Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Прогностическое значение молекулярно-генетических маркеров у пациентов с нейробластомой

На правах рукописи

Друй Александр Евгеньевич

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ У ПАЦИЕНТОВ С НЕЙРОБЛАСТОМОЙ

14.01.12 - Онкология 14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика

11 ПАР 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2015

005560063

005560063

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Государственном автономном учреждении здравоохранения Свердловской области «Институт медицинских клеточных технологий»

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Фечина Лариса Геннадьевна

Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области «Институт медицинских клеточных технологий», заведующая лабораторией клеточной терапии онкогематологических заболеваний, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Свердловской области «Областная детская клиническая больница №1», заместитель главного врача по онкологии и гематологии.

доктор медицинских наук, профессор Цвиренко Сергей Васильевич

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики и бактериологии.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Белогурова Маргарита Борисовна

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, Санкт-Петербургское бюджетное учреждение здравоохранения «Городская клиническая больница №31», заведующая отделением детской онкологии и гематологии.

доктор медицинских наук, профессор Мацко Дмитрий Евгеньевич

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Санкт-Петербургский клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)», заместитель директора по организационно-методической работе.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России.

Защита диссертации состоится «_»__ 2015 г. в « » часов на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Минздрава России (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68; тел.: (812) 4399554, электронная почта oncll@rion.spb.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии имени H.H. Петрова» Минздрава России по адресу 197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68 и на сайте http://www.niioncologii.m/nj/node/284

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Бахидзе Елена Внлльевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нейробластома - наиболее часто встречающаяся у детей солидная опухоль экстракраниальной локализации. Клиническое течение заболевания и, соответственно, прогноз варьируют в широких пределах от относительно доброкачественных форм, склонных к спонтанной регрессии (у детей раннего возраста) или созреванию (у детей более старших возрастных групп) до агрессивных опухолей, характеризующихся быстрым локорегионарным распространением, ранним появлением отдаленных метастазов, плохим ответом на проводимую мультимодальную терапию и высокой частотой рецидивов [G.M. Brodeur, 2000, N.K. Cheung, 2005].

Гетерогенность клинических форм нейробластомы обусловлена биологическими свойствами опухолевых клеток, включающих изменение количества копий отдельных генов или хромосомных регионов, мутации в онкогенах и генах-супрессорах опухолевого роста, а также аберрантную экспрессию ряда генов [G.M. Brodeur, 1984, E.F. Attiyeh, 2005, F. Abel, 2011]. Клинические данные, в первую очередь, возраст и масса опухоли в организме (локальная стадия и наличие отдаленных метастазов), имеют определенное прогностическое значение [М. Schmidt, 2006, G.A. Yanik, 2013]. Современные схемы стратификации больных нейробластомой на группы риска, основанные на совокупности клинических и молекулярно-биологических данных, позволяют проводить селективную риск-адаптированную терапию, однако они не дают полной возможности прогнозировать эффективность терапии, вероятность развития рецидива и исход заболевания [S.L. Cohn, 2009, R. Ladenstein, 2010]. Этим продиктована необходимость дальнейшего поиска прогностических маркеров, введение которых в современные схемы стратификации позволило бы более точно определять степень риска у пациентов с нейробластомой, проводить индивидуализированное противоопухолевое лечение, добиваясь высокой эффективности и избегая избыточной токсичности.

Диссеминация опухоли в организме значительно усугубляет течение заболевания и увеличивает риск неудачи терапии. При этом значение имеют не только визуализируемые метастатические очаги, но и пул циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови и инфильтрация ими костного мозга (КМ). Предполагается, что совокупность клеток опухоли в КМ, не выявляемая методами стандартного цитологического исследования, может иметь важное прогностическое значение [J. Stutterheim, 2008].

Ответ опухоли на проводимую терапию является независимым прогностическим фактором при различных онкологических и гематологических заболеваниях [H. Riehm, 1987, J. Stutterheim, 2011]. Наличие остаточных опухолевых клеток в организме - минимальной остаточной болезни (МОБ) - во время проведения химиотерапии, после индукционной химиотерапии или перед проведением трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (АГСК) значимо снижает

показатели выживаемости больных нейробластомой [М. Fukuda, 2001, А. Tchirkov, 2003, I.Y. Cheung, 2003]. Это определяет необходимость поиска высокочувствительных методов, служащих для обнаружения оккультных опухолевых клеток как в момент диагностики нейробластомы для корректного стадирования заболевания, так и в процессе лечения для оценки наличия и кинетики МОБ. Также необходим анализ прогностической значимости полученных результатов.

Степень разработанности темы исследования

На сегодняшний день в схемы стратификации больных нейробластомой на группы риска включены такие молекулярно-биологические характеристики опухоли, как амплификация гена MYCN, делеция короткого плеча хромосомы 1 и длинного плеча хромосомы 11, неблагоприятная роль которых была показана в большом количестве исследований [E.F. Attiyeh, 2005, S.L. Cohn, 2009, R. Ladenstein, 2010]. В то же время патогенетическое и прогностическое значение ряда генетических аберраций (аномалии хромосом 4,7,12,14) остается невыясненным, а литературные данные о влиянии структурных аберраций хромосом 3 и 9 на выживаемость пациентов являются противоречивыми [J. Takita, 1997, S.L. Fenton, 2004, A. Pezzolo, 2009]. Кроме того, отсутствуют данные об изменении спектра молекулярно-генетических аномалий в ткани опухоли при развитии рецидива заболевания по сравнению с клетками первичной опухоли.

Не подвергается сомнению факт ухудшения прогноза нейробластомы при наличии диссеминированной опухоли [N.K.V. Cheung, 2005]. Однако способы выявления отдаленных метастазов и, в частности, поражения опухолевыми клетками костного мозга в последнее время претерпели существенные изменения. Внедрены современные методы визуализационной диагностики (мультиспиральная компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, а также сцинтиграфия с использованием 131-1 метайодбензилгуанидина). Для оценки поражения КМ в рутинной практике продолжает применяться цитологический метод, чувствительность которого невелика [J. Stutterheim, 2008]. Вместе с тем различными исследовательскими группами предлагается использовать с этой целью высокочувствительные методы молекулярной биологии и иммунофенотипирование [S.A. Burchill, 2001, J. Stutterheim, 2008]. Однако стандартизованный подход к использованию данных методов для определения опухолевых клеток в КМ отсутствует.

Таким образом, целью исследования является определение прогностической значимости молекулярно-генетических аберраций в клетках нейробластомы и поражения КМ, выявляемого методами молекулярной биологии.

Задачи исследования

1. Изучить возможность применения полимеразной цепной реакции (ПНР), множественной лигазно-зависимой амплификации зондов (MLPА) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для определения изменений числа копий отдельных генов и хромосомных регионов, а также

проанализировать качественное соответствие результатов, полученных различными методами.

2. Установить частоту выявления и связь с клиническими характеристиками аберраций короткого плеча хромосомы 1, короткого плеча хромосомы 2 (а также гена MYCN), короткого плеча хромосомы 3, короткого плеча хромосомы 4, хромосомы 7, короткого плеча хромосомы 9, длинного плеча хромосомы 11, длинного плеча хромосомы 12 (а также гена A4DM2), длинного плеча хромосомы 14, длинного плеча хромосомы 17.

3. Определить прогностическое значение указанных аберраций во всей исследуемой группе пациентов, а также в подгруппах: больные младше 1 года, с локализованной опухолью, отсутствием амплификации гена MYCN.

4. Провести сравнение различных молекулярных маркеров поражения КМ и наличия МОБ на основе экспрессии опухоль-ассоциированных генов, а также оценить прогностическое значение их выявления при первичной диагностике и в ходе терапии.

5. Оценить возможность применения маркера поражения КМ на основе исследования геномной ДНК.

6. Провести сравнительный анализ методов ПЦР и проточной цитометрии для выявления поражения КМ и определения остаточных опухолевых клеток.

Научная новизна

Впервые установлено, что обнаружение экспрессии генов РНОХ2В и ТН является оптимальным тестом для оценки инициального поражения КМ и контроля МОБ (диагностическая эффективность теста (ДЭТ) 0,994 и 0,952, соответственно). Показано негативное прогностическое значение поражения КМ, выявленного с помощью анализа экспрессии генов РНОХ2В и ТН на момент первичной диагностики нейробластомы (снижение БСВ на 26%, OB — на 23%). Впервые выявлено снижение выживаемости пациентов (БСВ на 59%, OB - на 75%) при наличии экспрессии генов РНОХ2В и ТН в КМ перед процедурой афереза АГСК, несмотря на отсутствие экспрессии данных генов в аутотрансплантате.

Установлено неполное качественное соответствие результатов выявления поражения КМ методами ПЦР-РВ и проточной цитометрии (78,8%). Продемонстрирована эффективность применения и прогностическое значение (снижение БСВ на 39%) метилированной формы гена RASSFla в качестве маркера поражения КМ, основанного на исследовании геномной ДНК.

Получены высокие показатели качественного соответствия результатов выявления делеции короткого плеча хромосомы 1 (95%) и амплификации гена MYCN (100%) методами ПЦР, FISH и MLPA. Определено прогностическое значение генетических аберраций, клиническая значимость которых ранее оставалась неизвестной, в том числе увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 4, увеличения материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 и делеции короткого плеча хромосомы 9. В группе больных с прогностически благоприятными формами нейробластомы

выявлены генетические аберрации, имеющие негативное прогностическое значение: увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, увеличение материала длинного и короткого плеч хромосомы 7, деления короткого плеча хромосомы 9 и увеличение материала длинного плеча хромосомы 17.

Впервые обнаружено, что при возникновении рецидива или прогрессии нейробластомы спектр выявляемых генетических аберраций в ткани первичной опухоли и в ткани рецидива (после прогрессии) может различаться, причем как в сторону приобретения новых аномалий, так и в сторону исчезновения имеющихся и нормализации кариотипа.

Теоретическая и практическая значимость

Показано, что методы ПЦР, FISH и MLPA могут быть использованы для выявления генетических аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных регионов в клетках нейробластомы. При этом технология MLPA является универсальной и позволяет в условиях одной постановки определять множество аберраций в локусах, наиболее часто вовлекаемых в перестройки при нейробластоме. Выявленное негативное прогностическое значение аномалий хромосом 1, 2, 4, 7, 9, 17 позволяет использовать их для определения степени риска, в том числе, в группе с прогностически благоприятной нейробластомой, пациентам которой в ряде случаев проведение химиотерапии не показано. Обосновано комплексное использование всех трех методик для выявления прогностически-значимых генетических аберраций, как при первичной верификации диагноза, так и при возникновении прогрессии или рецидива опухоли.

Показано, что нормализованная величина экспрессии генов РНОХ2В и ТН в КМ является наиболее информативным маркером инициального поражения КМ и наличия остаточных опухолевых клеток перед проведением аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ДЭТ 0,994 и 0,952). Установлено, что для наиболее точной оценки поражения КМ необходимо дополнительное применение маркера, основанного на геномной ДНК - метилированной формы RASSFla или проточной цитометрии.

На основе технологии капиллярного электрофореза на микроструйных чипах установлен предельный уровень деградации РНК, используемой для анализа экспрессии генов (RIN=4,2).

Методология и методы исследования

Диссертационное исследование проведено в соответствии с мировым опытом проведения научно-исследовательских работ, в основе которого лежат принципы медицинской этики и доказательной медицины. Методология работы включала создание дизайна исследования, установление объема выборки и критериев включения и исключения пациентов, а также подбор оптимального математического аппарата для статистической обработки результатов. При осуществлении настоящего исследования были применены клинические, морфологические, инструментальные и

лабораторные методы, среди которых молекулярно-генетические и онтогенетические.

Положения, выносимые на защиту

1. Технология MLPA позволяет достоверно выявлять многочисленные генетические аберрации у больных нейробластомой.

2. Наличие делеций короткого плеча хромосомы 1, короткого плеча хромосомы 9, а также увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 2, короткого плеча хромосомы 4, длинного и короткого плеч хромосомы 7 и длинного плеча хромосомы 17 связаны с неблагоприятным прогнозом нейробластомы.

3. Экспрессия генов РНОХ2В и ТН обладает наибольшей диагностической ценностью при выявлении поражения КМ и МОБ среди транскриптов опухоль-ассоциированных генов (ДЭТ 0,994 и 0,952). Наличие экспрессии РНОХ2В и/или ТН в КМ во время инициальной диагностики ассоциировано со снижением выживаемости пациентов (БСВ на 26%, OB - на 23%). Выявление экспрессии данных генов в КМ пациентов перед аферезом АГСК связано с развитием посттрансплантационных рецидивов нейробластомы.

4. Выявление метилированной формы гена RASSF1 а является эффективным методом выявления поражения КМ у пациентов с нейробластомой. Обнаружение метилированной формы RASSFIа в КМ при первичной диагностике связано с более низкими значениями бессобытийной выживаемости пациентов (БСВ 0,28±0,13).

Внедрение в практику

Определение прогностически значимых генетических аберраций в клетках нейробластомы методами ПЦР, FISH и MLPA, а также выявление поражения КМ и оценка МОБ с помощью молекулярных маркеров РНОХ2В, ТН, RASSFla и проточной цитометрии успешно внедрены в практику Лаборатории молекулярной биологии Отдела детской онкологии и гематологии Областной детской клинической больницы №1 (ОДКБ №1, г. Екатеринбург) и применяются для всех больных нейробластомой. В лаборатории исследуются образцы пациентов из детских онкологических клиник Перми, Челябинска и Новосибирска. Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе на кафедре клинической лабораторной диагностики и бактериологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Степень достоверности и апробация работы

Для обеспечения достоверности результатов исследуемая когорта включала 122 пациента с верифицированным диагнозом нейробластома. С целью доказательной аргументации выводов данные, полученные в процессе исследования, подвергались статистической обработке с помощью программ Statistica 8.0 и Analyze-it.

Основные положения диссертации были доложены на IV Съезде детских онкологов России (Москва, 2008); IV Объединенном

иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); Конференциях «Достижения в исследовании нейробластомы - 2010, 2012 и 2014» (Стокгольм, 2010, Торонто, 2012, Кёльн, 2014); IV и V Митингах по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, посвященных памяти Р.М.Горбачевой (Санкт-Петербург, 2010, 2011); 42-46 Конгрессах Международного общества детских онкологов (Бостон, 2010, Окленд, 2011, Лондон, 2012, Гонконг, 2013, Торонто, 2014); 8 Азиатском Конгрессе Международного общества детских онкологов (Сеул, 2014); 14 и 16 Российских национальных онкологических конгрессах (Москва, 2010, 2012), Европейском мультидисциплинарном онкологическом конгрессе (Стокгольм, 2011), Конференции «Современные достижения и перспективы в клиническом и фундаментальном исследовании нейробластомы» (Екатеринбург, 2013), Конференции Американского общества клинической онкологии (Чикаго, 2013) и исследования рака (Сан-Диего 2014). По материалам исследования опубликовано 30 печатных работ, из них 6 статей в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора в получение результатов

При выполнении диссертационной работы автор лично участвовал в создании ее дизайна, формировал исследуемую когорту больных, осуществлял обработку и молекулярно-генетическое исследование клинического материала, сбор, систематизацию и анализ полученных результатов и данных дополнительных методов исследования. Автором выполнены обзор мировой литературы по теме диссертации, статистическая обработка результатов, формирование выводов и практических рекомендаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 206 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов. Библиография включает 205 источников, из них 9 отечественных и 196 иностранных. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 49 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Пациенты и методы исследования

Определение прогностической значимости генетических аберраций в клетках нейробластомы, а также поражения КМ с помощью методов молекулярной биологии осуществлялось с помощью ретроспективного когортного исследования. Наблюдение осуществлялось за 122 пациентами, находившимися на лечении в Областной детской клинической больнице №1 (г. Екатеринбург) в период с декабря 1999 года по декабрь 2012 года. У всех больных был морфологически верифицирован диагноз нейробластомы различной степени дифференцировки (нейробластома - 101 пациент, ганглионейробластома - 12 пациентов) и ганглионевромы (9 пациентов). Медиана возраста составила 16,5 месяцев (диапазон 6 дней - 15 лет), 44,3%

(54) пациентов были младше 1 года. У 30,3% (37 больных) была диагностирована I стадия заболевания, у 8,1% (10) - II стадия, у 18,9% (23) — III стадия, у 34,6% (42) - IV стадия, у 8,1% (10) - стадия П/В. Медиана времени наблюдения составила 28 месяцев (диапазон 1-166 месяцев). Схема распределения пациентов в зависимости от проведения им различных молекулярно-генетических исследований представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема распределения пациентов в зависимости от проведения различных молекулярно-генетических исследований

Определение генетических аберраций в клетках нейробластомы

проводилось методами ПЦР, MLPA и FISH. Исследование амплификации гена MYCN с помощью ПЦР-РВ и MLPA, а также делеции короткого плеча хромосомы 1 методом MLPA было выполнено всем 122 пациентам. 70 пациентам из данной группы проводилось исследование делеции короткого плеча хромосомы 1 с помощью ПЦР, а 22 пациентам поиск указанных аберраций проводился также методом FISH, что позволило проанализировать качественное соответствие результатов различных методик.

Выявление генетических аберраций хромосом 3, 11, 17 с помощью MLPA было выполнено 108 пациентам, анализ аномалий хромосом 4, 7, 9, 12. 14 - 100 больным. Для оценки возможности использования ДНК, выделенной из образцов ткани, фиксированной в формалине и залитой в парафиновый блок, было проанализировано 20 образцов. Кроме того, пятерым пациентам молекулярно-генетическое исследование проводилось при первичной диагностике нейробластомы и при развитии рецидива или прогрессии опухоли.

В качестве контрольных образцов использовались клеточные линии нейробластомы IMR-32, Kelly и SH-SY5Y, лейкоциты периферической крови 10 здоровых доноров, а также 5 фиксированных гистологических образцов аденокарциномы легкого с верифицированным лечебным патоморфозом.

Определение амплификации гена MYCN осуществлялось методами конкурентной ПНР и мультиплексной количественной ПЦР-РВ. Первый основан на коамплификации специфической последовательности ДНК гена MYCN вместе с известными концентрациями внутреннего стандарта в одной реакционной пробирке с последующим электрофоретическим разделением ПЦР-продуктов и их денситометрией. При втором происходит одновременная амплификация фрагмента гена MYCN и одного из референсных генов POLR2D (2q21) или NAG К (2р13.3). Количество копий гена MYCN рассчитывается по следующей формуле:

N=2-(CtMyc//-ctPr)x2.........................................................(1)

Где:

N - количество копий гена MYCN в диплоидном наборе хромосом клетки,

Ct MYCN- величина порогового цикла MYCN,

Ct РГ - величина порогового цикла референсного гена.

При амплификации гена MYCN величина количества копий, рассчитанная по формуле, превышает 10.

Обнаружение делеции 1р осуществлялось с помощью анализа вариабельного числа тандемных повторов в области короткого плеча хромосомы 1 (ПЦР VNTR). Для этого ДНК из ткани опухоли вносилась в 6 моноплексных ПЦР с использованием праймеров, специфичных к двум минисателлитным локусам (D1S76 и D1S80) и четырем микросателлитным локусам (D1S214, D1S436, D1S2663 и D1S2697). В качестве контроля проводилась ПЦР с использованием ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови или цитологически интактного костного мозга того же пациента. Продукты амплификации аллелей каждого локуса разделялись

электрофоретически.

Для проведения исследования количества копий MYCN методом FISH использовались наборы флуоресцентных зондов Vysis LSI N-MYC (2р24) SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probe (Abbott Molecular, США) и N-MYC Amplification LPS 009 (Cytocell, Великобритания). Для выявления делеции 1р применялся набор флуоресцентных зондов Vysis 1р36 Microdeletion Region Probe - LSI p58 (1р36) (SpectrumOrange)/TelVysion lp (SpectrumGreen)/LSI lq25 (SpectrumAqua).

Для анализа генетических аберраций в клетках нейробластомы методом MLPA использовались три панели зондов: SALSA Р251, включающая в себя 34 зонда для хромосом 1,3 и 11; SALSA Р252 (33 зонда для хромосом 2 и 17); SALSA Р253 (33 зонда для хромосом 4, 7, 9, 12 и 14) (MRC-Holland, Нидерланды). Анализируемые регионы были выбраны для детекции аберраций, являющихся доказанными (амплификация MYCN, делеции 1р и llq, увеличение материала 17q), или потенциальными (делеции Зр, 4р, увеличение материала 1р, 2р) факторами прогноза при нейробластоме. Каждая панель содержит 10 контрольных зондов, специфичных для регионов, в которых редко возникают делеции и амплификации при нейробластоме

и

(регионы 5р, 6р, 15q, 16p, 16q, 19q, 20q, 21q). Интерпретация результатов MLPA основана на расчете величины соотношения (ВС) количества ПЦР-продукта, соответствующего каждому зонду, в исследуемом образце к нормализованному количеству ПЦР-продукта аналогичного зонда в референсных образцах. При отсутствии аберраций, связанных с изменением числа копий анализируемого региона значение ВС составляет от 0,75 до 1,25. В случае гетерозиготной делеции происходит снижение ВС как минимум для двух смежных зондов до значений 0,5-0,75. При гомозиготной делеции сигнал от зондов исследуемого региона отсутствует. Увеличение ВС сигналов от более чем двух смежных зондов до значений 1,25-3,0 расценивается как увеличение генетического материала анализируемого региона, а при выявлении значения более 3,0 делается вывод о наличии амплификации.

Для выявления поражения КМ и оценки МОБ была сформирована панель, состоящая из маркеров РНОХ2В, ТН, ELAVL4 и GD2. Экспрессия генов была исследована в 331 образце КМ, полученном от 57 пациентов с верифицированным диагнозом нейробластомы. Все пациенты получали терапию по протоколу NB2004 в период с 2005 по 2010 годы. Распределение пациентов по стадиям заболевания было следующим: I стадия - 17 (29,8%) пациентов, II стадия - 4 (7,0%), П1 стадия - 13 (22,8%), IV стадия - 18 (31,6%), стадия IVS - 5 (8,8%). 116 образцов было взято на момент первичной диагностики, 181 образец - в ходе терапии, 34 - при диагностике рецидива. Для выявления экспрессии исследуемых генов клетками нормального КМ были исследованы 26 образцов от 21 пациента без злокачественных опухолей. В качестве позитивного контроля были использованы клеточные линии нейробластомы IMR-32 и Kelly. Общая РНК, выделенная из образцов подвергалась качественной и количественной оценке с помощью микроструйных чипов (Caliper Technologies, США). В дальнейшую работу брались образцы, в которых показатель целостности РНК превышал 4,2. Экспрессия каждого гена определялась с помощью мультиплексной ПЦР-РВ, в качестве референсного гена использовался ABL. Нормализованная величина экспрессии рассчитывалась как разность пороговых циклов гена ABL и гена-маркера (ACt = CtjM-CtMapKepa). Образцы КМ больных нейробластомой расценивались как позитивные в случае, если в них определялась экспрессия гена РНОХ2В и/или выявлялись опухолевые клетки в цитологических препаратах.

С целью оценки специфичности для клеток нейробластомы генов, отобранных в качестве потенциальных маркеров поражения КМ, была проанализирована их экспрессия в 75 образцах КМ 18 пациентов с другими негемопоэтическими солидными опухолями: злокачественная депигментированная меланома, ретинобластома, альвеолярная и эмбриональная рабдомиосаркома, злокачественная феохромоцитома, эпендимома, саркома Юинга и примитивная нейроэктодермальная опухоль.

Для оценки качественного соответствия результатов определения поражения КМ с помощью выявления экспрессии опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии были проанализированы 326 образцов КМ 52

больных. 108 из них были получены на момент первичной диагностики опухоли, 168 - в процессе лечения и 51 при диагностике рецидива. В образцах КМ оценивалось наличие экспрессии генов РНОХ2В и/или ТН с помощью ПЦР-РВ, а также наличие опухолевых клеток методом проточной цитометрии. Иммунофенотип клеток нейробластомы соответствовал CD45-

CD56+CD84+aGD2+.

В качестве молекулярного маркера поражения КМ, основанного на анализе геномной ДНК, была выбрана метилированная форма гена RASSFla. Исследование было осуществлено в 217 образцах КМ 42 больных нейробластомой. У 7,1% (3 пациента) была вьивлена I стадия заболевания, у 26,2% (11) - III стадия, у 50,0% (21) - IV стадия, у 16,7% (7) - стадия IVS. 101 образец КМ был получены при первичной диагностике нейробластомы, 91 - в ходе терапии, 25 - при диагностике рецидива или прогрессии опухоли. В качестве негативного контроля использовались 5 образцов КМ от 5 пациентов без злокачественных опухолей, в качестве позитивного контроля - образцы клеточных линий нейробластомы IMR-32, Kelly и SH-SY5Y. ДНК, выделенная из образцов, подвергалась бисульфитной конверсии с помощью набора EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Германия) и использовалась в ПЦР-РВ для выявления метилированной и неметилированной форм гена RASSFla.

Оценка прогностической значимости выявленных генетических аберраций в ткани опухоли и поражения КМ с помощью молекулярных маркеров основывалась на анализе показателей 5-летней бессобытийной (БСВ) и общей выживаемости (ОВ) пациентов. Прогностическое значение аберраций хромосом 1, 2, 3, 11, 17 исследовалось на основании данных о долгосрочном наблюдении за 108 пациентами, хромосом 4, 7, 9, 12 и 14 - на основании анализа выживаемости 100 больных.

Для определения прогностической значимости поражения КМ и МОБ, выявленных с помощью молекулярных маркеров оценивалось наличие в нем экспрессии генов РНОХ2В, ТН или метилированной формы гена RASSFla. Молекулярные маркеры анализировались в КМ при первичной диагностике нейробластомы, после 2 и 4 блока индукционной химиотерапии, после завершения индукционной химиотерапии и перед аферезом АГСК. В исследование влияния на показатели выживаемости наличия экспрессии генов РНОХ2В и ТН в КМ при первичной диагностике вошли 75 пациентов, в ходе индукционной терапии - 20, после окончания индукционной химиотерапии - 18, перед проведением афереза АГСК - 17. Прогностическое значение выявления метилированной формы гена RASSFla в КМ при первичной диагностике анализировалось на основании данных выживаемости 40 пациентов.

Для статистической обработки результатов применяли программы «Statistica 8.0», «Analyse-it» и «BioStat». Для сравнения количественных параметров в группах применялись критерии Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса. Для сравнения качественных параметров использовался критерий % с поправкой Йетса. Анализ ОВ и БСВ пациентов проводился с помощью LogRank теста. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.

Значимость определения экспрессии исследуемых генов для выявления поражения КМ была проанализирована методом характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROC-кривых). Площади под кривыми сравнивали по методу E.R. DeLong et al. Также определяли пороговые уровни (ПУ) показателей, характеризующиеся наибольшей диагностической эффективностью при разделении образцов, содержащих и не содержащих опухолевые клетки. С учетом ПУ для каждого теста рассчитывали диагностическую чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результатов, а также общую диагностическую эффективность теста.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование генетических аберраций, ассоциированных с изменением количества копий генов или хромосомных регионов

При исследовании аберраций короткого плеча хромосомы 2 (включая изменение количества копий гена MYCN) методами ПЦР и MLPA в клеточных линиях IMR-32 и Kelly была выявлена амплификация гена MYCN, тогда как в клетках SH-SY5Y и образцах лейкоцитов периферической крови здоровых доноров было обнаружено нормальное количество копий MYCN равное 2.

Амплификация гена MYCN была выявлена у 21 (17,2%) из 122 пациентов. Количество копий гена, определенное с помощью ПЦР-РВ находилось в диапазоне от 10 до 216 (медиана 46). Метод MLPA позволил выявить амплификацию MYCN самостоятельно (9 пациентов) или совместно с генами NAG, DDX1 или ALK (12 пациентов), а также два типа увеличения генетического материала 2р, не достигающего порога амплификации. При первом типе (13 пациентов) происходит увеличение числа копий крупного региона 2р от локуса 2р23.2 до теломерной области, при втором типе (15 пациентов) — только региона 2р24, включающего ген MYCN. При определении количества копий гена MYCN методом FISH, амплификация была выявлена у 6 из 22 обследованных пациентов. При этом у данных больных аберрация была выявлена как с помощью ПЦР-РВ, так и с помощью MLPA.

Наибольшее количество пациентов с амплификацией гена AiYCN и увеличением генетического материала 2р было отмечено среди больных с IV стадией заболевания, при этом амплификация гена MYCN выявлялась только у пациентов с морфологическим диагнозом нейробластома, преимущественно старше 12 месяцев.

Медиана времени наблюдения за больными составила 42 месяца (диапазон от 1 месяца до 13 лет). БСВ и OB в группе пациентов с амплификацией MYCN были достоверно ниже, чем у пациентов с нормальным количеством копий гена MYCN {0,20±0,11; 0,27±0,12 и 0,69±0,06; 0,77±0,06 соответственно, р<0,001). Выживаемость пациентов, имеющих амплификацию только гена MYCN, и коамплнфикацию MYCN с одним или несколькими генами региона 2р24 достоверно не отличалась.

Увеличение материала 2р первого типа значимо влияет на OB у пациентов со стадиями заболевания НИ и IVS (0,53±0,25 и 0,92+0,05, р=0,026) а увеличение материала 2р второго типа снижает БСВ у больных

младше 1 года (0,53±0,25 и 0,96±0,04, р=0,047).

Выявление делеции короткого плеча хромосомы 1 методом MLPA основано на обнаружении уменьшения ВС зондов, специфичных к регионам 1р35-1р36. Делеция 1р была обнаружена в образцах клеточных линий IMR-32 и Kelly, а также у 28 из 122 обследованных пациентов (23,0%) и только в одном случае (0,8%) являлась интерстициальной. С целью изучения возможности использования ДНК, выделенной из ткани, фиксированной в формалине и залитой в парафиновый блок, для последующего исследования методом MLPA, были проанализированы 20 образцов с использованием набора зондов SALSA Р251 (включающего зонды к локусам хромосомы 1). В силу высокой степени фрагментации выделенной ДНК, 7 образцов оказались непригодными для проведения анализа, в 3 из 13 проанализированных образцов была выявлена терминальная делеция 1р.

Делеция 1р была обнаружена у 9 из 73 (12,3%) больных, которым исследование проводилось с помощью ПЦР анализа вариабельности тандемных повторов. Метод FISH позволил обнаружить делецию 1р у трех из 22 пациентов, при этом соответствие данных ПЦР и MLPA составило 95,8%, MLPA и FISH - 95,5%, ПЦР и FISH - 90,9%. Решение в пользу наличия у пациента делеции 1р принималось в том случае, если она была обнаружена хотя бы одним из трех методов. Таким образом, из 135 обследованных пациентов делеция была выявлена у 33 (24,4%), большинство из которых имели IV стадию нейробластомы и были старше 12 месяцев.

БСВ и OB в группе пациентов с наличием делеции 1р были ниже, чем у пациентов без делеции (0,33±0,10; 0,46±0,10 и 0,67±0,06; 0,73±0,06 соответственно, р=0,002, р=0,003). Присутствие аберрации сохраняет прогностическое значение у пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS (0,53±0,15; 0,64±0,13 и 0,81±0,06; 0,87±0,05 соответственно, р=0,039, р=0,028) и без амплификации гена MYCN (0,40±0,14; 0,55±0,14 и 0,71±0,0б; 0,78±0,06 соответственно, р=0,029, р=0,039).

Для выявления делеции короткого плеча хромосомы 3 методом MLPA используются зонды, специфичные к регионам 3р12-3р25, при этом патогенетическое значение имеют аберрации региона Зр21. Делеция Зр была выявлена у 30 из 108 обследованных больных (27,8%). В клеточных линиях IMR-32, Kelly и SH-SY5Y аберраций хромосомы 3 выявлено не было. При анализе распределения частоты встречаемости делеции Зр не было отмечено связи с клиническими (стадия, гистологический вариант, возраст) и молекулярно-биологическими факторами риска нейробластомы (амплификация гена MYCN, делеции 1р и 1 lq).

Анализ показателей БСВ и OB не вьивил прогностической значимости исследуемой аберрации в общей когорте пациентов. БСВ при наличии делеции Зр в группе больных старше 3 лет была снижена по сравнению с пациентами, не имеющими данной аномалии: 0,25±0,13 и 0,71±0,11, р=0,034,

что соотносится с характеристикой аберрации как позднего события в молекулярном патогенезе нейробластомы у пациентов старшей возрастной группы.

При исследовании генетических аберраций хромосомы 4 методом МЬРА были выявлены делеция короткого плеча у 6 пациентов (6,0%), увеличение генетического материала короткого плеча у 8 пациентов (8,0%) и делеция длинного плеча у 2 больных (2,0%). Аберрации короткого плеча хромосомы 4 (делеция и увеличение генетического материала) одинаково часто встречались при всех стадиях заболевания, а также в группах пациентов младше и старше 12 месяцев. Обе аномалии отмечались только в ткани опухоли, верифицированной как нейробластома, а увеличение генетического материала 4р чаще сочеталось с делецией длинного плеча хромосомы 11. Увеличение генетического материала 4р было связано с заметным снижением показателей БСВ и ОВ, хотя в общей группе пациентов различия не достигли статистической значимости. Влияние увеличения материала 4р на БСВ приближалось к уровню достоверности в группе пациентов младше 1 года и приводило к драматичному снижению выживаемости: 0,00 и 0,88±0,0б (р=0,055),

Анализ аберраций хромосомы 7 с помощью МЬРА выявил увеличение генетического материала длинного плеча у 18 (18,0%), увеличение материала длинного и короткого плеч у 6 (6,0%), делению длинного плеча у 1 (1,0%) из 100 обследованных пациентов. Аберрации хромосомы 7 одинаково часто встречались при различных стадиях заболевания и несколько чаще при нейробластоме по сравнению с другими гистологическими вариантами опухоли (91,7%). Увеличение генетического материала 1с\ достоверно чаще выявлялось у пациентов младше 12 месяцев (12 из 18), тогда как увеличения материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 у таких пациентов отмечено не было. Обнаружена ассоциация увеличения материала 1<\ с делецией длинного плеча хромосомы 11.

Увеличение генетического материала 1<\ не оказывало значимого влияния на выживаемость пациентов. Напротив, увеличение генетического материала длинного и короткого плеч хромосомы 7 снижало показатель БСВ по сравнению с теми больными, у которых данная аномалия отсутствовала 0,33±0,19 и 0,56±0,06, соответственно, р=0,053. Прогностическое значение данной аберрации сохранялось в группе пациентов без амплификации гена МУСИ: БСВ 0,40+0,22 и 0,64±0,06, р=0,044.

Метод МЬРА позволил выявить два типа генетических нарушений короткого плеча хромосомы 9: делецию у 8 из 100 обследованных пациентов (8,0%) и увеличение генетического материала у 9 больных (9,0%). В случае делеции было отмечено снижение ВС зондов, локализующихся в локусах 9р21-9р23, затрагивающее ген-супрессор опухолевого роста СОКЫ2А/р16. Делеция и увеличение материала короткого плеча хромосомы 9 были выявлены с одинаковой частотой при всех стадиях нейробластомы, и их встречаемость не зависела от возраста пациентов. Обе аберрации не были обнаружены в образцах ганглионевромы и ганглионейробластомы. Также не

было отмечено ассоциации делеции и увеличения материала 9р ни с одним молекулярно-генетическим прогностическим фактором, используемым для стратификации пациентов.

В исследуемой группе пациентов делеция короткого плеча хромосомы 9 показала крайне негативное прогностическое значение в отношении как БСВ, так и OB пациентов. Оба показателя в группе пациентов с делецией 9р составили 0,00, тогда как у больных без аберраций хромосомы 9 они достигли 0,60±0,06 и 0,68±0,06, соответственно, р=0,035 и р=0,014. Делеция 9р сохраняла свое прогностическое значение в группах пациентов с локализованной нейробластомой (стадии I-III) и без амплификации гена MYCN.

Увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 9 не приводило к изменению показателей выживаемости в общей группе пациентов. Однако наличие данной аберрации оказывало значимое влияние на БСВ в наиболее благоприятной группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS без амплификации гена MYCN: 0,48±0,23 и

0,88±0,05 при отсутствии аберраций 9р (р=0,039).

Метод MLP А позволил выявить три типа аберраций хромосомы 11: интерстициальную (внутрихромосомную) делецию длинного плеча у 16 из 108 пациентов (14,8%), терминальную делецию длинного плеча у 9 (8,3%) больных, а также потерю всей хромосомы 11 у 5 пациентов (4,6%). В первом случае было отмечено снижение ВС зондов, локализующихся в регионах Ilq22.1-llq23.3, однако участок делеции не затрагивал ген MLL. Во втором случае фрагмент длинного плеча хромосомы 11, подвергшийся делеции, находился в регионе llq23.3-qter и включал ген MLL. В исследованных клеточных линиях IMR-32 и SH-SY5Y аберраций хромосомы 11 выявлено не было, в клетках Kelly определялась интерстициальная делеция 1 lq.

Интерстициальная делеция 1 lq и потеря хромосомы 11 встречались при различных стадиях нейробластомы, тогда как терминальная делеция - только при стадиях III и IV. Оба типа делеции llq отмечались преимущественно в образцах опухоли, классифицированной как нейробластома. Не было показано связи аберраций хромосомы 11 с возрастом пациентов и обратной ассоциации с амплификацией гена MYCN и делецией 1р.

При анализе выживаемости пациентов была выявлена тенденция к снижению показателей БСВ и OB в группе пациентов с интерстициальной делецией llq, однако, уровня статистической значимости различия не достигли (0,28±0,14; 0,29±0,16 и 0,60±0,06; 0,68±0,06, р=0,164, р=0,133, соответственно). Присутствие терминальной делеции llq не оказывало влияния на показатели БСВ и OB, которые достигли 0,78+0,14 и 0,86+0,13.

При исследовании хромосомы 12 методом MLPA были выявлены два типа генетических нарушений: увеличение генетического материала длинного плеча (увеличение количества копий гена MDM2) у 20 пациентов (20,0%) и увеличение материала короткого плеча у 16 (16,0%) из 100 больных.

Не было обнаружено связи аберраций хромосомы 12 со стадией заболевания, возрастом пациентов и гистологическим типом опухоли, хотя в образцах, морфологически охарактеризованных как нейробластома, аберрации встречались несколько чаще. Также не было отмечено связи аномалий с амплификацией гена MYCN и делецией 1р, однако обе аберрации достоверно чаще выявлялись в опухолях, имеющих делецию 1 lq.

Увеличение генетического материала 12q (увеличение количества копий гена MDM2) не показало прогностической значимости. При анализе влияния увеличения генетического материала 12р (увеличение количества копий гена-супрессора опухолевого роста CDKN1B) на выживаемость была выявлена тенденция к увеличению OB пациентов с данной аберрацией: 0,92±0,08 и 0,63±0,06 при отсутствии аномалий хромосомы 12, р=0,089.

Анализ аберраций хромосомы 14 методом MLPA позволил выявить делецию длинного плеча у 9 из 100 пациентов (9,0%), которая являлась терминальной и затрагивала ген-супрессор опухолевого роста МОАР1. Увеличение генетического материала 14q было выявлено у 5 больных (5,0%). Делеция 14q чаще выявлялась у пациентов младше 12 месяцев с локализованной нейробластомой. Увеличение материала 14q, напротив, отмечено у больных старше 12 месяцев с различными стадиями заболевания. Обе аберрации были выявлены в образцах опухоли, морфологически интерпретированных как нейробластома. Не было показано взаимосвязи делеции и увеличения материала 14q ни с одним из молекулярно-генетических факторов риска, однако в опухолях с амплификацией гена MYCN делеция 14q не была обнаружена ни в одном случае.

Наличие делеции или увеличения генетического материала 14q не оказывало влияния на выживаемость пациентов с нейробластомой. В то же время была отмечена тенденция к снижению OB в наиболее благоприятной группе пациентов со стадиями нейробластомы I-III и IVS без амплификации гена MYCN при наличии делеции 14q: 0,63±0,21, при отсутствии аберраций хромосомы 14 OB составила 0,93±0,04 (р=0,083).

Увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17 является наиболее частой аберрацией при нейробластоме. Из 108 пациентов, которым проводилось исследование аберраций хромосомы 17 методом MLP А, увеличение материала 17q было выявлено у 54 (50,0%). У пяти пациентов (4,6%) была обнаружена трисомия 17, у одного (0,9%) - моносомия 17. В образцах исследованных клеточных линий нейробластомы IMR-32, Kelly и SH-SY5Y было обнаружено увеличение генетического материала регионов 17q21-17q25.

Увеличение генетического материала 17q выявлялось при всех стадиях нейробластомы, тогда как трисомия 17 - только в случаях локализованной опухоли или при стадии IVS. Обе аберрации не были обнаружены в образцах ганглионевромы. Связи частоты выявления аномалий хромосомы 17 с возрастом пациентов, наличием амплификации гена MYCN и делеции 1р зафиксировано не было, однако в половине случаев опухоли с увеличением генетического материала 17q была выявлена делеция 1 lq.

При анализе влияния аберраций хромосомы 17 на показатели выживаемости пациентов было выявлено негативное прогностическое значение увеличения генетического материала 17q. БСВ в этом случае составила 0,42±0,08, OB - 0,48+0,09, а при отсутствии аберраций хромосомы 17 показатели достигли 0,71±0,07 и 0,8010,06, соответственно (р<0,001 и р=0,002). Влияние увеличения генетического материала 17q на прогноз нейробластомы сохраняется среди пациентов со стадиями опухоли 1-1П и IVS (0,57±0,15; 0,57±0,15 и 0,85±0,06; 0,94±0,04 соответственно, р=0,041, р=0,008) и в группе больных без амплификации гена MYCN (0,47±0,10; 0,57±0,10 и 0,77±0,07; 0,84±0,06 соответственно, р=0,002, р=0,006). Трисомия 17 не оказывала влияния на показатели выживаемости пациентов.

Пятерым пациентам, у которых произошел рецидив или прогрессия заболевания, было проведено сравнительное молекулярно-генетическое исследование ткани первичной опухоли и ткани опухоли при прогрессии (3 пациента) или рецидиве (2 пациента). Были использованы методы MLP А, ПЦР-РВ и ПЦР VNTR. В парах первичная опухоль-рецидив (прогрессия) были выявлены неидентичные результаты определения аберраций всех анализируемых хромосом (1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12, 14, 17). В одном случае в ткани первичной опухоли наблюдались множественные количественные аномалии хромосом, которые в ткани рецидивной опухоли выявлены не были. Во втором случае ткань опухоли после прогрессии характеризовалась меньшим количеством генетических аберраций по сравнению с образцом первичной опухоли. Это, возможно, определило благоприятный исход заболевания. У трех пациентов соотношение генетических аномалий в первичной опухоли и после развития рецидива (прогрессии) было приблизительно одинаковым, из них у одного больного не бьшо выявлено аберраций в исследуемых локусах как на момент первичной диагностики, так и после прогрессии. Во всех 5 случаях при определении количества копий гена MYCN и делеции 1р методы MLP А и ПЦР подтверждали друг друга.

Исследование молекулярно-генетических маркеров для выявления инициального поражения костного мозга и оценки минимальной остаточной болезни

Экспрессия генов РНОХ2В, ТН, GD2 и ELAVL4 была выявлена во всех образцах исследованных клеточных линий нейробластомы. При анализе серийных разведений РЖ нейробластомы в РНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров аналитическая чувствительность определения всех исследованных маркеров достигала 1><10 . Ни в одном из 26 образцов КМ пациентов без онкологических заболеваний экспрессия РНОХ2В и ТН не была выявлена. Матричная РНК ELA VL4 была обнаружена в 20 (76,9%), a GD2 - в 15 (57,7%) из 26 образцов.

Среди исследованного 331 образца КМ больных нейробластомой было выявлено 107 (32,3%) образцов, удовлетворяющих критериям позитивности (обнаружение опухолевых клеток в цитологических препаратах КМ или наличие экспрессии гена РНОХ2В). Из них 31 был получен на момент

первичной диагностики, 59 - во время терапии и 17 — при диагностике рецидива. Количество образцов, экспрессирующих исследуемые маркеры, представлено в таблице 1.

Таблица 1

Общее количество образцов КМ, где была выявлена экспрессия исследуемых маркеров

РНОХ2В ТН ELAVL4 GD2

Позитивные образцы 105/107 96/107 107/107 107/107

Негативные образцы 0/224 5/224 209/224 197/224

Контрольная группа 0/26 0/26 20/26 15/26

Р < 0,001 < 0,001 0,717 0,288

Таким образом, экспрессия генов РНОХ2В и ТН в позитивных образцах определялась достоверно чаще, чем в негативных и контрольных, тогда как частота обнаружения экспрессии ELAVL4 и GD2 в позитивных, негативных и контрольных образцах достоверно не отличалась. Количественно сравнивали образцы, в которых определялась экспрессия исследуемых маркеров. Было выявлено, что экспрессия ТН в позитивных образцах была выше, чем в негативных (р=0,002), а экспрессия ELAVL4 и GD2 в позитивных образцах была выше экспрессии этих маркеров как в негативных, так и в контрольных образцах (р<0,001 и р<0,001 для ELAVL4 и GD2, соответственно).

Так как мРНК части исследуемых маркеров была выявлена в негативных образцах и образцах пациентов контрольной группы, для определения порогового значения величины экспрессии генов ТН, GD2 и ELAVL4 был проведен ROC-анализ. Выявлено, что все исследованные маркеры обладают статистически значимой диагностической ценностью при разделении позитивных и негативных образцов (во всех случаях р<0,001), при этом ROC-кривые всех анализируемых маркеров достоверно различаются между собой. На основании анализа ROC-кривых были определены ПУ экспрессии, которые для ТН, ELAVL4, GD2 составили -16,535; -7,130; -8,495, соответственно. Учитывая пороговые значения экспрессии, были рассчитаны критерии диагностической значимости данных тестов, представленные в таблице 2. Кроме того, был дополнительно проанализирован вариант оценки поражения КМ, при котором позитивными признавались образцы с наличием экспрессии РНОХ2В и/или ТН, превосходящей пороговый уровень.

Таблица 2

Критерии оценки диагностической информативности определения экспрессии генов-маркеров для выявления поражения КМ при нейробластоме

Ген-маркер ПЦПР ПЦОР ДЧ Сп ДЭТ

РНОХ2В 1,000 0,991 0,981 1,000 0,994

ТН 0,950 0,952 0,897 0,978 0,952

ELAVL4 0,829 0,827 0,589 0,942 0,828

GD2 0,714 0,782 0,467 0,911 0,767

РНОХ2В и/или ТН 0,955 1,000 1,000 0,978 0,985

ПЦПР - прогностическая ценность положительного результата, ПЦОР - прогностическая ценность отрицательного результата, ДЧ - диагностическая чувствительность, Сп -специфичность, ДЭТ - диагностическая эффективность теста

Среди 75 проанализированных образцов КМ больных различными солидными опухолями экспрессия гена РНОХ2В была выявлена только в одном образце КМ пациента с меланомой. Ген ТН был экспрессирован в 1 из 3 образцов при меланоме, во всех трех образцах при злокачественной феохромоцитоме, в 1 из 33 образцов при саркоме Юинга/ПНЭО, а также в 12 из 26 образцов при альвеолярной рабдомиосаркоме. Наличие экспрессии генов РНОХ2В и ТН в клетках меланомы объясняется общим с нейробластомой гистогенезом опухоли из производных нервного гребня [N.K. Cheung, 2001]. Выявление высокой экспрессии гена ТН в клетках злокачественной феохромоцитомы связано с его участием в продукции катехоламинов. Экспрессия гена ELAVL4, превосходящая ПУ, была обнаружена в образцах КМ больных меланомой, саркомой Юинга/ПНЭО и альвеолярной рабдомиосаркомой, GD2 - также при ретинобластоме. Полученные результаты свидетельствуют о наибольшей специфичности гена РНОХ2В для клеток нейробластомы.

При оценке диагностической эффективности молекулярных маркеров поражения КМ было выявлено, что определение экспрессии генов РНОХ2В и ТН обладает наиболее высокими показателями. Соответственно, выявляемая экспрессия гена РНОХ2В и/или экспрессия ТН выше ПУ были приняты в качестве критериев наличия поражения КМ на момент первичной диагностики нейробластомы, а также персистенции опухолевых клеток в ходе и после индукционной химиотерапии (наличия МОБ). Из 75 пациентов, включенных в исследование прогностической значимости поражения КМ, у 24 (32,0%) на момент первичной диагностики опухоли была зафиксирована экспрессия генов РНОХ2В и/или ТН. Из них в одном случае была выявлена экспрессия только РНОХ2В, тогда как в остальных присутствовали оба гена. У 23 пациентов морфологическим вариантом опухоли являлась нейробластома, у 1 - ганглионейробластома. 12 больных были младше 1 года. Распределение по стадиям было следующим: стадия I - 2 пациента, стадия III - 3, стадия IV - 15, стадия IVS - 4 больных.

Наличие инициального поражения КМ, выявленное на основании экспрессии генов РНОХ2В и ТН, показало прогностическую значимость в отношении БСВ и ОВ пациентов: 0,49+0,12; 0,57±0,12, при отсутствии экспрессии - 0,75±0,07 и 0,80±0,07, соответственно, р=0,014 и р=0,029. Негативное прогностическое значение выявления экспрессии генов РНОХ2В и ТН в КМ при первичной диагностике нейробластомы сохраняется в группах пациентов с нормальным количеством копий гена МУСЫ (0,50±0,14; 0,62±0,14 и 0,83±0,07; 0,89±0,06, соответственно, р=0,011, р=0,027) и младше 12 месяцев (0,58±0,17; 0,66±0,17 и 0,93±0,07; 0,93±0,07, соответственно, р=0,014, р=0,069).

Из 24 пациентов, у которых на момент первичной диагностики нейробластомы в КМ была выявлена экспрессия генов РНОХ2В и/или ТН, у 13 сохранялась экспрессия данных генов в процессе лечения (после 2,4 или 6 блока химиотерапии), а у 6 - после окончания индукционной терапии (после 6 блока). При этом не было показано влияния наличия экспрессии генов РНОХ2В и ТН в КМ в ходе и после окончания индукционной химиотерапии на БСВ и ОВ пациентов. Экспрессия генов РНОХ2В и ТН исследовалась в 18 образцах АГСК для оценки возможности выявления их контаминации опухолевыми клетками. При этом экспрессия не была выявлена ни в одном случае, в том числе при наличии экспрессии РНОХ2В и ТН в КМ перед проведением процедуры лейкафереза (3 пациента) и при отсутствии СЭ34+ селекции (4 пациента). Вместе с этим, выявление экспрессии РНОХ2В и ТН в КМ перед проведением лейкафереза показало негативное прогностическое значение в отношении как БСВ, так и ОВ, которые в этом случае составляли 0,00. При отсутствии экспрессии показатели БСВ и ОВ достигли 0,59±0,14 и 0,75±0,13, соответственно, р=0,021 и р=0,016. Данный факт позволяет выбрать наиболее оптимальное время для заготовки АГСК, стремясь к достижению молекулярной ремиссии.

Факт наличия поражения КМ с помощью проточной цитометрии устанавливался при выявлении клеток с одновременной экспрессией маркеров С056, СБ81 и в02 и отсутствием экспрессии СБ45, при этом аналитическая чувствительность метода находилась в диапазоне от 1x10"3 до 1x10"5. В 193 (59,2%) из 326 образцов КМ, проанализированных с помощью ПЦР и проточной цитометрии, поражение не было выявлено ни одним методом, 38 (11,7%) образцов были негативны по результатам проточной цитометрии, но в них выявлялась экспрессия генов РНОХ2В и/или ТН. В 31 образце (9,5%), напротив, опухолевые клетки были выявлены с помощью проточной цитометрии, а экспрессия генов РНОХ2В и ТН отсутствовала. В 64 образцах (19,6%) наличие поражения КМ было зафиксировано обоими методами. Таким образом, общее соответствие результатов ПЦР-РВ и проточной цитометрии достигло 78,8%. Оно не зависело от распространенности опухолевого процесса (р=0,981), времени получения образцов КМ (р=0,490) и чувствительности проточной цитометрии (р=0,292).

Метилированная форма гена RASSFla была выявлена в образцах клеточных линий нейробластомы IMR-32, Kelly и SH-SY5Y, в то время как неметилированная отсутствовала. В образцах КМ пациентов без злокачественных новообразований, напротив, определялся только неметилированный ген RASSFla. Среди исследованных 217 образцов КМ больных нейробластомой было выявлено 69, в которых определялись как метилированная, так и неметилированная формы гена RASSFla, они были расценены как позитивные. Из них 27 были получены на момент первичной диагностики нейробластомы, 22 - во время терапии и 20 - при диагностике рецидива. В 148 негативных образцах КМ был обнаружен только неметилированный ген RASSFla. Метилированная форма гена RASSFla преимущественно выявлялась в КМ пациентов с IV стадией нейробластомы: у 12 из 21 больного, однако она была выявлена у 1 пациента со стадией I и у 4 со стадией III. При этом метилированный ген не был обнаружен в КМ ни у одного из 7 больных со стадией нейробластомы IVS, в том числе в 3 случаях, когда опухолевые клетки были выявлены с помощью цитологического исследования. Обнаружено негативное прогностическое значение наличия метилированного гена RASSFla в КМ при первичной диагностике нейробластомы. В этом случае БСВ пациентов составила 0,28±0,13, при отсутствии метилированной формы RASSFla в КМ - 0,67±0,11, р=0,023. Выявление метилированного гена RASSFla в КМ во время лечения не приводило к снижению показателей БСВ и OB по сравнению с его отсутствием: 0,19±0,17 и 0,49±0,23; 0,40±0,22 и 0,80±0,18, соответственно, р=0,205 и р=0,362. Качественное соответствие результатов выявления поражения КМ с помощью определения метилированной формы гена RASSFla и анализа экспрессии опухоль-ассоциированных генов составило 78,8%, а исследования гена RASSFla и проточной цитометрии - 73,2%

ВЫВОДЫ

1. Сопоставление результатов обнаружения амплификации гена MYCN и делеции 1р методами MLP А, FISH и ПЦР продемонстрировало высокую степень качественного соответствия (95,5% при выявлении делеции 1р и 100% при обнаружении амплификации гена MYCN). При этом ДНК, выделенная из гистологических препаратов, подходит для определения генетических аберраций методом ПЦР, тогда как для MLPA она не пригодна.

2. Амплификация гена MYCN, делеции короткого плеча хромосомы 1, короткого плеча хромосомы 9 и увеличение генетического материала длинного плеча хромосомы 17 приводят к достоверному снижению показателей БСВ и OB в общей группе больных нейробластомой. Коамплификация гена MYCN с генами NAG, DDX1 или ALK не показала прогностического значения по сравнению с амплификацией только гена MYCN.

3. У пациентов без клинических факторов риска нейробластомы и амплификации гена MYCN делеции короткого плеча хромосомы 1, короткого

плеча хромосомы 9, увеличение генетического материала короткого плеча хромосомы 2, короткого плеча хромосомы 4, длинного плеча хромосомы 17, а также трисомия 7 показали негативное прогностическое значение.

4. Экспрессия генов РНОХ2В и/или ТН в КМ является наиболее чувствительным и специфичным тестом для выявления поражения КМ клетками нейробластомы и оценки МОБ (ДЭТ 0,994 и 0,952, соответственно). Исследование экспрессии генов GD2 и ELAVL4 для оценки поражения КМ обладает меньшей диагностической ценностью (ДЭТ 0,828 и 0,767, соответственно).

5. Обнаружение экспрессии генов РНОХ2В и/или ТН в КМ при первичной диагностике нейробластомы ассоциировано с достоверным снижением показателей БСВ и OB пациентов на 26 и 23%, соответственно. Наличие экспрессии данных генов в КМ перед проведением афереза АГСК связано с увеличением частоты постгрансплантационных рецидивов опухоли на 59%, несмотря на отсутствие экспрессии в аутотрансплантатах.

6. Выявление метилированной формы гена RASSFla в ДНК, выделенной из КМ при первичной диагностике нейробластомы, ассоциировано с достоверно более низкими значениями БСВ (на 39%) в общей группе пациентов.

7. Качественное соответствие результатов определения поражения КМ с помощью анализа опухоль-ассоциированных генов и проточной цитометрии составляет 78,8%. Соответствие результатов выявления метилированной формы гена RASSFla с обнаружением экспрессии генов РНОХ2В/ТН достигает 78,8%, а с проточной цитометрией - 73,2%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У пациентов с нейробластомой целесообразно сочетание методов MLP А, FISH и ПЦР для корректного выявления аберраций, ассоциированных с изменением числа копий генов или хромосомных регионов в опухолевых клетках.

2. Для определения степени риска у пациентов с нейробластомой рекомендуется выявление амплификации гена MYCN, делеций 1 р, 9р, а также увеличения генетического материала 17q.

3. При отсутствии клинических факторов риска нейробластомы и амплификации гена MYCN для оценки прогноза важно определение увеличения генетического материала 2р, 4р, а также трисомии 7.

4. Для наиболее точного выявления поражения КМ и оценки МОБ рекомендуется сочетанное применение молекулярных маркеров РНОХ2В, ТН и RASSFla.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы в области изучения молекулярно-генетических прогностических маркеров нейробластомы заключаются в валидации выявленных факторов риска в рамках крупных многоцентровых

исследований с возможным последующим их включением в схемы стратификации больных с целью улучшения результатов терапии. Исследование генетических аномалий, связанных с агрессивным течением опухоли, является перспективным с точки зрения изучения молекулярных основ канцерогенеза.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цаур, Г. А. Возможность использования микроструйных биочипов для оценки качества и количества РНК у пациентов с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями / Г.А. Цаур, А.Е. Друй, А.М. Попов {и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №4. - С. 107-111.

2. Друй, А.Е. Исследование возможности определения экспрессии генов ТН, ELAVL4 и GD2 для оценки поражения костного мозга у пациентов с нейробластомой / А.Е. Друй, Г.А. Цаур, А.М. Попов [и др.] // Вопросы онкологии. - 2012. - №4. - С. 514-520.

3. Друй, А.Е. Амплификации гена MYCN при нейробластоме. Методы выявления и прогностическое значение / А.Е. Друй, Г.А. Цаур, Е.Р. Семенихина [и др.] // Медицинская генетика. - 2012. - №9. - С. 25-30.

4. Друй, А.Е. Прогностическое значение амплификации гена MYCN, делеции короткого плеча хромосомы 1 и делеции длинного плеча хромосомы 11 у пациентов с нейробластомой / А.Е. Друй, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков [и др.] // Педиатр. -2013. - №1. - С. 41-48.

5. Друй, А.Е. Методы выявления и прогностическое значение увеличения генетического материала короткого плеча хромосомы 2 и делеции короткого плеча хромосомы 1 у больных нейробластомой / А.Е. Друй, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков [и др.] // Вопросы онкологии. - 2013. - №5. - С. 591-598.

6. Друй, А.Е. Прогностическое значение определения поражения костного мозга у пациентов с нейробластомой на основании экспрессии генов РНОХ2В и ТН I А.Е. Друй, Е.В. Шориков, Г.А. Цаур [и др.] II Вопросы онкологии. - 2014. - №2. - С. 57-62.

7. Попов, A.M. Прогностическое значение определения поражения костного мозга у детей с нейробластомой методом проточной цитометрии / А.М. Попов, Е.В. Шориков, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, А.Е. Друй [и др.] // Вопросы онкологии. - 2014. - №4. - С. 470-476.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГСК Аутологичные гемопоэтические стволовые клетки

БСВ Бессобытийная выживаемость

ВС Величина соотношения

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЭТ Диагностическая эффективность теста

КМ Костный мозг

МОБ Минимальная остаточная болезнь

ОВ Общая выживаемость

ПНЭО Примитивная нейроэктодермальная опухоль

ГГУ Пороговый уровень

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

РНК Рибонуклеиновая кислота

CD Кластер дифференцировки

FISH Флуоресцентная гибридизация in situ

MLPA Множественная лигазно-зависимая амплификация зондов

RIN Показатель целостности РНК

VNTR Вариабельность числа тандемных повторов

Подписано в печать 24.02.2015 г. Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 77. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.