишемических поражениях мо: и позволяют заключить, что чрезмерное подавление перекисных п] цессов в мозге так же плохо, как и их чрезмерная активация, а рапевтические мероприятия при ишемии должны быть, вероятно, н, равлены не на ингибирование, а на модуляцию свободнорадикаль: реакций.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о т> что природный дипептид карнозин при его профилактическом приме: нии способен улучшать течение ишемического процесса в мозге.

этом, эффект карнозина по-разному проявляется у животных с разными поведенческими характеристиками. Полученные данные позволяют рекомендовать карнозин для дальнейших испытаний с целью выявления наиболее эффективных доз, способов и сроков введения при учете избирательной чувствительности особей к этому препарату. В конечном итоге предполагается возможность использования карнозина в качестве противоишемического и противогипоксического средства.'

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1) значения исходного мозгового кровотока и межполушарной разницы кровотока, а также величина индуцибельности перекисного окисления липидов в мозге могут быть прогностическими критериями тяжести течения ишемии мозга;

2) при ишемии мозга, вызванной двусторонней окклюзией общих сонных артерий у крыс, снижение мозгового кровотока не сопровождается выраженной активацией свободнорадикалзных реакций;

3) природный гистидинсодержащий дипептид карнозин при его профилактическом применении облегчает течение ишемии мозга у крыс, улучшает мозговой кровоток и стабилизирует амплитуду те-та-ритма ЭЭГ; эффект карнозина неодинаково проявляется у крыс с разным типом поведения;

4) карнозин при его внутрибрюшинном введении животным способствует увеличению индуцибельности перекисных реакций через 24 ч ишемии и поддержанию концентрации водорастворимых антиоксидан-тов на уровне контроля.

Апробация работ. Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме " Natural antioxidants: molecular mechanisms and health effects" (Китай, 1995), на 7 Международном симпозиуме по нейронаукам (Япония, 1995). Апробация работы состоялась на межлабораторной конференции в НИИ неврологии РАМН 29 сентября 1995 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста. Материал иллюстрирован 28 таблицами и 21 рисунком. Список цитированной литературы включает 196 источников, из них 131 иностранный.

- 6 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали 150 белых лабораторных крыс-самцов массой 220-260 г. Тип поведения животных определяли в тесте "открытого поля" (Власова Т.И. с соавт., 1983). Выделяли высокоактивных крыс (ВА), низкоактивных (НА) и промежуточную группу - сред-неактивных животных (CA), которых в работе не использовали.

В дальнейшем животных делили на 8 экспериментальных групп:

1 и 2 группы - ВА и НА животные с экспериментальной ! ишемией мозга; 3 и 4 группы - ВА и НА животные с экспериментальной ишемией мозга, получавшие карнозин внутрибркжинно в дозе 250 мг/кг веса за 25-30 мин до операции. Ишемию мозга осуществляли путем перевязки обеих общих сонных артерий на шее у крыс, анестезированных нембуталом в дозе 40 мг/кг веса (Ганнушкина И.В. с соавт., 1994). 5 и 6 группы - ВА и НА контрольные животные (норма), полу-т чавшие нембутал в дозе 40 мг/кг веса; 7 и 8 группы - ВА и НА

контрольные животные (норма+карнозин), получавшие нембутал и карнозин в вышеуказанных дозах.

В работе использовали следующие физиологические методы:

- локальный мозговой кровоток измеряли в динамике у анестезированных крыс с помощью лазерного допплерного флоуметра (Periflux Laser Doppler Syst. тип Periflux PF-3). Измерения проводили у анестезированных крыс до операции, через 15, 30, 45 мин и 24 ч после перевязки общих сонных артерий (Ганнушкина И. В. с соавт., 1994);

- ЭЭГ регистрировали с помощью полиграфа РМ-6000 ("Nikon Kohden") одновременно с измерением мозгового кровотока, используя монополярное отведение

- тяжесть неврологической симптоматики у крыс (Stroke-index) оценивали через 24 часа после операции, используя собственную модификацию метода Мак Гроу для мелких животных (McGrawC.P., 1977).

В работе использовали следующие биохимические методы:

- содержание гистидинсодержащих дипептидов (карнозина, гомо-карнозина и анзерина) определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); использовали колонку Ultrasphere I.P. 4,6 х 250 нм, 5 мкм и детектор Tracor 970А, абсорбцию измеряли при 210 нм;

- определение SH-групп белка и глутатиона проводили по методу Эллмана (Ellman G.L., 1958);

- индукцию процесса ПОЛ осуществляли в среде, содержащей сульфат железа (20 мкМ) и аскорбиновую кислоту (400 мкМ). Количество перекисных продуктов определяли по реакции с 2-тиобарбиту-ровой кислотой (Шелудченко Н.И. с соавт., 1992);

- концентрацию белка в гомогенатах коры головного мозга крыс определяли по методу Лоури (Ьотггу О.Н. еЬ а1., 1951).

Статистическую обработку результатов проводили при использовании непараметрических методов статистики с помощью и критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (Гублер В.Е., ГенкинА.А., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I.

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЗГОВОГО КРОВОТОКА И НЕКОТОРЫХ МЕХАНИЗМОВ ШИ0КСНЛШН0Й ЗА1ЩГ11 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МОЗГА.

1. Неврологическая симптоматика, мозговой кровоток и ЭЭГ.

Изучение тяжести течения ишемического процесса показало, что в группах крыс, проявляющих в тесте "открытого поля" высокую (ВА) и низкую (НА) двигательную активность, летальность' была одинаковой, однако ВА крысы характеризовались более тяжелой неврологической симптоматикой (р < 0,05) (табл.1):

Табл. 1. Летальность и неврологическая симптоматика у крыс черев 24 часа после двусторонней окклюзии общих сонных артерий.

* - различия между группами I, II, III и IV достоверны, р < 0,05; достоверность различий между группами ВА и НА крыс указана в тексте

Средние значения мозгового кровотока (МК) в нулевую минуту эксперимента достоверно не отличались у ВА и НА крыс, однако была отмечена тенденция к более низким значениям МК у НА животных.

Наличие- большого разброса данных по величине МК позволило

группы животных симптоматика гибель

отсутствует 0,5 - 2 балла более 2 баллов

I* II* III* IV*

ВА 25% 19% 12% 44%

НА 38% 24% 0% 38%

Табл. 2. Средние значения исходного мозгового кровотока и Дполуш (усл. ед.) у крыс с разным исходом ишемии через 24 часа.

Исход ишемии . через 24 ч. L ВА крысы НА крысы

ПОЛУ1 левое пария правое Дполуш П0ЛУ1 левое [ария правое Дполуш

I Отсутствие неврологической симптоматики 134±26 127+35 7±3 125±20 130+17 5+3

II Наличие неврологической симптоматики 153±36 174±19 35±12* 159±35 125±15 44±18*

III Гибель 149±28 161±15 34±10* 153±21 143±32 32±15*

* - различия между группами I и II, I и III достоверны для параметра Дполуш. Р < 0,05.

разделить ВА и НА крыс на группы с большими и меньшими значениями исходного МК. Через 24 ч ишемии оказалось, что животные с исходно более высокими значениями МК приобрели более тяжелую неврологическую симптоматику или погибли (табл. 2).

Из таблицы 2 видно, что крысы с тяжелым течением ишемии не только имели более высокий исходный уровень МК, но и характеризовались большей межполушарной разницей кровотока (Дполуш). то.есть величины МК у них значительно различались в правом и левом полушариях (р < 0,05). Можно полагать, что у этих животных хуже развиты анастомозы между левым и правым полушарием и/или имеет место разница в диаметре и геометрии сосудов виллизиева круга.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что величина исходного МК и Дполуш могут быть прогностическими критериями тяжести течения ишемии мозга в эксперименте.

Изучение динамики МК при ишемии мозга показало, что через 15 мин после перевязки обеих общих сонных артерий у ВА крыс МК снижался до 50-60% от' фона, а к 45 мин ишемии составлял 60-75% от фоновых значений. У НА крыс через 15 мин ишемии МК снижался до 75-90% от фона и держался на этом уровне в течении 45 мин ишемии (рис.1). У контрольных крыс обеих групп подобного снижения МК не происходило: в течении 45 мин эксперимента у них наблюдались лишь

колебания Ж вокруг фоновых значений, что, вероятно, отражало реакцию животных на введение нембутала, используемого для анестезии.

24ч

Рис.1. Динамика мозгового кровотока (МК) у крыс при ишемии. Представлены примеры наиболее характерных изменений МК при ишемии у 6 ВА и 5 НА крыс. Величина мозгового кровотока рассчитана в % к фону (фон (100%) - нулевая минута измерения). Каждая линия отражает динамику МК у индивидуального животного. Снижение МК при ишемии достоверно - р < 0,05.

24ч

Полученные данные согласуются с результатами исследования динамики МК при ишемии мозга (Meyer J.S., 1958; Ганнушкина И.В. с соавт., 1973; 1994) и свидетельствуют о том, что после окклюзии обеих общих сонных артерий у крыс имеет место более или менее выраженное снижение мозгового кровотока дистальнее места окклюзии. Можно предполагать, что в основе этого явления в первые секунды ишемии лежит эффект ОсТроумова-Бешшса, а затем начинается длительный ответ сосудистой системы мозга, основой которого уже являются сдвиги в метаболизме (Ганнушкина И.В., 1973).

Для более полной оценки функций головного мозга у крыс мы проводили регистрацию и анализ электроэнцефалограммы (ЭЭГ), в которой из-за условий наркоза преобладал тета-ритм. Было обнаруже-

но, что средние значения амплитуды тета-ритма ЭЭГ в нулевую минуту эксперимента достоверно не отличались у ВА и НА крыс. При этоь у всех животных имела место большая межполушарная разница по амплитуде ЭЗГ.

Изучение ЭЭГ в динамике показало, что в норме у крыс наблюдались некоторые колебания амплитуды тета-ритма ЭЭГ вокруг фоновых значений. При ишемии через 15 мин у всех животных отмечалои увеличение этого параметра, более выраженное у ВА крыс (рис.2).

24ч

Рис.2. Изменен» амплитуды тета-ритма ЭЭ в динамике. Представлен: примеры наиболее харак терных изменений амплиту ды тета-ритма при ишеми У 6 ВА и 5 НА крыс. Вели чина амплитуды ЭЭГ расс читана в % к фону (фо (100%), - нулевая минут измерения). Каждая лини отражает динамику ампли туды ЭЭГ у индивидуально го животного. Увеличен! амплитуды тета-ритма 3' при ишемии достоверно -< 0,05.

24ч

Амплитуда ЭЭГ оставалась повышенной как через 30-45 мин, так через 24 ч ишемического повреждения мозга.

Увеличение амплитуды тета-ритма ЭЭГ при ишемии, вероятн может свидетельствовать о том, что нарушения функциональной а тивности нервных клеток в указанные сроки еще не достигают знач тельной глубины, и мозг в состоянии реагировать усилением возбу

дения в ответ на гипоксию даже через 24 ч поражения (Гинзбург С.Е., 1974; Borzeix M.G. et al., 1988; Плотников М.Б. с соавт., 1994). С другой стороны, некоторые авторы рассматривают увеличение амплитуды тета- и дельта-ритмов ЭЭГ как результат органического поражения структур мозга (Проводина В.Н., Дмитриева O.K., 1984). Полученные данные отражают динамику изменений мозгового кровотока и ЭЭГ в норме и при ишемии, однако не позволяют■представить полной картины ишемического поражения.

Свободнорадикальные реакции, как известно, являются своеобразной точкой конвергентности, в которой сходятся все звенья патогенеза ишемии (Siesjo В.К., 1988; Bergamini Е., 1992; Peruche В. and Krieglstein J., 1993; Floyd R.A., 1993; Olanow C.W.,1993 Smith M.A. et al., Szatkowski M. and Attwell D., 1994). Оценка выраженности этих реакций может дать представление о тяжести течения патологического процесса. В связи с этим мы обратились к исследованию свободнорадикального перекисного окисления липидов, предполагая, что этот параметр позволит оценить степень повреждения мембран и выявить общие биохимические закономерности неодинакового течения ишемии у животных.

2. ТБКРП и водорастворимые аппиоксидапт в коре мозга крыс.

Содержание ТБКРП.

Для характеристики процесса ПОЛ в условиях ишемии мы измеряли уровень предобразованных перекисных соединений (определяемых как ТБК-реактивные продукты - ТБКРП), а также их накопление к 60 мин индукции ПОЛ в гомогенатах коры мозга крыс в присутствии железа и аскорбиновой кислоты (индуцибельность процесса ПОЛ in vitro). Достоверных различий по этим параметрам между контрольными и оперированными животными, а также между ВА и НА крысами, обнаружено не было. Однако большой разброс экспериментальных данных (до 30%) позволил разделить животных каждой экспериментальной группы (независимо от того, контроль это или опыт, ВА или НА крысы) на 2 подгруппы: с высоким и низким содержанием ТБКРП к 60 мин индукции ПОЛ (р < 0,05) (рис.3).

Оказалось, что при ишемии высокую индуцибельность ПОЛ имели животные без неврологической симптоматики или с симптоматикой не более 1 балла по шкале Мак Гроу, в то время как низкая индуци-

бельность ПОЛ была характерна для ВА и НА крыс с более тяжелой неврологической симптоматикой (рис.3). Это означает, что большая устойчивость к ишемическому повреждению коррелирует с более легкой индуцибельностью перекисных процессов в тканях коры мозга.

25 ^ 20 15-IDS'

[höpmäI

ТВКРП, нмоль/ыг белка

1

Я

гн 1

ВА крысы НА крысы

[ЙШЕМИЯI ТБКРП, киота/иг белка.

25 201510 5 0

Г~77А

■life.-.-.

Ш.

ВА,крысы НА крысы

Рис.3. Взаимосвязь между индуцибельностьк процесса ПОЛ в гомогена-тах коры мозга крыс (столбчатые диаграммы) у ■ тяжестью неврологическое симптоматики (круговые диаграммы) через 24 ишемии мозга. Секторг круговых диаграмм обозначают количество животные (в процентах) с разно! степенью неврологической дефицита: 0 - 0,5 балл; по шкале Мак Гроу (светлые секторы), 1 - 2,! балла (заштрихованны« секторы) и более 2,5 баллов (темные секторы), * ■ р < 0,05.

Водорастворимые антиоксиданты.

Принимая во внимание то, что в ранние сроки ишемического по ракения тканей эффекты свободных радикалов реализуются в гидро фильном пространстве клетки (Evans P.V. 1993; Ерин А.Н. с соавт. 1995; Болдырев A.A., 1995)' мы оценивали содержание некоторых во дорастворимых антиоксидантов - глутатиона, таурина, а также гис

А Б

Рис.4. Изменение содержания глутатиона и таурина в коре больших полушарии мозга крыс через 24 ч ишемии. А - крысы с неврологической симптоматикой; Б - крысы без неврологической симптоматики. Представлены средние значения концентраций глутатиона и таурина по группам в норме (светлые столбики) и при ишемии (темные столбики). * - р < 0,05.

тидинсодержащих дипептидов - карнозина, гомокарнозина и анзерина - в коре мозга крыс при ишемическом поражении.

Следует отметить, что восстановленный глутатион участвует в первичной защите мозга от ишемического поражения, а таурин и ди-пептиды включаются в защиту на более поздних стадиях (Биленко М.В., ' 1989). Действительно, преимущественной мишенью таурина является гипохлорит-анион (Агиоша 0.1. еЬ а1., 1988), а карнозина (гомокарнозина) - гидроксил-радикал (ВоЫугеу А. А. еЬ а1., 1994). Таким образом, эти гидрофильные антиоксиданты имеют более специфическую направленность действия, чем такой распространенный, также гидрофильный антиоксидант, как аскорбат. По этой причине, измеряя уровень таурина и гистидиновых дипептидов в мозге, мы предполагали оценить работу эндогенной антиоксидантной системы на разных этапах развития свободнорадикальных реакций.

Нами было показано, что содержание глутатиона достоверно не отличалось в коре мозга контрольных и оперированных животных (рис.4) и составляло в среднем 1,12 ± 0,06 мкмоль/г ткани. Не было обнаружено также различий по этому параметру у ВА и НА крыс. Полученные результаты находятся в соответствии с данными литературы о том, что количество глутатиона в разных структурах мозга

нмоль/г ткани

ВА крысы НА крысы

нмоль/г ткани

ВА крысы НА крысы

Рис.5. Изменение содержания гомокарнозина в коре больших полушарий мозга крыс через 24 ч ишемии. А - крысы с неврологической симптоматикой; Б - крысы без неврологической симптоматики. Представлены средние значения концентраций гомокарнозина по группам в норме (светлые столбики) и при ишемии (темные столбики).

составляет 1,05 - 2,07 мкмоль/г ткани (РеЬпсгопа Б. е1 а1., 1980; Аскеров Ф.Б. с соавт., 1988). Детальный анализ показал, что количество глутатиона достоверно не отличалось в коре мозга животных с неврологической симптоматикой и без нее (рис.4).

Можно полагать, что если низкомолекулярные БН-соединения при ишемии й подвергаются окислению в первую очередь, (в результате чего обеспечивается защита от окисления других биомакромолекул), то это окисление скорее всего является обратимым и представляет собой неспецифическую реакцию организма на экстремальное воздействие (Соколовский В.В., 1988; Биленко М.В., 1989).

Изучение содержания таурина через 24 ч после двусторонней окклюзии общих сонных артерий у крыс показало, что. у животных с неврологической симптоматикой вровень таурина при ишемии был несколько ниже, чем в контроле (|? > 0,05), или даже не отличался от контрольного (рис.4А). У крыс- без неврологической симптоматики наблюдалось увеличение содержания таурина в коре мозга (р < 0,05) (рис.4Б). Ранее нами было показано, что животные без неврологической симптоматики характеризовались и более высокой индуцибель-

ностью процесса ПОЛ. В связи с этим можно предполагать, что если более легкое течение ишемии у крыс хотя бы частично связано с функцией таурина, то последний, вероятно, обеспечивает защиту мозга от повреждения не в качестве антиоксиданта, а по другим механизмам, например являясь ингибиторной аминокислотой (Hag-berg Н. et al.., 1985).

Исследование содержания гистидинсодержащих дипептидов (кар-нозина, гомокарнозина и анзерина) показало, . что методом ВЭ1Х в мозге крыс определяется только гомокарнозин, и его концентрация составляет 50-100 нмоль/г ткани. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что содержание гомокарнозина в мозге не превышает 200-400 нмоль/г ткани (Pisano J.J. et al., 1961; Margolis F.L. et al., 1985; 0'Dowd J.J. et al., 1990).

При развитии ишемического повреждения уровень гомокарнозина в мозге оказывался несколько ниже контрольного (р > 0,05) только у крыс с неврологической симптоматикой (рис.5); минимальное количество этого дипептида составляло 55 нмоль/г ткани. У животных без неврологической симптоматики содержание гомокарнозина не отличалось от контрольного (рис.5).

ЧАСТЬ II.

ВЛИЯНИЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ КЛРНОЗИНА НА РАЗВИТИЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ МОЗГА КРЫС.

Известно, что природный гистидинсодержащий дипептид карнозин при его пероральном или внутрибрюшинном введении животным в различных дозах способствует снижению смертности при экстремальных состояниях и воздействиях: при гамма-облучении (Северин С.Е. с соавт., 1990; Курелла Е.Г. ссоавт., 1991), при гипобарической гипоксии (Болдырев А. А. с соавт., 1994; Стволинский С.Л. с соавт., 1995), при гипотермии Стволинский С.Л. с соавт., 1995). Механизм действия карнозина in vivo остается до конца не выясненным. В то же время in vitro показано, что карнозин способен взаимодействовать с радикалами 0z'~, -0Н, а также с гипохлорит-анионом и гидроперекисями липидов и прерывать цепные реакции переокисления, предотвращая структурные и функциональные нарушения в тканях (Boldyrev А.А., 1993).

В настоящей работе мы изучали профилактическое действие карнозина при двусторонней окклюзии общих сонных артерий у крыс.

Исследование влияния этого дипептида на развитие ишемии, не con ровождающейся активацией свободнорадикалъных реакций (что был показано в I части нашей работы), представляло особый интерес обнаружение защитного эффекта карнозина при использовании данно модели ишемии мозга позволило бы заключить, что его протекторно действие in vivo не ограничивается антиоксидантными свойствами.

L

1. Неврологическая симптоматика, мозговой кровоток и ЭЭГ.

Через 24 ч ишемии у животных с предварительным введение карнозина развивающаяся неврологическая симптоматика была боле легкой, однако снижение летальности - с 38 до 17% (р < 0,05) отмечалось только в группе НА крыс;« для ВА крыс (характеризующих ся той же степенью летальности при ишемии) снижения смертности н наблюдалось (табл. 3).

Табл. 3. Летальность и неврологическая симптоматика через 24 после двусторонней окклюзии общих сонных артерий крыс, получавших или не получавших карнозин.

* - различия межд\ группами I, II, III i IV достоверны, р < 0,05.

Изучение влияния карнозина на мозговой кровоток (МК) показа ло, что у НА крыс введение карнозина за 25-30 мин до операци способствовало менее выраженному (чем при ишемии без предвари тельного введения карнозина) снижению МК в ранние сроки ишемии более полному его восстановлению (до 85-120% от фона) через 24 ишемического повреждения (р < 0,05) (рис.бБ). В группе ВА кры эффект карнозина проявлялся примерно у половины животных и выра жался в восстановлении МК до 80-95% от фона (р < 0,05) только н 30 мин ишемии. На 45 мин МК у всех ВА крыс составлял 65-70% о

Группы животных Симптоматика гибель

отсутствует 0,5 - 2 балла более 2 баллов

I* II* III* IV*

ВА без карнозина 25% 19% 12% 44%

с карнозином' 34% 12% 13% 41%

НА без карнозина 38% 24% 0% 38%

с карнозином 40% 43% 0% 17%

А

100

50

—I-1-1-1--—I-1 I i-1"— 1--Г"

0 15 30 45мин 24ч

время

100

i ишсмил тд. о^пцоип |

время

Б

150

100

30 45мин время

24ч

. % 150

100

30 45мин время

24ч

I

Рис.6. Влияние профилактического применения карнозина (250 мг/кг веса) на динамику мозгового кровотока (МК) у ВА (А) и у НА (Б) крыс при ишемии. Величины МК рассчитаны в Z к фону (фон (100%) - нулевая минута измерения). Каждая линия отражает динамику МК у индивидуального животного. Достоверность указана в тексте.

фона (рис.бА). Через 24 ч ишемии оказалось, что именно ВА живо ные с восстановлением кровотока на 30 мин ишемии не приобре неврологической симптоматики.

Некоторыми авторами показано, что наибольшее снижение после двусторонней окклюзии общих сонных артерий у крыс отмечае ся через 20-30 мин ишемии (Миллер Л. Г. с соавт., 1990). В наш экспериментах применение карнозина способствовало частично восстановлению кровотока у ВА крыс именно на 30 мин ишемии, ко релирующее с последующим отсутствием неврологической симптомат ки. Можно предполагать, что 30 мин ишемии - один из критическ моментов развития повреждения, когда решается вопрос о том, во можно ли компенсаторное формирование коллатерального кровообращ ния, и будут ли реакцией на ишемию реактивные или деструктивн изменения клеток мозга.

Изучение эффекта карнозина на ЭЭГ крыс позволило заключит что в норме карнозин способствует значительной стабилизации ам литуды тета-ритма ЭЭГ, при этом диапазон ее колебаний вокруг ф нового значения, свойственного каждому животному, значитель снижается по сравнению с таковым у крыс без введения карнозина < 0,05). При ишемии у НА животных, получавших карнозин, амплиту тета-ритма ЭЭГ увеличивалась в динамике так же, как и у крыс б предварительного введения карнозина (рис.7Б); у ВА животных, п лучавших карнозин, наблюдалось некоторое снижение амплитуды т та-ритма, р > 0,05 (рис.7А).

Таким образом, профилактическое применение карнозина в до 250 мг/кг веса за 30 мин до ишемии ведет к улучшению невролог ческой симптоматики у крыс, менее выраженному снижению мозгово кровотока в ранние сроки ишемии и более полному его восстановл нию через 24 ч на фоне выраженной стабилизации амплитуды ЭЭГ. С поставленйе этих результатов с данными о том, что ишемия, вызва ная двусторонней окклюзией общих сонных артерий, не сопровождав ся выраженной активацией процесса ПОЛ (см. часть 1), позволи предположить, что основой протекторного эффекта карнозина являе ся не только его антиоксидантное действие, но и способность это дипептида поддерживать гомеостаз клеток мозга. Чтобы провери это предположение, мы провели изучение влияния карнозина на инд цибельность процесса ПОЛ и содержание водорастворимых антиокс дантов в гомогенатах коры мозга крыс.

% %

время I время -

Рис.7. Влияние профилактического применения карнозина (250 мг/кг веса) на динамику амплитуды тета-ритма ЭЭГ у ВА (А) и НА (Б) крыс при ишемии. Величина амплитуды ЭЭГ рассчитана в % к фону (фон (100%) - нулевая минута измерения). Каждая линия отражает динамику амплитуды ЭЭГ у индивидуального животного. Достоверность указана в тексте.

А

ТБКРП, кио ль/иг белка

25 20 15 10-1 5 О

ю

»

лЦЦ

(ГШ

м

■&Й "Ш

ишемия ишемия+карнозин

ТБКРП. нмоль/мг белка

25 20 15 10

J5 0

лЛ

V

Ш

и iffei

ишеыия+карноэ

Рис.8. Влияние профилактического применения карнозина (25С мг/кг веса) на уровень ТБКРП в гомогенатах коры мозга крыс к 6( мин индукции процесса ПОЛ in vitro (столбчатые диаграммы) и тяжесть неврологической симптоматики (круговые диаграммы) через 2' ч ишемии мозга. А - ВА крысы; Б - НА крысы. Сектора круговых диаграмм обозначают процент животных с разной степенью неврологического дефицита: 0-0,5 балла по шкале Мак Гроу (светлые секторы), 1 - 2,5 балла (заштрихованные секторы) и более 2,5 балло: (темные секторы). * - р < 0,05.

2. ТБКРП ц некоторые водорастворимые аштоксидант в коре мозга крыс.

Содержание ТБКРП.

В наших экспериментах было ¡показано, что как в группе В/ так и в группе НА крыс через 24 ч ¡¡после профилактического введе ния карнозина в дозе 250 мг/кг вера индуцибельность процесса ПС в гомогенатах коры мозга достоверно не изменялась как в норме так и при ишемии. Однако достаточно большой разброс экспериме! тальных данных позволил выделить среди крыс, получавших карнозш животных с высокой и низкой индуцибельностью процесса ПОЛ (р 0,05) (рис. 8). При этом, как и у крыс без введения карнозиш

высокая индуцибелъность ПОЛ коррелировала с отсутствием неврологической симптоматики, а низкая - с наличием симптоматики, однако, на фоне введения карнозина неврологическая симптоматика была более легкой. Кроме того, уровень индуцибельности ПОЛ у животных с неврологической симптоматикой был выше, чем при ишемии без введения карнозина (р > 0,05), и соответствовал таковому у контрольных животных (рис. 8).

Некоторое повышение индуцибельности ПОЛ у животных с предварительным введением карнозина может быть связано как со способностью этого дипептида защищать мембранные липиды от окисления in vivo до воздействия индуктора окисления in vitro (Стволинский С.Л. с соавт., 1995), так и с наличием у карнозина прооксидантных свойств, проявляющихся в определенных условиях (Boldyrev A.A., 1994).

Водорастворимые антиоксиданты.

Внутрибрюшинное введение карнозина животным в дозе 250 мг/кг веса не приводило к изменениям уровня глутатиона в мозге крыс как в норме, так и при ишемии (рис.9).

шсмоль/г ткани

ВА крысы

шемолг/г ткани

НА крысы

ВА крысы

НА крысы

Рис.9. Влияние профилактического применения карнозина (250 мг/кг веса) на уровень глутатиона и таурина в коре больших Полушарий мозга крыс через 24 ч ишемии. А - животные с неврологической симптоматикой*, Б - животные без неврологической симптоматики. Представлены средние значения концентраций глутатиона и таурина по группам в норме (светлые столбики), при ишемии (темные столбики) и при ишемии с предварительным введением карнозина (заштрихованные столбики). * - р < 0,05.

А Б

нмопь /г ткани__нмоль/г ткани

Рис.10. Влияние профилактического применения карнозина (2 мг/кг веса) на уровень гомокарнозина в коре больших полушар мозга крыс через 24 ч ишемии. А - животные с неврологическ симптоматикой; Б - животные без неврологической симптомам? Представлены средние значения концентраций гомокарнозина по гру пам в норме (светлые столбики), при ишемии (темные столбики) при ишемии с предварительным введением карнозина (заштрихован! столбики). ' -

Отсутствие эффекта карнозина может быть объяснено стабильнос самой системы глутатиона, так как не было отмечено и изменени уровне глутатиона в мозге крыс при ишемии (без предварительн

введения карнозина).

Влияние карнозина на содержание таурина в мозге было нео наковым у животных с разным течением ишемического процесса: крыс с неврологической симптоматикой на фоне предварительн введения карнозина уровень таурина не отличался от такового ишемии; у крыс без неврологической симптоматики уровень таур был ниже, чем при ишемии без карнозина (р < 0,05), и соответст вал контрольному (рис. 9).

В работе также показано, что внутрибрюшинное введение кар зина (250 мг/кг веса) не приводило к его появлению в мозге I

определении через 24 ч после введения). Уровень гомокарнозина у крыс с неврологической симптоматикой был выше, чем при ишемии без введения карнозина (р > 0,05); у животных без неврологической симптоматики уровень гомокарнозина не отличался в норме, при ишемии и при ишемии с предварительным введением карнозина (рис. 10).

Таким образом, при двусторонней окклюзии общих сонных артерий у крыс карнозин способствует поддержанию концентрации таурина и гомокарнозина на уровне контроля.

Проведенное исследование показало, что при двусторонней окклюзии общих сонных артерий у крыс происходит снижение мозгового кровотока и повышение амплитуды тета-ритма ЭЭГ, причем изменение этих параметров более выражено у животных с высокой двигательной активностью (ВА крысы), которые через 24 ч ишемии характеризуются и более тяжелой неврологической симптоматикой (по сравнению с НА крысами). Накопление ТБК-реактивных продуктов к 60 мин индукции ПОЛ в гомогенатах коры мозга крыс через 24 ч ишемии (индуцибель-ность ПОЛ), а также изменения содержания глутатиона, таурина и гомокарнозина не зависят от типа поведения животных; при этом высокая индуцибельность ПОЛ коррелирует с более легким течением . ишемии. Это, вероятно, свидетельствует о том, что свободные радикалы присутствуют в мозге этих животных в таких концентрациях, когда они могу! оказывать положительный эффект.

Карнозин при его профилактическом применении при данной модели ишемии мозга способствует улучшению неврологической симптоматики у животных и менее выраженным изменениям МК и ЗЭГ как в ранние сроки поражения мозга, так и через 24 ч. Кроме того, применение' карнозина ведет к защите мембранных липидов от окисления in vivo до воздействия индуктора окисления in vitro и поддержанию концентрации антиоксидантов на уровне контроля. Эффект карнозина проявляется через 15-45 мин и сохраняется через 24 часа после введения. Все это позволяет .рекомендовать карнозин для дальнейших испытаний с целью возможного использования в качестве противоише-мического и противогипоксич^ского средства.

В |Ы в о д ы.

1. При двусторонней окклюзии общих сонных артерий у крыс предикторами более тяжелого течения церебральной ишемии являются высокие значения исходного мозгового кровотока и его межполушар-

ной разницы, при этом тяжелое течение ишемического процесса con ровождается более выраженным снижением мозгового кровотока в ран ние сроки ишемии и менее полным его восстанавлением через 24 час на фоне увеличения амплитуды тета-ритма ЭЭГ.

2. Накопление ТБК-реактивных продуктов к 60 мин индукции ПС в гомогенатах коры мозга крыс через 24 ч ишемии (индуцибельност ПОЛ) не зависит от содержания глутатиона, таурина и гомокарнози на, причем низкая индуцибельность ПОЛ является прогностически критерием более тяжелого течения ишемии.

3. Профилактическое применение гистидинсодержащего дипептид карнозина в дозе 250 мг/кг веса за 30 мин до ишемии ведет к улуч шению неврологической симптоматики,; менее выраженному снижени мозгового кровотока в ранние сроки ишемии и более полному ег восстановлению через 24 ч на фоне выраженной стабилизации ампли туды тета-ритма ЭЭГ.

4. Улучшение неврологической симптоматики у крыс с предвари тельным введением карнозина коррелирует с более высокой индуци бельностью перекисных процессов in vitro через 24 ч ишемии.

5. Карнозин при его профилактическом применении оказывав влияние на мозговой кровоток, ЭЭГ, индуцибельность процесса ПОЛ и уровень водорастворимых антиоксидантов в мозге крыс как в нор ме, так и при ишемии, причем его эффект, проявляется через 15-4 мин после введения и сохраняется через 24 ч.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Перекисное окисление липидов в мозге крыс с различной устойчи востью к эмоциональному стрессу. // Вюлл. эксперим. биол. мед., 1994, N 10, с. 384-387 (соавт. Стволинский С.Л. , Болды рев A.A., Ганнушкина И.В.)

2. Перекисное окисление липидов в мозге крыс при ишемии // Нейро химия, 1995, т.12, вып.2, с. 28-35 (соавт. Стволинский С.Л. В.Х.Шаврацкий, Шатрова Ю.В.)

3. Free radical defence mechanisms in brain // Abstracts of Int Symp. on Natural Antioxidants: Molecular Mechanisms and Healt Effects, China, June 20-24, 1995, p. 139 (соавт. Boldyre A.A., Kurella E.G., Stvolinsky S.L., Tyulina O.V.)

4. Carnosine effects oh the brain during1 ischemic injury / Abstracts of 7th Int. Symp. 15th ISN Satell. Symp., Kurashiki

Japan, 1995, June 27-July 1 (coaBT. Stvolinsky S., Dobrota D., Vachova M., Boldyrev A.) 5. Carnosine and free radical defence mechanisms in brain. In: Natural antioxidants: molecular mechanisms and health effects. // AOCS press, 1996, pp. 600-614. (coaBT. Boldyrev A.A., Stvolinsky S.L. and Gannushkina I.V.)