Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Прогностическая значимость степени гистологической злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы

На правах рукописи

Филиппова Екатерина Михаиловна

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ СТЕПЕНИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ ПРОТОКОВОЙ АДЕНОКАРЦННОМЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени Кандидата медицинских наук

г 1 МАЙ 2№

Москва - 2015

005569410

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Институт хирургии им. A.B. Вишневского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, отдел патоморфологии с лабораторией электронной микроскопии.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Паклина Оксана Владимировна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, Хомерикн Сергей Германович

руководитель лаборатории патоморфологии Московского клинического научного центра Департамента здравоохранения Москвы.

Доктор медицинских наук, профессор, Делекторская Вера Владимировна

заведующая лабораторий гистохимии и электронной микроскопии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии наук.

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «_» 2015г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.04 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте http//ww\v.rsmu.ru ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени НИ. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, дом 1

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, Леонова Людмила Васильевна

Общая характеристика работы.

Актуальность исследования.

Протоковая аденокарцинома (ПАК) является одной из самых прогностически неблагоприятных опухолей органов пищеварительного тракта и составляет 75-85% всех опухолей поджелудочной железы (ПЖ) (Кубышкин В.А.2004; Пальцев М.А. 2011). Несмотря на совершенствование хирургических методов и возможностей диагностики, с каждым годом в развитых странах прослеживается неуклонный рост заболеваемости и смертности от ПАК ПЖ. При IV стадии заболевания и отсутствии радикального удаления опухоли, прогноз для жизни пациентов крайне неблагоприятный, медиана выживаемости составляет 3-5 месяцев, длительное бессимптомное клиническое течение заболевания приводит к тому, что лишь у 15-20% пациентов опухоль на момент диагностики является резектабельной (Егоров В.И., 2010). В последнее время для ПАК ПЖ были выделены различные клинические и морфологические факторы прогноза, из которых важнейшим является определение гистологической степени злокачественности (grade). В настоящее время существует несколько систем оценки вариантов гистологической дифференцировки ПАК ПЖ. Bosnian T.F. и соавт. в последней редакции гистологической классификации опухолей пищеварительного тракта (ВОЗ, 2010), предлагают оценивать степень гистологической злокачественности ПАК ПЖ на основе дифференцировки гистологических структур опухоли, степени ядерного полиморфизма, количества митозов в клетках опухоли. При выраженной гетерогенности опухоли, учитываются все компоненты гистологической злокачественности. Согласно данной системе оценки, большинство случаев ПАК ПЖ можно отнести к высоко- и умереннодифференцированным опухолям, обладающим более благоприятным прогнозом, по сравнению с низкодифференцированными и анапластическими, что однако не всегда согласуется с существующей статистикой выживаемости. Другие авторы предлагают использовать для комплексной оценки степени дифференцировки ПАК ПЖ такие показатели, как секреция муцинов (Паклина О.В., Сетдикова Г.Р., 2008). эксперессия опухолевыми клетками ростовых факторов (EGFR, HER 2/neu), карцино-эмбрионального антигена (CEA) и др. (Navas С.. 2012), матриксных металлопротеиназ (Гуревич Л.Е., 2005). Большое значение в настоящее время придается показателям баланса пролиферативной активности опухолевых клеток и апоптоза. установлена роль мутаций в генах, регулирующих эти процессы (р53, р16). Однако, данные выживаемости больных в зависимости от степени гистологической злокачественности противоречивы, поэтому проблема разработки новой гистологической системы злокачественности для ПАК ПЖ,

которая отвечала бы таким критериям как объективность, хорошая воспроизводимость и простота в использовании, пока еще остается актуальной.

Цель исследования - разработка морфологических критериев злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, влияющих на выживаемость больных.

Для достижения указанной цели, были определены следующие задачи:

1.Изучить прогностическую значимость степени злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, определенной по системе ВОЗ

2.Изучить прогностическую значимость степени злокачественности (grade) протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, определенной по системе Глисона.

3.Определить прогностическую значимость наличия в структуре опухоли анапластического компонента

4.Изучить прогностическую значимость маркеров пролиферации и апоптоза

5.Построить алгоритм морфологической диагностики степени злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.

Научная новизна.

Гистологическая степень злокачественности ПАК ПЖ была определена с помощью нескольких широко используемых в морфологической диагностике систем градации. Статистически значимые различия были получены в группах пациентов, у которых степень злокачественности определялась по системе Глисона. Определена роль анапластического компонента, как наиболее важного фактора прогноза, влияющего на выживаемость больных.

Практическая значимость.

Разработан перспективный алгоритм определения степени злокачественности протоковой аденокарциномы, основанный на выделении двух типов опухоли — дифференцированного и дедифференцированного, по признаку наличия или отсутствия в ней анапластического компонента.

Внедрение в практику результатов исследования.

Полученные в ходе работы данные по морфологической диагностике ПАК ПЖ используются в практической работе отдела патоморфологии Федерального гос учреждения «Институт хирургии им. A.B. Вишневского» Министерства Здравоохранения РФ, Городской клинической больницы № 1 им. Н.И. Пирогова г. Москвы.

Апробация диссертации.

Основные материалы диссертации доложены на XIV Всероссийском конгрессе молодых ученых «Актуальные вопросы онкологии» (Москва, 2013г), а так же на

4

совместном заседании сотрудников отдела патоморфолопш ФГБУ «Институт хирургии им. A.B. Вишневского» Минздрава России и кафедры патологической анатомии и клинической патологической анатомии ГБОУ РНИМУ им. Н И. Пирогова Минздрава России.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 4 в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждений, заключения, выводов, списка литературы. Текст диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирован фотографиями, таблицами, схемами, гистограммами и графиками. Библиографический указатель включает 175 источников, из них 20 отечественных и 155 зарубежных.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1 .Гистологическая степень злокачественности является важным прогностическим фактором послеоперационной выживаемости больных ПАК ПЖ.

2. Степень злокачественности ПАК ПЖ определенная по системе ВОЗ не имеет статистически значимой связи с показателями выживаемости больных, в отличие от системы градации Глисона.

3. Гистологические варианты протоковой аденокарциномы, в которых присутствует анапластический компонет можно отнести к дедиффренцированным опухолям, имеющим худший прогноз для жизни больных. Опухоли без анапластического компонента (дифференцированные) прогностически более благоприятны.

Содержание работы.

Материал и методы исследования.

Для клинико-морфологического сопоставления исследован операционный материал 60 больных ПАК ПЖ, находившихся на лечении в Институте хирургии им. A.B. Вишневского с 2005 по 2012 годы, из которых для статистической обработки были выбраны 47 больных (22 мужчин и 25 женщин). Возраст пациентов колебался от 47 до 76 лет, составляя в среднем 60 лет. 13 больных исключенных из статистической обработки умерли в результате осложнений операции или данные об их послеоперационной

выживаемости не были получены. У всех пациентов операция была выполнена радикально (R0). Гистологически все изученные опухоли являлись первичными образованиями поджелудочной железы, соответствующими протоковой аденокарциноме не специального типа (ICD-code 8500/3, ВОЗ, 2010).

У 24 пациентов после оперативного вмешательства была диагностирована IIb (рТ2-3N1) стадия опухоли, у 19 - IIa (рТ2-3 N0), у 3 - III (рТ4), у 1 - 1b (pT2N0). В 27 наблюдениях выявлены метастазы в регионарные лимфатические узлы (N1). Стадирование проводилось согласно 7 пересмотру международной классификации TNM.

Возраст

{средний возраст 60 лет)

■ мужчины

■ женщины

Морфологическая стадия рт [UICC, 2010т)

Клиническая стадия заболевния

Рис. 1 Распределение больных ПАК ПЖ в зависимости от пола, возраста, морфологической и клинической стадий заболевания.

Преобладающей локализицией опухолей была головка ПЖ (35 наблюдений), в 7 случаях опухоль локализовалась в теле ПЖ, в 1 случае в хвосте, в 4 случаях опухоль выходила за пределы 1 локализации (Рис 1). В зависимости от локализации опухоли, пациентам выполнялись следующие типы оперативных вмешательств: панкреатодуоденалъная резекция (ПДР) стандартная при ТЗ опухолях или расширенная при Т4 опухолях ; дистальная резекция (ДР) со спленэктомией; дуоденопанкреатэктомия.

Рис. 1 Распределение больных по локализации опухоли в ткани ПЖ

При макроскопическом исследовании удаленного операционного материала оценивали локализацию и размеры опухоли поджелудочной железы, ее консистенцию, наличие очагов распада и кровоизлияний. Так же отмечали прорастание опухоли в парапанкреатическую клетчатку, в прилежащие структуры - стенку желудка и двенадцатиперстной кишки в случае локализации опухоли в головке поджелудочной железы, в селезенку при опухолях тела и хвоста, оценивали возможность прорастания опухоли в стенки висцеральных сосудов (чревного ствола, верхней брыжеечной артерии, воротной вены). Все информативные фрагменты опухоли, а так же найденные регионарные лимфатические узлы брались для гистологического исследования.

Гистологические препараты, полученные с помощью стандартного метода фиксации и парафиновой заливки, изучали и фотографировали с помощью обычного светового микроскопа Leica DMLB. а так же с помощью системы сканирования гистологических срезов 3D Histech и программы Panoramic Viewer, с целью уточнения соотношения различных типов гистологических структур в опухоли.

Иммуногистохимическое исследование с целью изучения пролиферативной и апоптотической активности опухоли, проводили на отобранных образцах (6 случаев из каждой группы). Для этой задачи определяли экспрессию маркера пролиферации KÍ67 и маркера мутаций регуляторного гена р53.

Постановку иммуногистохимических реакций проводили с использованием стандартных протоколов, прилагаемых к используемым антителам. Визуализацию результатов иммуногистохимического исследования проводили с помощью системы (Ultra Vision LP) LabVision, с использованием диаминбензидина (DAB), ядра докрашивали гематокистином. Положительно окрашенными считали темно коричневые ядра, не окрашенные ядра имели синий цвет. Результаты реакции оценивали в процентах окрашенных ядер опухолевых клеток относительно не окрашенных на 100-300 клеток

Изучение процессов апоптоза в опухоли проводили с помощью системы детекции апоптоза DeadEnd Colorimetric TUNEL System. TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) - представляет собой аналитическую систему, которая

позволяет выявить фрагментированные молекулы ДНК на поздних стадиях апоптоза или программированной гибели клетки. Метод основан на использовании фермента терминальной деоксинуклеотидил трансферазы (TdT), который распознает точки фрагментации в молекуле ДНК. Исследованию подвергали серийные срезы с парафиновых блоков, приготовленных по стандартной методике. В качестве положительного контроля использовалась обработка срезов раствором фермента ДНКазы в рабочей концентрации 3 е.а. в мкл, которая проводилась перед этапом нанесения смеси, содержащей TdT. Результаты реакции учитывались путем подсчета абсолютного количества ядер клеток с коричневым окрашиванием во всем срезе.

Для электронно-микроскопического исследования 7-8 кусочков опухоли, полученной от 10 больных с ПАК ПЖ размером приблизительно 1 мм3, фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% растворе четырехокиси осмия. Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 96 и 100%), после чего пропитывали в смеси окись пропилена-аралдитовая смола. После пропитки материал помещали в капсулы и заливали аралдитовой смолой, затем помещали в термостат при температуре 60°С на двое суток. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1,5-2 мкм. После этого срезы окрашивали толуидиновым синим. После предварительного светомикроскопического исследования полутонких срезов вырезали пирамидки с таким расчетом, чтобы поверхность среза приходилась на интересующий нас участок. Ультратонкие срезы толщиной 100-200 нм получали на ультрамикротоме фирмы LKB (Швеция). Ультраструктурное изучение препаратов проводили при помощи электронного микроскопа JEOL JEM 100-СХ (Япония) в трансмиссионном режиме при ускоряющем напряжении 80КВ. Оценка полученных электронограмм проводилась под руководством заведующей лабораторией электронной микроскопии ФГБУ «Институт хирургии им. A.B. Вишневского» Минздрава России, доктора биологических наук Чекмарёвой И.А.

Статистическая обработка полученных данных проводилась программой Statistica 6.0 (StatSoft, USA), со значимым коэффициентом р<0.05. Выживаемость оценивалась методом К. Майера (1958). преимущество которого - возможность оценивать не только полные данные, но и цензурированные. проводить анализ выживаемости в различных группах больных. Данные по выживаемости были получены от 32 больных, к цензурированным данным отнесены 15 пациентов, из которых 10 были живы на момент исследования, а судьба 5 пациентов прослежена на протяжении 7, 12, 15 и 41 месяцев. Данные помещались в таблицу, в строках которой размещались пациенты, а в столбцах

соответствующие им клинические и морфологические характеристики, а так же указывался тип данных.

Макро- и микроскопическая характеристика ПАК ПЖ. Макроскопически ПАК ПЖ представляла собой плотный серовато-желтый узел, диаметром от 2 до 7 см, без четких границ. В большинстве случаев определялся рост опухоли в парапанкреатическую клетчатку и стенку 12-ти перстной кишки, что соответствовало ТЗ стадии по системе TNM (стадирование проводилось согласно рекомендациям Union for International Cancer Control, 2010). В случае локализации опухоли в области головки поджелудочной железы часто наблюдалось едавление общего желчного и главного панкреатического протоков, за счет прорастания их стенок опухолю, ретенционное расширение проксимальной части холедоха и панкреатических протоков в области тела и хвоста поджелудочной железы. В случаях локализации опухоли в головке ПЖ, маркировка макропрепарата производилась в соответствии с рекомендациями CAP (College of American Pathology, 2013), производилась оценка среза поджелудочной железы, среза общего желчного протока, маркировались задняя, передняя и медиальные поверхности парапанкреатической клетчатк. Затем через препарат проводили параллельные поперечные срезы, захватывающие опухоль, парапанкреатическую клетчатку и область ампулы (Рис.3).

В случаях локализации опухоли в дистальных отделах поджелудочной железы, цветом маркировались 2 поверхности парапанкреатической клетчатки.

При микроскопическом исследовании ПАК ПЖ имела гетерогенную структуру - в одном и том же срезе опухоли в различных соотношениях определялись железистые структуры различной степени дифференцировки, иногда участки слизеобразования. Строма опухоли хорошо развита, десмопластическая. иногда с признаками инфильтрации лимфоцитами, плазмоцитами и макрофагами.

Результаты исследовании.

Рис. 3 Схема маркировки панкреато-дуоденального комплекса.

Характерной особенностью протоковой аденокарцнномы было наличие инвазии периневральных пространств в парапанкреатической клетчатки, которая наблюдалась в большинстве исследованных случаев (85%), внутрисосудистая микроинвазия имелась в 4 исследованных случаях (8,5%).

Оценка степени ¡.¡(/качественности ПАК ПЖ с помощью системы градации, рекомендованной ВОЗ. На первом этапе исследования оценка степени злокачественности ПАК ПЖ проводилась по системе, рекомендованной ВОЗ, согласно которой grade опухоли определяется аналогично степени ее гистологической дифференцировки (Таблица 1). На основании представленных критериев, к гистологическим структурам, соответствующим высокой степени дифференцировки, были отнесены опухоли, в которых преобладали высокодифференцированные протокоподобные железистые структуры различного размера с близкими к округлым или неровными контурами базальной поверхности, неоднородными контурами апикальной поверхности, окруженные хорошо развитой десмопластической стромой.

Таблица №1

Степени злокачественности ПАК ПЖ (ВОЗ, 20 Юг)

Степень злокачественное ти (grade) Дифференцировка желез Продукция муцина Количеств о митозов (на 10 РПЗ) Ядерный полиморфиз м

grade 1 Высокодифференцированны е Интенсивна я <5 Низкий

grade 2 Умереннодифференцированн ые протоко-подобные и тубулярные структуры Нерегулярна я 6-10 Умеренный

grade 3 Низкодифференцированные железистые, мукоэшщермоидные и плеоморфные структуры Отсутствует > 10 Значимый полиморфиз м и увеличение ядра

Опухолевый эпителий однослойный, иногда с участками псевдостратификации.

Клетки гиперхромные, вытянутой или кубической формы, цитоплазма эозинофильная,

ядра округлой или овальной формы расположены чаще центрально или базально, с четко

различимыми ядрышками, полиморфизм обычно слабо выражен. Митотическая

10

активность низкая - 1-5 митозов в 10 РПЗ. В проведенном исследовании степень дифференцировки ПАК ПЖ оценивалась не только на светооптическом, но и на электронно-микроскопическом уровне. При высокой степени дифференцировки ПАК ПЖ в паренхиматозной части отмечали разные по размеру структуры похожие на протоки. Муцинпродуцирующие железы разного размера, некоторые не были полностью сформированы, другие, деструктивно изменены, что являлось аномальным признаком. Муцинпродуцирующие опухолевые эпителиоциты, в основном, имели цилиндрическую форму, на апикальном полюсе выявлялись единичные и, чаще слипшиеся, микроворсинки. Ядра клеток вытянутой или овальной формы, иногда с признаками умеренного полиморфизма, располагались в базалыюй части. В цитоплазме обнаруживались гранулы муцина, вакуоли различного размера, немногочисленные митохондрии с нарушенной ориентацией крист и слаборазвитая гранулярная цитоплазматическая сеть. Во фрагментах опухолевой ткани, где деструктивные процессы не выражены, межклеточные соединения представлены интердигитациями и плотными контактами. При выраженности деструктивных процессов интердигитации (пальцевидные межклеточные соединения) претерпевали ряд изменений - расстояние между контактирующими клетками увеличивалось, складчатость плазмолеммы уменьшалась. Плотные контакты определяли только между апикальными частями эпителиальных клеток. Базальная часть опухолевых эпителиоцитов прилегала к набухшей, фрагментированной базалыюй мембране. Протокоподобные железистые структуры располагались в склерозированной строме и не соответствовали нормальной лобулярной архитектонике поджелудочной железы. Среди волокон коллагена находились зрелые фибробласты. чаще в состоянии деструкции, и капилляры с измененной ультраструктурой. Перикапиллярное пространство было расширено, базальный слой, включающий базальную мембрану и перициты, изменен. Базальная мембрана набухшая, неровная, фрагментированная. Перициты в состоянии деструкции. Встречали единичные тучные клетки, которые участвуют в запуске и регуляции воспалительных реакций. Цитоплазма тучных клеток была заполнена большим количеством электронно-плотных секреторных гранул. Анапластический компонент в этой группе опухолей обнаружен не был.

К умереннодиффренцированным опухолям отнесены ПАК ПЖ, в которых преобладали железистые структуры различного размера, чаще неправильной формы с явными признаками атипии, где также встречались папиллярные, криброзные или тубулярные структуры, небольшие пласты эпителиальных клеток. Эпителиальные клетки опухоли имели вытянутую, кубическую или уплощенную форму, иногда с образованием псевдососочковых структур, выступающих в просвет желез, где часто в большом

11

количестве встречались слущеные опухолевые клетки и слизь. Ядра располагались на любом уровне, полиморфизм более выражен. Хроматин в основном дисперсный, но иногда с крупными глыбками, ядрышки четко различимы. Количество митозов - 6-10 на 10 РПЗ. На ультраструктурном уровне в опухолях умеренной степени дифференцировки встречались протоковые структуры разного размера и неправильной формы. Ядра, как правило, имели сложную, причудливую конфигурацию, выглядели сегментированными. Нуклеоплазма нередко выглядела оптически просветленной с глыбками хроматина различной величины. Псевдожелезистые структуры представлены малигнизированными эпителиоцитами чаще кубической или уплощенной формы, окруженные выраженной фиброзной стромой. Снижена выработка слизи, участки опухоли с протоковыми структурами, продуцирующими муцин, встречались реже, чем при высокой степени дифференцировки ПАК. Электронно плотная цитоплазма эпителиоцитов чаще отличалась скудностью органелл - небольшое количество митохондрий с просветленным матриксом и нарушенной ориентацией крист, отдельные короткие профили гранулярной цитоплазматической сети, редко отмечали небольшое количество гранул муцина. Отличительной особенностью от предыдущей группы опухолей являлось наличие анапластического компонента. На светооптическом уровне это были крупные клетки с ядерным полиморфизмом и маргинальным расположением хроматина. Ультраструктурная анаплазия опухолевой клетки выражалась в мембранных контактах ядра, митохондрий и эндоплазматической сети, наличии митохондрий не типичной формы (гетерогенность органелл). Большинство митохондрий увеличены в размере с просветленным матриксом и частичной редукцией крист. Вакуолизация клеток сочеталась с повышением осмиофилии основного вещества цитоплазмы и деструкцией митохондрий . Клеточные контакты типа интердигитаций были единичны, в основном, имели место простые межклеточные контакты, посредством которых осуществляется слабая механическая связь клеток. К опухолям с низкой степенью дифференцировки были отнесены ПАК ПЖ, архитектурно представленные пластами из недифференцированных клеток, разрозненными группами или отдельно лежащими клетками, а также ПАК с мелкими железистоподобными структурами, клетки которых обладали выраженной степенью атипии и полиморфизма. Цитоплазма опухолевых клеток в основном оксифильная, иногда с содержанием крупных оптически пустых вакуолей. Ядра уродливые различных размеров и формы, хроматин с крупными глыбками или полностью конденсированный. Опухолевые клетки обладали высокой митотической активностью (10 и более митозов в 10 РПЗ), встречались атипические митозы. В некоторых случаях встречались анаплазированные участки. На ультраструктурном уровне паренхима опухоли представлена солидными участками с

фокусами некроза, мелкими опухолевыми железами с электронно плотной цитоплазмой, окруженными слабо развитой стромой. С уменьшением степени днфференцировки ПАК ПЖ чаще отмечали наличие анапластического компонента. Клетки опухоли, расположенные отдельно или скоплениями, частично или полностью утрачивают ультраструктурные признаки гистогенетической днфференцировки (рис. 24). Ядра таких клеток с глубокими инвагинациями с просветленной нуклеоплазмой и маргинальным расположением хроматина. Цитоплазма в значительной степени вакуолизирована, сохранные митохондрии единичны, гранулярная цнтоплазматическая сеть представлена отдельными короткими фрагментами. Клеточные границы прерывистые, плохо различимы. На коротких участках отмечали простые межклеточные контакты. С уменьшением межклеточного сцепления, возможно, связан инвазивный рост опухоли и способность к метастазировашпо.

Кроме полиморфных клеток с измененными ядрами отмечали скопления веретенообразных (саркомаподобных) клеток с оватьными гиперхромными ядрами и мелкими ядрышками. Гранулярная цнтоплазматическая сеть и секреторные пузырьки образовывали крупные вакуоли. Клетки формировали пучки среди волокон стромы, где отмечали и деструктивно измененные сосуды капиллярного типа.

В результате проведенного исследования отмечены ультраструктурные признаки анапластического компонента опухоли; отсутствие его в высокодифференцированных опухолях ПАК ПЖ. По мере снижения днфференцировки опухоль теряет способность формировать железистые структуры, изменяются (упрощаются) межклеточные контакты, возрастает степень выраженности клеточной атипии малигнизированных эпителиоцитов.

После применения системы градации ВОЗ ПАК ПЖ, дополненной данными электронно-микроскопического исследования, больные были разделены на 3 прогностические группы.

grade-l(выcoкoдиффepeнциpoвaннaя опухоль)-9 человек; grade-2 (умереннодифференцированная опухоль) - 26 человек; grade-З (низкодифференцированная опухоль) - 12 человек.

Определение степени злокачественности (grade) ПАК ПЖ с помощью системы градации Глисона. На втором этапе исследования степень злокачественности ПАК ПЖ оценивалась с помощью системы градации Глисона, предложенной в 1966 г. американским исследователем D.F. Gleason, для определения градации аденокарциномы предстательной железы. В связи с тем, что большинство ПАК ПЖ содержит участки различной днфференцировки, следует считать возможным применение к ней данной системы градации. Ранее Adsay et al применяли модифицированную систему Глисона для

13

градации ПАК ПЖ, в результате чего были выделены 3 степени злокачественности данной опухоли, которые коррелировали с данными отдаленной выживаемости больных.

Согласно шкале Глисона, все участки аденокарциномы оцениваются в баллах от 1 до 5 по мере снижения дифференцировки, затем суммируется самый распространенный компонент и второй по распространенности. В нашем исследовании мы оценивали различные типы структур ПАК ПЖ в баллах, применяя к ним следующие морфологические критерии:

3 балла — железистые структуры среднего и крупного размера, различной формы, с появлением папиллярных и мелких криброзных структур, нарастанием ядерного полиморфизма, инвазивным ростом.

4 балла - выраженная стромальная инвазия, мелкие тубулярные, ацинарные, криброзные и папиллярные структуры, различный размер желез, заметный полиморфизм ядер.

5 баллов - выраженная стромальная инвазия, опухолевые клетки изолированные или в виде солидных комплексов с едва различимыми просветами желез, резкий полиморфизм ядер, выраженная митотическая активность. Гистологические структуры, соответствующие 1 и 2 баллам в большей степени соответствовали диспластическим изменениям протокового эпителия - панкреатической интраэпителиальной неоплазии (Рап1Ы-2 и Рап!Ы-3), поэтому в настоящем исследовании не рассматривались.

Учитывалось так же, что значение имеет не только сумма баллов, но и порядок слагаемых. Так, например сумма Глисона 3+4=7 относится к умереннодифференцированной опухоли, а сумма 4+3=7 к низкодифференцированной.

Основные типы железистых структур ПАК ПЖ и их размерные соотношения в соответствии с баллами, по системе Глисона, приведены на схеме (Рис.4)

Рис. 4. Три типа железистых структур ПАК ПЖ и соответствующие им баллы по системе Глисона.

3 балла

4 балла

5 баллов

В результате данной системы градации, были получены три варианта гистологической дифференцировки ПАК ПЖ, основанные на значении суммы Глисона (Таблица 2). В соответствии с вариантами степеней злокачественности ПАК ПЖ, больные были разделены на 3 прогностические группы: grade-1 - 7 человек, grade-2 - 24 человека и grade-З - 16 человек.

Таблица 2

Варианты суммы Глисона и соответствующие им значения grade ПАК ПЖ

Сумма Глисона Значение grade

3+3=6 grade-1 (Рис.6-7)

3+4=7 grade-2 (Рис.8)

4+3=7, 4+4=8, 4+5=9, 5+4=9 grade-З (Рис.9-11)

Градация ПАК ПЖ в зависимости от наличия или отсутствия в опухоли анапластического компонента. Анапластический компонет (недифференцированный полиморфно-клеточный, саркомаподобный) нередко может присутствовать в структуре ПАК ПЖ различных по степени дифференцировки или быть основным компонентом анапластических форм рака ПЖ. Гистологически анапластический компонент опухоли характеризуется преобладанием крупных плеоморфных клеток с уродливыми ядрами, большим количеством глыбок ядерного хроматина, могут встречаться гигантские многоядерные клетки или клетки с пикнотическими ядрами. Цитоплазма таких клеток часто эозинофильная, содержит вакуоли, могут встречаться атипичные митозы. В некоторых случаях ПАК ПЖ может присутствовать саркомаподобный компонент, характеризующийся веретеновидными и мелкими округлыми клетками с выраженным полиморфизмом и большим количеством митозов, окруженными волокнами стромы. иногда формирующими ритмичные структуры. (Рис. 5). Анапластический компонент является преобладающим (50% и выше) в структуре таких редких форм рака ПЖ. как анапластический и недифференцированный рак с остеокластоподобными гигантскими клетками. Частота встречаемости этих форм составляет 0.2% от общего числа злокачественных опухолей ПЖ, прогноз выживаемости чаще неблагоприятный [Paal Е., Thompson L.et al, 2001]. Нередко анапластический компонент в небольшом объеме может присутствовать в ПАК ПЖ и служить признаком определения потенциала злокачественности опухоли, как неблагоприятный прогностический фактор, определение которого явилось одной из задач настоящего исследования

Рис.5 Анапластический компонент в протоковой аденокарциноме, окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200.

На третьем этапе исследования пациенты были разделены на 2 группы по признаку наличия или отсутствия в опухоли анапластического компонента, площадь которого сотставляла от 15 до 30% в срезах. В исследованном материале анапластический или саркомаподобный компонент, встречался преимущественно в низко - и умереннодифференцированных опухолях. По признаку наличия или отсутствия анапластического компонента все наблюдения были разделены на 2 группы: в 18 случаях в исследованных ПАК ПЖ присутствовали анапластические структуры, такие опухоли были отнесены к группе дедифференцированных (А+), 29 случаев, в которых эти структуры отсутствовали - к группе дифференцированных (А-).

Иммуногистохилшчесое исследование пролиферативной и апоптотической активности ПАК ПЖ. При иммуногистохимическом исследовании проводилась оценка биологических характеристик опухоли, таких как уровень пролиферативной активности и апоптоза. В результате было выявлено, что уровень экспрессии KÍ67. в участках опухоли, обладающих различной степенью дифференцировки одинаково высок и может составлять до 80-100%, что говорит о высокой пролиферативной активности протоковой аденокарциномы . Сходные результаты получены при оценке уровня экспрессии р53 - до 90% в опухолевых структурах различной дифференцировки. Внутренним контролем являлись нормальные протоковые структуры поджелудочной железы, ядра которых оставались не окрашенными. Уровень апоптотической активности опухоли оценивался с помощью реакции TUNEL, которая маркирует концевые фрагменты молекулы ДНК клеток, находящихся на последней стадии апоптотического процесса. В результате ядра этих клеток преобретают коричневое окрашиваение, что позволяет произвести их подсчет. Контролем служил срез, предварительно обработанный раствором DNase, вызывающим фрагментацию молекул ДНК опухолевых клеток. В исследованном материале ПАК ПЖ различных степеней дифференцировки, лишь единичные ядра опухолевых клеток на все поля зрения имели положительное окрашивание, тогда как в элементах стромы, а так же прилежащих к ткани опухоли лимфоузлах такие клетки встречались в количестве 2-10 на

V,: J.-v 1 .v V л •

»" )•- - v-."V V-v •VSz:.V»-*rU

10 РПЗ. В контрольном препарате большинство ядер опухолевых клеток имели коричневую окраску, что связано с фрагментирующим воздействием ДНКазы (рис. 6).

шш^ш 1

л.Л .Я'.;..''-

• .'.]r "/'/•. Рис 6. ПАК ПЖ. Реакция TUNEL.

* "í , г.. ■ "'. Единичное окрашенное ядро

опухолевой клетки. Увеличение х400.

Результаты реакции, вместе с высоким уровнем экспрессии р53 в опухолевых клетках говорят, о крайне низкой апоптотической активности ПАК ПЖ. Анализируя данные иммуногистохимического исследования биологических характеристик опухоли, становиться очевидным отсутствие различий экспрессии изучаемых молекул в опухолях различной гистологической дифференцировки. что делает не целесообразным их использование для задач определения степени злокачественности ПАК ПЖ.

Анализ данных выживаемости. Для того чтобы оценить объективность применяемых систем градации, полученные данные сравнивались с показателями выживаемости пациентов. Полные данные по выживаемости были получены от 32 больных, к цензурированным отнесены 15 пациентов, из которых 10 были живы на момент исследования, и судьба 5 пациентов прослежена на протяжении 7, 12, 15 и 41 месяцев. Медиана выживаемости больных после выполнения радикальной операции составила 13 месяцев, двухлетняя выживаемость не превышала 19%, что согласуется с данными других авторов (Кубышкин В.А. и соавт., 2004г; Данилов М.В.. 1995) (Рис 7). Результаты исследования сравнения выживаемости в исследованных группах пациентов представлены в таблице 3.

Как видно из представленной ниже таблицы, статистически значимых различий в данных выживаемости больных в зависимости от пола и возраста не наблюдалось. Статистически значимых различий по выживаемости между группами N0 и N1. а так же между ПА и ПВ стадиями опухоли выявлено не было (р=0.5).

Таблица№3

Клинико-морфологические характеристики опухоли в связи сданными послеоперационной выживаемости больных.

Критерии Количество случаев % Значения коэффициента р

Пол

Мужчины 22 47 0,4

Женщины 25 53

Возраст

<60 25 47 0,4

>60 22 53

Наличие метастазов в лимфатические узлы (pN)

pNO 20 43 0,5

pNl 27 57

Grade (WHO)

I 9 19 0,1

И 26 55

III 12 26

Grade (Glison)

I 7 15 0,04

II 24 51

III 16 34

Анапластический компонент (A)

Присутствует (A+) 18 38 0.032

Отсутствует (A-) 29 62

При оценке гистологической злокачественности с использованием критериев системы ВОЗ большинство исследованных опухолей отнесено в категорию умеренно дифференцированных новообразований (grade II), что связано с неоднородностью структуры ПАК ПЖ. В одной и той же опухоли присутствовали железы различной степени дифференцировки, тогда как оценка, согласно примененной данной системе градации, производилась по преобладающему компоненту. При сравнении данных

послеоперационной выживаемости в 3-х группах (grade I. II и III), не было выявлено достоверных статистических различий (коэффициент р=0,1) (Рис.8).

В результате применения системы Глисона возрастает количество пациентов в группах с более высокой степенью злокачественности опухоли, по сравнению с низкой и умеренной.

Q 10 20 30 40 SO SO 70 ВО

Рис.7.Общаяпослеоперационная выживаемость больных раком головки поджелудочной железы после радикального хирургического лечения (Kaplan-Meier).

О Ю 20 30 40 50 во 70 вО' *

Рис.8. Общая послеоперационная выживаемость больных ПАК ПЖ, степень злокачественности (grade) определена по системе ВОЗ. р=0.1

При сопоставлении данных выживаемости больных и степени злокачественности, определенной по данной системе, получены статистически достоверные различия в группах с grade I, grade II и grade III (p=0.04) (Рис. 9). Ранее Adsay и соавт., 2005г., изучив применение модифицированной системы Глисона на 112 больных ПАК ПЖ, получили прямую корреляцию между grade и сроками жизни больных после радикальной операции.

Наибольший интерес представляют результаты сопоставления послеоперационной выживаемости больных в 2 группах, выделенных по признаку наличия или отсутствия анапластического компонента в опухоли (А+ и А-). В результате сопоставления были получены статистически значимые различия (р=0.032). Кумулятивная кривая выживаемости в зависимости от А-критерия представлена на Рис. 10.

Кумулятивная трнвая выживаемое!* Кумулятивная уривая аылтваеыости

Cumulative Prooortion SuTyiwnp (Kaplan-Meiei Cumulative Proportion Suiwving {Kaplan-Meiei

о Complete ■ Cen*ued о Complale .- Censorefl

Рис.9 Кумулятивная кривая выживаемости больных. Степень злокачественности опухоли (grade) определена по системе Глисона.

Рис. 10 Общая послеоперационная выживаемость больных ПАК ПЖ в зависимости от наличия в опухоли анапластического компонента,

коэффициент р=0.032 .

Медиана выживаемости больных с анапластическим компонентом опухоли составила 8.5 месяцев, без анапластического компонента - 13 месяцев.

Полученные результаты также показывают, что такие клинико-морфологические характеристики как пол. возраст пациентов, стадия и размер первичной опухоли не влияют на послеоперационную выживаемость. Не получено достоверной корреляции между выживаемостью больных и степенью злокачественности опухоли (grade), определенной по степени дифференцировки, как рекомендует ВОЗ. Напротив, при использовании системы Глисона, которая учитывает не только самый распространенный компонент в опухоли, но и второй по распространенности, получена достоверная связь с показателями послеоперационной выживаемости больных, что делает данную систему градации перспективной для применения в диагностике ПАК ПЖ.

Наибольшую прогностическую значимость, представляет наличие в опухоли анапластического компонента, вне зависимости от его площади и морфологических характеристик других опухолевых структур, что усовершенствует применяемую систему определения степени злокачественности ПАК ПЖ. В качестве алгоритма предлагается разделять все ПАК ПЖ на два основных типа - дифференцированные, в которых анапластический компонент отсутствует и дедифференцированные, в которых присутствует анапластический компонент. Алгоритм определения степени злокачественности ПАК ПЖ по анапластическому компоненту приведен на Рис. 11.

Анапластический компонент присутствует

Анапластический компонент отсутствует

Неблагоприятный прогноз

Относительно бол ее благоприятный прогноз

Рис. 11 Алгоритм определения степени злокачественности (grade) ПАК ПЖ по признакку наличия или отсутствия в опухоли анапластического компонента.

Анализ и обсуждение собственных результатов.

Задачами исследования являлись оценка гистологической степени злокачественности ПАК ПЖ по нескольким широко используемым в морфологической практике системам градации с последующим сравнением полученных результатов с данными общей послеоперационной выживаемости больных.

На первом этапе исследования степень злокачественности ПАК ПЖ определялась с помощью системы градации, рекомендованной ВОЗ и опубликованной в руководстве по гистологической классификации опухолей «WHO Classification of Tumours of the Digestive System» 2010 года, под редакцией Т. Bosman. Согласно требованиям этой системы все опухоли делятся на 3 степени злокачественности, в зависимости от степени дифференцировки железистых структур, уровня продукции муцинов, степени ядерного полиморфизма и количества митозов в 10 РПЗ.

В нашем исследовании опухоли были изучены с помощью световой микроскопии и дополнены данными электронно-мокроскопического исследования, которое позволило на ультраструктурном уровне оценить степень дифференцировки опухолевых клеток.

В результате были получены 3 группы больных: grade 1- 9 человек, grade2 — 26 и grade3 - 12 человек. Показатели выживаемости в данных трех группах сравнивали методом Каплана-Майера, который не показал статистически значимых различий (р=0.1).

Такой результат, на наш взгляд, говорит о недостаточной воспроизводимости этой системы градации, что связано с использованием в ней большого количества параметров. Кроме того нет достаточной ясности, как следует трактовать наличие в структуре опухоли низкодифференцированного компонента, представленного в небольшом объеме.

Изучение ядерного полиморфизма как отдельного прогностического фактора для ПАК ПЖ, по нашему мнению, не является целесообразным, так как по мере снижения дифференцировки опухолевых желез происходит увеличение его степени.

На следующем этапе степень злокачественности ПАК ПЖ оценивалась с помощью системы Глисона. Каждому варианту дифференцировки желез соответствует балл, от 1 до 5, по мере ее снижения. Затем суммируется балл соответствующий самому распространенному компоненту и второму по распространенности, каждому значению суммы Глисона соответствует определенное значение grade. В случае применения этой системы к ПАК ПЖ были использованы баллы от 3 до 5, поскольку значения 1 и 2 балла соответствовали диспластическим изменениям панкреатических протоков. В результате были получены 3 варианта градации опухоли - grade-1 у 7 пациентов, grade-2 у 24 и grade-3 у 16. В этих группах были выявлены статистически значимые различия по показателям общей 2х летней выживаемости (р=0.04). В случае определения степени злокачественности ПАК ПЖ по системе Глисона, в группах уменьшается количество больных с grade-1 и grade-2 и возрастает количество больных с grade-З по сравнению с результатами, полученными при использовании градации ВОЗ. При сравнении медиан выживаемости в данных группах, видно, что медианы выживаемости больных с grade-1 равны, медиана выживаемости больных с grade-2, определенная по системе Глисона выше, а с grade-З ниже, чем при использовании системы ВОЗ.

Полученные результаты соотносятся с данными Adsay и соавт. (2005), которые применили модифицированную систему градации Глисона к ПАК ПЖ и так же получили корреляцию с данными выживаемости. Все это делает перспективным возможность применения данной системы градации в морфологической диагностике ПАК ПЖ.

На следующем этапе исследования все пациенты были разделены на 2 группы по признаку наличия в опухоли анапластического компонента, вне зависимости от его площади в срезе опухоли и дифференцировки других опухолевых структур. В результате в 18 наблюдениях анапластический компонент был обнаружен и такие опухоли были отнесены к группе дедифференцированных (А+), остальные 29 случаев были отнесены к группе дифференцированных опухолей (А-). При сравнении показателей выживаемости были выявлены выраженные статистически значимые отличия (р=0.032).

С помощью иммуноморфологических методов были изучены показатели пролиферативной активности и апоптоза в ПАК ПЖ. Для изучения пролиферации опухолевых клеток был использован индекс Ki67 (клон MIB-1), в результате оценки которого было выявлено, что уровень его в ПАК ПЖ одинаково высок как в низко- так и в высокодифференцированных опухолевых структурах и составлял от 80 до 99%, что

22

свидетельствует о высокой агрессивности данной опухоли. Изучение уровня апоптотической активности проводилось с помощью реакции TunelTest, которая позволяет маркировать ядра клеток, содержащих фрагментированные молекулы ДИК. В результате во всех изученных случаях ПАК ПЖ встречались лишь единичные окрашенные ядра опухолевых клеток (0-1%), не зависимо от степени дифференцировки опухолевых структур, тогда как в элементах стромы и прилежащих лимфатических узлах такие ядра встречались значительно чаще.

Все опухолевые клетки ПАК ПЖ имели высокий индекс экспрессии онкобелка р53, по сравнению с рядом лежащими нормальными протоками ПЖ. Такие результаты говорят о высокой пролифератавной и крайне низкой апоптотической активности опухоли, что свидетельствует о ее высокой агрессивности. Но использование данных маркеров в определении прогноза опухоли не целесообразно, поскольку различий их экспрессии в опухолевых структурах различной дифференцировки не наблюдалось.

Выводы:

1. Степень злокачественности ПАК ПЖ (grade), определенная с помощью системы, рекомендованной ВОЗ, не имеет статистически достоверной связи с данными выживаемости больных (р=0.1).

2. По модифицированной системе градации Глисона были получены три степени злокачественности ПАК ПЖ, которые имели статиститески достоверную зависимость с данными послеоперационной выживаемости больных (р=0,04). Медиана выживаемости больных с grade-1 опухолями составила 15 месяцев, с grade-2 - 12.5 месяцев, с grade-З -8.5 месяцев.

3. ПАК ПЖ как низкой, так и высокой степени дифференцировки железистых структур имеет высокий индекс пролиферации Ki67 (до 80-99%) и высокий уровень экспрессии онкобелка р53 (до 80-90%), что делает оценку экспрессии этих маркеров не целесообразной в определении степени злокачественностп.

4. Уровень апоптоза в опухолевых клетках ПАК ПЖ не зависимо от степени дифференцировки опухолевых структур является крайне низким (0-1%), по сравнению с контрольным образцом и элементами стромы.

5. По признаку наличия или отсутствия в опухоли анапластического компонента (АК) были выделены два типа ПАК ПЖ - дедифференцированные (АК-позитивные) и дифференцированные (АК-негативные опухоли). Показатели выживаемости в этих группах имеют наиболее выраженные статистические различия (коэффициент достоверности р=0.0032). Медиана выживаемости больных с АК-позитивными опухолями составила 8,5 месяцев, с АК-негативными - 13 месяцев.

23

Практические рекомендации:

1. В определении степени злокачественности ПАК ПЖ с помощью системы, рекомендованной ВОЗ, следует учитывать наличие в опухоли низкодифференцированного или анапластического компонента и всегда включать его в морфологический диагноз, поскольку его наличие имеет важное прогностическое значение.

2. В практической работе морфолога возможно применение модифицированной системы градации Глисона в диагностике ПАК ПЖ, поскольку она имеет статистически значимую связь с показателями выживаемости больных.

3. Оценка пролиферативной и апоптотической активности ПАК ПЖ не имеет прогностического значения, поскольку эти показатели не отличаются между собой в участках с различной дифференцировкой.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Филиппова, ЕМ. Прогностическая значимость степени гистологической злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы /Е.М. Филиппова, О.В. Паклина, И.А. Чекмарева, др. // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. -2013.- №4.-С. 117-127.

2. Филиппова, Е.М. Редкие формы протоковой аденокарциномы поджелудочной железы / Г.Р. Сетдикова. Е.М. Филиппова, О.В. Паклина и др. // Хирургия. - 2013. - №6 - С. 4-7.

3. Филиппова, Е.М. Панкреатэктомия при опухолях поджелудочной железы / В.А. Кубышкин, А.Г. Кригер, Е.М. Филиппова и др. // Хирургия. - 2013 - №3 - С. 11-16.

4. Филиппова, Е.М. Редкие формы недифференцированного рака поджелудочной железы (случаи из практики) / Е.М.Филиппова, О.В. Паклина. // Сборник тезисов международного XVI Онкологического конгресса. Москва.-2012. - С. 123.

6. Филиппова, Е.М. Оценка степени злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы / Е.М. Филиппова // Материалы всероссийского симпозиума молодых ученых «Современные проблемы хирургии и хирургической онкологии». М. -2012. - С. 123.