Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологические и молекулярно-биологические факторы прогноза несветлоклеточного почечно-клеточного рака

На правах рукописи

МОСКВИНА Лариса Вячеславовна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА НЕСВЕТЛОКЛЕТОЧНОГО ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОГО РАКА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.03.02 - патологическая анатомия 14.01.12 - онкология

7 НОЯ 2013

Москва-2013

005537681

Работа выполнена на факультете фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научные руководители:

доктор медицинских наук доктор медицинских наук Официальные оппоненты:

Мальков Павел Георгиевич Андреева Юлия Юрьевна

доктор медицинских наук, профессор, зав. Михалева Людмила Михайловна лабораторией клинической морфологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

доктор медицинских наук, профессор, Русаков Игорь Георгиевич заместитель главного врача по онкологии Московской городской клинической больницы №57

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Защита диссертации состоится $ в /2.. с9с2 часов

на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН (117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

Автореферат разослан ^

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Почечно-клеточный рак - одна из ведущих проблем современной онкоурологии, что связано не только с ростом заболеваемости (за пять лет абсолютный прирост числа заболевших составил 17% среди мужчин и 21% среди женщин), но и с недостаточным объемом знаний об этой группе опухолей (Давыдов М.И. с соавт., 2012; Чиссов В.В. с соавт., 2012). По статистике в структуре почечно-клеточного рака до 90% наблюдений представлено светлоклеточным вариантом. Однако каждый из 10 гистологических вариантов почечно-клеточного рака, включенных в классификацию ВОЗ, имеет уникальные морфологические и клинические характеристики.

Несмотря на то, что стандартом лечения почечно-клеточных карцином является хирургическое удаление опухоли, остается множество вопросов по лечебной тактике, многие из которых связаны с их прогнозом, однако из-за гетерогенности этой группы опухолей до настоящего времени прогностические факторы не валидированы (Eble J.N. et al., 2011).

Большой клинический интерес представляет изучение зависимости прогноза от гистологического варианта несветлоклеточного почечно-клеточного рака, однако в литературе приводятся противоречивые данные о роли этого фактора (Пасечник Д.Г., 2001; Hsu R.M. et al., 2004; Deng F.M., Melamed J., 2012).

По результатам многих исследований, прогноз почечно-клеточного рака определяется, в первую очередь, стадией заболевания, однако, не все авторы разделяют эту точку зрения (Lau W.K. et al., 2001; Brookman-May S. et al., 2011). Классификация TMN этой группы опухолей пересматривается каждые 6-8 лет. Особое внимание уделяется категории «рТ» - размер опухолевого узла -ведутся активные споры о «пограничных» значениях этого показателя (Delahunt В., 2009; Sobin L.H., Gospodarowicz М.К., Wittekind С., 2009). Высокая гетерогенность группы несветлоклеточного почечно-клеточного рака, относительно низкое распространение этих опухолей, частая смена классификации TNM затрудняют оценку прогностической значимости отдельных критериев.

Остается дискутабельной прогностическая значимость степени дифференцировки и особенностей строения опухоли (Van Poppel H. et al., 1997; Sika-Paotonu D. et al.,2006; Paner G.P. et al., 2010). Среди общепринятых морфологических факторов прогноза почечно-клеточного рака выделяют наличие некроза и веретеноклеточной дифференцировки в опухоли (Hemmerlein В. et al., 2001; Adley В.Р. et al., 2006; Pichler M. et al., 2013). В отечественной литературе такие публикации единичны, исследования проведены на препаратах светлоклеточных карцином (Калпинский А.С., 2008; Алексеев Б.Я., Франк Т.А. с соавт., 2009).

Для определения биологической агрессивности несветлоклеточного почечно-клеточного рака используют иммуногистохимические методы с

з

применением широкой панели антител: белков-регуляторов клеточного цикла, молекул адгезии, индукторов апоптоза, регуляторов ангиогенеза и других. Однако до настоящего времени нет принятых значимых факторов прогноза этой группы опухолей (Лоран О.Б., Франк Г.А. с соавт., 2008; Delahunt В., Eble J.N., 1997; Abrahams N.A. et al.; 2004).

Генетические особенности почечно-клеточного рака достаточно хорошо изучены. Наиболее характерный цитогенетический признак светлоклеточного рака - делеции короткого плеча хромосомы 3 (Зр-), папиллярного - трисомия по хромосомам 7 и 17, потеря Y-хромосомы, хромофобного - потери участков в хромосомах 1, 2, 6, 10, 13 и 17 (Weterman М.А., Wilbrink M., Kessel A.G., 1996). Кроме того, для папиллярного рака отмечено, что амплификацию локусов 7р и 17р" чаще наблюдают в карциномах 2-го типа, чем 1-го (Sudarshan S., Linehan W.M., 2006). Зарубежными и отечественными исследователями продолжаются поиски прогностически значимых генетических нарушений почечно-клеточного рака (Sidhar S.K. et al., 1996; Osunkoya A.O. et al., 2009).

Таким образом, выявление морфологических, молекулярных и генетических признаков биологической агрессивности в свете оценки прогноза несветлоклеточных карцином крайне актуальны и необходимы для последующей разработки эффективных способов лечения больных.

Цель исследования

Выявление признаков биологической агрессивности, оценка морфологических, иммуногистохимических и генетических факторов прогноза несветлоклеточного почечно-клеточного рака.

Задачи исследования

1. Изучить зависимость прогноза от стадии заболевания и морфологического варианта карциномы.

2. Оценить прогностическую значимость некроза, сосудистой инвазии, веретеноклеточной дифференцировки при разных формах несветлоклеточного почечно-клеточного рака.

3. Исследовать особенности иммунофенотипа карцином с благоприятным и неблагоприятным течением.

4. Выбрать микросателлитные маркеры в области lq31-32 для изучения аллельного дисбаланса и оценить его прогностическое значение для папиллярного рака.

Научная новизна

В работе изучена большая группа пациентов, страдавших несветлоклеточным почечно-клеточным раком, оценена кумулятивная выживаемость этой группы больных в сравнении с выживаемостью пациентов со светлоклеточным почечно-клеточным раком, и определены факторы прогноза заболевания.

На основе данных комплексного морфологического, иммуногистохимического и молекулярно-биологического исследования

4

определены факторы, влияющие на течение заболевания, такие как гистологический вариант и размеры опухоли, наличие некроза, гиперэкспрессия молекул адгезии. Определен прогностический потенциал коэкспрессии маркеров неясного прогностического значения: рацемазы, топоизомеразы, циклооксигеназы 2 типа, рецептора эндотелиального фактора роста 2 типа (Flk).

Показано, что наименьшая кумулятивная выживаемость пациентов в группе несветлоклеточных карцином характеризует больных с папиллярным раком 2 типа, что соотносится с особенностями экспрессии опухолями молекулы адгезии E-cadherin.

Выявлено статистически значимое снижение кумулятивной выживаемости пациентов при гиперэкспрессии неспецифической молекулы адгезии CD44.

Впервые обнаружена микросателлитная нестабильность по локусам D1S2142 и D1S3465 в папиллярном раке и отмечен тренд увеличения частоты генетических нарушений в этой группе опухолей при снижении степени дифференцировки.

Получено подтверждение теории опухолевого поля R.A. Willis как причины первичной множественности папиллярных карцином.

Научно-практическая значимость

Полученные результаты уточняют морфологическую диагностику и дают новые возможности для дифференциальной диагностики вариантов почечно-клеточного рака. Выявленные факторы, влияющие на прогноз заболевания, позволяют оптимизировать лечебную тактику с учетом потенциальной биологической агрессивности опухоли.

Разработан протокол морфологического и иммуногистохимического заключения по исследованию операционного материала больных почечно-клеточным раком, отражающий значимые характеристики, необходимые для определения стадии и тактики лечения заболевания.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу патологоанатомического отделения МНИОИ им. П.А.Герцена.

Апробация работы

Результаты исследования доложены на съезде онкоурологов стран СНГ (Киев, 2011); конференции молодых ученых МГНЦ РАМН (Москва, 2011), 32nd Congress of the Société Internecionale d'Urologie (30.09-04.10.2012, Japan), 25lh European congress of Pathology (31.08.13-04.09.13, Lisbon).

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 12 печатных работах, из них 4 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура исследования

Объем рукописи составляет 187 страницы, состоит из введения, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Библиографический аппарат работы представлен 229 источниками, в том числе 212 на иностранном языке. Работа иллюстрирована 46 таблицами, 77 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы

Исследование проводилось на архивном и текущем операционном материале патологоанатомического отделения ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт им. П.А. Герцена» Министерства Здравоохранения РФ. Изучено 158 опухолей от пациентов, проходивших лечение в институте им. П.А. Герцена с 1998 по 2010 годы. Средний возраст пациентов составил 56±11 лет (от 18 до 76 лет), соотношение женщин и мужчин - 1:1,16. В каждом случае определяли гистологический тип опухоли, размер узла (по критериям TNM), степень дифференцировки по критериям S.A. Fuhrman (1982) и критериям G.P. Paner (2010) для хромофобного рака, проводили морфологический анализ и сопоставление выявленных признаков с выживаемостью пациентов. Период прослеженности больных составил от 25 до 167 месяцев, медиана выживаемости - 53 месяца. Клинические данные оценивали по амбулаторным картам и историям болезни. Все пациенты получали лечение в сопоставимом объеме (нефрэктомия или резекция почки без дополнительного специфического пред-/послеоперационного лечения).

Основные исследуемые группы: папиллярный (68/134, 51% наблюдений) и хромофобный вариант (56/134, 49% наблюдений) почечно-клеточного рака, редкие типы (рак из протоков Беллини, муцинозный тубулярный и веретеноклеточный рак), в связи с их небольшим количеством (по два наблюдения), не учитывались. Таким образом, выборка несветлоклеточного рака была представлена 124 опухолями. В качестве группы сравнения выбрано 30 наблюдений светлоклеточного почечно-клеточного рака.

На основании клинических данных, было сформировано две группы: опухоли с благоприятным и неблагоприятным течением. Во вторую из этих групп вошли все случаи прогрессирования опухолевого процесса (рецидив, развитие регионарных или отдаленных метастазов, смерть больного). В группу опухолей с неблагоприятным течением вошли карциномы как папиллярного, так и хромофобного строения.

Для иммуногистохимического исследования использовали панель антител, включающую антитела к белкам клеточного цикла (Ki-67, р53, topo-II, PTEN, р27), молекулам адгезии (ЕМА, E-cadherin, CD44), некоторым внутриклеточным ферментам (ММР-2, ММР-9, р504, СОХ2, Flk). С выбранных блоков (93 наблюдения) изготавливали срезы толщиной 4 мкм, монтировали их на высокоадгезивные полилизиновые стекла (Polylisin Slides, Menzel GmbH&Co KG; Германия). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили при помощи специализированной системы EnVision Flex (Dako,

6

Дания) по стандартному протоколу в модуле предобработки к автостейнеру (PT-Module). ИГХ-реакции осуществляли в автоматическом режиме с помощью автостейнера Dako. В качестве системы детекции использовали набор EnVision Flex (Dako, Дания) с DAB-хромогеном. В каждой серии препаратов был соответствующий положительный и отрицательный контроль. Результаты реакции маркеров ядерной локализации (Ki-67, р53, р27, топоизомераза II а, PTEN) оценивали в процентах окрашенных опухолевых клеток в трех полях зрения (увеличение х40). Критериями гиперэкспрессии Ki-67, р53, р27 было выбрано окрашивание более 10% клеток опухоли (по Migita Т. et al., 2008; Cho D.S., Joo H.J., 2005), топоизомеразы - более 20% клеток (по Duzcan F. et al., 2011), PTEN - более 90% клеток (по Hager M., Haufe H., 2007).

Для маркеров с мембранной/цитоплазматической локализацией метки критерии гиперэкспрессии были следующие:

- для CD44 - окрашивание более, чем 10% клеток опухоли (по Iozzo R.V. et al., 2001);

- для р504 и СОХ2 — окрашивание более 20% клеток опухоли (по Sozen S. et al., 2008; Kourda N. et al., 2010);

- для EMA, E-cadherin - выраженная экспрессия более, чем в 40% клеток опухоли или умеренная более, чем в 60% (по Langner С. et al., 2004);

- для металлопротеиназ - выраженная экспрессия более, чем в 20% клеток опухоли или умеренная более, чем в 40% (Perez-Gracia J.L. et al., 2009);

- для Flk - выраженная экспрессия более, чем в 30% клеток опухоли или умеренная более, чем в 50% (по Farace F. et al., 2011).

Препараты изучали при помощи светового микроскопа Axioskop «Opton» (Carl Zeiss, Германия). Микрофотографирование проводили на биологическом универсальном микроскопе Leica DM4000B с цветной цифровой камерой DFC495 при помощи стандартного программного обеспечения Leica Application Suite v.3.7.0 (Германия).

В группе папиллярного рака на части образцов (п=39) было проведено исследование микросателлитной нестабильности. Геномную ДНК выделяли из срезов с парафиновых блоков методом фенол-хлороформной экстракции. Полученный раствор ДНК использовали для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). С помощью ПЦР амплифицировали последовательности локусов D1S2142 и D1S3465, содержащие простые тандемные повторы, локализованные в области lq32. ПЦР-продукт анализировали в режиме фрагментного анализа с использованием полимера РОР4 на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 "Applied Biosystems" (США). Обработку данных, полученных при детекции флуоресцентных сигналов (вычисление длин меченых фрагментов ДНК и площадей пиков, характеризующих количество соответствующих аллелей), проводили с помощью программы GeneMapper v.3.5. "Applied Biosystems" (США). Ферментативное секвенирование по Сэнгеру проводили с помощью набора ABI PRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 с последующей оценкой на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 по протоколам фирмы "Applied Biosystems" (США).

Анализ результатов исследования выполняли с помощью программы 8ТАТ18Т1СА у.8.0 и Мес1Са1к у.12.0 методами Каплана-Мейера (мультивариантный анализ), методом точного двустороннего критерия Фишера, относительного риска (ОР), расчета коэффициента корреляции, логистической регрессии, построением классификационных таблиц. Соответствие наблюдаемых частот генотипов закону Харди-Вайнберга и сравнение частот аллельного дисбаланса и микросателлитной нестабильности в разных группах пациентов проверяли с помощью программы КхС, реализующей метрополис-алгоритм. Уровень значимости (р) принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждения

В исследованную выборку вошли наиболее распространенные варианты несветлоклеточного почечно-клеточного рака: папиллярный рак 1 и 2 типа, классический и эозинофильный вариант хромофобного рака. В качестве возможных прогностических факторов были рассмотрены морфологическое параметры (размер опухолевого узла, степень дифференцировки, наличие некроза, участков веретеноклеточной дифференцировки, сосудистой инвазии, метастатического поражения регионарных лимфатических узлов) и молекулярно-биологические особенности (иммунофенотип и влияние на прогноз генетических нарушений).

Морфологические факторы прогноза несветлоклеточных почечно-клеточных карцином. В результате проведенного исследования некротические изменения были отмечены в 40% несветлоклеточных карцином и в 70% светлоклеточных опухолей. Среди несветлоклеточных вариантов наиболее часто некроз выявлялся в папиллярном раке 2 типа, реже всего — хромофобном классическом раке (х2, р<0,05, табл. 1). Кроме этого была отмечена ассоциация снижения частоты некроза в местно-распространенных (рТЗ-4) опухолях по сравнению с локализованными (рТ1-2) и в низкодифференцированных по сравнению с высоко- и умеренно дифференцированными. При этом стоит отметить, что основные тенденции выявления некроза в исследованной группе несветлоклеточного почечно-клеточного рака и группы сравнения (светлоклеточного) совпадали. В результате проведенного анализа мы отметили, что наличие некроза повышает вероятность неблагоприятного течения несветлоклеточного рака на 64%, а папиллярного рака — на 74% (относительный риск 3,8; 95% доверительный интервал [3,60;3,99]).

Таблица 1

Морфологические характеристики почечно-клеточного рака_

Вариант Рака N (%) Размер узла Степень диффе-ренцировки Некроз В Сосудистая инвазия N+

рТ1-2 рТЗ-4 G1-2 G3-4

1 36 (23) 30(83) 6(17) 33 (92) 3(8) 12 (33) 1(3) 8(22) 4(11)

2 32 (21) 15(47) 17 (53) 19 (59) 13(41) 17 (53) 3(9) 12 (38) 9(28)

3 30(19) 25(83) 5(17) 27 (90) 3(10) 10 (33) 0 8(27) 1(3)

4 26(17) 18(69) 8(31) 23 (88) 3(12) 11(42) 0 3(12) 2(8)

5 30(19) 15(50) 15 (50) 22 (71) 8(27) 21 (70) 4(13) 16(53) 6(20)

6 154(100) 103(67) 51 (33) 124 (81) 30(19) 71 (46) 8(5) 47 (31) 22 (14)

Обозначения: 1 - папиллярный 1 типа; 2 - папиллярный 2 типа; 3 - хромофобный классический; 4 - хромофобный эозинофильный; 5 - светлоклеточный; 6 - всего; В -веретеноклеточная дифференцировка; N+ - метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов.

По данным литературы, микроскопическое выявление некроза в опухоли относится к важнейшим признакам неблагоприятного течения почечно-клеточных карцином. Этот параметр валидирован и включен в ряд прогностических шкал для светлоклеточного рака (SSIGN Score System, 2002; Leibovich L., 2005; Karakiewicz С., 2007; Thompson T., 2007), однако для несветлоклеточных форм его значимость спорна. Некоторые исследователи считают наличие некроза фактором прогноза лишь определенных вариантов несветлоклеточных опухолей (Hemmerlein В. et al., 2001; Algaba F., 2006; Pichler M. et al., 2013).

При сопоставлении выраженности некроза в группе опухолей благоприятного и неблагоприятного течения, нами было отмечено снижение кумулятивной выживаемости пациентов на 6% (р=0,032, рис. 1), при этом средний безрецедивный период в группе несветлоклеточных опухолей с некрозом составил 55,4±41,8 месяцев, без некроза - 77,3±40,5 месяцев. Таким образом, микроскопическое выявление некроза можно отнести к неблагоприятным прогностическим признакам несветлоклеточного почечно-клеточного рака любого гистологического варианта.

По результатам проведенного исследования, сосудистая инвазия была выявлена в 28% опухолей: 25% (31 из 124) несветлоклеточных и 53% (16 из 30) светлоклеточных карцином. При этом среди несветлоклеточных форм инвазия сосудов чаще отмечалась в папиллярном раке 2 типа (38%), реже всего - в хромофобном классическом. Результаты в целом по выборке сопоставимы с приводимыми в литературе (Kroeger N. et al., 2012). Исходя из полученных данных, нами было показано, что сосудистая инвазия повышает риск прогрессии всех вариантов несветлоклеточного рака и папиллярных карцином в отдельности (ОР=2,8 и 2,4 соответственно) на 47% и 58% соответственно (атрибутивный риск, увеличение риска частоты события при влиянии

9

исследуемого фактора). Однако унивариантный анализ влияния этого фактора на кумулятивную выживаемость не дал значимых результатов. Микроскопическое выявление сосудистой инвазии в почечно-клеточном раке — сложная задача, что объясняется вовлечением в опухоль клубочков с их сосудистой сетью и обилием новообразованных сосудов в опухоли (Lang H. et al., 2000). Большинство исследователей расценивают наличие инвазии сосудов как неблагоприятный фактор прогноза, независимо от типа опухоли, однако, при анализе почечно-клеточных карцином данные расходятся (Van Poppel H. et al., 1997; Sevinc M. et al., 2000).

В исследованной выборке веретеноклеточная дифференцировка была выявлена лишь в 3% несветлоклеточных карцином (4 из 124, табл. 1), при оценке прогностической значимости этого параметра для почечно-клеточного рака отмечено снижение кумулятивной выживаемости пациентов на 21% (р=0,016, рис. 2). По данным литературы, опухоли с веретеноклеточной дифференцировкой обычно характеризуются агрессивным течением. Часть авторов предлагают учитывать наличие этого компонента в опухоли при градации почечно-клеточного рака (Paner G.P. et al., 2006). Длительное время выделяли самостоятельную нозологическую единицу - саркоматоидный рак (Bertoni F,et al., 1987). Shuch В., Bratslavsky G. С соавт. (2012) показали, что эти опухоли не имеют собственного генотипа, а объединяют генетические нарушения разных вариантов почечно-клеточного рака, и веретеноклеточная дифференцировка - проявление строения опухолей разных гистологических типов.

i<00-

SS 35. л

Й <30-

0

¡<?5.

1 go. I 'Э-5-§ и-

03 i

I 60S

I ТМ

50 100 150

Врсш. МЕСЯЦЫ

100 150 1Я. месяцы

Рис. 1. Влияние некроза на кумулятивную выживаемость в группе несветлоклеточного почечно-клеточного рака, р<0,05.

Рис. 2. Влияние веретеноклеточной дифференцировки на кумулятивную выживаемость в группе почечно-клеточного рака, р<0,05.

В нашем исследовании метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов на момент постановки диагноза было диагностировано у 22 пациентов: 16 из 124 (13%) в группе несветлоклеточных опухолей, 6 из 30 (20%) в группе светлоклеточных (табл. 1). Большинство метастатических

опухолей было отмечено в группе местно-распространенных (рТЗ-4) низкодифференцированных карцином р=0,01). Из-за малого числа

наблюдений метастатических опухолей с неблагоприятным течением, оценить влияние этого фактора на относительный риск прогрессирования заболевания было невозможно. Для рака почки не определено необходимое минимальное число исследуемых лимфатических узлов. Согласно опубликованным данным, лимфатические узлы ворот почки выявляются лишь в 10% наблюдений при макроскопическом исследовании, в 25% - при микроскопии. Вероятность метастатического поражения макроскопически определяемых лимфатических узлов - 80% (МесЫ:а V. е1 а1., 2013). При этом по данным литературы пятилетняя выживаемость пациентов при метастатическом поражении лимфатических узлов (ТЗс) и без него (Т1) сопоставима (81етег Б., 2005).

При оценке прогностической значимости гистологического варианта почечно-клеточного рака было отмечено, что несветлоклеточные опухоли имеют лучший прогноз, по сравнению со светлоклеточными: кумулятивная трехлетняя выживаемость в первой группе была на 28% выше, чем в во второй (97% и 69%, соответственно, р<0,001). Дальнейшая оценка выживаемости в разных группах несветлоклеточных опухолей показала, что кумулятивная выживаемость уменьшается в ряду: хромофобный классический рак, папиллярный рак 1 типа, хромофобный эозинофильный, папиллярный рак 2 типа, светлоклеточный (р<0,001, рис. 3). Эта закономерность также подтверждилась при расчете относительного риска прогрессии разных вариантов опухолей одинаковых стадий и степени дифференцировки.

Вреш.месяцы

Рис. 3. Влияние гистологического типа на безрецидивную

выживаемость в группе почечно-клеточного рака, р<0,001.

1 - светлоклеточный;

2 - папиллярный рак 1 типа;

3 - папиллярный рак 2 типа;

4 - хромофобный класссический;

5 - хромофобный эозинофильный.

Результаты некоторых крупных исследований, посвященных оценке прогноза почечно-клеточных карцином, подтверждают выявленную нами закономерность (лучший прогноз папиллярного рака по сравнению со светлоклеточным, худший - при сравнении с хромофобный, Amin M.B. et al., 2002). Противоречивые данные приводятся о прогнозе вариантов папиллярного рака: ряд авторов предлагают выделять локализованный и распространенный варианты, некоторые - использовать молекулярную классификацию этих опухолей (Ku J.H. et al., 2009; Steffens S. et al., 2012). Исследований

11

хромофобных карцином гораздо меньше, прогностическая значимость выделения классического и эозинофильного варианта практически не обсуждается. Встречаются мнения, что в рутинной практике определение гистологического варианта несветлоклеточного почечно-клеточного рака малоцелесообразно (Deng, F.M., Melamed J., 2012). Исходя из данных проведенного исследования, мы считаем, что определение гистологического варианта а также подварианта (если он предусмотрен классификацией) несветлоклеточного почечно-клеточного рака необходимо, так как эта информация имеет большое клиническое значение и важна для накопления эпидемиологических знаний и ретроспективной оценки больших выборок несветлоклеточных опухолей. Кроме того, крайне важным является выделение и использование морфологических дифференциально-диагностических критериев, так как иммуногистохимические и генетические методы исследования в рутинной практике не всегда доступны и экономически оправданы. Гистологический вариант почечно-клеточного рака может служить отправной точкой при оценке прогноза течения болезни, хотя и нельзя опираться исключительно на строение опухоли, необходимо также учитывать другие факторы, такие как размер опухолевого узла и степень злокачественности.

При унивариантном анализе исследуемой выборки было отмечено, что местно-распространенные опухоли имеют худший прогноз по сравнению с локализованными (трехлетняя кумулятивная выживаемость 94% и 98% соответственно, р=0,02, метод Каплана-Мейера), однако значимых различий внутри групп (рТ1-2 и рТЗ-4) получено не было. В части исследований размер опухоли считается независимым признаком, в некоторых эти данные не находят подтверждения (Delahunt В., Bethwaite Р.В., Nacey J.N., 2007; Przybycin C.G. et al., 2011). При этом стоит отметить, что число наблюдений весьма вариабельно и результаты не определяются ни объемом выборки, ни гистологическим вариантом опухоли (Turun S. et al., 2002; Waldert M. et al., 2010).

В связи с неравномерным распределением наблюдений по степени дифференцировки, были объединены опухоли G1 и G2 а также G3 и G4, таким образом получены две группы сравнения. Исследования других авторов показали, что при анализе относительно небольших групп это допущение возможно (Tsui К.Н. et al., 2000; Al-Aynati M. et al., 2003). Распределение опухолей по степени дифференцировки приведены в таблице 1. Относительная частота неблагоприятного течения всех несветлоклеточных карцином G1-2 составила 6%, G3-4 - 5%, папиллярных - 7% и 4%, хромофобных - 6% и 2%, соответственно. При расчете относительного риска неблагоприятного течения опухолей было отмечено, что вероятность его выше при низкой степени дифференцировки, независимо от гистологического типа рака (табл. 2).

Таблица 2

Относительный риск неблагоприятного течения низкодифференцированного _несветлоклеточного рака__

G3-4/G1-2 ОР 95% ДИ

Папиллярный 2,25 (2,16; 2,35)

Хромофобный рак 2,78 (2,59; 2,97)

Для определения степени дифференцировки хромофобных карцином, наряду с системой S.A. Fuhrman, была использована шкала градации, разработанная специально для хромофобного рака G.P. Paner с соавт. (2010), в которой отчасти нивелирован выраженный ядерный полиморфизм, свойственный этим опухолям. Авторы предложили при определении степени дифференцировки игнорировать единичные укрупненные клетки с конденсированным хроматином, дольчатым пузырьковидным ядром, сближенные клетки (рис. 4).

Рис.4. А - хромофобный рак Gl по G.P. Paner, по критериям S.A. Fuhrman опухоль соответствует G2; Б - хромофобный рак G2 по G.P. Paner, по критериям S.A. Fuhrman опухоль соответствует G3. Окраска гематоксилином и эозином, х400.

При сопоставлении полученных результатов, были выявлены значительные расхождения в распределении карцином по степени дифференцировки (табл. 3). Относительная частота

высокодифференцированных опухолей при определении степени дифференцировки по S.A.Fuhrman составила 16%, по G.P. Paner - 50%, умеренно дифференцированных - 73% и 41% соответственно, низкодифференцированных - 11% и 8% соответственно. Самый высокий процент расхождений был отмечен в группе умеренно дифференцированных опухолей - 34% (в группе высоко- и низкодифференцированных - 20% и 7% соответственно, рис. 5). Таким образом, при градации хромофобного рака с использованием критериев G.P. Paner с соавт, степень дифференцировки опухолей в среднем повышается на один ранг.

Таблица 3

Результаты определения степени дифференцировки хромофобного рака по __критериям S.A. Fuhrman и G.P.Paner_

Группа S.A. Fuhrman grade G.P. Paner grade Расхождения

Gl 9(16%) 28 (50%) 20%

G2 41 (73%) 23 (41%) 34%

G3 6(11%) 5 (8%) 7%

G4 0 - -

45

IS A Fuhrman I G.F Faneur

Рис. 5. Сравнение распределения хромофобных карцином по степени дифференцировки при использовании разных систем градации.

При оценке времени безрецидивной выживаемости хромофобного рака ни одна шкала не показала значимых результатов (р>0,05), что совпадает с данными ряда публикаций (Shuch В. et al., 2011). Однако проведенное исследование показало, что пересмотр критериев S.A. Fuhrman для несветлоклеточных карцином, в частности для хромофобных опухолей, оправдан, так как при классическом подходе градация их искусственно завышается. Необходимо учитывать сочетание высокого ядерного полиморфизма хромофобного рака с его относительно благоприятным клиническим течением (Sika-Paotonu D. et al., 2006; Delahunt В. et al, 2007). Сходные особенности характерны и для других опухолей: например, доброкачественная опухоль онкоцитома может характеризоваться выраженным ядерным полиморфизмом, значительными размерами и даже «инвазией» паранефральной клетчатки (Zhou М., M-Galluzzi С., 2007); классические морфологические критерии не определяют степень злокачественности феохромоцитомы.

В качестве дополнительного фактора прогноза для хромофобного почечно-клеточного рака рассматривали тип преимущественного гистологического строения. Этот признак учитывается как прогностический параметр во многих опухолях: например, аденокарцинома легкого,

аденокистозный рак (El-Naggar А.К., Huvos A.G., 2005; Travis D.W. et al., 2011). Среди изученного материала нами было выделено 6 вариантов строения хромофобного рака: альвеолярный, трабекулярный, инсулярный, солидный, папиллярный, тубулярный и различные их сочетания (рис. 6).

Рис. 6. Варианты строения хромофобного рака. Окраска гематоксилином и эозином, х200.

А - инсулярное; Б - трабекулярное и солидное; В -тубулярное; Г - альвеолярное; Д - папиллярное.

В 19 из 56 (34%) наблюдений опухолевые клетки формировали небольшие гнезда или островки, расположенные в миксоидной строме (инсулярный вариант). В 17 (30%) случаях опухоль формировала широкие клеточные тяжи, разделенные тонкими соединительно-тканными прослойками или солидные поля опухолевых клеток (трабекулярно-солидный тип). Помимо

этого, встречались опухоли с преимущественно тубулярного (9/56, 16%), альвеолярного (4/56, 7%) и папиллярного (7/56, 13%) строения.

Трабекулярный, инсулярный и солидный варианты строения были отнесены к классическим вариантам строения хромофобного рака (35/56, 62% опухолей), остальные - к неклассическим (21/56, 38%). При унивариантном анализе не выявлено прогностической значимости этого параметра. Однако отмечена корреляция со стадией (г = -0,32; р=0,01): среди локализованных опухолей (рТ1-2) преобладали карциномы классического варианта строения, среди местно-распространенных (рТЗ-4) - неклассического. Нами также было отмечено значимое увеличение опухолей неклассического варианта строения при увеличении размера опухолевого узла (табл. 4).

Таблица 4

Варианты строения хромофобного рака в зависимости от размера

опухоли _

Размер опухоли Классический вариант строения, п (%) Неклассический вариант строения, п (%) Всего, п (%)

ГрТ11 27 (48%) 9 (16%) 36

** рТ2 * 2 (4%) 5 (9%) 7

рТЗ 5 (9%) 7 (13%) 12

"~рТ4 0 1 (2%) 1

*р=0,028; ** р=0,07, критерий Фишера.

В результате проведенного анализа, мы считаем, что преобладающий тип строения может быть прогностическим фактором для хромофобного рака, однако для оценки значимости этого признака необходимо исследование большего числа наблюдений. Наши данные согласуются с результатами исследования Amin M.B. с соавт. (2008), однако в литературе недостаточно публикаций по данному вопросу.

Для папиллярного рака в качестве дополнительного прогностического фактора оценивали количество ксантомных клеток. Выявление этого типа клеток - важный диагностический признак этих опухолей, однако число их может значительно варьировать. В нашем исследовании отмечалось снижение числа ксантомных клеток (единичные клетки в 5 полях зрения при малом увеличении, хЮО) в 33/68 (49%) наблюдениях. Среднее время безрецидивной выживаемости при этом составило 53,9±39,8 месяцев, против 41,7±27,0 месяцев в группе с «нормальным» их количеством. При расчете атрибутивного риска отмечено, что снижение числа ксантомных клеток повышает вероятность неблагоприятного течения опухоли на 5,71% (ОР 1,06, 95% доверительный интервал [1,02; 1,10]), при унивариантном анализе - повышение кумулятивной выживаемости пациентов первой группы (низкое число клеток типа ксантомных, р=0,043). Полученные результаты не согласуются с данными, приведенными в работе J. Thakajam и К. Tanaka (2007). В литературе нет

объяснения причин наблюдаемой вариабельности, как и происхождения ксантомных клеток в папиллярных почечно-клеточных карциномах.

Обобщая этот раздел исследования, к значимым прогностическим факторам несветлоклеточного почечно-клеточного рака можно отнести микроскопическое выявление некроза и веретеноклеточной дифференцировки, гистологический вариант, размер опухолевого узла, снижение числа ксантомных клеток в папиллярном раке. К важным прогностическим признакам - степень дифференцировки опухоли (для хромофобного рака по критериям S.A. Fuhrman и G.P. Paner), наличие сосудистой инвазии, вариант строения хромофобного рака.

Иммуногистохимические особенности почечно-клеточного рака. Проведенное иммуногистохимическое исследование позволило выявить закономерности экспрессии широкого спектра белков различными вариантами несветлоклеточного почечно-клеточного рака.

Экспрессия маркера пролиферативной активности Ki-67, по сравнению с опухолями других локализаций, в почечно-клеточном раке оказалась невысока, при этом опухоли с высоким уровнем маркера значимо чаще выявлялись среди папиллярных карцином 2 типа (63% опухолей, табл. 5, %2 р<0,05). Уровень экспрессии Ki-67 снижался при увеличении размера опухолевого узла и понижении степени ее дифференцировки (х2, р<0,05). Такая же тенденция была выявлена и при оценке экспрессии белка-супрессора опухолевого роста р27 (г=0,38, р=0,02). Снижение уровня р27 является характерной чертой карцином разного происхождения и ассоциировано с плохим прогнозом (Migita Т et al., 2002; Lahav-Baratz, S. et al„ 2004; Hershko D.D., Shapira M., 2006).

Таблица 5

Результаты экспрессии белков-регуляторов клеточного цикла в разных

вариантах почечно-клеточного рака

Вариант рака, N (%) Ki-67* р53 TopoIIa* PTEN р27

Папиллярный 1 типа 15 (63) 6(20) 15 (50) 14 (47) 9(30)

Папиллярный 2 типа 12(48) 6(25) 16 (67) 12 (48) 9(38)

Хромофобный классический 3(13) 3(13) 16 (66) 13 (54) 3(13)

Хромофобный эозинофильный 3 (30) 6(40) 11 (80) 10(71) 6(40)

Светлоклеточный 1(8) 0 2(17) 2(16) 0

* р<0,05; X

Уровень экспрессии р53 в исследованной группе карцином варьировал в широком диапазоне и не был связан ни с гистологическим вариантом, ни со степенью дифференцировки, ни с размером опухоли. Прогностическое значение экспрессии мутантного белка-супрессора опухолевого роста р53 по данным литературы не определено. Некоторые авторы относят его к неблагоприятным факторам прогноза, однако эти работы малочисленны (Cho D.S., Joo H.J., 2005; Kroeze S.G. et al, 2010).

Важным белком, регулирующим пролиферативную активность клеток, является топоизомераза. В нашем исследовании уровень экспрессии этого

маркера оказался достаточно высок с максимальными значениями в группе хромофобных карцином (у2, р<0,05). По данным литературы, гиперэкспрессия топоизомеразы характерна для медуллярного варианта почечно-клеточного рака, что может обусловливать высокую агрессивность этих опухолей (SwartzM.A. et al., 2002), кроме этого, топоизомераза рассматривается как возможная мишень при разработке таргентых препаратов (Зуков P.JL, 2012). При унивариантном анализе не было отмечено значимых закономерностей влияния уровня экспрессии топоизомеразы на кумулятивную выживаемость пациентов.

При проведении исследования мы отметили крайне высокую ядерную экспрессию белка PTEN, подавляющего пролиферативную активность опухоли. Среднее значение экспрессии маркера составило 66% клеток опухоли. Согласно данным литературы, пороговым уровнем гиперэкспрессии белка рекомендовано принимать значение 90% клеток опухоли, хотя некоторые исследователи считают таковым 95% и даже 100% клеток (Hager М., Haufe Н., 2007; Hager М., Haufe Н., 2011). При оценке наших данных, было отмечено, что большинство наблюдений с низким уровнем экспрессии PTEN (менее 50%) относилось к низкодифференцированным местно-распространенным карциномам. Прогностическая значимость экспрессии PTEN неоднозначна, в литературе нет объяснения столь высокого уровня экспрессии этого маркера. Некоторые исследователи расценивают гиперэкспрессию PTEN как следствие активации сигнального Akt-пути неизвестным еще механизмом, а снижение уровня экспрессии этого белка связывают с повышением агрессивности опухоли (Hennenlotter J. et al, 2008; Mundhenk J. et al., 2011).

Таким образом, при первичном анализе результатов иммуногистохимического исследования белков клеточного цикла несветлоклеточным почечно-клеточным раком гиперэкспрессия Ki-67, р53 была отнесена к факторам неблагоприятного течения, р27, PTEN -благоприятного течения, топоизомеразы - к белкам с неопределенным прогностическим потенциалом.

В процессе метастазирования опухолей важную роль играют молекулы адгезии. Нами была рассмотрена экспрессия неспецифической молекулы адгезии CD44, E-cadherin и ЕМА (табл. 6). Наиболее интересные результаты получены при оценке первых двух белков.

Таблица 6

Результаты экспрессии молекул адгезии в разных вариантах почечно-_клеточного рака _

Вариант рака, N (%) CD44 ЕМА* E-cadherin*

Папиллярный 1 типа 3(10) 15 (50) 10 (33)

Папиллярный 2 типа 18 (80) 11 (46) 2(21)

Хромофобный классический 12 (50) 13 (54) 19 (79)

Хромофобный эозинофильный 0 7(47) 9(60)

Светлоклеточный 0 7(58) 0

* Р<0,05; х2

Неспецифическая молекула адгезии CD44 регулирует подвижность опухолевой клетки, способность ее к миграции а также участвует в регуляции множества клеточных каскадов (пролиферативной активности, апоптоза). Среди несветлоклеточных карцином наибольшая экспрессия CD44 была отмечена в группе папиллярного рака 2 типа (табл. 6). Кроме этого была отмечена умеренная положительная корреляция гиперэкспрессии CD44 и Ki-67 (коэффициент корреляции Фехнера, Kf=0,31, р=0,05), что, вероятно, связано с активацией факторов роста гликизилированными изоформами CD44 (Iozzo R.V., San Antonio J.D., 2001; Kroeze S.G. et al., 2010). По мнению некоторых авторов, гиперэкспрессия CD44 - неблагоприятный прогностический признак почечно-клеточного рака. Однако большинство исследований проведено на светлоклеточных опухолях (Yildiz Е. et al., 2004; Kroeze S.G. et al., 2010). При унивариантном анализе прогностической значимости экспрессии CD44 было отмечено значительное снижение пятилетней безрецидивной выживаемости больных (18% против 70%) при высоком уровне экспрессии белка (р<0,05, рис.

7).

Время, мес

-<10% клеток

->10% клеток

Рис. 7. Зависимость времени безрецидивной выживаемости больных несветлоклеточным почечно-клеточным раком от гиперэкспрессии

неспецифической молекулы адгезии СП44. р=0,018.

Считается, что низкий уровень экспрессии ЕМА и E-cadherin ассоциирован с высоким риском метастазирования опухолей. В нашем исследовании минимальный уровень экспрессии ЕМА был отмечен в папиллярном раке 2 типа (метод у2, р<0,05, табл. 6), прогностической значимости выраженности экспрессии белка не было выявлено. Гиперэкспрессия E-cadherin была отмечена в 46% несветлоклеточных опухолей. Среди несветлоклеточных карцином минимальный уровень экспрессии белка был зарегистрирован в группе папиллярного рака 2 типа. При оценке группы опухолей с низким уровнем экспрессии маркера было отмечено преобладание местно-распространенных карцином среди всех гистологических типов (у2, р<0,05, рис. 8). Изменение уровня экспрессии кадгеринов влияет не только на адгезивные свойства клеток, но и на их пролиферативную активность (Migita Т. et al., 2008). Одним из важнейших представителей этой группы белков является E-cadherin. Снижение его уровня вызывают дестабизацию белка р53, в результате чего нарушаются механизмы клеточной гибели (Imai, J.

19

е1 а1., 2003). Кроме того, необходимо отметить, что повышение уровня экспрессии Е-сасШепп соответствовало последовательности увеличения трехлетней выживаемости больных: светлоклеточный рак, папиллярный 2 типа, папиллярный 1 типа, хромофобный классический, хромофобный эозинофильный (метод у2, р<0,01).

Таким образом, гиперэкспрессия СВ44 была отнесена к факторам неблагоприятного течения несветлоклеточного рака, ЕМА Е-сасИтепп -благоприятного.

Рис. 8. Распределение почечно-клеточных опухолей с низким (<40% клеток) уровнем экспрессии Е-сасШепп по стадиям (%2, р<0,05).

1 - папиллярный I типа;

2 - папиллярный II типа;

3 - хромофобный классический;

4 - хромофобный эозинофильный;

5 - светлоклеточный.

При оценке экспрессии клеточных ферментов, в частности матриксных металлопротеиназ (ММР2, 9), не было выявлено прогностических закономерностей (табл. 7), однако по данным других исследователей, эти белки были отнесены к группе факторов неблагоприятного течения несветлоклеточного почечно-клеточного рака (Регег-Огааа ТЬ. е1 а!., 2009).

Таблица 7

Результаты экспрессии клеточных ферментов в разных вариантах _почечно-клеточного рака___

Вариант рака, N (%) ММР2 ММР9 р504 СОХ2 Б1к

Папиллярный 1 типа 8 (27) 19 (63) 20 (67) 2(7) 11 (37)

Папиллярный 2 типа 7 (28) 18 (72) 18(75) 10 (40) 14 (58)

Хромофобный классический 0 6(25) 0 13 (55) 17 (71)

Хромофобный эозинофильный 2(12) 3(17) 2(12) 1(7) 7 (47)

Светлоклеточный 0 0 3(35) 0 3(25)

Оценка экспрессии рацемазы (р504) имеет большое значение для дифференциальной диагностики почечно-клеточных карцином. Белок р504 экспрессируется преимущественно папиллярным раком, однако в литературе встречаются данные о его экспрессии и другими вариантами почечно-клеточных карцином (ТакаЬаэЫ К. й а!., 2006). В нашем исследовании гиперэкспрессия рацемазы была отмечена в 70% папиллярных опухолей, 12% хромофобных, 25% светлоклеточных карцином (табл. 7). Значимых закономерностей распределения белка получено не было.

ЮС0» 90° о

80°о

70%

60« о

50« о 40° о 30" о

20° о 10° о

0°о

|рТЗ-4 ■ рТ 1 -2

В результате проведенного исследования нами не было выявлено прогностических закономерностей выживаемости больных и экспрессии Flk (рецептора VEGF 2 типа). Значение сосудистых факторов роста и их рецепторов в патогенезе почечно-клеточного рака широко изучается в связи с частыми генетическими нарушениями этих опухолей (Meloni-Ehrig A.M., 2002). При этом данные об их прогностической значимости противоречивы. Некоторые авторы рассматривают высокий уровень экспрессии Flk как предиктор повышенного риска гематогенных метастазов, демонстрируя корреляцию экспрессии с размером опухоли и степенью дифференцировки (Rivet J. et al„ 2008; Zhang Y.H., Cui W„ 2010).

По данным литературы, гиперэкспрессия циклооксигеназы 2 типа (СОХ2) ассоциирована с благоприятным прогнозом почечно-клеточных карцином (Schwandt A. et al., 2011). По полученным результатам, мы не смогли подтвердить эти наблюдения. Напротив, в нашем исследовании гиперэкспрессия СОХ2 чаще выявлялась в низкодифференцированных карциномах (р<0,01) и была отмечена умеренная положительная корреляция экспрессии СОХ2 и ММР9 (г=0,47; р=0,004). В исследованиях Tawfik O.W. с соавт. (2007) и Sozen S. с соавт. (2008) описана корреляция гиперэкспрессии СОХ2 и низкой степени дифференцировки опухоли. Кроме того, экспрессия СОХ2 активируется при повышении уровня CD44. Таким образом, СОХ2, р504 и Flk были отнесены к белкам с неопределенным прогностическим потенциалом.

Для определения прогностической значимости группы белков с неопределенным потенциалом были использованы методы многомерного анализа данных. При оценке классификационной таблицы предлагаемой модели прогноза несветлоклеточного почечно-клеточного рака, был отмечен высокий процент верно классифицированных образцов: в группе опухолей с благоприятным течением - 92,31% совпадений, с неблагоприятным - 66,67%, в целом по выборке - 85,71%. При дальнейшем анализе апостериорных вероятностей, было замечено, что большинство опухолей с гиперэкспрессией топоизомеразы, р504, СОХ2 и Flk с высокой вероятностью были включены в группу неблагоприятного течения даже при коэкспрессии маркеров благоприятного прогноза, таких как EMA, E-cadherin, PTEN. На основании этих наблюдений, мы отнесли коэкспрессию названных белков к факторам неблагоприятного прогноза несветлоклеточного почечно-клеточного рака.

При оценке влияния рассматриваемых параметров на прогноз почечно-клеточного рака методом регрессионного анализа было отмечено, что при определении прогноза этих опухолей первостепенное значение имеют факторы неблагоприятного течения (табл. 8). Для разработки диагностического алгоритма необходимо проведение обширного дискриминантного и дисперсионного анализа, что позволит ранжировать влияние каждого фактора на прогноз несветлоклеточного почечно-клеточного рака.

Таблица 8

Результаты оценки прогностической значимости белков благоприятного и

неблагоприятного течения в группе почечно-клеточного рака методом _логистической регрессии

Параметр Маркеры благоприятного течения Маркеры неблагоприятного течения

Уровень значимости модели Р=0,09 Р<0,05

лис* 0,77 0,79

Стандартная ошибка 0,09 0,08

95% доверительный интервал 0,60 - 0,89 0,63-0,91

*AUC - area under curve - площадь под ROC кривой.

Генетические особенности папиллярного рака. Группа почечно-клеточных карцином характеризуется большим разнообразием генетических нарушений. В рамках нашего исследования был оценен аллельный дисбаланс и микросателлитная нестабильность в группе папиллярного рака.

Частота аллельного дисбаланса по 0182142 составила 30% (10/33), Б133465 -29% (10/34) информативных случаев (гетерозиготных образцов, где возможно сравнение разных аллелей), по двум локусам одновременно - 43% (6/14) случаев. В целом, с помощью системы из двух ЗТЯ-маркеров была определена частота аллельного дисбаланса, равная 37% (14/38) информативных случаев папиллярного рака, что является высоким показателем для этого типа опухолей (1л X. е1 а1., 2009), однако не было обнаружено значимой связи с клиническими и морфологическими характеристиками.

При генотипировании и анализе аллельного дисбаланса области Ц32 в части исследуемых опухолей была обнаружена микросателлитная нестабильность по локусам Б182142 и Б183465. При оценке зависимости микросателлитной нестабильности папиллярного рака от степени дифференцировки опухоли было отмечено нарастание частоты генетических нарушений при снижении дифференцировки (табл. 9).

Таблица 9

Микросателлитная нестабильность по локусам dls2142 и dls3465 в папиллярном раке разной степени диффренцировки_

Группа Частота МН*, % (чел.) Критерий Сиирмена, р ЧастотаМН % (доля) Критерий Фишера, р

G1 (п = 8) 25,0 (2/8) 0,083 48 (13/27) 0,405

G2(n= 19) 57,9(11/19)

G3 (п = 6) 83,3 (5/6) 71 (5/7)

G4 (п= 1) 0

*МН - микросателлитная нестабильность.

22

Мы не обнаружили ассоциации аллельного дисбаланса с клиническими и морфологическими характеристиками папиллярного рака, возможно, из-за малого количества пациентов с этим нарушением. Тем не менее, наблюдаемые электрофореграммы, по крайней мере, в 6 образцах с показателем более 0,9 для большего пика, были более характерны для потери гетерозиготности, а не для увеличения копийности одного из аллелей локуса lq31-32.

Кроме того, при генотипировании части образцов папиллярного рака аберрантные аллели, возникшие в результате микросателлитной нестабильности, были обнаружены не только в опухоли, но и в условно нормальной, морфологически неизмененной ткани почки, взятой вблизи опухолевого узла. Это наблюдений подтверждает теорию опухолевого поля R.A. Willis (Costa V.L. et al., 2007). В статье T.D. Jones с соавт. (2005) приведены доказательства независимого происхождения опухолевых узлов при мультифокальном папиллярном раке. С помощью лазерной микродиссекции были выделены изолированные группы опухолевых клеток, принадлежащие разным спорадическим мультифокальным папиллярным карциномам. Методом анализа аллельного дисбаланса по 6 STR-маркерам (D3S1285, D7S522, D9S171, D16S507, D17S1795, TP53-IVS1) и исследованием инактивации Х-хромосомы было показано, что в большинстве случаев опухоли внутри одной и той же почки имеют разные паттерны генетических нарушений и представляют собой независимо возникшие карциномы (Jones T.D. et al., 2005).

Выводы

1. Группа несветлоклеточных карцином характеризуется более благоприятным прогнозом по сравнению с группой светлоклеточных: кумулятивная трехлетняя выживаемость пациентов составляет 97% и 69%, соответственно, (р<0,01). Прогноз несветлоклеточных карцином ухудшается в ряду: эозинофильный вариант хромофобного рака, папиллярный рак 1 типа, классический вариант хромофобного рака, папиллярный рак 2 типа при оценке кумулятивной трехлетней выживаемости.

2. Значимыми факторами прогноза несветлоклеточного почечно-клеточного рака являются: наличие некроза (снижение кумулятивной выживаемости на 13%, р<0,005) и размер опухолевого узла (трехлетняя выживаемость при локализованных формах - 98%, при местно-распространенных - 94%, р<0,05). Для почечно-клеточного рака прогностическим фактором служит наличие веретеноклеточной дифференцировки (р=0,016).

3. Снижение числа ксантомных клеток является благоприятным прогностическим признаком папиллярного рака (р<0,05).

4. Гиперэкспрессия неспецифической молекулы адгезии CD44 и коэкспрессия клеточных ферментов циклооксигеназы 2 типа, рацемазы, топоизомеразы, рецептора эндотелиального фактора роста 2 типа относится к независимым факторам неблагоприятного прогноза несветлоклеточного

почечно-клеточного рака (пятилетняя выживаемость 18% при гиперэкспрессии CD44, 70% - при низком уровне экспрессии белка, р<0,05).

5. Впервые обнаружена микросателлитная нестабильность по локусам D1S2142 и D1S3465 не только в папиллярном раке, но и в морфологически неизмененной ткани почки вблизи опухолевого узла.

Практические рекомендации

Стандарт патологоанатомического заключения по операционному материалу при почечно-клеточном раке должен включать:

— гистологический тип опухоли (для папиллярного рака подтип 1 или 2, для хромофобного рака классический или эозинофильный вариант и преобладающее строение опухоли);

— степень дифференцировки по S.A. Fuhrman (для хромофобного рака степень дифференцировки по S.A. Fuhrman и G.P. Paner);

— наличие веретеноклеточного компонента (при любом его проценте в опухоли);

— наличие и выраженность некроза опухоли;

— наличие сосудистой инвазии (инвазия почечной вены и ее ветвей указывается отдельно);

— инвазию чашечно-лоханочной системы;

— инвазию паранефральной клетчатки;

— вовлеченность прилежащих органов и лимфатических узлов;

— состояние края резекции (при органосохраняющих операциях).

Для определения дополнительных факторов прогноза целесообразно выполнение иммуногистохимического исследования с определением следующей панели антител: Ki-67, р53, PTEN, р27, р504, CD44, р27, PTEN, Е-cadherin.

Маркерами неблагоприятного течения почечно-клеточного рака являются гиперэкспрессия Ki-67, р53, р504, CD44; коэкспрессия СОХ2, р504, topoll, Flk.

Маркерами благоприятного течения почечно-клеточного рака - р27, PTEN, E-cadherin.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в ведущих периодических изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Москвина JT.B., Андреева Ю.Ю., Мальков П.Г. Прогностические факторы почечно-клеточного рака // Архив патологии. - 2011. - №6. - С. 47-52.

2. Москвина JI.B., Михайленко Д.С., Андреева Ю.Ю., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Аллельный дисбаланс в области lq32 и микросателлитная нестабильность при папиллярной карциноме почки. // Архив патологии. -2012.-№. 2-С,- 10-13.

3. Москвина JI.B., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Петров А.Н., Мальков П.Г. Прогностическая значимость экспрессии молекул адгезии для несветлоклеточных вариантов почечно-клеточного рака// Архив патологии -2013 -№4. - С. 3-8.

4. Москвина JI.B., Андреева Ю.Ю., Мальков П.Г., Франк Г.А., Алексеев Б.Я, Калпинский А.С., Прядилова Е.А. Клинически значимые морфологические аспекты почечно-клеточного рака // Журнал онкологии им. П.А. Герцена. - 2013. - №4. - С. 34-39.

Публикации в руководствах:

5. Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Москвина Л.В., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Франк Г.А. Рак почки. Морфология, иммуногистохимия, генетика // Национальное руководство по онкоурологииюю - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - с. 132-150.

6. Опухоли почки. Морфологическая диагностика и генетика: Руководство для врачей. Под ред. Ю.Ю.Андреевой, Г.А.Франка/ Франк Г.А., Андреева Ю.Ю., Москвина Л.В., Завалишина Л.Э., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Данилова Н.В., Мальков П.Г. РМАПО. - М.: РМАПО, 2012. - 66 с.

Публикации в материалах конгрессов, съездов и конференций:

7. Москвина Л.В., Михайленко Д.С., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Аллельный дисбаланс в области lq32 и микросателлитная нестабильность при папиллярной карциноме почки. // Тезисы к конференции молодых ученых МГНЦ РАМН. - 2011. - С. 15.

8. Mikhaylenko D.S., Moskvina L.V., Andreeva Y.Y., Mikhalchenko A.E., Zaletayev D.V.. Microsatellite instability and allelic inbalance in papillary renal cell carcinoma as potential molecular genetic markers. // Клиническая онкология. - 2012. - № 1 (спец.). - С. 79. (Тезисы съезда онкоурологов стран СНГ, Киев).

9. Михальченко А.Е., Москвина Л.В., Андреева Ю.Ю., Михайленко Д.С. Молекулярно-генетические изменения в папиллярной карциноме почки // Тезисы конференции молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН, Москва, Россия.-2012.-С. 9.

10.Moskvina L., Mikchailenko D., Alekseev В., Andreeva J., Frank G., Kalpins-kiy A., Nyushko K., Pryadilova E. Morphological assessment of prognostic factors of papillary renal cell cancer. // Urology. - 2012. - vol. 80. (supplement ЗА) . - p. S246-247.

11.Moskvina L.V., Andreeva Yu.Yu., Malkov P.G., Zavalishina L.E., Frank G.A. Prognostic utility of CD44, E-cadherin and EMA for non-clear cell renal cell cancer. // Virchows Archiv. - 2013. - Vol. 463. - №2. - p. 352.

12.A.E. Mikhalchenko, L.V. Moskvina, D.S. Mikhaylenko, D.V. Zaletayev. Allelic imbalance and microsatellite instability in papillary renal cancer // Abstracts

of European Human Genetics Conference 2013, Paris, France // European Journal of Human Genetics. - 2013. - Vol. 21 (suppl 2). - P. 527.

Соискатель

Москвина JI.В.

Подписано в печать:

18.10.2013

Заказ № 8925 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 autorefefat.ru