Автореферат и диссертация по медицине (14.01.05) на тему:Клиническая фармакогенетика клопидогреля у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями

На правах рукописи

МЕСИТСКАЯ ДИНАРА ФЕРАТОВНА

КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОГЕНЕТИКА КЛОПИДОГРЕЛЯ У ПАЦИЕНТОВ С СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

14.01.05 - кардиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 1 Н:0Н 2015

005570105

Москва-2015

005570105

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Копылов Филипп Юрьевич Официальные оппоненты:

Панченко Елизавета Павловна - доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории клинических проблем атеротромбоза Института кардиологии им. А.Л. Мясникова Российского кардиологического научно-производственного комплекса Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи Российской Федерации

Затейщиков Дмитрий Александрович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий первичным сосудистым отделением ГЪУЗ "Городская клиническая больница №51 ДЗ г. Москвы"

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства» России

Защита диссертации состоится «/¿7» ¡ЮЛЖР^ 201 .Згода в «¿¿ЧУ'часоп на заседании диссертационного совета Д.208.04(7.05 Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайте организации, www.mma.ru.

Автореферат разослан « 09ч> ¿¿¿О^СсР 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук,

доцент Брагина Анна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Несмотря на большой прогресс в диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), они по-прежнему остаются наиболее распространенными и занимают первое место в структуре смертности и инвалидизации населения в развитых странах. По данным Федеральной службы государственной статистики Российской Федерации за период с января по декабрь 2014 года смертность от ССЗ в нашей стране составляет 49,8% от общей, причем, почти 20% из этого числа умирают в трудоспособном возрасте. В 83,8% случаев причиной смерти становится ишемическая болезнь сердца или инсульт [Отчет Федеральной службы государственной статистики Российской Федерации за период с января по декабрь 2014 года: ЬИрг/Лулу^кз.гиЯгее с1ос/2014/с1ето/13 ЗхЬ].

Согласно рекомендациям ВНОК и Европейского общества кардиологов в стандарты лечения больных с острым коронарным синдромом (ОКС), как один из вариантов, входит двойная антитромбоцитарная терапия аспирином и клопидогрелем. Однако у некоторого количества пациентов на фоне приема двойной антиагрегантной терапии рецидивировали случаи сердечно-сосудистых осложнений, которые обусловлены существенной вариацией в ответе на терапию. Одной из причин этого феномена может быть резистентность к антитромбоцитарным препаратам.

В настоящее время резистентность к антитромбоцитарным препаратам, ее причины, механизмы развития и возможные пути преодоления активно исследуются. Однако до сих пор нет полного согласия между исследователями относительно термина «резистентность к антиагрегантным препаратам» из-за недостаточной стандартизации методов мониторинга функции тромбоцитов и общепринятых пороговых значений, которые позволили бы классифицировать больных на отвечающих на терапию и резистентных [КиПсгкоиъИ XV и соавт., 2009].

В нашем исследовании мы попытались выявить количество резистентных пациентов методом определения динамики агрегации тромбоцитов на фоне приема клопидогреля (с помощью оптической агрегометрии), а также оценить влияние недостаточного ответа на терапию клопидогрелем на сердечнососудистые исходы в течение 18 месяцев.

Актуальность работы заключается в необходимости изучения комбинированного влияния клинических факторов и полиморфизма большого количества генов на феномен развития резистентности к клопидогрелю и риск возникновения сердечно-сосудистых событий. Выявить группу риска пациентов и найти ранее не изученные факторы, влияющие на резистентность и возникновение сердечно-сосудистых событий.

Цель исследования: Изучить влияние клинических факторов и полиморфизма генов, участвующих во всасывании, метаболизме клопидогреля, кодирующих рецепторы к АДФ и гена тромбоксан-синтазы на агрегацию тромбоцитов и прогноз у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Задачи исследования

1. Проанализировать частоту и выявить факторы риска возникновения сердечно-сосудистых событий у пациентов, принимающих клопидогрель в течение 12 и 18 месяцев наблюдения.

2. Определить агрегационную способность тромбоцитов методом оптической агрегометрии у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями до приема клопидогреля и на фоне постоянного его приема через 7-10 дней.

3. Выявить клинические факторы, связанные с развитием резистентности к терапии клопидогрелем.

4. Изучить связь полиморфизмов генов, кодирующих транспортный белок АВСВ1 (3435С—>Т), ферменты биотрансформации СУР2С9 (А^144Суз С430Т экзон 3 и 11е359Ьеи А1075С экзон 7), СУР2С19 (СУР2С19*2 -ге4244285, СУР2С19*3 - гб4986893 и СУР2С19*17 - ге12248560), рецепторы к АДФ Р2У12 (Т744С) и тромбоксан-синтазу ТВХА81 (гзб9б2291) с агрегационными свойствами тромбоцитов.

Научная новизна исследования

Впервые выявлены ранее не изученные факторы риска возникновения феномена резистентности к клопидогрелю в соответствии со временем наступления сердечно-сосудистых событий. Впервые установлен вклад сочетания клинических показателей и полиморфизмов генов, ассоциированных с тромбоцитарной активностью (СУР2С9 и ТВХА81) в развитие резистентности к клопидогрелю.

Практическая значимость

У пациентов с мультифокальным поражением артерий или с ОКС, страдающих сахарным диабетом 1-го или 2-го типа, представляется целесообразным проведение генетического тестирования для выявления лиц с высоким риском сердечно-сосудистых событий. У данной категории пациентов при наличии А/Т (гя 6962291) полиморфизма гена тромбоксан-синтазы ТВХА81 назначение двойной антиагрегантной терапии аспирином и клопидогрелем может оказаться недостаточно эффективным.

Положения, выносимые на защиту

1. Сердечно-сосудистые события достоверно чаще возникают у пациентов, резистентных к терапии клопидогрелем. Риск возникновения сердечнососудистых событий у пациентов с АТ и ТТ генотипами ТВХА81 гена на 84 % выше по сравнению с пациентами с АА генотипом, которые в 100% случаев не имеют первичные конечные точки.

2. При анализе клинических факторов в однородных группах пациентов выявлено достоверное влияние нозологической формы и статуса углеводного обмена на феномен возникновения резистентности.

3. «Медленный» АА генотип СУР2С19*2 достоверно ассоциирован с АДФ-агрегацией через 7 дней приема клопидогреля и высоким риском возникновения резистентности к клопидогрелю. Пациенты с АА генотипом гена тромбоксан-синтазы ТВХА81 оказались более чувствительны к терапии клопидогрелем, в то время как среди пациентов с АТ и ТТ генотипом было достоверно больше резистентных пациентов.

Внедрение в практику. Практические рекомендации, разработанные в диссертации, внедрены на кафедре профилактической и неотложной кардиологии ИПО Первого МГМУ имени И.М.Сеченова, в повседневную работу отделения реанимации и интенсивной терапии для больных с инфарктом миокарда Городской клинической больницы № 7 г. Москвы.

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры профилактической и неотложной кардиологии ИПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова совместно с сотрудниками отделения для больных инфарктом миокарда, ОРИТ №1, функциональной диагностики и отделения реабилитации УКБ №1 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 27 марта 2015 г., протокол № 3. Диссертация рекомендована к защите.

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Российском национальном конгрессе кардиологов «Интеграция знаний в кардиологии» (Москва, 3-5 октября 2012 г.), II Московском международном форуме кардиологов (Москва, 26-28 марта 2013 г.) и Юбилейном XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 15-19 апреля 2013 г.).

Публикации: По теме диссертационного исследования опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки Российской Федерации.

Личный вклад автора. Автор самостоятельно осуществляла набор, скрининг и ведение пациентов, госпитализированных в связи с дебютом или обострением ишемической болезни сердца. Всем пациентам автором лично дважды определялась АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов методом оптической агрегометрии (при поступлении и через 7 дней постоянного приема клопидогреля). Автором также проведены анализ, количественная оценка, систематизация и статистическая обработка полученного материала.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.05 «кардиология». Результаты проведенного исследования соответствуют области

исследования специальности, конкретно пунктам 11, 12 и 14 паспорта кардиологии.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 128 страницах машинописи, иллюстрирована 12 таблицами и 71 рисунком, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, описание материалов и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 103 источников, из них 17 отечественных и 86 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В проспективное исследование продолжительностью 18 месяцев было включено 250 пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями: 176 (70,4%) мужчин и 74 (29,6%) женщины. Перед включением в исследование пациенты подписали информированное согласие.

Пациенты при поступлении классифицированы по основным нозологическим формам: 103 (41,2%) больных с инфарктом миокарда с подъемом сегмента БТ, 126 пациентов (50,4%) с инфарктом миокарда без подъема сегмента БТ и нестабильной стенокардией и 21 (8,4%) больной с мультифокальным атеросклерозом коронарных и периферических артерий.

Критерии включения в исследование: больные в возрасте старше 18 лет, госпитализированные в стационар в связи с дебютом или обострением сердечнососудистых заболеваний, которым был назначен клопидогрель:

- острый коронарный синдром: нестабильная стенокардия (впервые возникшая, прогрессирующая) или инфаркт миокарда (первичный или повторный);

- пациенты, которым планируется хирургическое лечение ишемической болезни сердца (ангиопластика и стентирование коронарных артерий);

пациенты с мультифокальным атеросклерозом перед стентированием брахиоцефальных артерий и артерий нижних конечностей.

Критерии исключения из исследования:

- пациенты, принимавшие клопидогрель за 14 дней до включения в исследование;

- состояния, ассоциированные с повышенным риском кровотечений: острое кровотечение или геморрагический синдром, пептическая язва, язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки в стадии обострения, внутричерепное кровоизлияние, неспецифический язвенный колит, туберкулез, опухоли легких;

- беременность и период лактации;

- пациенты с выраженной почечной и печеночной недостаточностью;

- тяжелые психические расстройства;

- алкоголизм и снижение комплаентности.

Пациенты при поступлении классифицированы по основным нозологическим формам: 103 (41,2%) больных с инфарктом миокарда с подъемом сегмента БТ, 126 пациентов (50,4%) с инфарктом миокарда без подъема сегмента БТ и нестабильной стенокардией и 21 (8,4%) больной с мультифокальным атеросклерозом коронарных и периферических артерий. Характеристика общей выборки больных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Общая характеристика пациентов, включенных в исследование

Показатели Число пациентов, п (%)

Возраст, лет 60,84+10,06

Пол (м) 176 (70,4%)

Ожирение 1-3 степени 83 (33,2%)

Сахарный диабет 2го типа 75 (30%)

Степень артериальной гипертонии II степень 36 (14,4%)

III степень 157 (62,8%)

Курение 104(41,6%)

Прием ацетилсалициловой кислоты до госпитализации 71 (28,4%)

Риск развития ишемической болезни сердца 1-2 фактора риска 28(11,2%)

3 фактора риска 57 (22,8%)

4 и более факторов риска 165 (66%)

При поступлении всем пациентам была назначена терапия согласно существующим рекомендациям ВНОК.

Мы не лимитировали наше исследование назначением оригинального и дженерического клопидогреля.

Средний период наблюдения за пациентами составил 545±19 дней. По истечении 3, 6, 12 и 18 месяцев оценивались течение ИБС и наличие осложнений. Комбинированная первичная конечная точка включала: сердечно-сосудистую смерть, развитие нефатального инфаркта миокарда, случаи ранней постинфарктной стенокардии и тромбоз стента.

Исследование функции тромбоцитов Забор крови для исследования производился сразу после поступления пациента в стационар (до приема клопидогреля) и через 7-10 дней после первичного определения агрегации тромбоцитов. Для этого сухой иглой пунктировали периферическую вену и набирали кровь в пластиковую пробирку, содержащую 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении: 1 объемная часть раствора цитрата натрия и 9 объемных частей крови. Пробирки с кровью доставлялись в лабораторию и находились при комнатной температуре в течение одного часа после забора. Стабилизированную кровь центрифугировали в течение 5-7 минут при 1500 оборотах в минуту для получения богатой тромбоцитами плазмы. Затем богатую тромбоцитами плазму в пластиковой посуде повторно центрифугировали в течение 15-20 минут при 4000 оборотах в минуту для получения бедной тромбоцитами плазмы.

Агрегацию тромбоцитов исследовали в межклинической коагулологической лаборатории Первого МГМУ им. И. М. Сеченова (заведующая лабораторией Нестерова Светлана Георгиевна) турбодиметрическим методом Борна, основанном на регистрации изменений светопропускания богатой тромбоцитами плазмы. В работе использовался анализатор агрегации тромбоцитов АР 2110 фирмы «SOLAR». В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовался раствор АДФ в конечной концентрации 10 мкмоль/литр. Агрегация тромбоцитов

измерялась как максимальное изменение (увеличение) светопропускания богатой тромбоцитами плазмы в процентах после добавления индуктора. При этом светопропускающая способность богатой тромбоцитами плазмы принималась за 0%, а в качестве контроля служила бедная тромбоцитами плазма этого же пациента, светопропускающая способность которой принималась за 100%. После добавления индуктора к богатой тромбоцитами плазме в процессе агрегации тромбоцитов ее светопропускающая способность стремится от 0 к 100%.

Определение резистентности к терапии клопидогрелем Для оценки ответа на лечение клопидогрелем определяли снижение агрегации тромбоцитов на фоне индукции АДФ по отношению к исходному значению в процентах по формуле:

AT исх. - AT врем, х 100%, где AT исх.

AT исх. - исходная агрегация тромбоцитов, AT врем. - агрегация тромбоцитов через 7-10 дней после первичного определения агрегации тромбоцитов, которое соответствует времени, прошедшему от начала терапии клопидогрелем.

При снижении <10%, 10-29%, и >30% пациентов рассматривали как резистентных, «частично резистентных» и чувствительных к терапии клопидогрелем соответственно [Müller I. и соавт., 2004].

За критерий резистентности к терапии клопидогрелем в нашей работе принято снижение агрегации менее чем на 10%.

Генетический анализ Генетический анализ проводился на базе Института экологии человека и гигиены окружающей среды (заведующая лабораторией молекулярно-генетической диагностики, к.б.н. Аксенова Марина Геннадьевна) и лаборатории генно-инженерных систем ЗАО «Лагис» (заведующий научным отделом Кириллов Михаил Юрьевич). Для того чтобы убедиться в происхождении выборки больных образцы были прогенотипированы по Alu-маркерам - PV92 и ТРА25, которые широко применяются в популяционных исследованиях. В

выборке распределение аллелей и генотипов данных маркеров подчинялось закону Харди-Вайнберга, что свидетельствует об однородности выборки.

В нашей работе исследован ряд генетических полиморфизмов, которые потенциально могут быть связаны с развитием резистентности к клопидогрелю:

1. Полиморфизм 3435С—>Т транспортного гена - АВСВ1 (гликопротеин Р);

2. Полиморфизм Argl44Cys С430Т экзон 3 гена CYP2C9*2 и Ue359Leu А1075С экзон 7 CYP2C9*3 системы цитохрома Р-450;

3. Полиморфизм гена CYP2C19*2 (rs4244285), CYP2C19*3 (rs4986893) и CYP2C19*17 (rsl2248560) системы цитохрома Р-450;

4. Полиморфизм Т744С гена, кодирующего рецепторы тромбоцитов P2Y12;

5. Полиморфизм rs6962291 гена тромбоксан-синтазы TBXAS1.

Исследование проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с

последующим рестрикционным анализом [Sirotkina О. и соавт., 2005]. В основе метода ПЦР лежит процесс многократного увеличения копий (амплификации) определенных участков ДНК, осуществляемый с помощью фермента ДНК-полимеразы.

ДНК для генетического исследования выделяли из цельной венозной крови, забранной в пробирку с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), стандартным фенол-хлороформным методом. Для определения аллельного полиморфизма генов проводили рестрикцию с соответствующими рестриктазами.

Статистический анализ

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакетов программ для статистического анализа STATISTICA (версия 10,0), SPSS (версия 20,0) и программы Excel for Windows.

Для количественных показателей вычислялись следующие показатели описательной статистики: среднее значение, стандартное отклонение, медиана, квартили, минимальное и максимальное значение. Для качественных показателей вычислялись следующие показатели: число наблюдений и доля (в %) от общего количества пациентов или от количества пациентов в соответствующей подгруппе.

Учитывая заведомо ненормальный тип распределения основных переменных, сравнение средних тенденций осуществлялось с использованием непараметрических статистических критериев. Сравнение между независимыми подгруппами по количественным показателям проводилось с помощью теста Манна-Уитни или теста Крускала-Уолиса. В последнем случае при выявлении статистически достоверных различий апостериорный анализ осуществлялся с использованием критерия Шеффе. Сравнение между независимыми подгруппами по качественным показателям осуществлялось с использованием критерия хи-квадрат. Соотношение между количественными показателями оценивалось с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Время до наступления событий комбинированной первичной конечной точки (ПКТ) анализировалось с использованием метода Каплана-Мейера. Для всех факторов, потенциально влияющих на частоту сердечно-сосудистых событий, строились графики кумулятивной доли пациентов без ПКТ. Достоверность различия по времени до наступления событий комбинированной ПКТ оценивалась с использованием критериев Вилкоксона-Гехана и лог-рангового теста, или же критерия хи-квадрат.

Различия считались достоверными при уровне значимости более 95% (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На фоне терапии клопидогрелем через 7 суток наблюдалось снижение средней агрегации тромбоцитов с 65,6±17,5% до 45,3±20,2%. Согласно принятому критерию резистентности (снижение АДФ-агрегации менее 10%) все пациенты были разделены на чувствительных — 74% и резистентных к терапии клопидогрелем — 26%.

Уровень исходной АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациентов чувствительных к терапии клопидогрелем составил 66,9±15,6%, а у резистентных пациентов - 61,6±21,8% (р=0,03). Агрегация через 7 дней у чувствительных пациентов снизилась до 36,6±14%, в то время как у резистентных повысилась до 67,1±19,2% (р<0,01).

При подробном анализе различных групп (таблица 2) оказалось, что пациенты с острым коронарным синдромом (ОКС) более чувствительны к терапии антиагрегантными препаратами, чем стабильные пациенты с мультифокальным поражением артерий (МФА), в том числе коронарных (43% против 56,8%, р<0,01). Кроме того, внутри группы ОКС пациенты с инфарктом миокарда с подъемом сегмента БТ (ИМспЗТ) оказались менее чувствительны к терапии клопидогрелем, чем пациенты с инфарктом миокарда без подъема сегмента 8Т (ИМбп8Т) и нестабильной стенокардией (НС) (48,8% против 38,4%, р<0,01).

Пациенты, страдающие сахарным диабетом 1-го и 2-го типа менее чувствительны к антиагрегантной терапии, чем пациенты без диабета (51,6% против 42,5%, р<0,01).

Не выявлено влияния пола, степени артериальной гипертонии, статуса курения и массы тела на уровень АДФ-агрегации тромбоцитов через 7 дней приема клопидогреля. Таблица 2

Клинико-демографическая характеристика пациентов исследования на

момент поступления в стационар

Показатель Исходная Р АДФ-агрегация Р

АДФ-агрегация через 7 дней

Пол:

-мужчины 65±17,6% }р=0,5 44,7±20,8% }р=0,5

-женщины 66,7±17,3% 46,6±18,6%

Возраст:

-до 60 лет 66,8±16,8% }р=0,3 45,3±21,2% }р=0,9

-после 60 лет 64,5±18,1% 45,3±19,2%

Диагноз:

-ОКСспБТ 67±16,9% }р=0,2 48,8±20,7% }р<0,01

-ОКСбп5Т/НС 63,3±17,3% 38,4±15,7%

-МФА 68,4±21,1% }р=0,4 58,6±24,5% }р<0,01

(ОКС УБ (ОКС Ув

Статус курения: МФА) МФА)

-курящие 66,2±18,3% }р=0,7 46,1±23,1%

-некурящие 65,2±16,9% 44,7±17,8% }р=0,6

Ожирение:

-с ожирением 64,7±18,0% }р=0,6 47,4±20,9% }р=0,3

-без ожирения 65,9±17,3% 44,3±19,7%

Сахарный диабет

(1 и 2 типа):

-с диабетом 65,6±18,4% }р=0,9 51,6±21,9% }р<0,01

-без диабета 65,6±17,1% 42,5±18,7%

Гипертоническая

болезнь (1, 2 и 3

степени): }р=0,2 }р=0,2

-с ГБ 66,3±17,8% 46,2±20,4%

-без ГБ 62,8± 16,0% 41,8±19,1%

Холестерин

крови, ммоль/л:

-менее 5,5 65,4±18,6% }р=0,9 44,6±18,5% }р=0,6

-более 5,5 65,8±15,4% 45,3±20,8%

Феномен резистентности в различных подгруппах не зависит от первоначальной дозы клопидогреля: 600 (при чрескожных коронарных вмешательствах), 300 или 75 мг. Прием аторвастатина (р=0,4) и омепразола (р=0,3) не оказывает влияния на эффективность антиагрегантной терапии.

Кроме того, такие показатели как пол, статус курения, масса тела и количество факторов риска ИБС также не оказывают влияние на возникновение феномена резистентности.

Аналогично влиянию на уровень АДФ-агрегации через 7 дней терапии клопидогрелем, нами была получена взаимосвязь нозологической формы пациентов и резистентности к клопидогрелю. Среди пациентов с ИМбпБТ или нестабильной стенокардией 15,5% оказались резистентными к терапии, с ИМспБТ - 30,9% и с МФА - 47,6%, р<0,05. Таким образом, относительно стабильные пациенты с МФА оказались менее чувствительными к антиагрегантной терапии, чем пациенты с ОКС (рисунок 1).

Различия статистически достоверны «р Краске.-а/оллиса Н Л N=250) = 16 87445 р = 0 0002)

Основной клинический диагноз

□ Медиана

□ 25%-75% X Мин -Макс

Рисунок 1. Резистентность к терапии кпопидогрелем и нозологическая форма Статус углеводного обмена также влияет на чувствительность к терапии

клопидогрелем (рисунок 2): среди пациентов без СД только 19,6% оказались

резистентными, в то время как, среди пациентов, страдающих СД 1-го и 2-го

типов-40,3%, р<0,001.

Различия статистически достоверны 84 р=0 30013)

Нормальный углезодньй обмен Сахарный диабет

Нарушения углеводного обмена

п Медиана I Мин -Ма.с

Рисунок 2. Резистентность к клопидогрелю и статус углеводного обмена

Нами были исследованы гены, влияющие на всасывание (транспортный ген АВСВ1), метаболизм (СУР2С9 и СУР2С19 гены системы цитохрома Р-450),

рецепторную чувствительность тромбоцитов (P2Y12) клопидогреля и ген тромбоксан-синтазы (ТВXAS 1). Из большого количества исследованных нами полиморфизмов генов на феномен резистентности достоверно влияет АА генотип CYP2C19*2 цитохрома Р-450 и АА полиморфизм гена TBXAS1. АА генотип CYP2C19*2 гена замедляет превращение клопидогреля, являющегося пролекарством, в его активный метаболит. У пациентов с АА генотипом CYP2C19*2 гена был достоверно более высокий уровень АДФ-агрегации через 7 дней приема клопидогреля. При противопоставлении двух групп (АА против GA/GG), было получено достоверное влияние АА генотипа на риск возникновения резистентности к антитромбоцитарным препаратам.

Среди пациентов с АА генотипом гена тромбоксан-синтазы было достоверно меньше резистентных пациентов, чем среди носителей АТ и ТТ генотипов.

Не получено достоверного влияния ни на уровни исходной агрегации и через 7 дней приема клопидогреля, ни на возникновение резистентности полиморфизмов транспортного АВСВ1, CYP2C9 системы цитохрома Р-450 и рецепторного P2Y12 генов.

Сердечно-сосудистые события (сердечно-сосудистая смерть, развитие нефатального инфаркта миокарда, случаи ранней постинфарктной стенокардии и тромбоз стента) достоверно чаще возникают у пациентов, резистентных к терапии клопидогрелем (рисунок 3).

Кумулятивная доля пацлвмтое без комбинированной лвреичной конечной точки (ПКТ) в зависимости от чувствительности к т-лопидогрелю (метод Каллана-Меиера} ■ Коиогяирова^пач ПКТ * Цек;ур»1роеаям»г пабпюдеггя

120 180 240 300

Сро»: наблюдения (дни!

- Пациенты чувствительные к кдопидогрег-ю

■ Пациенты резистентные < клопидогрелт

Рисунок 3. Оценка влияния резистентности на риск возникновения ПКТ в течение 12 месяцев наблюдения

Среди пациентов без сердечно-сосудистых событий за 12 месяцев наблюдения 22% оказались резистентными к терапии клопидогрелем, а среди пациентов с первичной конечной точкой - 81,2%.

При анализе риска возникновения ПКТ в течение 12 месяцев наблюдения в различных клинико-демографических подгруппах нами не было получено достоверного влияния ни нозологической формы пациентов, ни пола, ни статуса курения или массы тела. Однако у пациентов с нормальным углеводным обменом достоверно (р=0,049) реже возникали сердечно-сосудистые события, чем у пациентов, страдающих сахарным диабетом. Среди пациентов, страдающих сахарным диабетом, за 12 месяцев у 16% зафиксированы случаи развития ПКТ, в то время как у пациентов с нормальным углеводным обменом только в 7% случаев (рисунок 4).

Кумулятивная доля пациентов без событий комбинированной первичной конечной точки (метод Капяана-Мейера) Различия статистически достоверны (Критерий Гехана-Вилкоксона 2=1,969. р=0 049; • Завершенные + Цензурироеанные

120 130 240 300 360 Период наблюдения (дней)

Рисунок 4. Оценка влияния статуса углеводного обмена на риск возникновения ПКТ за 12 месяцев

Наличие аллели с утратой функции *2\*3 СУР2С9 гена достоверно ассоциировано с риском развития первичной конечной точки (рисунок 5).

Кумулятивная доля пациентов без событий комбинированной первичной конечной точки (метод Каплана-Мейера)

Различия статистически достоверны (Критерий Гехана-Вилкоксона 2=3 255 р=0 0011) • Завершенные + Цензурироеанные

Период наблюдения (дней)

Рисунок 5. Оценка влияния генотипа СУР2С9 на риск возникновения ПКТ за 18 месяцев

Не было получено достоверного влияния ТТ, ТС или СС генотипов АВСВ1 гена и вв или ОТ генотипов Р2У12 гена на сердечно-сосудистые события в течение года.

Наличие аллеля с утратой функции СУР2С9 гена достоверно ассоциировано с риском развития первичной конечной точки.

Широко известный факт влияния носительства АА полиморфизма СУР2С19 гена, не получил достоверного отражения в нашей работе из-за небольшого количества данного генотипа в популяции наших пациентов: АА генотип СУР2С19*2 цитохрома Р-450 выявлен у 9 (3,6%) больных.

При анализе сердечно-сосудистых событий в течение 12 месяцев наблюдения не было получено достоверного влияния АА или ТТ генотипов гена тромбоксан-синтазы на риск возникновения первичной конечной точки.

Через 18 месяцев мы получили достоверное различие между пациентами с АА и АТ-ТТ генотипами ТВХА81 в отношении риска возникновения первичной конечной точки. Более того, среди пациентов с АА генотипом по-прежнему не было ни одного сердечно-сосудистого события (рисунок 6).

Кумулятивная доля пациентов без событий комбинированной первичной конечной точки Iметод Каплана-Мейера) Различия статистически достоверны (Критерий Гехана-Вилкоксоиа 2=1% р=0 049) о Завершенные + Ценгурироеанные

Варианты генотипа ТБХА51

—ТВХА51 АА ТВХА51АТ+ТТ

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 Период наблюдения (дней)

Рисунок 6. Оценка влияния полиморфизма гена тромбоксан-синтазы на риск возникновения ПКТза 18 месяцев

Интересные факты были получены в отношении статуса курения. Анализ

годичной выживаемости пациентов с различным полиморфизмом СУР2С9 гена и

статусом курения достоверно показал, что среди никогда не куривших пациентов с аллелем с утратой функции низкий процент выживаемости - 73% по сравнению с курильщиками носителями такого же генотипа - 93%. Такая же тенденция сохраняется и в течение 18 месяцев наблюдения.

Доля пациентов без ПКТ среди имеющих «дикий» тип СУР2С9 гена с нормальным углеводным обменом за 12 месяцев составила 94,3%, а пациентов, страдающих сахарным диабетом — 88%. У больных с аллелем с утратой функции СУР2С9 гена без диабета, доля пациентов без ПКТ составила 89%, в то время как у пациентов с сахарным диабетом всего 75%. Через 18 месяцев доля пациентов без ПКТ среди, имеющих аллель с утратой функции СУР2С9 гена и страдающих сахарным диабетом составила всего 63%, что подтверждает доказанное ранее неблагоприятное влияние сахарного диабета на сердечно-сосудистые исходы.

В нашем исследовании мы обнаружили, что пациенты с АА генотипом ТВХА81 гена в 100% случаев не имели ПКТ в течение 18 месяцев наблюдения вне зависимости от комбинации со статусом углеводного обмена, курением или количеством факторов риска ИБС.

Так, у пациентов с АА генотипом гена ТВХА81 с нормальным углеводным обменом или страдающих сахарным диабетом доля пациентов без ПКТ за 18 месяцев составила 100%, в то время как у пациентов с ТТ генотипом и нормальным углеводным обменом 79%, а страдающих сахарным диабетом - 71%.

Вне зависимости от количества факторов риска ИБС пациенты с АА генотипом ТВХАБ1 не имели ни одного сердечно-сосудистого исхода. В то время как доля пациентов без ПКТ среди имеющих ТТ генотип составила 75% при наличии менее 4 факторов риска и 77% имея 4 и более факторов риска ИБС, хотя эти данные оказались недостоверными.

Нами было выявлено также, что пациенты с АА генотипом ТВХА81 независимо от варианта СУР2С9 гена не имели ни одного случая ПКТ за 18 месяцев наблюдения. Среди пациентов с АТ-ТТ генотипами ТВХАБ1 гена и * IV1 СУР2С9 генотипом доля без ПКТ за 12 месяцев составила 92%, а при сочетании АТ-ТТ с генотипом со сниженной активностью - 84% (рисунок 7).

К^иугятивмая доля га^еитсе без ссб^г.м >.ои5,*нироеанио;< первичной гонимой то-'и (метод Калланэ-Мейера) Различия статистически дсстоеерны (Хи-кеасрэт * 13.30. сс = 3 р = 3 0033) о Завершение + Цензурироеанмые

5 г

" 5

1 00

О 95

£ 0 90 с

1 "8Б 1 0 80 О 75 О 70 0 66

♦

Сочетания генотипов СГР2С9 и ТВХА51

-СУР2С9 'П

»ТВХАБ! АА

- -СУР2С9'П +ТВХА51 АТТТ

СГР2С9 V

( Сниженная активность) +ТБХА51 АА

СУР2С9

юни*енная эк^зность) »ТЕХА51АТТТ

0 еЭ 120 153 243 303 353 420 453 543 603 553 723 753 Период наблюдения иней)

Рисунок 7. Оценка риска возникновения ПКТ за 18 месяцев при сочетании полиморфизмов ТИХАЯ 1 и СУР2С9 генов

Известно, что аденознндифосфат (АДФ) является одним из наиболее важных паракринных медиаторов тромбоцита. АДФ через Р2У1 и Р2У12 рецепторы при помощи киназы, регулирующей уровень внеклеточного кальция и фосфолипазы А2 запускает цикл арахидоновой кислоты с образованием тромбоксана А2. Образование тромбоксана А2 из эндопероксидов осуществляется тромбоксан-синтазой. Секретируемые с началом активации тромбоцитов АДФ, серотонин и тромбоксан А2 в свою очередь активируют близлежащие тромбоциты, что запускает процесс тромбообразования в сосудах.

Таким образом, при анализе факторов, влияющих на повышение агрегации тромбоцитов и на сужение сосудов с помощью тромбоксана А2 (рисунок 8) при блокаде Р2У12 рецепторов клопидогрелем и цикла арахидоновой кислоты ацетилсалициловой кислотой, мы предполагаем, что наличие «медленного» А аллеля гена тромбоксан-синтазы ТВХА81 является значимым протективным фактором при вторичной профилактике ИБС. Однако наши данные требуют дальнейших более масштабных исследований в этом направлении.

ТР0М50ШГГ

АД <> - к* «« ела }<*; флг ШГ - кгом^-*?***'» ЕКК •»мам*. ь

И.,С -фссф*«8»ж А!

Рисунок 8. Факторы, влияющие на метаболизм тромбоксана А2

Выводы

1. Сердечно-сосудистые события (сердечно-сосудистая смерть, развитие нефатального инфаркта миокарда, случаи ранней постинфарктной стенокардии и тромбоз стента) достоверно (р<0,01) чаще возникают у пациентов, резистентных к терапии клопидогрелем. Риск возникновения сердечно-сосудистых событий у пациентов с АТ и ТТ генотипами ТВХА81 гена на 84 % выше (отношение шансов - 0,16) по сравнению с пациентами с АА генотипом, которые в 100% случаев не имеют первичные конечные точки (ПКТ), вне зависимости от комбинации со статусом углеводного обмена (р=0,056), курением (р=0,09), количеством факторов риска ИБС (р=0,18) или генотипом СУР2С9 гена (р<0,01).

2. Согласно принятому критерию резистентности (снижение АДФ-агрегации менее 10%) в исследуемой популяции выявлено 26% пациентов, резистентных к клопидогрелю. Уровень исходной АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациентов чувствительных к терапии клопидогрелем составил 67%, а у резистентных пациентов - 62%. Агрегация через 7 дней у

чувствительных пациентов достоверно (р<0,01) снизилась до 37%, в то время как у резистентных достоверно (р<0,01) повысилась до 67%.

3. При анализе клинических факторов в однородных группах пациентов выявлено достоверное влияние нозологической формы и статуса углеводного обмена на феномен возникновения резистентности. Пациенты с ОКС более чувствительны к терапии антиагрегантными препаратами, чем стабильные пациенты с мультифокальным поражением артерий, в том числе коронарных (43% против 56,8%, р<0,01). Пациенты, страдающие сахарным диабетом 1-го и 2-го типа менее чувствительны к антиагрегантной терапии, чем пациенты без диабета (51,6% против 42,5%, р<0,01).

4. «Медленный» АА генотип СУР2С19*2 достоверно ассоциирован с АДФ-агрегацией через 7 дней приема клопидогреля и высоким риском возникновения резистентности к клопидогрелю. Пациенты с АА генотипом гена тромбоксан-синтазы ТВ ХАЗ 1 оказались более чувствительны к терапии клопидогрелем, в то время как среди пациентов с АТ и ТТ генотипом было достоверно больше резистентных пациентов, р<0,01. Не получено достоверного влияния на уровни исходной агрегации, агрегацию через 7 дней приема клопидогреля и на возникновение резистентности полиморфизмов транспортного АВСВ1, СУР2С9 системы цитохрома Р-450 и рецепторного Р2У12 генов.

Практические рекомендации

У пациентов с мультифокальным поражением артерий или с ОКС, страдающих сахарным диабетом 1-го или 2-го типа, представляется целесообразным проведение генетического тестирования для выявления лиц с высоким риском сердечно-сосудистых событий. У данной категории пациентов при наличии А/Т (гб 6962291) полиморфизма гена тромбоксан-синтазы ТВХА81 назначение двойной антиагрегантной терапии аспирином и клопидогрелем может оказаться недостаточно эффективным.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Меснтская Д.Ф., Никитина Ю.М., Копылов Ф.Ю. Резистентность к клопидогрелю: все ли мы знаем? // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2013. - том 6, №1. - С. 27-33.

2. Меснтская Д.Ф., Никитина Ю.М., Копылов Ф.Ю. Современная антитромботическая терапия // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2013. - том 6, №4. - С. 19-24.

3. Копылов Ф.Ю., Меситская Д.Ф., Никитина Ю.М., Аксенова М.Г., Добровольский A.B., Ломакин О.В., Черный О.В. Положительное влияние гена тромбоксансинтазы А низкой активности на прогноз при ишемической болезни сердца // Терапевтический архив. - 2015. -№3. - С. 59-65.

4. Меситская Д.Ф., Никитина Ю.М., Ломакин О.В., Щекочихин Д.Ю., Копылов Ф.Ю. Влияние на прогноз оригинального и генерического клопидогрела в зависимости от различных полиморфизмов генов//Терапевтический архив.-2014.-том 86,№9.-С. 77-82.

5. Меситская Д.Ф., Никитина Ю.М., Копылов Ф.Ю., Сыркин А.Л., Аксенова М.Г., Кириллов М.Ю., Добровольский A.B. Клинические и фармакогенетические факторы, влияющие на резистентность к клопидогрелу у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями // Клиническая медицина. -2015. - том 93, №2. - С. 40-46.

6. Меситская Д.Ф., Никитина Ю.М., Копылов Ф.Ю., Сыркин А.Л. Резистентность к клопидогрелю у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями // Материалы конгресса Российского национального конгресса кардиологов «Интеграция знаний в кардиологии». -Москва, 3-5 октября 2012 г. - С. 300.

7. Меситская Д.Ф., Никитина Ю.М., Копылов Ф.Ю. Факторы, влияющие на резистентность к терапии клопидогрелем у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями // Научная программа Московского международного Форума кардиологов. - Москва, 26-28 марта 2013 г. -С. 118.

8. Меснтская Д.Ф. Влияние полиморфизма транспортного гена и генов системы цитохрома Р450 на резистентность к терапии клопидогрелем // Сборник материалов конференции Российского союза молодых ученых. Всероссийская научно-практическая конференция «Аспирантские и докторантские чтения: Моделирование научного исследования - форсайт-технологии». - Москва, 29 марта 2013 г. - С. 55-56.

9. Меснтская Д.Ф., Никитина Ю.М., Копылов Ф.Ю. Клиническая фармакогенетика клопидогреля у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями // Сборник материалов Юбилейного XX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 15-19 апреля 2013 г.-С. 184-185.

Список используемых сокращений

АГ - артериальная гипертония

АДФ - аденозиндифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБС - ишемическая болезнь сердца

МФА - мультифокальный атеросклероз

ОКС - острый коронарный синдром

OKConST - острый коронарный синдром без подъема сегмента ST на ЭКГ

OKCcnST - острый коронарный синдром с подъемом сегмента ST на ЭКГ

ПКТ - первичная конечная точка

СД - сахарный диабет

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

TBXAS1 -тромбоксан -синтаза

Подписано в печать:

27.05.2015

Заказ № 10781 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru