Автореферат и диссертация по медицине (14.01.05) на тему:Прогностическое значение, механизмы развития и возможные способы преодоления резистентности к антиагрегантным препаратам (аспирин и клопидогрел)у больных с острым коронарным синдромом

004609663 На правах рукописи

Фролова Наталья Сергеевна

Прогностическое значение, механизмы развития и возможные способы преодоления резистентности к антиагрегантным препаратам (аспирин и клопидогрел) у больных с острым коронарным синдромом

14.01.05 Кардиология 03.01.04 Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 СЕН 2010

МОСКВА 2010

004609663

Работа выполнена в отделе неотложной кардиологии Института клинической кардиологии им. Л.Л. Мясникова ФГУ «РКНПК Минздравсоцразвития РФ».

Научный руководитель:

Доктор медицинских паук, профессор

Руда Михаил Яковлевич

Доктор биологических наук, профессор

Добровольский Анатолий Борисович

Официальные оппопенты:

Доктор медицинских наук, профессор

Подзолков Валерий Иванович

Доктор медицинских наук, профессор

Титов Владимир Николаевич

Ведущая организация:

ГУ ВПО РГМУ Росздрава

Защита диссертации состоится «30» сентября_2010 г. в 13.30 на заседании

диссертационного совета (Д 208.073.04) но присуждению ученой степени кандидата наук в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе Минздравсоцразвития РФ (Москва, 121552, 3-я Черепковская ул., д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Т.Ю. Полевая

Список сокращений

АДФ- адснозиндифосфат

АК - арахидоповая кислота

ИБС - ишемичсская болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

ИЛ-6 - интерлейкин 6

ИЛ-10 - интерлейкин 10

ИМ - инфаркт миокарда

КК - коронарный кровоток

КФК - креатинфосфокиназа

ЛЖ - левый желудочек

НК - недостаточность кровообращения

НС - нестабильная стенокардия

ОКС - острый коронарный синдром

ОКСпЗТ - острый коронарный синдром с подъемом сегмента БТ ОКСбпБТ - острый коронарный синдром без подъема сегмента БТ ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения СРБ - С-реактивный белок

ТБА - траислюмииальная баллонная ангиопластика

ТЛТ - тромболитическая терапия

ТхЛ2 - тромбоксан А2

у\УР - фактор Виллебрандта

ЦОГ1 -циклооксигеназа 1

ЭКГ - электрокардиограмма (графия)

ЭХОКГ - эхокардиография

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. В патогенезе острого коронарного синдрома (ОКС) ведущую роль играет тромбоз коронарных артерий, развитие которого начинается с адгезии и агрегации тромбоцитов в области повреждения эндотелия. Применение аспирина и клопидогрсла, ингибирующих агрегацию тромбоцитов, сегодня является основой терапии ОКС. Эти препараты назначаются в дозах, эффективность которых доказана в крупных исследованиях. Вместе с тем известно, что у ряда больных, несмотря на проводимую терапию, происходят тромботические осложнения. Одной из причин этого может быть резистентность к антитромбоцитарным препаратам или недостаточная эффективность назначенной дозы.

В настоящее время резистентность к антитромбоцитарным препаратам, ее причины и механизмы развития, а также возможность преодоления активно изучаются. Важное место занимает исследование генетических аспектов резистентности.

Вместе с тем, ряд основополагающих моментов проблемы остаются неясными. Данные литературы противоречивы. Достаточно указать, что до настоящего времени не решено, что считать резистентностью к антиагрегантным препаратам, по клиническим или биологическим критериям ее диагностировать, что принять за норму, и какие тесты оптимальны для распознавания и количественной характеристики этого состояния. Нам представлялось важным оценить динамику агрегации тромбоцитов на фойе терапии антиагрегантами у больных ОКС, выявить частоту резистентности к антиагрегаитам в российской популяции больных, проанализировать связь этого феномена с прогнозом заболевания и попытаться найти практически значимые методы ее преодоления.

Цель исследования. Изучить частоту резистентности к аспирину и клопидогрелу при ОКС, возможные причины и механизмы ее развития,

клиническое значение и способы преодоления, оценить влияние этого явления па прогноз заболевания.

Задачи исследования:

Í Выявить частоту развития резистентности к аспирину, определить ее варианты, возможные способы преодоления.

2 Выявить частоту развития резистентности к клопидогрелу.

3 Оценить влияние резистентности к антиагрегаитам па прогноз у больных с ОКС по данным однолетнего наблюдения.

4 Проанализировать влияние полиморфизмов генов циклооксигеназы-1 (A-842G), гликопротсина Ша (ЬеиЗЗРго), рецептора P2Y]2 - (С18Т и G36T) и фермента CYP3A4 (A293G) семейства цитохромов Р450 па развитие резистентности к антиагрегаптам.

5 Определить связь маркеров воспаления (С-рсактивного белка, иитерлейкина-6 и интсрлсйкина-10) с резистентностью к аспирину и клопидогрелу.

Научная новизна.

Показано, что резистентность к аспирину выявляется в первую неделю терапии, наблюдается значительно чаще у больных ОКС с подъемом ST (OICCnST), чем у больных ОКС без подъема сегмента ST (OKC6nST) и связана с активацией воспалительного ответа. У резистентных больных, продолжающих прием стандартной дозы аспирина, уровень агрегации тромбоцитов значительно снижается через месяц терапии. Повышение дозы аспирина до 300 мг не влияет на динамику агрегации тромбоцитов. У большинства резистентных к аспирину больных выявлено повышение 11-дегидротромбоксаиа В2 (11-ДГТХВ2), что свидетельствует о преобладании истинного типа резистентности. Уровень 11-ДГТХВ2 исходно значительно выше в группе OKCnST, чем в группе OKC6nST, затем достоверно снижается

в обеих группах. Высокий уровень 11-ДГТХВ2 на терапии аспирином связан с неблагоприятным прогнозом.

У больных ОКС, получающих терапию клопидогрелом, снижение индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов зависит от ее исходного значения и дозы препарата. Связи резистентности к клопидогрелу с вариантом течения ОКС и исходами за период наблюдения не выявлено. У резистентных к клопидогрелу больных отмечена тенденция к большей частоте встречаемости гетерозиготного варианта A293G гена цитохрома CYP3A4 и гомозиготного варианта С18С гена рецептора P2Yn тромбоцитов.

Практическая значимость

Определение уровня агрегации тромбоцитов на фоне терапии антиагрегантными препаратами может быть полезно для оценки эффективности терапии у больных ОКС.

Увеличение дозы аспирина до 300 мг резистентным больным не рекомендуется, так как не оказывает существенного влияния на динамику агрегации тромбоцитов и прогноз.

Резистентные к аспирину имеют более высокий уровень маркеров воспаления, чем чувствительные, что может быть использовано для выявления группы больных с повышенным риском развития резистентности к препарату.

Использование высоких нагрузочных доз клопидогрела (600 мг вместо 300 мг) может быть рекомендовано для уменьшения частоты резистентности к клопидогрелу.

Публикации. По теме диссертации опубликовано две статьи и 3 тезисов. Материалы диссертации доложены на конференции «Перспективы кардиологии в свете достижений медицинской науки», Москва 18.05.07.

Апробация диссертации состоялась 22 декабря 2009г на межотделенческой конференции ФГУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ. Диссертация рекомендована к защите.

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 133 странице машинописи и состоит из введения, четырех глав (обзор данных литературы, материал и методы исследования, результаты и обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 5 отечественных и 171 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 19 рисунками.

Материал и методы исследования

Структура исследования

Работа выполнена в Отделе неотложной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический Научно-производственный комплекс Росмедтехнологий». В исследование были включены больные с ОКС старше 18 лет независимо от пола: 51 больной с ОКСпЭТ и 49 больных без подъема сегмента БТ (ОКСбпБТ).

В группу ОКСпБТ включены больные с типичным ангинозным приступом, сопровождающимся стойкой (не менее 20 минут) элевацией сегмента 8Т в сочетании с повышением маркеров некроза миокарда: тропоиин Т>0,1 нг/мл (в норме - отрицательный), МВ КФК (норма <19 Е/л). В группу ОКСбпБТ включали больных с нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда без подъема сегмента 8Т, отвечающих как минимум двум из ниже перечисленных критериев: 1) ангинозная боль продолжительностью не менее 20 минут; 2) увеличение содержания тропонина Т; 3) признаки ишемии миокарда (депрессия сегмента БТ >1 мм, или инверсия Т >3 мм в двух последовательных отведениях).

Критерии исключения:

Непереносимость аспирина; догоспитальное введение тромболитических препаратов и/или нефракционировапного гепарина; длительный предшествующий прием антиагрегантов; прием других препаратов, содержащих АСК; активное внутреннее кровотечение; кардиогепный шок; тяжелые сопутствующие заболевания, самостоятельно влияющие на прогноз (например, злокачественные новообразования); развитие ОКС, не связанное с прогрессированием коронарного атеросклероза (анемии, тиреотоксикоз); количество тромбоцитов менее 200 тыс/мкл.

Критерием резистентности к аспирину считали уровень агрегации тромбоцитов, индуцированный 1,6 мМ (0,5 мг/мл) арахидоновой кислотой (AK) in vitro >20% на 7 сутки приема препарата [Gum с соавт., 2003]. Согласно принятому критерию 11 больных с ОКС были резистентны к аспирину и 89 чувствительны. Всем резистентным больным доза аспирина была увеличена до 300 мг/сутки после проведения пробы in vitro. Дополнительно было обследовано 10 больных с OKCnST в качестве группы сравнения с фармакокинетическим типом резистентности к аспирину: они продолжали принимать 100 мг аспирина в день. Фармакокииетический тип резистентности к аспирину диагностировался, если при пероралытом приеме аспирина уровень агрегации тромбоцитов оставался на прежнем уровне, а после добавления аспирина in vitro отмечалось снижение ее показателей менее 20% [Weber с соавт., 2002].

Критерий резистентности к клопидогрелу — снижение индуцированной 20 мкМ АДФ агрегации тромбоцитов <10% (дельта%) на 7 сутки приема препарата по сравнению с исходным уровнем [Gurbel с соавт., 2003]. Клопидогрел принимали 75 больных: 30 больных с OKCnST и 45 человек с OKCönST. Согласно выбранному критерию, чувствительными к клопидогрелу были 54 больных и 21 (28%) — резистентными.

Протокол исследования.

поступлении,

далее 100 мг/сут

Рисунок 1а. Выявление резистентности к аспирину.

Рисунок 16. В группе сравнения, несмотря на фармакокинетический тип резистентности к аспирину, больные продолжали принимать 100 мг/сут._

далее 75 мг/сут Рисунок 1в. Выявление резистентность к клопидогрелу.

Клиническая характеристика групп

Клинико-демографическая характеристика групп больных с ОКСпБТ и ОКСбпЯТ представлена в таблице 1. Группы были сопоставимы по основным характеристикам, хотя имелись некоторые различия. В группе ОКСпЗТ было больше мужчин и курящих.

Показатели OKCnST п=51 OKC6nST п=49 Р

Возраст (лет) (М±а) 55,7±10,59 57,6±10,53 0,37

Поп (м) 92% 76% 0,03

Курение 71% 51% 0,06

Злоупотребление алкоголем (в анамнезе -лечение от алкогольной зависимости) 16% 8% 0,36

ИМ в анамнезе 12% 35% 0,01

АГв анамнезе 50% 65% 0,16

Сахарный диабет -впервые выявленный -в анамнезе 13% 14% 9% 11% 0,40 0,15

Мультифокальный атеросклероз 16% 27% 0,34

Наследственность (сердечно-сосудистая патология у ближайших родственников) 16% 16% 1,00

Холестерин (ммопь/п) (Mia) 5,7±1.25 6,2+7,18 0,05

Аспирин на догоспитальном этапе 63% 82% 0,05

Триглицериды (ммоль/л) (М±о) 1,67±1,4 1,75±1,8 0,93

Таблица 1. Сравнительная характеристика больных с ОКСпБТ и ОКСбпБТ.

У больных ОКСбиЗТ чаще отмечались инфаркты миокарда, перенесенные ранее, был выше уровень холестерина. В этой же группе больные чаще принимали аспирин на догоспитальном этапе: 82% и 63% соответственно в группе ОКСпБТ, р=0,05.

Большинству больных с ОКСпБТ проведена реперфузионная терапия. Тромболитическая терапия (ТЛТ) проурокиназой проводилась только в стационаре у 22 (43%) больных. Транслюминальная баллонная ангиопластика (ТБА), которая выполнялась как самостоятельный метод

лечения (первичная ТБА), или после неэффективной ТЛТ («спасительная» ТБА), проведена у 30 (59%) больных.

В дальнейшем больные получали стандартную медикаментозную терапию, включавшую в себя антиагрсганты, бета-адрсноблокаторы, ингибиторы ангиотензинпревращающсго фермента (АГГФ), статипы, при необходимости - диуретики. При выявлении ишемии миокарда в период госпитализации больным рекомендовалось проведение коронарной ангиографии, а в последующем - соответствующее лечение.

Больным с ОКСбпБТ назначалась стандартная медикаментозная терапия. Части больных из этой группы проведено экстренное или плановое эндоваскулярнос лечение.

Средний период наблюдения за больными составил 325,2±19 дней. Регистрируемыми событиями считали: смерть от любых причин, развитие нсфатального инфаркта миокарда, повторную госпитализацию в связи с нестабильной стенокардией, острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК), тромбозы различной локализации.

Методы исследования

В течение госпитализации все больные проходили стандартное клинико-ииструменталыюе обследование, включающее ежедневные осмотры, клинические и биохимические анализы крови, ЭКГ, ЭХОкг, холтеровское мониторирование ЭКГ, рентгенографию органов грудной клетки, нагрузочные тесты (стрессЭХОкг с физической нагрузкой (тредмил) или с инфузией добутамина или чреспищсводную электростимуляция (ЧПЭС)), а также другие исследования, необходимые для диагностики и лечения конкретного больного.

Исследование агрегационпой способности тромбоцитов.

Исследование агрегации тромбоцитов проводилось исходно, через 7 и 30 дней, а также через 6-8 месяцев с момента госпитализации. Кровь забирали в пробирки, содержащие 1/10 объема 3,2% цитрата натрия, и обрабатывали при комнатной температуре в течение одного часа после взятия. Обогащенную тромбоцитами плазму (PRP-pIatelet rich plasma) получали центрифугированием 10 минут при 1000 об/мин при комнатной температуре и отбирали в сухую пробирку. Для получения бедной тромбоцитами плазмы (poor platelet plasma - РРР) оставшуюся кровь центрифугировали еще 10 минут при 3000 об/ мин (при уровне тромбоцитов более 600 тыс/мкл PRP разводилась РРР до -300 тыс/мкл). Подсчет тромбоцитов проводился в PRP. Больные с уровнем тромбоцитов менее 200 тыс/мкл из исследования исключались. Уровень агрегации измерялся на двухканальном лазерном анализаторе LA 230 НПФ «Биола», с использованием в качестве индукторов 0,5 мг/мл АК, или АДФ в диапазоне концентраций от 1 до 20 мкМ.

Если на 7 сутки приема аспирина уровень агрегации был равен или превышал 20%, то до принятия решения о целесообразности увеличения дозы препарата проводилось исследование чувствительности к аспирину in vitro. Для этого в кювету с PRP добавляли 100 мкг растворенного аспирина и через 15 минут инкубации проводилось повторное измерение агрегации. В случае выявления фармакокинетического типа резистентности дозу аспирина увеличивали до 300 мг/сут.

В контрольной группе больные с OKCnST, имеющие фармакокинетический тип резистентности к аспирину, продолжали получать стандартную дозу аспирина.

Определение 11-дегидротромбоксана В2.

Для определения уровня 11- ДГТХВ2 образцы мочи собирали при поступлении, а также утреннюю порцию мочи на 7 день, 30 день и через 6-8

месяцев. Для консервации добавляли индометацин (250 мкг/мл) и замораживали при температуре -60°С для серийных определений.

После размораживания образцы центрифугировали при комнатной температуре при 10000 g в течение 10 минут. Для определения 11-ДГТХВ2 использовали наборы реактивов производства «Neogen». Результаты представлялись в виде соотношения 11-ДГТХВ2/ креатинин (нг/ммоль).

Маркеры воспаления.

Исследования маркеров воспаления проводились в лаборатории клинической иммунологии РКНПК (руководитель - проф. Масенко В.П.)

Определение «свободных» форм ИЛ-6 и ИЛ-10 проводилось методом ИФА с использованием наборов фирмы BcndcrMcdSystems (BMS). Порог чувствительности метода составлял 0,92 пг/мл для ИЛ-6, и - 0,99 пг/мл для ИЛ-10. Определение С-реактивного белка (СРБ) проводилось иммунонсфеломстричсским методом с использованием набора «Cytoimmune Science» (норма <3 мкг/мл).

Генетический анализ.

В нашей работе исследован ряд генетических полиморфизмов, которые потенциально могут быть связаны с развитием резистентности к антиагрегантам.

- Полиморфизм гена субъединицы Illa ГП Ilb/IIIa - ЬеиЗЗРго, также известный как Р1Л'/Р1Л2.

- Полиморфизм гена ЦОГ-1 A842G.

- Полиморфизмы гена рецептора P2Y]2: CI 8Т и G36T.

- Полиморфизм гена CYP3*A4 (A293G).

Исследование проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз PstI, Mnll, Seel и Mspl. ДНК выделяли фенол-хлороформным

методом из венозной крови, забранной в пробирку с ЭДТА. Продукты рестрикционного анализа разделяли электрофоретически и визуализировали в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием (работа выполнена к.б.н. Сироткиной О.В., с.н.с. лаборатории молекулярной генетики человека Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН).

Статистическая обработка данных.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов прикладных статистических программ 8ТАТ18Т1СА V 6.0. Для каждой из непрерывных величин в таблицах приведены либо среднее (М) и стандартное отклонение (о), либо медиана и квартили распределения. При сравнении групп в зависимости от типа распределений анализируемых показателей использованы ^критерий Стыодепта или и-критерий Манна-Уитпи. Для анализа таблиц сопряженности 2x2 применялся двусторонний точный критерий Фишера. С использованием бинарной логистической регрессионной модели вычисляли отношение шансов (ОШ) и его доверительные интервалы (ДИ). Значимость регрессии (р) оценивали с помощью метода максимального правдоподобия. Кривые выживаемости Каплана-Мейера оценивались по отсутствию конечных точек в течение периода наблюдения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Резистентность к аспирину.

Клиническая характеристика больных с ОКС, чувствительных и

резистентных к аспирину.

На седьмые сутки терапии аспирином уровень индуцированной АК агрегации, превышающий 20%, был выявлен у 11 из 100 больных. Причем в подавляющем большинстве случаев (10 из 11, р=0,008) резистентность выявлялась у больных ОКСиЯТ.

В связи с этим сравнение клинических характеристик резистентных и чувствительных больных проводили именно в группе ОКСпБТ. По

большинству показателей и медикаментозной терапии резистентные и чувствительные к аспирину больные не различались. В группе резистентных чаще встречались лица, злоупотребляющие алкоголем, а также имеющие признаки мультифокального атеросклероза (таблица 2).

В исследование дополнительно была включена группа сравнения из 10 больных с ОКСпБТ, резистентных к аспирину, которым дозу препарата не увеличивали. По клиническим характеристикам резистентные больные, получавшие различные дозы аспирина не различались.

Показатели Группа резистентных, п=10 Группа чувствительных, п=41 Р

Возраст (лет) (М±а) 57,819,25 55,2110,90 0,60

Пол (м) 100% 90% 0,60

Курение 90% 66% 0,20

Злоупотребление алкоголем 40% 10% 0,04

ИМ в анамнезе 10% 12% 1,00

АГ в анамнезе 40% 54% 0,50

Сахарный диабет 40% 24% 0,40

Мультифокальный атеросклероз 40% 12% 0,06

Наследственность 0% 20% 0,3

Холестерин (ммоль/л) (М+ст), при поступлении 5,6±1,32 5,811,22 0,70

Триглицериды (ммоль/л) (М±б) 1,97±1,7 2,21±1,6 0,21

Эритроциты (млн/мкл) 4,7310,44 4,84+0,49 0,8В

Тромбоциты (тыс/мкл) 261,9±61,6 279,9+67,3 0,82

Таблица 2. Клинико-демографическая характеристика больных с ОКСпЭТ на момент поступления, резистентных и чувствительных к аспирину.

Динамика агрегации тромбоцитов.

У чувствительных больных исходный уровень агрегации тромбоцитов был ниже, чем у резистентных, снижался к концу первой недели лечения с 14,1±2,3% до 1,3±0,8% (р=0,016), а далее практически не изменялся: 30 день - 2,84±1,2% (р=0,7), в конце периода наблюдения - 3,43±1,8% (р=0,89).

15

В группе резистентных больных наблюдалось значительное повышение агрегации от 26,6±5,21% до 48,6±6,7% через 7 дней приема стартовой дозы аспирина, р<0,0001 (рисунок 2). Увеличение дозы аспирина до 300 мг/сутки сопровождалось снижением агрегации к 30 дню наблюдения у 9 из 10 резистентных больных. У одного больного снижение агрегации выявлено только к 6 месяцу наблюдения. Снижение средних значений агрегации к 30 дню наблюдения было статистически достоверным (7,1±2,01%, р<0,0001, по сравнению с 7 днем). К концу периода наблюдения показатель составил 4,4±1,8% (р=0,52, по сравнению с 30 днем).

Рисунок 2. Динамика агрегации тромбоцитов у резистентных и чувствительных к аспирину больных ОКСпБТ в основной группе.

резистентные —•— чувствительные

48,6

месяцев

Период наблродения

Для выяснения возможных причин резистентности в исследование дополнительно включили 10 больных с ОКСпБТ с фармакокинетичсским типом резистентности, которым доза аспирина не увеличивалась.

Несмотря на это, у них также отмечалось достоверное снижение агрегации тромбоцитов к 30 дню наблюдения (рисунок 3). Кривые динамики агрегации тромбоцитов у резистентных больных, получавших различные дозы аспирина, сопоставимы и не различаются достоверно.

■ резистентные, 300 мг —■—резистентье, 100 мг

исходно 7дней ЗОдней 6-8

Период наблюдения месяЧев

Рисунок 3. Динамика агрегации тромбоцитов у резистентных больных, получавших 100 и 300 мг аспирина (группа сравнения).

Изменения метаболита тромбоксаиа А2- 11-дегидротромбоксаиа В2.

У включенных в исследование больных ОКС наблюдалась достоверное снижение уровня 11-ДГТХВ2 в течение первой недели лечения от 619±98 до 438±56 нг/ммоль креатипина, р<0,01. В дальнейшем существенных изменений этого показателя не отмечалось. Уровень метаболита составил 436±62 нг/ммоль креатинина на 30 день и 410±69 нг/ммоль креатинипа к концу периода наблюдения.

В группе ОКСпБТ исходный уровень 11-ДГТХВ2 был выше, чем в группе ОКСбпБТ (935±92 по сравнению с 501±64 нг/ммоль креатинина, р=0,04). К 7 дню терапии уровень 11-ДГТХВ2 достоверно снижался в обеих группах, но снижение было более выраженным у больных ОКСп8Т (с 935±92 до 476±52 нг/ммоль креатинипа, р <0,0001), чем у больных ОКСбпБТ (с 501±64 до 373±76 нг/ммоль креатинина, р=0,03). В дальнейшем в обеих группах уровень 11-ДГТХВ2 продолжал снижаться, однако изменения по сравнению с 7 днем не были статистически значимыми (таблица 3).

Период наблюдения ОКСпЭТ, М±а ОКСбпБТ, М±о Р

Исходно 935±92 501±В4 0,04

7 дней 476±52 373±76 0,80

30 дней 441 ±59 406±31 0,80

6 — 8 месяцев 418±84 400±88 0,90

Таблица 3. Значения 11-ДГТХВ2 (нг/ммоль креатинина) у больных с различными формами ОКС.

Общепринятый уровень метаболита, превышение которого позволяло бы диагностировать резистентность к аспирину, на сегодня не установлен. Мы условно приняли, что уровень 11-ДГТХВ2 на 7-й день терапии, превышающий медиану, которая составила 438 нг/ммоль креатинина, отражает недостаточное ингибирование синтеза тромбоксана аспирином.

При сопоставлении данных агрегации тромбоцитов индуцированной ЛК с уровнем 11-ДГТХВ2 оказалось, что у 8 из 11 (73%) резистентных к аспирину больных наблюдался высокий уровень метаболита, что свидетельствует об истинном типе резистентности. Ложный тип резистентности к аспирину, когда, несмотря на отсутствие подавления агрегации тромбоцитов, уровень метаболита тромбоксана снижался, выявлен только у 3 больных (27%). Таким образом, в нашей работе чаще отмечался истинный тип резистентности к аспирину, р=0,02.

Резистентность к клопидогрелу.

Клиническая характеристика больных с ОКС, чувствительных и

резистентных к клопидогрелу.

Согласно принятому критерию резистентности из 75 человек, получавших терапию клопидогрелом, 54 оказались чувствительными к нему (72%), а 21 - резистентными (28%). Среди больных ОКСпБТ 7 оказались резистентными к клопидогрелу (23%), а 23 были чувствительными. В группе ОКСбпБТ резистентность выявлена у 14 больных (31%). Таким образом, частота выявления резистентности к клопидогрелу практически не зависела от варианта ОКС (р=0,60).

Больные, резистентные и чувствительные к клопидогрелу, не различались между собой по клиническим характеристикам. Следует отметить, что в группе «чувствительных» больных было больше тех, кто получил в качестве нагрузочной дозы 600 мг клопидогрела (р=0,02), а в группе «резистентных» - 300 мг (р=0,05).

Динамика агрегации тромбоцитов.

Исходно в подгруппе чувствительных больных уровень агрегации тромбоцитов составил 38,3±14,6%. Через 7 дней лечения он снизился до 12,4±9,4% (р<0,001), затем несколько повысился к 30 дню до 18,45±11,6% и оставался па уровне 18,6±13,9 в течение следующих 6-8 месяцев (р=0,45).

В группе резистентных больных исходный уровень агрегации был достоверно ниже, чем у чувствительных больных, и повышался к 7 дню терапии. В дальнейшем группы резистентных и чувствительных к клопидогрелу больных по величине агрегации не различались (рисунок 3).

Рисунок 3. Динамка агрегации тромбоцитов, индуцированной 20 мкМ АДФ, у больных ОКС, чувствительных и резистентных к клопидогрелу.

- резистентные -

- чувствительные

60

5 50 I 40

6 30

П Л

I 20 10 0

■ 38,3

17,6 18,6

12,4 12,3

исходно 7дней ЗОдней 6-8

месяцев

_ Период наблюдения__

Прогноз по данным однолетнего наблюдения у больных с ОКС.

Влияние резистентности к аспирину по данным агрегатометрии на прогноз.

У больных, резистентных к аспирину, определяемой по величине индуцированной АК агрегации тромбоцитов, частота осложнений в период наблюдения была несколько выше, чем у чувствительных, однако различия не достигали достоверности (таблица 4).

Осложнения Чувствительные к аспирину, п=41 Резистентные к аспирину, >1=10 Р

Летальные исходы 5 (12%) 2 (20%) 0,91

Нестабильная стенокардия 5 (12%) 2 (20%) 0,91

Нефатальный ИМ 2 (5%) 1(10%) 0,71

ОНМК 3 (7%) 0 0,09

Таблица 4. Структура осложнений у больных, резистентных и чувствительных к аспирину.

В группе сравнения у резистентных больных, которые продолжали принимать 100 мг аспирина в течение всего периода наблюдения, неблагоприятные события произошли в 4 случаях (40%), что не отличается от основной группы. Также не выявлено значимых различий по количеству неблагоприятных событий с группой чувствительных к аспирину больных: 40% ув 37%, р=1,00.

Прогноз у больных ОКС в зависимости от уровня 11-ДГТХВ2 На рисунке 4 приведены кривые дожития у больных с уровнем 11-ДГТХВ2 выше и ниже медианы, составлявшей 438 нг/ммоль креатинина. Различия между группами становятся достоверными к 200 дню и сохраняются до конца периода наблюдения.

Рисунок 4. Вероятность отсутствия неблагоприятных сердечнососудистых осложнений у больных ОКС с высоким и низким уровнем метаболита у больных с ОКС, р<0,01.

* > 438 н г/миоль креатинина ■ <438 н г/м мол ь ко еатинина

£ 40--

| 30 -1-1-.-1-1-1-1-

^ О 50 100 150 200 250 300 350

Период наблюдения, дни

Нефатальиыс ИМ перенесли 2 больных (4%) с низким и 4 (8%) с высоким уровнем 11-ДГТХВ2. Все три случая ОНМК произошли у больных с высоким уровнем 11-ДГТХВ2.

Прогноз у больных ОКС, резистентных к клопидогрелу.

Связи частоты осложнений с резистентностью к клопидогрелу, определяемой по величине снижения индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов, мы не выявили.

Следует отметить, что согласно этому критерию резистентность диагностируется у больных с исходно низкой агрегацией. Это явно противоречит другому используемому во многих исследованиях критерию -определению пороговой величины агрегации, превышение которой свидетельствует о резистентности. Поскольку для лазерного агрегометра этот показатель не установлен, то мы анализировали частоту осложнений в зависимости от квартилей величины агрегации (рисунок 5). При таком варианте анализа отмечается некоторое увеличение частоты неблагоприятных исходов с увеличением уровня агрегации, однако различия не достигали уровня статистической значимости.

Рисунок 5. Частота неблагоприятных исходов у больных ОКС в зависимости от уровня агрегации тромбоцитов, индуцированной 20 мкМ АДФ: максимальное количество неблагоприятных событий отмечалось в 3 и 4 квартилях агрегации.

Резистентность больных ОКС к антиагрегантам и маркеры воспаления.

У резистентных к аспирину больных исходный уровень всех исследованных маркеров воспаления был значительно выше, чем у чувствительных (таблица 5, стр. 20). Достоверные различия выявлялись и в течение всего периода наблюдения. Это свидетельствует о возможной связи резистентности к аспирину с активацией воспалительного процесса.

Маркеры Резистентные Чувствительные Р

исходно 10,4+6,3 5,67±5,9 0,015

7 дней 7,Э±3,9 4,4±4,32 0,011

ИЛ-6, пг/мл 30 дней 6,29±3,06 5,5+4,3 0,03

6-8 мес. 5,66±4,4 3,58±3,5 0,09

исходно 24,05±8,6 7,74±9,68 <0,001

ИЛ-10, пг/мл 7 дней 30 дней 3,89+1,7 6,13±6,1 4,1±4,3 3,6±2,76 0,9 0,006

6-8 мес. 3,2710,62 3,85±3,8 0,9

исходно 11,8±11,04 4,64±4,8 0,001

СРБ, мг/л 7 дней 15,34+13,4 9,2±8,3 0,05

30 дней 2,64 ±2,6 3,7±3,01 0,7

6-8 мес. 0,99±0,68 2,9±2,6 0,04

Таблица 5. Уровень маркеров воспаления у больных, резистентных и чувствительных к аспирину.

Резистентные к клопидогрелу больные отличались от чувствительных

только по исходному уровню ИЛ-10 (таблица 6).

Маркеры Резистентные Чувствительные Р

11_-6, пг/мл исходно 3,45±3,27 5,2±4,9 0,35

7 дней 2,5±2,01 4,88±4,76 0,14

30 дней 3,18±3,7 3,11 ±1,82 0,94

6-8 мес. 3,31±1,6 1,92±3,37 0,57

11.-10, пг/мл исходно 11,6±2,05 7,65±1,42 0,05

7 дней 2,63±1,4 3,4±2,36 0,32

30 дней 2,66±1,27 4,28±3,62 0,26

6-8 мес 2,83±1,26 4,39±3,38 0,72

СРБ, мг/л исходно 1,42±0,4 4,2В±5,8 0,51

7 дней 2,67±0,1 6,98±2,36 0,59

30 дней 1,51 ±1,23 1,73±3,62 0,9

6-8 мес 2,1±0,43 1,97±1,36 0,71

Таблица 6. Уровень маркеров воспаления у больных, резистентных и чувствительных к клопидогрелу.

Генетические полиморфизмы у резистентных и чувствительных к антиагрегаитам больных.

Мы изучали некоторые полиморфные варианты генов, потенциально имеющих отношение к развитию резистентности к аспирину и клопидогрелу.

Полиморфизм А842С гена ЦОГ 1, являющейся основной мишенью действия АСК, выявлялся недостоверно несколько чаще у резистентных, чем у чувствительных к аспирину больных: 18% и 8%. Оказалось, что дикий или исходный вариант АА встречался в 100% случаев у больных с ОКСбпЗТ и в 82% случаев у больных с ОКСпБТ, р=0,003.

Полиморфизм С18Т гена рецептора Р2У!2. Дикий тип СС встречался у 49 больных с ОКС, одинаково часто у больных с ОКС с подъемом и без подъема сегмента БТ: 27 (53%) и 22 (45%), соответственно. Полиморфизм СТ отмечен у 20 больных (41%) ОКСбпЗТ и у 19 больных (37%) с ОКСпЗТ. Гомозиготный вариант ТТ одинаково часто встречался в 16% случаев у больных ОКСбпБТ и в 13% случаев при ОКСпБТ.

Выявлена тенденция к большей частоте гомозиготного варианта ТТ у резистентных больных - 6 человек (29%) по сравнению с чувствительными -5 человек (9%), а дикого типа у чувствительных больных: 28 (52%). Связи СТ и ТТ полиморфизмов с прогнозом у больных ОКС не выявлено.

Полиморфизм С36Т гена рецептора Р2Уп. Одинаково часто при ОКС встречался исходный вариант СО: 36 (73%) при ОКСбиБТ и 36 (71%) при ОКО^Т. Вариант вТ выявлен у 19 больных ОКС: 13 (27%) при ОКСбпБТ и 14 (27%) при ОКСп8Т, и у одного больного выявлен вариант ТТ в группе ОКСп8Т.

Не выявлено достоверной связи между наличием данного полиморфизма и развитием резистентности к клонидогрелу: у 40 чувствительных больных (73%) и у 15 резистентных (71%) встречался дикий тип, р-0,9. Вариант ОТ встречался у 13 (24%) чувствительных больных и у 6 (29%) резистентных, р=0,7. Гомозиготный вариант ТТ выявлен только у одного чувствительного к клопидогрелу больного.

Полиморфизм Л293С гена СУР*ЗЛ4. Дикий тип АА встречался у 67 больных с ОКС: в 89% случаев у больных с ОКСбпЗТ и в 90% у больных с ОКСпЗТ, р=1,0. Полиморфный вариант - Ай у 8% больных с ОКСбпБТ и у 10% с ОКСбпЗТ. Только у одного больного в группе ОКСбп8Т отмечен гомозиготный тип СС.

Дикий вариант АА встречался с одинаковой частотой у чувствительных - 49 (91%) и резистентных - 18 (86%) к клопидогрелу

больных (р=0,8). У одного чувствительного больного выявлен гомозиготный вариант GG. Гетерозиготный вариант AG несколько чаще встречался у резистентных к клопидогрелу больных: в 3 случаях (14%); а у чувствительных в 4 (7%) случаях, р=0,07.

Полиморфизм гена субъедииицы lila рецептора ПЬ/Ша - ЬеиЗЗРго.

В нашей работе дикий тип LeuLeu встречался у 30 больных (61%) с OKC6nST и у 40 больных (78%) с OKCnST. В 39% случаев встречались полиморфные варианты LeuPro или РгоРго у больных с OKC6nST и в 22% случаев у больных с OKCnST, р=0,05.

Мы не получили данных о связи резистентности к аспирину или клопидогрелу с 33Leu/Pro полиморфизмом субъединицы Ша рецептора Ilb/IIIa тромбоцитов.

Выводы

1. Резистентность к аспирину, определяемая по уровню агрегации тромбоцитов индуцируемой АК, чаще выявляется у больных ОКСпБТ, чем у больных ОКСбп БТ: 22% против 4%.

2. Имеется связь между резистентностью к аспирину и активацией воспалительного процесса.

3. У большинства резистентных к аспирину больных отмечается истинный тип резистентности, о чем свидетельствует повышенный уровень 11-ДГТХВ2.

4. К концу 1-го месяца приема аспирина у большинства резистентных больных наблюдалось достоверное снижение агрегации тромбоцитов. Увеличение дозы препарата до 300 мг не оказывало существенного влияния на динамику агрегации тромбоцитов. Достоверных связей величины агрегации тромбоцитов с прогнозом у больных ОКС в течение 1 года наблюдения не выявлено.

5. У больных ОКС с высоким уровнем 11-ДГ ТХВ2 отмечался достоверно худший прогноз.

6. Резистентность к клопидогрелу, определяемая по величине снижения индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов, отмечалась у 28% больных с ОКС и зависит от исходного уровня агрегации и неличины нагрузочной дозы препарата. Больные в группах ОКСпВТ и ОКСбг^Т по частоте выявления резистентности к клопидогрелу не различаются.

7. При выборе в качестве критерия резистентности к клопидогрелу дельта агрегации связи данного критерия с неблагоприятными исходами не

получено. Выявлена тенденция к большей частоте осложнений в верхнем квартиле агрегации.

8. У резистентных к клопидогрелу больных несколько чаще встречается гомозиготный вариант ТТ полиморфизма С18Т рецептора P2Yi2 и гетерозиготного полиморфизма A293G цитохрома CYP3A4.

Практические рекомендации.

1. Увеличение суточной дозы аспирина со 100 до 300 мг Fie влияет на уровень агрегации тромбоцитов и прогноз. Этот способ не рекомендуется для преодоления повышенной остаточной реактивности тромбоцитов.

2. Повышение нагрузочной дозы клопидогрела с 300 до 600 мг обеспечивает большее снижение индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов и может быть рекомендовано для уменьшения количества случаев резистентности к клопидогрелу.

3. В качестве дополнительного метода диагностики резистентности к аспирину может быть рекомендовано исследование метаболита тромбоксана А2 - 11ДГТВ2, повышенный уровень которого на седьмые сутки терапии аспирином является предиктором неблагоприятного прогноза у больных с ОКС.

4. Данных, свидетельствующих о целесообразности рутинного использования теста агрегации тромбоцитов для контроля терапии антиагрегантами, не получено.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Фролова Н.С., Шахнович P.M., Добровольский A.B., Руда МЛ. Доклад на тему «Резистентность к аспирину у больных с острым коронарным синдромом». Тезисы Всероссийской научно-практической конференции (ежегодная сессия ФГУ РКНПК). 17-18 мая 2007 года. Москва.

2) Фролова Н.С., Шахнович P.M., Добровольский А.Б., Руда МЛ. «Резистентность к аспирину у больных с острым коронарным синдромом». Тезисы Всероссийского национального конгресса кардиологов, 09-11 октября 2007 года. Москва, № 315.

3) N. Frolova, R.Shakhnovich, A. Dobrovolsky, M.Ruda. «Aspirin resistance in patients with acute coronary syndrome ». Abstract for 7lh Congress in Acute Cardiac Care, Izrael October 2007, abstract № 716.

4) Фролова H.C., Шахнович P.M., Сироткина О.В., Добровольский А.Б., Руда МЛ. Резистентность к клопидогрелу у больных с острым коронарным синдромом. Терапевтический архив, 2010, №8, стр. 14-20.

5) Фролова Н.С., Шахнович P.M., Сироткина О.В., Казначеева Е.М., Добровольский А.Б. Резистентность к аспирину у больных с острым коронарным синдромом. Часть I. Кардиоваскулярная терапия и профилактика 2010, №6 (в печати).

Подписано в печать 19.08.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

Актуальность исследования

В патогенезе острого коронарного синдрома (ОКС) ведущую роль играет тромбоз коронарных артерий, развитие которого начинается с адгезии и агрегации тромбоцитов в области повреждения эндотелия. Применение аспирина и клопидогрела, ингибирующих агрегацию тромбоцитов, сегодня является основой терапии ОКС. Эти препараты назначаются в дозах, эффективность которых доказана в многочисленных исследованиях. Вместе с тем, известно, что у ряда больных, несмотря на проводимую терапию, происходят тромботические осложнения. Одной из причин этого может быть резистентность к антитромбоцитарным препаратам или недостаточная эффективность назначенной дозы.

В настоящее время резистентность к антитромбоцитарным препаратам, ее причины и механизмы развития, а также возможность преодоления, активно изучаются. Важное место занимает исследование генетических аспектов резистентности.

Вместе с тем, ряд основополагающих моментов остается неясным. Данные литературы о прогностическом значении резистентности к антитромбоцитарным препаратам противоречивы. Достаточно указать на то, что до настоящего времени нет единой точки зрения о том, что считать резистентностью к антиагрегантным препаратам, по клиническим или биологическим критериям ее диагностировать, что принять за норму, и какие тесты оптимальны для распознавания и количественной характеристики этого состояния. Нам представлялось важным оценить динамику агрегации тромбоцитов на фоне терапии антиагрегантами у больных ОКС, выявить частоту резистентности к антиагрегантам в российской популяции больных, проанализировать влияние этого феномена на прогноз заболевания и попытаться найти практически значимые методы ее преодоления.

Цель исследования.

Изучить частоту резистентности к аспирину и клопидогрелу при ОКС, возможные причины и механизмы ее развития, клиническое значение и способы преодоления, оценить влияние этого явления на прогноз заболевания.

Задачи исследования:

1. Выявить частоту развития резистентности к аспирину, определить ее варианты, возможные способы преодоления.

2. Выявить частоту развития резистентности к клопидогрелу.

3. Оценить влияние резистентности к антиагрегантам на прогноз у больных с ОКС по данным однолетнего проспективного наблюдения.

4. Проанализировать влияние полиморфизмов генов циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1) (A-842G), гликопротеина (ГП) Ша (Leu33Pro), Р2У12-рецептора (С18Т и G36T) и фермента CYP3A4 (A293G) семейства цитохромов Р450 на развитие резистентности к антиагрегантам.

5. Оценить уровень маркеров воспаления (С-реактивный белок (СРБ), интерлейкин 6 (ИЛ6), интерлейкин 10 (ИЛ 10)) у резистентных и чувствительных к антиагрегантам больных и проанализировать их влияние на развитие резистентности к аспирину и клопидогрелу.

Научная новизна.

Показано, что резистентность к аспирину выявляется в первую неделю терапии, наблюдается значительно чаще у больных с ОКС с подъемом сегмента ST (OKCnST), чем у больных с ОКС без подъема сегмена ST (OKC6nST) и связана с активацией воспалительного ответа. У резистентных больных, продолжающих прием стандартной дозы аспирина, уровень агрегации тромбоцитов значительно снижается через месяц терапии. 8

Повышение дозы аспирина до 300 мг не влияет на динамику агрегации тромбоцитов. У большинства больных, резистентных к аспирину, выявлено повышение уровня 11-дегидротромбоксана В2 в моче, что свидетельствует о преобладании истинного типа резистентности. Уровень 11-ДГТХВ2 исходно значительно выше в группе OKCnST по сравнению с группой OKC6nST, затем достоверно снижается в обеих группах. Высокий уровень 11-ДГТХВ2 на терапии аспирином связан с неблагоприятным прогнозом.

У больных ОКС, получающих терапию клопидогрелом, снижение АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов зависит от ее исходного значения и дозы препарата. Связи резистентности к клопидогрелу с вариантом течения ОКС и исходами за период наблюдения не выявлено. У резистентных к клопидогрелу больных отмечена тенденция к большей частоте встречаемости гетерозиготного варианта A293G гена цитохрома CYP ЗА4 и гомозиготного варианта С18Т гена рецептора P2Yi2.

Практическая значимость.

Определение уровня агрегации тромбоцитов на фоне терапии антиагрегантными препаратами может быть полезно для оценки эффективности терапии у больных ОКС. Степень адекватности терапии проводилась на 7 сутки лечения препаратами.

Увеличение дозы аспирина до 300 мг резистентным больным не рекомендуется, так как не оказывает существенного влияния на динамику агрегации тромбоцитов и прогноз.

Резистентные к аспирину имеют более высокий уровень маркеров воспаления, чем чувствительные, что может быть использовано для выявления группы больных с повышенным риском развития резистентности к препарату.

Использование высоких нагрузочных доз клопидогрела (600 мг вместо 300 мг) может быть рекомендовано для уменьшения частоты резистентности к клопидогрелу.

Рутинное определение агрегации тромбоцитов всем больным, находящимся на терапии аспирином и клопидогрелом, в настоящее время не показано.

Выводы:

1. Резистентность к аспирину, определяемая по уровню агрегации тромбоцитов индуцируемой АК, чаще выявляется у больных OKCnST, чем у больных ОКСбп ST: 22% против 4%.

2. Резистентность к аспирину связана с активацией воспалительного процесса.

3. У большинства резистентных к аспирину больных отмечается истинный тип резистентности к аспирину, о чем свидетельствует повышенный уровень 11-ДГТХВ2.

4. К концу 1-го месяца приема аспирина у большинства резистентных больных наблюдалось достоверное снижение агрегации тромбоцитов. Увеличение дозы препарата до 300 мг не оказывало существенного влияния на динамику агрегации тромбоцитов. Достоверных связей величины агрегации тромбоцитов с прогнозом у больных ОКС в течение 1 года наблюдения не выявлено.

5. У больных ОКС с высоким уровнем 11-ДГ ТХВ2 отмечался достоверно худший прогноз.

6. Резистентность к клопидогрелу, определяемая по величине снижения индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов, отмечалась у 28% больных с ОКС и зависит от исходного уровня агрегации и величины нагрузочной дозы препарата. Больные в группах OKCnST и OKC6nST по частоте выявления резистентности к клопидогрелу не различаются.

7. При выборе в качестве критерия резистентности к клопидогрелу дельта агрегации связи данного критерия с неблагоприятными исходами не

115 выявлено. Разделив больных по квартилям агрегации, мы выявили тенденцию к большей частоте осложнений в верхнем квартиле.

8. У резистентных к клопидогрелу больных отмечена несколько большая частота встречаемости гомозиготного варианта ТТ полиморфизма С18Т рецептора P2Y12 и гетерозиготного полиморфизма A293G цитохрома CYP3A4.

Практические рекомендации.

1. Увеличение суточной дозы аспирина со 100 до 300 мг не влияет на уровень агрегации тромбоцитов и прогноз. Этот способ не рекомендуется для преодоления повышенной остаточной реактивности тромбоцитов.

2. Повышение нагрузочной дозы клопидогрела с 300 до 600 мг обеспечивает большее снижение АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов и может быть рекомендовано для уменьшения количества случаев резистентности к клопидогрелу.

3. В качестве дополнительного метода диагностики резистентности к аспирину может быть рекомендовано исследование метаболита тромбоксана А2 в моче, повышенный уровень которого на седьмые сутки терапии аспирином является предиктором неблагоприятного прогноза у больных с ОКС.

4. Данных, свидетельствующих о целесообразности рутинного использования теста агрегации тромбоцитов для контроля терапии антиагрегантами, не получено.