Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Прогнозирование течения острого панкреатита на основании определения экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови

На правах рукописи

□□3459983

Тоноян Андраник Гегамович

ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ТЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА НА ОСНОВАНИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ МЕЛАТОНИНА В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ КРОВИ (клинико-экспериментальное исследование)

14.00.27-Хирургия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

? : 2323

Санкт-Петербург 2009

003459983

Работа выполнена на кафедре общей хирургии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Семенов Дмитрий Юрьевич

Официальные оппоненты: - доктор медицинских наук, профессор Седов Валерий Михайлович -доктор медицинских наук, профессор Петров Сергей Викторович

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Защита диссертации состоится «16» февраля 2009 г. в «_» часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.090.05 ГОУ ЕЩО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (197022, Санкт-Петербург, ул.Льва Толстого, д.6/8) в зале Ученого Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Автореферат разослан «_»____2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, доцент Мясникова Марина Олеговна

Актуальность проблемы. На протяжении последних десятилетий, несмотря на постоянное развитие и совершенствование методов диагностики и лечения, проблема острого панкреатита сохраняет свою актуальность. По-прежнему высокими остаются показатели заболеваемости и летальности при данном заболевании во всех регионах мира. Так в Санкт-Петербурге в 2003 году число больных с диагнозом острый панкреатит превысило 9000 и составило 38,6% от общего числа всех поступивших в хирургические стационары города с диагнозом «острый живот» (Борисов А.Е., 2004). Показатели летальности при деструктивных формах острого панкреатита по некоторым данным достигают 70% (Mayerle J., 2005).

Продолжаются попытки улучшения результатов лечения острого панкреатита за счет более современной фармакотерапии и внедрения в практику высокотехнологичных малоинвазивных методов хирургического лечения заболеваний. Несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении, в 15-20% случаев заболевание сопровождается формированием панкреонекроза с высокой вероятностью последующего инфицирования и развитием полиорганной недостаточности и септического шока (Sekimoto М, 2006). В то же время у большей части пациентов острый панкреатит протекает без некроза ткани поджелудочной железы и заканчивается достаточно быстрым купированием всех клинических проявлений и полной реабилитацией больного.

Таким образом, особую важность приобретает возможность заблаговременного прогнозирования вариантов течения острого панкреатита. Наличие достоверных и максимально ранних прогностических критериев развития тяжелых деструктивных и инфицированных форм заболевания позволит ощутимо улучшить результаты лечения и снизить летальность благодаря своевременному применению всех существующих в распоряжении клиницистов диагностических и лечебных ресурсов (Rettally С.А., 2003).

Для решения проблемы прогнозирования тяжести течения острого панкреатита пытаются использовать разнообразные биохимические и иммунологические критерии. Однако, все многочисленные применяемые маркеры по сути своей является продуктами или медиаторами патологических процессов происходящих в организме человека при остром панкреатите в реальном времени заболевания, и поэтому способны лишь отвечать задачам ранней диагностики некроза и инфицирования ткани поджелудочной железы.

В настоящее время не существует прогностических критериев, позволяющих достоверно предсказать легкое или тяжелое течение острого панкреатита на этапе первых проявлений заболевания. Путь к решению этой задачи лежит в дальнейшем изучении патогенеза заболевания и заключается в открытии возможности оценки исходных эндогенных ресурсов организма, противостоящих механизмам альтерации, развивающимся при остром панкреатите. Одним из факторов, определяющих

резистентность поджелудочной железы' к развитию деструкции, является мелатонин, принимающий активное участие в происходящих в железе противовоспалительных процессах.

Мелагонип, открытый изначально, как гормон эпифиза, в значительном количестве продуцируется клетками APUD-системы желудочно-кишечного тракта и обладает самыми разнообразными эффектами в организме млекопитающих (Dubocovich M.L., 1995,2003).

Противовоспалительный эффект мелатонина отчасти обусловлен крайне сильной способностью нейтрализовать свободные радикалы, играющих важнейшую роль в патогенезе многих заболеваний (Tan D.X., 1993). Кроме антиоксидантной активности самой молекулы мелатонина, данный медиатор значительной усиливает защитные возможности клеток при возникающих цитотоксических процессах (Jaworek J., 2002).

Основное воздействие мелатонина на клетку осуществляется путем его связывания с высокоафинными мембранными рецепторами (Dubocovich M.L., 1995). На сегодняшний день у млекопитающих описаны два типа специфичных рецепторов мелатонина, которые именуются в современной литературе, как МТ1 и МТ2 (Dubocovich M.L., 1995,2003).

В экспериментальных исследованиях на животных было показано, что мелатонин в условиях моделированного острого панкреатита существенно уменьшает тяжесть течения заболевания, реализую свои эффекты на самые разные звенья патогенеза посредством МТ-2 рецепторов (Jaworek J., 2002). Несмотря на встречающиеся данные о том, что MTI обладают вазоконстриктивным действием (Bûcher В., 1999), тем самым усугубляя выраженность патологических изменений, функции рецепторов первого типа остаются малоизученными.

Таким образом, тяжесть поражения при остром панкреатите может в определенной степени зависеть от рецептор-опосредованной активности мелатонина, как одной из наиболее важных составляющих эндогенного противовоспалительного потенциала.

Опираясь на полученные данные о роли мелатонина и его рецепторов в патогенезе острого панкреатита (ОП), нами была впервые высказана гипотеза о том, что различные по тяжести варианты течения и исходы этого заболевания при схожих начальных клинических проявлениях и стандартных применяемых лечебных подходах могут быть патогенетически обусловлены индивидуальными особенностями экспрессии рецепторов мелатонина.

Диссертация выполнена по плану научно-исследовательских работ ГОУ ВПО СПбГМУ им.акад.И.П,Павлова Росздрава (номер государственной регистрации 01.200.212883).

Цель исследования - обосновать возможность прогнозирования тяжести течения острого панкреатита с помощью определения экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови (МНК).

Задами исследования:

Па экспериментальном папе:

1. Получить путем иммунизации лабораторных животных специфические антитела, позволяющие в дальнейшем производить определение количества мононуклеарных клеток крови, несущих МТ-рецепторы.

2. Оценить особенности экспрессии рецепторов мелатонина в МНК у близкородственных лабораторных крыс.

На клиническом этапе:

3. Изучить распределение МТ-рецепторов в мононуклеарах и лимфоцитах (ЛФЦ) крови у условно здоровых людей и у пациентов, перенесших острый панкреатит различной степени тяжести.

4. Выявить взаимосвязь экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках с тяжестью течения острого панкреатита.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложенный метод иммунофлюоресценции с использованием полученных специфических антител позволяет проводить количественную оценку содержания и соотношения МТ1 и МТ2 рецепторов в мононуклеарных клетках крови.

2. Уровень экспрессии рецепторов мелатонина в МНК крови является генетически детерминированным признаком, позволяющим оценивать эффективность противовоспалительных ресурсов организма и резистентности поджелудочной железы при развитии острого панкреатита.

3. Анализ соотношения лимфоцитов, содержащих МТ1 и МТ2-рецепторы может стать наиболее ранним критерием прогноза вариантов течения ОП.

Научная новизна. В работе впервые выдвинута гипотеза о наличии связи между количеством и соотношением МТ-рецепторов в лимфоцитах и всех мононуклеарных клетках крови и тяжестью течения ОП. Для реализации данной гипотезы был впервые разработан и испытан на группе лабораторных животных метод определения содержания рецепторов мелатонина в мононуклеарах крови.

При помощи разработанного метода было исследовано содержание МНК крови, несущих рецепторы мелатонина, у группы условно здоровых лиц и у пациентов, перенесших острый панкреатит различной степени тяжести. Для выявления и обоснования возможности прогнозирования течения острого панкреатита был впервые проведен анализ взаимосвязи особенностей течения заболевания и экспрессии МТ1 и МТ2-рецепторов.

В результате проведенного анализа полученных данных была выявлена корреляционная связь между тяжестью поражения поджелудочной железы и соотношением двух типов рецепторов мелатонина в лимфоцитарной фракции мононуклеаров, на основании которой были

разработаны рекомендации по прогнозированию течения острого панкреатита.

Практическая ценность работы. Разработанный метод достоверной оценки экспрессии рецепторов мелатонина может позволить максимально рано прогнозировать развитие деструктивных форм заболевания и предельно своевременно, но, при этом, обоснованно применять весь комплекс лечебных мероприятий и тем самым повысить эффективность лечения больных острым панкреатитом. Лабораторный анализ содержания и соотношения МТ-рецепторов в лимфоцитах крови может стать одним из основных составляющих используемых в клинике тактических схем диагностики и прогноза острого панкреатита. Доказанная прогностическая ценность описанных показателей экспрессии позволяет рекомендовать их для более широкого применения в хирургических стационарах.

Личный вклад в результаты исследования. Все разделы работы выполнены лично автором. Автором осуществлялось участие в разработке и апробации метода оценки экспрессии МТ-рецепторов, обследовании и лечении пациентов, анкетировании данных историй болезни, определение экспрессии МТ-рецепторов у исследуемых лиц, анализе и статистической обработке полученных результатов.

Реализация результатов работы. Предлагаемый способ прогнозирования тяжести течения острого панкреатита применяется в практической работе хирургического отделения клиники общей хирургии СПбГМУ имени акад. И.П.Павлова (197022, Санкт-Петербург, ул.Льва Толстого, д.6/8). Полученные результаты используются при подготовке студентов, аспирантов, врачей-интернов и клинических ординаторов на кафедре общей хирургии.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной 50-летнему юбилею городской клинической больницы №20 (С-Пб, 2008). По теме исследования опубликовано 3 печатные работы, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Оригинальный метод получения специфических антител к рецепторам мелатонина зарегистрирован в виде рационализаторского предложения (удостоверение № 1516 от 5.12.2008).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах (из них 91 страница текста) и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 135 источников, в том числе 105 иностранных авторов. ; ■

Содержание работы. Характеристика групп и методов исследования. Проведенное нами исследование была разделено на два этапа. Первый, 'экспериментальный этап представлял собой получение специфических антител, использованных в дальнейшем при разработке и апробации метода определения содержания рецепторов мелатонина в клетках крови, и оценку вариабельности экспрессии МТ-рецепторов у близкородственных лабораторных животных.

Отправной точкой исследования стало получение антител к рецепторам мелатонина того и другого типа. Для этого были синтезированы полипептиды, повторяющие активные центры интересующих нас рецепторов, которые были использованы при последующей иммунизации лабораторных кроликов. После серии повторных иммунизации из плазмы кроликов были выделены высокоспецифичные антитела к исследуемым мембранным рецепторам мелатонина (Захарова Е.Т., 1983). Все дальнейшее лабораторное определение экспрессии МТ1 и МТ2 в исследуемых клеточных популяциях проводилось с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции (Ройт А., 2000).

Для изучения влияния генетического фактора на экспрессию исследуемых маркеров следующей задачей экспериментального этапа исследования явилось определение содержания и соотношения мононуклеарных клеток крови, имеющих на своих мембранах МТ-рецепторы, посредством описанного выше метода у 12 близкородственных лабораторных крыс линии Вистар мужского пола, одного возраста и веса, находящихся в одинаковых условиях содержания.

Клинический этап исследования заключался в изучении закономерностей экспрессии рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови у условно здоровых людей и пациентов, перенесших ранее острый панкреатит различной степени тяжести.

Для решения поставленных на данном этапе задач было выполнено иммунофенотипирование 70 лиц мужского пола. 29 добровольцев, составивших контрольную группу (средний возраст - 41 <6+2,7 лет), на момент исследования были условно здоровы и не имели в анамнезе воспалительных заболеваний пищеварительной системы. Основную группу сформировали 41 пациент (средний возраст - 45+3,6 лет), которые в период с 1998 по 2006 год перенесли острый панкреатит той или иной степени тяжести. Обе группы были сопоставимы по возрасту (1=1.34; р>0,5).

Каждый клинический случай имевшего место острого панкреатита у исследуемых лиц был подвергнут тщательному ретроспективному анализу. При изучении историй болезни пациентов и сборе анамнеза во время проводимого исследования в обязательном порядке учитывалось наличие сопутствующей патологии, особенно носящей хронический воспалительный характер. Для объективизации тяжести состояния больных на момент

заболевания проводилась интегральная оценка с применением шкалы SAPS (Le Gall J.-L, 1984).

С целыо проведения в дальнейшем сравнительного анализа экспрессии МТ-рецепторов при различных вариантах течения ОГ1 все случаи заболевания были классифицированы согласно международной классификации острого панкреатита, принятой в Атланте в 1992 году (Bradley E.L., 1992). Кроме того, производилась количественная оценка степени деструкции поджелудочной железы и забрюшинной клетчатки у всех пациентов основной группы по шкале интегральной оценки тяжести поражения, разработанной и предложенной В.С.Савельевым в 2000 году (Савельев B.C., 2002).

Обработка полученных в ходе исследования данных выполнялась при помощи общепринятых методов статистического анализа с использованием t-критерия Стьюдента, U-критерия Манна-Уитни, коэффициента ранговой корреляции Спирмена, критерия хи-квадрата Пирсона.

Результаты исследования. При анализе результатов экспериментального этапа исследования следует в первую очередь отмстить, что разработанный и апробированный нами на лабораторных животных метод позволяет в достаточно сжатые сроки и с привлечением стандартного лабораторного оборудования производить определение содержания и соотношения мононуклеарных клеток крови, имеющих рецепторы мелатонина.

Первым сделанным наблюдением стало то, что значения содержания рецепторов мелатонина, как первого, так и второго типов у лабораторных крыс одной генетической линии практически не отличались. Среднее значение количества МНК, несущих МТ1 составили 76,57+0,51%, а МТ2 -80,46+0,78%. При этом было доказано, что для всех животных характерно преобладание количества МТ2-содержащих клеток (t=5,002; р<0,001). Выявленная закономерность нашла отражение в показателе МТ2/МТ1, который в данной группе был стабильно больше 1,0, а среднее значение равнялось 1,05+0,01.

Таким образом, установлено, что соотношение МНК с исследуемыми маркерами в группе условно здоровых лабораторных крыс смещено в сторону МТ2. Кроме того, полученные у группы близкородственных лабораторных крыс данные экспрессии МТ-рецепторов демонстрируют, что при идентичности влияющих факторов внешней среды и максимальной схожести генотипов животных вариабельность количества МТ-содержащих клеток в исследуемых фракциях является крайне низкой.

На клиническом этапе у всех исследуемых людей проводилась оценка экспрессии интересующих нас маркеров не только во всей фракции мононуклеарных клеток, но и отдельно в лимфоцитарной субпопуляции.

В ходе анализа полученных данных о распределении рецепторов мелатонина в исследуемых популяциях клеток было обнаружено, что, как у здоровых добровольцев (г-'0,18; р 0,05), гак и у больных острым панкреатитом (г<0,24; р>0,05) отсутствовала корреляционная зависимость экспрессии обоих типов рецепторов от возраста.

Следующим наблюдением стало то, что содержание мононуклеаров и лимфоцитов с МТ1-рецепторами у здоровых людей и у пациентов, перенесших острый панкреатит, не имело ощутимых отличий (1=1,46; р<0,2). Так, если в контрольной группе МТ-рецепторы первого типа определялись на поверхности 64,27+2,74% МНК и 56,41+3,59% ЛФЦ, то в основной группе они имелись у 60,94+2,69% МНК и 54,15+4,03% ЛФЦ.

При изучении экспрессии МТ2-рецепторов было обнаружено, что у пациентов, перенесших острый панкреатит, отмечаются более низкие средние значения содержания клеток с данным маркером (57,36+2,90%. МНК и 50,48+4,32% ЛФЦ) по сравнению со здоровыми добровольцами (65,23+2,52% МНК и 59,11+3,73% ЛФЦ). Несмотря на то, что данное отличие не было подтверждено в ходе статистической обработки данных, снижение количества клеток с МТ2 среди лиц основной группы привело значительной разнице соотношения клеток МТ2/МТ1 с определяемыми маркерами у представителей двух групп.

В процессе сравнения средних значений показателя МТ2/МТ1 выявлено, что у больных острым панкреатитом данный показатель достоверно ниже и в среднем составляет в контрольной группе 1,02+0,03 для мононуклеаров и 1,06+0,06 для лимфоцитов, а в основной группе 0,95+0,03 и 0,96+0,06 соответственно (1=3,28; р<0,002).

Таким образом, в результате проведенного сравнительного анализа было продемонстрировано, что у условно здоровых лиц контрольной группы так же, как и на экспериментальном этапе в группе лабораторных крыс, наблюдается преобладание экспрессии рецепторов мелатонина второго типа, чего нельзя сказать о пациентах, перенесших острый панкреатит, у которых баланс между содержанием рецепторов склоняется в пользу МТ1 за счет описанного выше снижения экспрессии МТ2-рецепторов.

Предметом дальнейшего исследования стало влияние преморбидного фона на распределение рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови пациентов, перенесших ОП различной степени тяжести.

В процессе анализа полученных данных достоверно доказано, что у представителей основной группы с сопутствующими хроническими воспалительными заболеваниями (СХВЗ) значительно снижено содержание как мононуклеарных (48,75+4,75%), так и лимфоцитарных клеток крови (40,23+6,67%) с МТ2-рецепторами в сравнении с теми, кто не имел в анамнезе СХВЗ (61,35+3,43% МНК и 55,34+5,28% ЛФЦ).

Таблица I.

Содержание и соотношение МТ-рецепторов у пациентов с наличием или отсутствием сопутствующих хронических __воспалительных заболеваний в основной группе__

СХВЗ Мононуклеары Лимфоциты

МТ1(%) МТ2(%) МТ2/МТ1 МТ1(%) МТ2(%) МТ2/МТ1

Есть п=13 57,58+4.49 48.75+4,75 0,84+0,04 49,96+7,08 40,23+6,67 0,81+0,07

Нет п=28 62,50+3,36 61,35+3,43 1,00+0,04 56,14+4,96 55,34+5,28 1,04+0,07

При этом статистически достоверных отличий в содержании МТ1-рецепторами у обеих категорий лиц обнаружено не было (t=0,85; р<0,5). Склонность к превалированию рецепторов второго типа в обеих клеточных популяциях у пациентов без СХВЗ статистически подтверждается ощутимо большими значениями показателя МТ2/МТ1 в мононуклеарах (1,00+0,04 против 0,84+0.04) и в лимфоцитах (1,04+0,07 против 0,81+0,07) (1=2.59; р<0,02).

Данный факт в свете имеющихся данных о рецептор-опосредованной противовоспалительной активности мелатонина может объясняться тем, что при исходно меньшем количестве клеток, несущих на мембране рецепторы второго типа, происходит снижение выраженности данного эффекта мелатонина в организме человека, а это, в свою очередь, приводит к развитию хронических воспалительных заболеваний.

Следующим этапом в изучении полученных данных была выполнена оценка взаимосвязи распределения рецепторов мелатонина в исследуемых популяциях клеток крови и тяжести состояния больного на момент заболевания, оцениваемой по шкале SAPS. В ходе проведенного корреляционного анализа значений баллов SAPS с содержанием и соотношением МТ-рецепторов в мононуклеарных и лимфоцитарных клетках крови было выявлено, что в группе пациентов, перенесших ОП, отсутствовала достоверная корреляция значений SAPS и экспрессии рецепторов мелатонина первого типа в обеих клеточных фракциях (rs=-0,25; р<0,2) и (rs=-0,21; р<0,5). В тоже время определялась значимая обратная корреляция экспрессии МТ2-рецепторов с суммарными баллами SAPS как в мононуклеарах (г5=-0,49; р<0,001), так и в лимфоцитах (rs=-0,47; р<0,02). При исследовании соотношения клеток с определяемыми маркерами была отмечена средней степени плотности обратная корреляция показателя МТ2/МТ1 в МНК с оценками по SAPS (rs=-0,58; р<0,002). Еще более выраженная достоверная зависимость обнаружена при анализе соотношения показателей SAPS и МТ2/МТ1 в лимфоцитарной субпопуляции у пациентов основной группы (rs=-0,62; р^0.001).

Таким образом, выявленные закономерности свидетельствуют о том, что снижение экспрессии МТ2 и вызываемое этим фактом снижение показателя МТ2/МТ1 приводит к повышению уровня прогнозируемой летальности вследствие уменьшения резистентности организма человека к тяжелым воспалительным заболеваниям; одним из которых является острый панкреатит.

Задачей дальнейшей обработки данных являлось изучение экспрессии рецепторов мелатонина при различных вариантах течения заболевания согласно классификации ОП, принятой в Атланте. В процессе исследования сразу обратило внимание отсутствие достоверных отличий в содержании клеток обеих фракций с МТ1-рецепторами у пациентов с различными по тяжести формами заболевания (1=0,75; р<0,5) и у здоровых добровольцев (1=1,15; р<0,2 и 1=0,24; р>0,5), чего нельзя сказать про содержание МТ2-несущих клеток. Так, средние значения количества мононуклеаров с рецепторами второго типа ощутимо ниже у больных, перенесших деструктивный панкреатит (49,59+3,80%), в сравнении, как с представителями контрольной группы (65,23+2,52%) (1=3,25; р<0,005), так и в сравнении с пациентами с легким течением заболевания (65,51+3,69%) (1=3,00; р<0,005). Аналогичная тенденция прослеживается и в лимфоцитарной субпопуляции, где средние значения содержания клеток с данным маркером составили 43,45+6,68% у пациентов с тяжелым течением ОП, 56,57+5,33% при легком течении и 59,11+3,73% в контрольной группе. Обращает внимание, что экспрессия МТ2 у больных острым панкреатитом без деструкции поджелудочной железы абсолютно сопоставима с экспрессией этого же рецептора у лиц контрольной группы (1=0,06; р>0,5).

Таблица 2.

Содержание и соотношение МТ-рецепторов у пациентов с _различными формами острого панкреатита______

Форма ОП Мононуклеары Лимфоциты

Среднее значенне МТ1 (%) Среднее значение МТ2 (%) Среднее значение МТ2/МГ1 Среднее значение МТ1 (%) Среднее значение МТ2 (%) Среднее значение МТ2/МТ1

ОП легкого течения п=20 63.02+4.15 65,51+3,69 1.07+0.04 54,29+5,83 56.57+5,33 1.12+0,07

ОП тяжелого течения п=21 58,96+3.50 49,59+3,80 0,84+0.03 53,99+5.74 43,45+6.68 0.79+0.06

Контрольная [руппа п=29 64.27+2.74 65.23+2.52 1.02+0.03 56.41+3,59 59.11+3.73 1.06+0,06

Все отмеченные особенности экспрессии определяемых рецепторов закономерно сказались на разнице значений показателя МТ2/МТ1. У пациентов основной группы с деструктивным ОП средние значения МТ2/МТ1 в мононуклеарах (0,84+0,03) и лимфоцитах (0,79^0,06) достоверно уступают, таковым у больных с легким вариантом течения заболевания (1,07+0,04 в МНК и 1,12+0,07 в ЛФЦ) 0=4,66; р<0,001) и у здоровых добровольцев (1,02+0,03 в МНК и 1,06+0,06 в ЛФЦ) (1=4,07; р<0,001). Еще более существенным представляется тот выявленный факт, что для больных ОП, не сопровождавшимся деструкцией поджелудочной железы, характерно преобладание МТ2-рецепторов, так же как и для условно здоровых людей. В лимфоцитарной субпопуляции у пациентов с легким течением панкреатита обращает внимание даже несколько более высокое значение МТ2/МТ1 в сравнении с контрольной группой (1,12+0,07 против 1,06+0,06), несмотря на то, статистического подтверждения это наблюдение не получило (1=0,89; Р<0,5).

Таким образом были выявлены качественные отличия распределения рецепторов мелатонина в исследуемых клетках в зависимости от наличия деструкции и инфицирования ткани поджелудочной железы при ОП.

Для количественной оценки взаимосвязи экспрессии изучаемых маркеров и выраженности изменений при данном заболевании был произведен корреляционный анализ обширности деструкции поджелудочной железы и забрюшинной клетчатки по шкале интегральной оценки В.С.Савельева с полученными показателями содержания и соотношения МТ-несущих мононуклеарных клеток крови.

Таблица 3.

Содержания и соотношения МТ-рецепторов у пациентов с различной

тяжестью поражения поджелудочной железы и забрюшинной клетчатки

Балл Мононуклеары Лимфоциты

МТ1(%) МТ2(%) МТ2/МТ1 МТ1(%) МТ2(%) МТ2/МТ1

1 балл 62,32+5.70 67.14+5,06 1.12+0,05 50,66+6,21 55,52+5,86 1,19+0,08

2 балла 64,65+4,54 61.70+3,55 0,96+0.03 57,76+6,62 55.08+4,74 0,98+0,05

3 балла 58,85+6.42 49.77+6.23 0,84+0.03 49,88+6,37 40.30+6,61 0,80+0,05

4 балла 59,04+4.07 49.46+4,97 0.83+0.05 47.22+5,99 35.51+6.36 0.74+0.06

В результате анализа была получена достоверная обратная зависимость обширности деструктивных изменений поджелудочной железы и забрюшинной клетчатки с уровнем экспрессии МТ2 (г5=-0,34 и г5=-0,37; р<0,05) и соотношением обоих типов рецепторов в виде показателя МТ2/МТ1

(^,--0,59 и г^=-0,64; р<0,001) в мононуклеарах и лимфоцитах крови у всех обследованных больных. При этом отмечено, что особенно выраженная и достоверная корреляция наблюдается в лпмфоцмгарной субпопуляции и именно в отношении покупателя МТ2/МТ1.

Обсуждение результатов. Результатом экспериментального этапа исследования стало выявление того, что экспрессия рецепторов мелатонина является, по всей вероятности, генетически детерминированным признаком, и для здоровых особей крыс свойственно превалирование рецепторов второго типа.

В ходе клинического этапа нашего исследования было обнаружено достоверное объяснение тому, что у определенной категории пациентов острый панкреатит при всей схожести инициирующих факторов и принципиальной однотипности патогенетических механизмов не сопровождается деструкцией органа, а все возникающие в процессе заболевания изменения носят полностью обратимый характер. В то же время у других больных течение острого панкреатита характеризуется обширным некротизированием ткани поджелудочной железы и окружающей клетчатки, быстрым присоединением бактериальной инфекции с развитием тяжело поддающегося любым видам лечения абдоминального сепсиса. Причина этого факта заключается в особенностях распределения МТ-рецепторов в различных клетках организма. Как было продемонстрировано в нашем исследовании, снижение экспрессии рецепторов мелатонина второго типа и смещение равновесия между МТ1 и МТ2 в сторону рецепторов первого типа вызывает значительную супрессию описанного цитопротективного действия мелатонина. Это приводит к неизбежному снижению противовоспалительного потенциала организма и резистентности самой поджелудочной железы к каскаду патогенетических факторов агрессии при остром панкреатите и вызывает более обширную деструкцию данного органа, что, в свою очередь, обусловливает возрастание тяжести проявлений заболевания, ухудшает эффективность лечебных мероприятий и повышает уровень вероятной летальности.

Исходя из полученных данных о влиянии генотипа на экспрессию рецепторов мелатонина и выявленных закономерностей распределения данных маркеров, в современной гастроэнтерологии и экстренной хирургии определение показателя МТ2/МТ1 в лимфоцитах крови может стать критерием прогноза потенциальной тяжести течения острого панкреатита до развития не только осложненных форм, но и на момент появления первых симптомов заболевания.

Выводы.

1. Разработанный метод позволяет в достаточно сжатые сроки и с привлечением стандартного лабораторного оборудования производить определение содержания и соотношения мононуклеарных клеток крови, имеющих рецепторы мелатонина.

2. Экспрессия рецепторов мелатонина является генетически детерминированным фактором, что подтверждается минимальной вариабельностью значений содержания мононуклеарных клеток крови с МТ-рецепторами.

3. Доказанные закономерности распределения рецепторов мелатонина в мононуклеарах и лимфоцитах позволяют прогнозировать развитие деструктивных форм острого панкреатита.

4. Выявленная'" корреляционная зависимость тяжести поражения поджелудочной железы и соотношением лимфоцитов с рецепторами мелатонина в виДе показателя МТ2/МТ1 является патогенетическим обоснованием количественного прогноза тяжести течения острого панкреатита.

Практические рекомендации.

1. Внедрение в клиническую практику разработанного метода определения экспрессии рецепторов мелатонина в лимфоцитах крови, в качестве самостоятельного критерия прогноза течения заболевания, обосновывает возможность дифференцированного подхода к лечению больных острым панкреатитом.

2. Определение низких значений показателя МТ2/МТ1 при диагностике острого панкреатита, достоверно свидетельствующих о потенциальной распространенности деструкции поджелудочной железы, является показанием к максимально раннему применению всего комплекса современных лечебных мероприятий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Горчакова М.В., Тоноян А.Г., Степнов И.А., Русанова Г.Б., Зуева Е.1£. Мембранные рецепторы мелатонина на лимфоцитах человека при остром панкреатите// Российский иммунологический журнал, 2008, том 2(11), №2-3. С.153.

2. Семенов Д.Ю., Васильев В.Б., Тоноян А.Г., Степнов И.А., Шапкина Л.Г., Зуева Е.Е., Соколов А.В, Горчакова М.В., Резван Т.А. Клинико-экспериментальное обоснование возможности определения рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови человека // Клиническая лабораторная диагностика. 2009, №1, С. 18-20.

3. Тоноян А.Г., Степнов И.А., Шапкина Л.Г. Клинико-экспериментальное обоснование возможности определения рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови человека// Передовые медицинские технологии практическому здравоохранению.// Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летнему Юбилею городской клинической больницы №20. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2008. - С. 301-302.

Лицензия ИД №00597 от 15.12.99. Подписано в печать 23.12.08. Усд. печ. л. 1 Формаг 60Х84'/1(. Печать офсетная Тираж 100 экз. Заказ 137. Отпечатано в Лаборатории оперативной печати факультета журналистики Санкт-Петербургского государственного университета 199004, Санкт-Петербург, В. О., 1-я линия, д. 26