Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Прогностическое значение определения интерферонового статуса и экспрессии генов цитокинов у беременных высокого инфекционного риска

На правах рукописи

МАГОМЕДОВА АМИНАТ МУХТАРОВНА

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ У БЕРЕМЕННЫХ ВЫСОКОГО ИНФЕКЦИОННОГО РИСКА

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

18 АПР 2013

Москва-2013

005057632

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Бахарева Ирина Викторовна доктор медицинских наук, профессор Ганковская Людмила Викторовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Цахилова Светлана Григорьевна профессор кафедры акушерства и гинекологии стоматологического факультета ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России доктор медицинских наук Тетруашвили Нана Картлосовна

руководитель второго акушерского отделения патологии беременности ФГБУ Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Минздрава России Ведущая организация:

ГБУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства здравоохранения Московской области

Защита диссертации состоится «22» апреля 2013 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.072.12 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «19» марта 2013 года Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема преждевременных родов (ПР) и внутриутробного инфицирования плода (ВУИ) в современном акушерстве продолжает оставаться актуальной и нерешенной проблемой [Краснопольский

B.И. и соавт., 2003; Кулаков В.И., 2006; Сидельникова В.М., Сухих Г.Т., 2010; Kenneth L., Vancouver B.C., 2011].

На долю недоношенных детей приходится 60-70% - ранней неонатальной смертности и 65-75% - детской смертности. Мертворождаемость при преждевременных родах в 8-13 раз выше, чем при своевременных, а перинатальная смертность у недоношенных новорожденных в 33 раза выше, чем у доношенных [Martin J.A., Kirmeyer S. et al., 2009; Hamilton B.E. et al., 2009]. Следует отметить, что 40% преждевременных родов обусловлено инфекционными факторами, а преждевременные роды до 30 недель беременности имеют инфекционную этиологию в 80% случаев [Goldenberg R.L. et al., 2000; Lamont R.F., 2003; Сидельникова B.M., Антонов А.Г., 2006; Ходжаева З.С., 2011].

Несмотря на многочисленные научные и практические исследования в этой области, частота преждевременных родов не снижается, а в некоторых странах даже растет, что заслуживает дальнейшего всестороннего изучения и совершенствования диагностических и лечебных мероприятий, направленных на снижение количества преждевременных родов [Серов В.Н., 2002; Ananth

C.V., Vintzileos A.M., 2006; Robert L.G., Jennifer F. С., 2008].

По современным представлениям, одной из причин развития преждевременных родов инфекционного генеза являются ограниченные возможности иммунной системы беременной к своевременному распознаванию и уничтожению этиологического агента инфекции. Для осуществления иммунологической защиты против различных патогенов необходима скоординированная работа врожденной и адаптивной систем иммунитета [Сухих Г.Т., Ванько JI.B., 2003; Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005; Ковальчук JI.B., Ганковская JI.B. и соавт., 2012].

Система цитокинов играет важную роль в течение всей беременности, регулируя процессы инвазии трофобласта, межклеточные взаимоотношения в эндометрии, воспалительные реакции [Beigi R.H., Yudin М.Н., 2007]. При осложненном течении беременности на фоне урогенитальной инфекции отмечается увеличение в периферической крови провоспалительных цитокинов, что приводит к возрастанию продукции простагландинов и ферментов, способствующих сокращениям матки и раскрытию шейки матки [Тетруашвили Н.К., Сухих Г.Т., 2003; Romero R. et al., 2007].

Дальнейшие исследования в этой области и поиск новых иммунологических маркеров невынашивания беременности позволят выявить пациенток групп риска по развитию преждевременных родов инфекционного генеза, своевременно проводить патогенетически обоснованную терапию с целью улучшения исходов беременности и родов, снижения перинатальной заболеваемости и смертности.

Цель исследования

Определить диагностическую и прогностическую значимость комплексного исследования интерферонового статуса и экспрессии генов цитокинов у беременных высокого инфекционного риска.

Задачи исследования

1. Провести анализ течения беременности, родов и послеродового периода у беременных с урогенитальной инфекцией и здоровых беременных на основании комплексного клинико-лабораторного обследования беременных и их потомства.

2. Провести анализ экспрессии генов цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНОа, ИЛ-4, ИЛ-10, ИФНа, ИФНу) в мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови у пациенток обследованных групп и оценить их диагностическую значимость для выявления беременных группы риска по преждевременным родам и по реализации ВУИ.

3. Оценить диагностическую и прогностическую значимость определения интерферонового статуса у пациенток обследованных групп.

4

4. Определить чувствительность лейкоцитов периферической крови (ЛПК) к препаратам ИФНа и ИФНу у пациенток обследованных групп.

5. Разработать алгоритм обследования беременных высокого инфекционного риска для прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза, реализации ВУИ и оптимизации тактики ведения данного контингента беременных.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование экспрессии генов цитокинов^ в МНК периферической крови у беременных высокого инфекционного риска для выявления группы риска по преждевременным родам и реализации ВУИ.

У беременных с преждевременными родами инфекционного генеза показано увеличение уровня экспрессии генов ИЛ-1, ИЛ-8 и снижение уровня экспрессии гена ИЛ-18 в МНК периферической крови, по сравнению с беременными со своевременными родами.

При реализации ВУИ наблюдается достоверное снижение уровня экспрессии гена ИЛ-12 в МНК и частоты его выявляемое™.

Впервые выявлен дисбаланс в индуцированной выработке интерферонов в культуре лейкоцитов у беременных с ПР, который проявляется в значительном увеличении выработки ИФНа и снижении выработки ИФНу.

Полученные результаты об изменении экспрессии генов цитокинов и интерферонового статуса углубляют представления о патогенезе преждевременных родов инфекционного генеза.

В данном исследовании разработаны новые иммунологические критерии прогнозирования преждевременных родов и реализации ВУИ у беременных высокого инфекционного риска, позволяющие оптимизировать тактику ведения данного контингента беременных. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение, заявка № 2011146149/15(069086) от 15.11.2011г.

Практическая значимость

Изучение социально-возрастного состава, а также соматического и гинекологического статуса беременных позволяет выделить факторы риска преждевременных родов инфекционного генеза, что способствует своевременной диагностике и проведению лечения угрозы ПР.

Определение факторов риска развития преждевременной родовой деятельности позволяет выделить когорту беременных для проведения динамического клинико-лабораторного контроля над состоянием будущей матери и плода с применением современных технологий согласно разработанному в результате проведенного исследования алгоритму обследования беременных с высоким инфекционным риском.

Увеличение уровня экспрессии ИЛ-1, ИЛ-8 и снижение уровня экспрессии гена ИЛ-18 в МНК могут быть рекомендованы в качестве дополнительных критериев диагностики и прогнозирования преждевременных родов.

Изучение индуцированной выработки ИФНа и ИФНу в культуре лейкоцитов позволило разработать новые критерии ранней диагностики и прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза.

Положения, выносимые на защиту

1. Наличие урогенитальной инфекции (УГИ) у беременной является фактором риска развития акушерских осложнений во время беременности и родов и способствует к высокой частоте преждевременных родов инфекционного генеза, высокой перинатальной заболеваемости.

2. Комплексное исследование экспрессии генов цитокинов представляет особую диагностическую значимость для прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза. Показано увеличение уровня экспрессии генов ИЛ-1, ИЛ-8 и снижение уровня ИЛ-18 в МНК периферической крови у беременных с преждевременными родами инфекционного генеза. При реализации ВУИ наблюдается снижение уровня экспрессии гена ИЛ-12 в МНК периферической крови и частоты его выявляемое™.

3. Изменение соотношения ИФНа к ИФНу, выявленное при изучении индуцированной выработки интерферонов лейкоцитами периферической крови, позволяет с высокой точностью прогнозировать преждевременные роды у беременных высокого инфекционного риска. Полученные данные изучения индуцированной выработки интерферонов лейкоцитами периферической крови и определения чувствительности ЛПК к препаратам ИФНа и ИФНу являются обоснованием для проведения иммунокорригирующей терапии у беременных высокого инфекционного риска.

4. С учетом полученных клинико-иммунологических критериев разработан алгоритм диагностики и прогнозирования преждевременных родов у беременных высокого инфекционного риска.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, кафедры иммунологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, используются в практической работе родильного отделения ГБ №8 ДЗ г. Москвы, родильного дома №1 ДЗ г. Москвы, родильного дома №10 ДЗ г. Москвы.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); VII Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии, качество» (Москва, 2012); VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012).

Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции сотрудников кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России,

7

кафедры иммунологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, врачей гинекологических отделений ГКБ №55 ДЗ г. Москвы, родильного отделения ГЪ №8 ДЗ г. Москвы, сотрудников родильного дома №1 ДЗ г. Москвы и родильного дома №10 ДЗ г. Москвы 26 июня 2012 г., протокол №12.

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 11 публикациях, из них 5 -в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личное участие автора Автором лично проведена работа по клиническому и инструментальному обследованию тематических больных, анализу клинико-лабораторных исследований; статистическая обработка полученных данных и анализ результатов исследования.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Работа изложена на 147 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, клинической характеристики групп, результатов собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя литературы, включающего 177 источников, из них 72 отечественных и 105 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 37 диаграммами.

Материалы и методы исследования Настоящая работа выполнена в 2009-2012 гг. на клинической базе кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (заведующий кафедрой - д.м.н., профессор, Заслуженный врач России О.В. Макаров), в родильном отделении ГБ №8 ДЗ г. Москвы (главный врач - к.м.н., А.Б. Дуленков). Иммунологические исследования выполнены на кафедре иммунологии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (заведующий кафедрой -академик РАЕН, профессор, д.м.н., Л.В. Ковальчук i и

в лаборатории Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Минздрава России (директор института - академик РАМН, профессор, д.м.н., А.Л. Гинцбург).

Нами проведено клинико-лабораторное обследование 100 пациенток и новорожденных в раннем неонатальном периоде от матерей основной групп и группы сравнения. Все пациентки были разделены на три группы. В I (основную группу) вошли 65 беременных с наличием урогенитальной инфекции. Основная группа была разделена на 3 подгруппы: 1а подгруппа - 24 беременные с преждевременными родами с реализацией внутриутробной инфекции; 16 подгруппа - 15 беременных с преждевременными родами без реализации внутриутробной инфекции и 1в подгруппа - 26 беременных со своевременными родами. Во II (контрольную группу) вошли 20 пациенток без УГИ, у которых беременность завершилась своевременными родами. В III (группу сравнения) вошли 15 небеременных женщин.

Характеристика обследованных групп

100 пациенток в возрасте 18-40 лет

1_ -

:гтг

Здоровые беременные п=20 Контрольная группа

Беременные с УГИ п=65 Основная группа

Небеременные женщины п=15 Группа сравнения

Преждевременные роды п=39 25-36 недель беременности 1а+1б подгр.

Своевременные роды п=26 1в подгруппа

С реализацией ВУИ п=24 1а подгруппа

Без реализации ВУИ п=15 16 подгруппа

Критериями включения пациенток в основную группу являлись: срок беременности от 25 до 36 недель, наличие урогенитальных инфекций, угроза преждевременных родов. Критериями исключения пациенток из основной группы являлись: многоплодная беременность, острые инфекционные, воспалительные заболевания, оперативное родоразрешение.

В обследованных группах изучали: данные соматического и акушерского анамнеза, течение настоящей беременности, особенности родового акта,

9

состояние новорожденных. Всем пациенткам проводили комплексное клинико-'лабораторное обследование (клинический анализ крови и мочи, определение группы крови и резус-фактора, биохимический анализ крови, гемостазиограмма, анализ микрофлоры влагалища и цервикального канала). Ультразвуковое исследование проводили у всех беременных на аппарате «Aloka 4000» (Япония) с использованием трансабдоминальных и эндовагинальных датчиков, проводили допплерометрическое исследование кровотока в сосудах системы мать-плацента-плод. Для наблюдения за состоянием плода с 30 недель беременности использовали антенатальную кардиотокографию при помощи мониторов фирмы «HewlettPackard» (США).

Бактериологическое исследование цервикальной слизи и определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили в бактериологической лаборатории ГБ №8 ДЗ г. Москвы. Патоморфологическое исследование последов проводили в патологоанатомическом отделении Морозовской детской городской клинической больницы №1 ДЗ г. Москвы.

Иммунологические и молекулярно-генетические исследования выполнены в лаборатории Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Минздрава России (зав. лабораторией - д.б.н., М.В. Мезенцева). Определение экспрессии генов цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНОа, ИЛ-4, ИЛ-10, ИФНа, ИФНу) в МНК периферической крови проводили с использованием методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Выделение мРНК из клеток проводили по методике Chomezynski P. et al. [1987]. ОТ-ПЦР-амплификация была выполнена по методике Gelder С.М. et al. [1995]. В работе были использованы пары праймеров для ИЛ-6, ИЛ-8 [Lin Y. et al., 1998], ИЛ-12 [Thomas S.H. et al., 1996], ИЛ-18 [Gaede K.I. et al., 1999], ИФНа [Gelder С.М. et al., 1995], ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ФНОа, ИФНу [Yamamura M. et al., 1991]. В качестве положительного контроля амплификации использовали ß-актин [Lin Y., Zhang M., 1998]. Для идентификации

нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза в 1758 фирмы Рготе§а.

Определение интерферонового статуса и чувствительности лейкоцитов к препаратам ИФНа и ИФНу проводили в цельной крови биологическим методом. Для осуществления данного метода у обследуемых получали 1мл венозной крови путем пункции локтевой вены. Далее у каждой пациентки определяли способность к продукции ИФНа и ИФНу лейкоцитами периферической крови биологическим методом тестирования ИФН статуса пациентки. В этом случае в ответ на обработку ЛПК субоптимальными дозами митогенов у одних индивидуумов происходило значительное увеличение индуцируемой продукции ИФНа и ИФНу, у других - нет. В качестве митогена для ИФНа использовали вирус болезни Ньюкасла, для ИФНу -фитогемагглютинин [Мезенцева М.В., 2006].

Определение чувствительности ЛПК к препаратам интерферонов осуществляли, используя предварительную обработку (примирование) клеток препаратами ИФНа и ИФНу с последующей оценкой индуцированной выработки интерферонов.

Пациентку считали чувствительной к препаратам ИФНа и ИФНу, если ее ЛПК отвечали увеличением продукции интерферонов при примировании хотя бы одним из препаратов интерферонов (Реаферон, Реальдирон, Интрон А, Роферон А, Гаммаферон) [Мезенцева М.В., 2006].

Статистическую обработку данных производили с использованием статистического пакета программ 81а1лзиса 7 и М80ШсеЕхсе1 2010 с применением методов параметрической и непараметрической статистики. Для сравнения групп данных использовали параметрический критерий Стъюдента и степень вероятности (р), а при малом объеме выборки определяли достоверность различия типов распределений с помощью критерия Манна-Уитни. Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ течения беременности, родов и послеродового периода у пациенток обследованных групп

Возраст обследованных пациенток варьировал от 18 до 40 лет, средний возраст составил 29,0±4,5 лет. Однако в основной группе у беременных с преждевременными родами возраст пациенток свыше 35 лет выявлен достоверно чаще, чем в контрольной группе (30,8% и 10,0% соответственно; р<0,05), что указывает на достоверную взаимосвязь возраста пациенток с ПР.

В ходе клинического изучения анамнеза в обследованных группах нами не было выявлено достоверных различий по массо-ростовым показателям, наследственности, особенностям менструальной функции.

При изучении общего соматического анамнеза у пациенток с преждевременными родами отмечена высокая частота хронических заболеваний: хронический пиелонефрит (45,8% - в 1 а подгруппе, 46,7% - в 16 подгруппе, 10,0% - в группе контроля), хронический тонзиллит (16,7% и 13,3% соответственно по сравнению с группой контроля - 5,0%) и эндокринные заболевания (25,0% и 26,7% соответственно, по сравнению с группой контроля -10,0%; р<0,05).

В структуре гинекологической патологии с высокой частотой были выявлены: хронический сальпингоофорит (в 1а подгруппе - 54,2%, в 16 подгруппе - 46,7%, в группе контроля - 10,0%), кольпиты различной этиологии (33,3% - в 1а подгруппе, 40,0% - в 16 подгруппе, тогда как в контрольной группе кольпит выявлен у 15,0%), эктопия шейки матки (45,8%, 53,3%, 10,0% соответственно; р<0,05), что предопределяет восходящий путь инфекции и внутриутробное инфицирование у пациенток с преждевременными родами.

При изучении акушерского анамнеза в группе беременных с преждевременными родами отмечена высокая частота самопроизвольных и медицинских абортов в анамнезе (35,4% по сравнению со здоровыми беременными - 15%; р<0,05), что, безусловно, также способствует

инфицированию внутренних половых органов.

12

В структуре урогенитальной инфекции у пациенток основной группы с наибольшей частотой выявлялась Ureaplasma urealyticum - 83,3% в la подгруппе, 80,0% - в 16 подгруппе, тогда как в 1в подгруппе - 53,8%. Частота выявления Mycoplasma hominis составила 58,3% - в la подгруппе, 53,3% в 16 подгруппе, 42,3% - в 1в подгруппе. Вирус простого герпеса II и цитомегаловирус у беременных с ПР встречались примерно с одинаковой частотой - 61,5% и 63,1% соответственно (рис. 1).

С большой частотой был выявлен вагинальный кандидоз: в группе с преждевременными родами в 41,0% случаев, что в 2,7 раза выше, чем в группе контроля (15,0%). Бактериальный вагиноз встречался с высокой частотой у беременных с преждевременными родами - 20,8% в 1а подгруппе и 13,3% в -16 подгруппе, тогда как в 1в подгруппе бактериальный вагиноз не был выявлен.

При бактериологическом исследовании отделяемого цервикального канала у обследованных пациенток основной группы наиболее часто встречались возбудители: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella - 29,2% в la подгруппе, 26,7% - в 16 подгруппе и 15,4% - в 1в подгруппе, тогда как в группе контроля и сравнения роста микрофлоры не было выявлено.

Mycopl. Ureapl. Chlam. Gardn.

HSV II

CMV

HPV

16/18/32

Рис. 1. Структура урогенитальных инфекций у пациенток основной группы 1а подгр. - беременные с УГИ, преждевременные роды, с реализацией ВУИ 16 подгр. - беременные с УГИ, преждевременные роды, без реализации ВУИ 1в подгр. - беременные с УГИ, своевременные роды.

Наиболее часто встречающимся осложнением беременности у пациенток с урогенитальными инфекциями была угроза прерывания беременности и преждевременных родов, которая наблюдалась в группе с преждевременными родами в 59,0% случаев и носила рецидивирующий характер, тогда как в контрольной группе данное осложнение наблюдалось в 20,0% случаев, что в 3 раза реже, чем в основной группе.

Частым осложнением беременности у обследованных пациенток основной группы было несвоевременное излитие околоплодных вод - у 70,8% беременных с ПР инфекционного генеза с реализацией ВУИ, у 60,0% беременных с ПР инфекционного генеза без реализации ВУИ и у 27,0% беременных 1в подгруппы, тогда как в контрольной группе данное осложнение беременности наблюдалось только у 15,0% пациенток. Клинические симптомы хориоамнионита наблюдались у 16,7% беременных 1а группы.

У беременных с преждевременными родами хроническая внутриутробная гипоксия плода наблюдалась в 66,7% случаев, по сравнению с 15,4% случаев в 1в подгруппе и 5,0% - в группе контроля. У беременных основной группы острая гипоксия плода наблюдалась в 10,3% случаев, тогда как в группе контроля данное осложнение не было выявлено.

Таким образом, при наличии УГИ повышается риск разгития осложнений беременности, наиболее характерными из которых являются: угроза прерывания беременности, плацентарная недостаточность, хроническая гипоксия плода, синдром задержки роста плода и преедевременный разрыв плодных оболочек.

В основной группе у 39 беременных с прждевременными родами инфекционного генеза родились недоношенные /-ти, из них у 24 (61,5%) выявлены различные признаки ВУИ, состояние фи рождении данных детей оценивалось как тяжелое, что обусловлено недоношенностью и ВУИ. Выявлена высокая частота внутриутробной пневмонии у новорожденных от матерей 1а подгруппы - 70,8%, частота энтероколита составила 16,7%, данные осложнения в 16 подгруппе не встречались.

Таким образом, результаты проведенного клинического обследования у пациенток с преждевременными родами и реализацией ВУИ свидетельствуют о высокой частоте осложнений у матери, плода и новорожденного, что подтверждает данные ряда исследователей [Кан Н.Е., 2005; Кулаков В.И., 2006; Colman R.W., Lippincott W.W. et al., 2006] и подчеркивает актуальность проблемы.

Комплексный анализ экспрессии генов цитокинов в МНК периферической крови у пациенток обследованных групп

Изменение концентрации цитокинов в различных биологических жидкостях у беременных с невынашиванием было определено многими исследователями [Тетруашвили Н.К., 2008; Бахарева И.В., 2009; Левкович М.А., 2009 и др.]. Однако уровень экспрессии генов цитокинов в МНК периферической крови не изучен. В связи с этим в настоящем разделе был проведен комплексный анализ уровня экспрессии генов цитокинов в МНК.

На первом этапе было проведено исследование экспрессии генов цитокинов у здоровых беременных (II группа) и небеременных женщин (III группа). У пациенток с физиологическим течением беременности выявлено достоверное увеличение частоты выявляемое™ экспрессии генов ИЛ-6 (40,0%) и ИЛ-18 (100%) в МНК по сравнению с небеременными женщинами (13,3% и 40,0% соответственно). Уровень экспрессии гена ИЛ-6 у здоровых беременных составил 93,7%, что достоверно выше, чем у небеременных женщин - 37,5% (р<0,05), тогда как уровень экспрессии гена ИЛ-18 в МНК у пациенток сравниваемых групп практически не отличался и находился на одинаково высоком уровне (рис. 2; рис. 3). Достоверные различия по частоте выявления и уровню экспрессии мРНК других исследуемых цитокинов нами не выявлены. Однако следует отметить 100% частоту выявляемое™ экспрессии гена ИФНа у пациенток обследованных групп, при этом уровень экспрессии гена в обеих группах был высоким и составил 96,2% и 93,3% соответственно.

<о <Ь Л Л „й- .> л # # # # ^ ^ ^

N> пй- л> ^

^ ^ ^ # ^ ^ # ^

Рис. 2 Рис.3

Рис. 2 Частота выявления экспрессии генов про- и противоспалительных цитокинов у здоровых беременных (II гр.) и здоровых небеременных женщин (III гр.) По оси ординат - частота выявления экспрессии генов цитокинов в % По оси абсцисс - исследованные цитокины

Рис. 3 Уровень экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов у здоровых беременных (II гр.) и здоровых небеременных женщин (Ш гр.) По оси ординат - уровень экспрессии генов цитокинов в % По оси абсцисс - исследованные цитокины

Примечание: *р<0,05 - указаны достоверные различия по сравнению с небеременными женщинами

В патогенезе преждевременных родов инфекционного генеза и внутриутробной инфекции важную роль играют система про-и противовоспалительных цитокинов. Увеличение уровня провоспалительных цитокинов под действием инфекции приводит к нарастанию синтеза простагландинов и преждевременному развитию родовой деятельности [Сотникова Н.Ю., 2005; Тетруашвили Н.К., 2008; Romero R. et al., 2007; Holst R.M. et al., 2005].

У беременных с преждевременными родами инфекционного генеза частота выявления экспрессии гена ИЛ-1 в МНК периферической крови составила 92,3%, что 3,7 раза превышает частоту выявления у здоровых беременных, и 2,4 раза - в 1в подгруппе; р<0,05 (рис. 4, рис. 2). Наблюдается увеличение уровня экспрессии гена ИЛ-1 в МНК периферической крови у беременных с преждевременными родами инфекционного генеза - 69,4% по сравнению с подгруппой с УГИ и своевременными родами - 27,5%; р<0,05 (рис. 5, рис. 3).

юоЧ"~ 90 " 80 ' 70 ' 60 " 50 ' 40 ' 30 ' 20 ' 10 ' * ■ 1а+1е * ■ 1 ш%Г ~ 90 х .1 ■ 1а+1б группа 1в группа

* II _*_ ¡1 ои * 70 60 гИ 50 ГШ~ 40 гИ~~" : зо 20 -М 10 Ш г „ Л - ¡А

и .я- <о <Ъ ¿V Л Л> Л # # # # # и----— ———- <ч> <Ь Л А -Л- .> Л # # # # # ^

Рис. 4 Рис. 5

Рис. 4 Частота выявления экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов у беременных основной группы с преждевременными родами инфекционного генеза (1а+1б подгр.) и своевременными родами с наличием УГИ (1в подгр.) По оси ординат - частота выявления экспрессии генов цитокинов в % По оси абсцисс - исследованные цитокины

Рис. 5 Уровень экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов у беременных основной группы с преждевременными родами инфекционного генеза (1а+1б подгр.) и своевременными родами с наличием УГИ (1в подгр.) По оси ординат - уровень экспрессии генов цитокинов в % По оси абсцисс - исследованные цитокины

Примечание: *р<0,05 - указаны достоверные различия по сравнению с 1в подгруппой.

В 100% наблюдений у беременных с преждевременными родами была выявлена экспрессия гена ИЛ-6 в МНК, что статистически достоверно выше, чем у здоровых беременных - 40,0%, и у беременных 1в подгруппы (УГИ, своевременные роды) - 38,5% наблюдений; р<0,05. Экспрессия гена ИЛ-6 также была высокой и составила 89,7%, но достоверные различия по сравнению со здоровыми беременными и беременными 1в подгруппы не выявлены.

Анализ экспрессии гена ИЛ-8 в МНК периферической крови в обследованных группах показал, что, несмотря на низкую частоту выявления экспрессии гена ИЛ-8 у беременных с ПР инфекционного генеза (38,5%) по сравнению с беременными 1в подгруппы (84,7%; р<0,05), уровень экспрессии гена ИЛ-8 при преждевременных родах был максимальным и составил 100%. Нами показано, что уровень экспрессии данного показателя в основной группе статистически достоверно выше, чем у здоровых беременных (48,5%) и беременных 1в подгруппы с УГИ и своевременньми родами (47,7%).

Полученные данные свидетельствуют о том, что при преждевременных родах инфекционного генеза наблюдается увеличение экспрессии генов провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 в МНК периферической крови и увеличение их содержания в сыворотке крови, что подтверждает роль данных цитокинов в патогенезе преждевременных родов инфекционного генеза [Сидельникова В.М. и соавт., 2006; Бахарева И.В., 2009; Левкович М.А., 2009].

Нами показано достоверное снижение уровня экспрессии гена ИЛ-18 в МНК у беременных с преждевременными родами инфекционного генеза (39,5%) по сравнению с группой здоровых беременных и с 1в подгруппой (92,5% и 86,3% соответственно). Нами также установлено снижение выявляемое™ экспрессии генов ИЛ-2 в 2,2 раз, ИЛ-12 - в 3 раза у беременных с преждевременными родами, по сравнению с 1в подгруппой; р<0,05.

Таким образом, увеличение уровня экспрессии генов ИЛ-1, ИЛ-8 и снижение уровня экспрессии гена ИЛ-18 в МНК периферической крови у беременных высокого инфекционного риска могут служить одним из прогностических критериев преждевременных родов инфекционного генеза.

Нами проведен анализ результатов экспрессии генов цитокинов у беременных основной группы с реализацией ВУИ (1а подгруппа, п=24) и без реализации ВУИ (16 подгруппа, п=15).

У беременных с реализацией ВУИ показано достоверное снижение уровня экспрессии гена ИЛ-12 в МНК периферической крови - 25,0%, по сравнению с беременными без реализации ВУИ - 56,3%; р<0,05. Следует отметить достоверное снижение частоты выявляемое™ экспрессии гена ИЛ-12, который был выявлен в 4,2% случаев, по сравнению с беременными без реализации ВУИ - 53,3% случаев. При реализации ВУИ также достоверно снижена частота выявления экспрессии гена ИЛ-4 в МНК. Получены достоверные отличия по частоте выявления экспрессии гена ИФНу, которая у беременных с реализацией ВУИ более чем в 2,5 раза выше, чем у беременных без реализации ВУИ. Полученные показатели могут быть использованы как прогностические и диагностические критерии реализации внутриутробной инфекции.

18

Анализ интерферонового статуса у беременных обследованных групп

Способность к продукции ИФНа в культуре лейкоцитов беременных с преждевременными родами была выше (рис. 6а, 66), чем у здоровых беременных (35,5±11,6 Ед/мл по сравнению с 25,5±5,4 Ед/мл). Способность к продукции ИФНу у беременных с преждевременными родами, напротив, была понижена (5,1±2,4 Ед/мл и 14,9±1,6 Ед/мл, соответственно; р<0,05). Соотношение показателей ИФНа к ИФНу в культуре лейкоцитов у беременных с преждевременными родами в среднем составило 9,7±3,2 по сравнению с 3,2±1,4 у родивших в срок; р<0,05.

При сопоставлении результатов экспрессии генов интерферонов с их продукцией в культуре лейкоцитов показано, что у беременных с ПР инфекционного генеза высокий уровень экспрессии гена ИФНа (82,3%) сочетается с высокой выработкой ИФНа в культуре лейкоцитов (35,5±11,6 Ед/мл), однако на фоне высокого уровня экспрессии гена ИФНу (91,0%) продукция его снижена (5,1±2,4 Ед/мл) [рис.ба, 66], что свидетельствует о нарушении продукции ИФНу на посттранскрипционном уровне.

Рис. 6а Рис. 66

Рис.ба Экспрессия генов ИФНа и ИФНу и уровень продукции ИФНа и ИФНу в группе беременных с физиологическими родами (6а) и в группе беременных с преждевременными родами (66).

По левой оси ординат - уровень экспрессии генов ИФНа и ИФНу (%), по правой оси ординат - уровень продукции ИФНа и ИФНу (Ед/мл). По оси абсцисс - исследованные цитокины

Таким образом, выявлен дисбаланс в системе интерфероногенеза при преждевременных родах, который проявляется увеличением экспрессии гена ИФНу в МНК и снижением его индуцированной продукции лейкоцитами. Увеличение индуцированной выработки ЛПК ИФНа в 5 и более раз по сравнению с выработкой ИФНу у беременных с наличием УГИ позволяет с высокой точностью прогнозировать преждевременные роды инфекционного генеза и реализацию ВУИ в 60,0 % случаев.

Анализ результатов определения чувствительности лейкоцитов периферической крови к препаратам ИФНа и ИФНу у пациенток

обследованных групп В данной работе нами было проведено индивидуальное определение чувствительности лейкоцитов периферической крови к препаратам ИФНа (Реаферон, Реальдирон, Интрон А, Роферон А) и ИФНу (Гаммаферон) во всех обследованных группах (табл. 1).

Следует отметить высокую чувствительность лейкоцитов периферической крови у беременных с преждевременными родами инфекционного генеза к препаратам ИФНа: Роферону А - в 82,0% и Интрону А - в 82,0% наблюдений, при этом чувствительность в культуре лейкоцитов к препарату - Гаммаферону выявлена только в 20,5% случаев; р<0,05.

Таким образом, нами показано, что у пациенток с преждевременными родами инфекционного генеза не только снижена продукция ИФНу на постгранскрипционном уровне, но и понижена чувствительность лейкоцитов периферической крови к препарату ИФНу - Гаммаферону, что необходимо учитывать при назначении препаратов интерферона. Полученные нами данные являются обоснованием для возможного применения препаратов рекомбинантного ИФНа-2 у пациенток с рецидивирующей угрозой прерывания беременности.

Таблица 1

Определение чувствительности ЛПК к препаратам ИФНа и ИФНу у пациенток обследованных групп (в %)

~~ ._____ Группы Препараты -—___ 1а+1б подгр. 1в подгр. Игр. III гр.

Роферон А 82,0%* 30,7% 30,0%" 86,6%

Интрон А 82,0%* 40,3% 40,0%" 13,3%

Реаферон 58,9% 42,3% 30,0%" 66,6%

Реальдирон 20,5% 38,4% 30,0% 33,3%

Гаммаферон 20,5% 23,0% 20,0%" 6,6%

1а+1б подгр.- беременные с УГИ, преждевременные роды 1в подгр. - беременные с УГИ, своевременные роды

II гр. - здоровые беременные

III гр. - небеременные женщины

Примечание: р<0.05 - указаны достоверные различия 1а+1б подгруппы *по сравнению с 1в подгруппой, II группа **по сравнению с III группой

ВЫВОДЫ

1. Факторами риска развития преждевременных родов и реализации ВУИ у плода и новорожденного являются: наличие УГИ во время беременности в сочетании с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза, хроническими экстрагенитальными заболеваниями; рецидивирующая угроза прерывания беременности; хроническая плацентарная недостаточность; хроническая гипоксия плода.

2. У беременных с преждевременными родами инфекционного генеза выявлено достоверное увеличение уровня экспрессии генов ИЛ-1, ИЛ-8 более чем в 2 раза и снижение экспрессии гена ИЛ-18 в МНК более чем в 2,2 раза по сравнению с группой с наличием УГИ и своевременными родами. При реализации ВУИ наблюдается снижение уровня экспрессии гена ИЛ-12 в 2,3 раза и частоты его выявляемое™ более чем в 12,7 раз, по сравнению с беременными без реализации ВУИ.

3. У беременных с преждевременными родами инфекционного генеза на

фоне высокого уровня экспрессии гена ИФНу продукция его в культуре

лейкоцитов снижена, что свидетельствует о нарушении продукции ИФНу на

21

посттранскрипционном уровне. Увеличение индуцированной выработки лейкоцитами периферической крови ИФНа в 5 и более раз по сравнению с выработкой ИФНу у беременных с наличием урогенитальной инфекции позволяет с высокой точностью прогнозировать преждевременные роды инфекционного генеза в 60,0% случаев.

4. Наиболее высокой чувствительностью (82,0%) к препаратам ИФНа (Роферону А, Интрону А) обладают лейкоциты беременных в группе с УГИ и ПР, т.е. с наиболее выраженными изменениями интерферонового статуса.

5. Выявленные изменения в цитокиновом и интерфероновом статусе у беременных с наличием УГИ могут быть использованы как прогностические и диагностические критерии ПР и реализации ВУИ. В алгоритм обследования беременных групп риска следует включать комплексное исследование экспрессии генов цитокинов и оценку интерферонового статуса, что позволит своевременно проводить этиопатогенетическую и иммунокорригирующую терапию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявление факторов повышенного риска развития осложнений беременности у обследованных пациенток (острая или рецидивирующая хроническая инфекция, наличие воспалительных заболеваний тазовых органов в анамнезе, плацентарная недостаточность, хроническая гипоксия плода, маловодие, многоводие и другие осложнения) дают основания относить данный контингент к группе высокого риска по развитию преждевременной родовой деятельности и реализации ВУИ, и, соответственно, проводить целенаправленное обследование.

2. Выявленные изменения в цитокиновом и интерфероновом статусах (повышение уровня экспрессии гена ИЛ-1, ИЛ-8 и снижение уровня экспрессии гена ИЛ-18; увеличение индуцированной выработки ИФНа по сравнению с ИФНу в 5 и более раз) у беременных с наличием УГИ и явлениями угрозы прерывания беременности могут быть использованы как маркеры

осложненного течения беременности, что позволит своевременно проводить симптоматическую и патогенетическую терапию.

3. Понижение уровня экспрессии гена ИЛ-12 по сравнению с данными обследованных пациенток без реализации ВУИ позволяет отнести данных пациенток в группу риска по реализации ВУИ.

4. Выявленные изменения в интерфероновом статусе у пациенток с ПР инфекционного генеза и реализацией ВУИ могут служить теоретическим обоснованием для своевременного начала иммунокорригирующей терапии препаратами ИФНа в группах риска.

5. Наблюдается высокая (82,0%) чувствительность лейкоцитов к препаратам ИФНа (Роферон А, Интрон А) у обследованных беременных с ПР инфекционного генеза, что является теоретическим обоснованием для назначения терапии препаратами рекомбинантного ИФНа-2 в группах риска.

6. На основании полученных результатов нами разработан алгоритм клинико-иммунологического обследования беременных высокого инфекционного риска. Согласно представленному ниже алгоритму на первом этапе на основании данных клинико-лабораторного обследования необходимо выявить беременных групп риска по осложненному течению беременности, которым показаны дополнительные иммунологические методы обследования. Для своевременной диагностики и прогнозирования преждевременных родов и развития инфекционного процесса у плода и новорожденного в алгоритм обследования пациенток с угрозой прерывания беременности целесообразно включать оценку интерферонового статуса и комплексное исследование экспрессии генов цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18, ИФНа, ИФНу).

Увеличение индуцированной выработки ИФНа в 5 и более раз по сравнению с выработкой ИФНу у беременных с наличием УГИ позволяет отнести данных беременных в группу риска по преждевременным родам и реализации ВУИ.

При определении уровня экспрессии генов цитокинов в МНК были

разработаны следующие критерии прогнозирования ПР и реализации ВУИ:

23

- достоверное увеличение уровня экспрессии гена ИЛ-1, ИЛ-8 более чем в 2 раза и снижение уровня экспрессии гена ИЛ-18 более чем в 2,2 раза может служить прогностическим критерием развития преждевременных родов инфекционного генеза;

- понижение уровня экспрессии гена ИЛ-12 более чем в 2,3 раза может служить прогностическим критерием реализации ВУИ, что позволяет проводить своевременную иммунокорригирующую терапию и оптимизировать тактику ведения матерей и их новорожденных.

АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ БЕРЕМЕННЫХ С ВЫСОКИМ ИНФЕКЦИОННЫМ РИСКОМ

Выявление беременных групп риска по данным клинико-лабораторного обследования

О --

Дополнительные иммунологические обследования

Периферическая кровь

Оценка цитокинового статуса по уровню экспрессии генов цитокинов методом ОТ-ПЦР

Оценка интерферонового статуса биологическим методом

1ИЛ-12

Беременные группы риска по реализации ВУИ

Т ИЛ-1, | ИЛ-8 |ИЛ-18

Т индуцированной выработки ИФНа ЛПК по отношению к ИФНу в 5 и более раз

.....^

Беременные группы риска по преждевременным родам

Динамическое наблюдение, лечебные мероприятия, иммунокорригирующая терапия, контрольное обследование

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Магомедова, A.M. Прогностическое значение исследования факторов врожденного иммунитета при преждевременном разрыве плодных оболочек / О.В. Макаров, JI.B. Ганковская, И.В. Бахарева, A.M. Магомедова и др. // Вестник РГМУ специальный выпуск. Материалы V международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» Москва. - 2011. - № 2. - с. 21-24.

2. Магомедова, A.M. Иммунологические аспекты преждевременных родов инфекционного генеза / О.В. Макаров, В.В. Романовская, A.M. Магомедова и др. // Вестник РУДН. - 2011. - № 6. - с. 373-380.

3. Магомедова, A.M. Исследование экспрессии генов цитокинов в процессе культивирования лейкоцитов здоровых доноров / JI.B. Ковальчук, JI.B. Ганковская, A.M. Магомедова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 2. - с. 60-63.

4. Магомедова, A.M. Прогностическое значение экспрессии генов молекул врожденного иммунитета при невынашивании беременности / И.В. Бахарева, Л.В. Ганковская, A.M. Магомедова и др. // Журнал «Лечащий врач» - 2012. -№ 9. - с. 84-90.

5. Магомедова, A.M. Иммунологические аспекты невынашивания беременности / О.В. Макаров, В.В. Романовская, И.В. Бахарева, A.M. Магомедова и др. // Справочник акушера-гинеколога. - 2011. - № 1-2. - с. 4-10.

6. Магомедова, A.M. Экспрессия генов молекул врожденного иммунитета при беременности с высоким риском реализации внутриутробной инфекции / И.В. Бахарева, Л.В. Ганковская, A.M. Магомедова и др. // Научно-практический медицинский журнал «Лечение и Профилактика» - 2012. -№1(2). - с. 44-51.

7. Магомедова, A.M. Интерфероновая реакция лейкоцитов в прогнозировании преждевременных родов у беременных с высоким инфекционным риском / A.M. Магомедова, И.В. Бахарева, Л.В. Ганковская и

др. // Материалы XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Сборник материалов конгресса. - 2012. - с.531.

8. Магомедова, A.M. Прогностическое значение определения индуцированной продукции интерферонов лейкоцитами периферической крови у беременных с высоким инфекционным риском / О.В. Макаров, И.В. Бахарева, Л.В. Ганковская, A.M. Магомедова и др. // Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя» - 2012. - с. 102.

9. Магомедова, A.M. В основе патогенеза бактериального вагиноза и преждевременных родов лежат локальные иммунные изменения / И.В. Бахарева, П.А. Кузнецов, A.M. Магомедова и др. // Материалы VII Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии, качество» Москва. - 2012. - с. 4.

10. Магомедова, A.M. Индуцированная продукция интерферонов лейкоцитами периферической крови у беременных с высоким инфекционным риском как прогностический фактор преждевременных родов / И.В. Бахарева, О.В. Макаров, A.M. Магомедова и др. // Материалы VII Ежегодного Конгресса специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии, качество» Москва. - 2012. - с. 5.

11. Магомедова, A.M. Прогностическое значение интерфероновой реакции лейкоцитов у беременных с высоким инфекционным риском / A.M. Магомедова, И.В. Бахарева // Вестник РГМУ специальный выпуск. Материалы VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых. Москва. - 2012. - № 1. - с. 59.