Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анеуплоидия и особенности пролиферации клеток рака различного происхождения (эктодермального, энтеродермального, мюллерова) по данным проточной цитометрии ДНК

РГ6 ол

г з ^

На правах рукописи

БЫЧКОВА Наталия Владимировна

АНЕУПЛОИДИЯ И ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК РАКА РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (ЭКТОДЕРМАЛЬНОГО, ЭНТЕРОДЕРМАЛЬНОГО, МЮЛЛЕРОВА) ПО ДАННЫМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДНК.

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте онкологии им. проф . Н. Н. Петрова Министерства здравоохранения РФ и Всероссийском Центре Экологической Медицины. Санкт-Петербург.

-шъл-пищ/. tntn, димир медицинских наук, профессор К.М.Пожарисский кандидат технических наук Ю.М.Розанов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Л.М.Берштейн

кандидат биологических наук, доцент А.Д.Харазова

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская Государственная Академия им. И.И.Мечникова

Зашита диссертации состоится "_"_1997г. в_час. на заседании

специализированного совета К 074.38.01 НИИ онкологии им. проф.Н.Н.Петрова Минздрава РФ по адресу: 189646, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул., 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан /Ц&/ |997г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е.В.Дсмин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия одним из перспективных методов для решения проблем канцерогенеза, диагностики и прогнозирования клинического течения опухолевых заболеваний признан метод проточной цитометрии ДНК ядер неопластических клеток {Николаева Т.Г. и соавт., 1990. Johnson T.S.. Katz R.L., Pershouse М„ 1988, Gansler Т., 1989, Vassilacos Р., Albe X., 1990, Sasaki К., Murakom Т., 1992, Zackon I.L., Goolsby C.L., 1994). Этот метод позволяет в одном и том же образце при небольшом количестве материала определить два важных параметра, отражающих сущность и потенцию злокачественного роста и характеризующих биологическое поведение опухоли - интенсивность клеточной пролиферации, в том числе распределение популяции опухолевых клеток по митотическому циклу, и изменение содержания ДНК в их ядрах (выявление несбалансированности генома - анеуплоидии и степени ее выраженности).

В нашей стране, к сожалению, этот надежный и высоко воспроизводимый метод не получил достаточно широкого распространения. Одной из причин такого положения, наряду с трудностями внедрения нового дорогостоящего оборудования, является то, что несмотря на активные исследования в данной области (в основном, в зарубежных лабораториях) остаются нерешенными ряд принципиальных вопросов аналитической цитологии и фундаментальной онкологии. Так, неясно, является ли анеуплоидия характерной особенностью только клеток злокачественных новообразований или она может выявляться и в доброкачественных опухолях, какова частота анеуплоидных опухолей в злокачественных новообразованиях различного тканевого происхождения, какова зависимость между морфологическими проявлениями анаплазии опухоли и анеуплоидией, возможно ли использование показателей плоидности и пролиферативной активности клеток опухоли в качестве самостоятельных критериев прогноза (частота рецидинов. метастазов, исхода онкологического заболевания), какая степень анеуллоидии находит отражение в биологическом поведении новообразования.

Не подлежит сомнению необходимость и перспективность исследований, направленных на решение перечисленных вопросов.

Кроме гого, представляются крайне интересными сравнительные данные об особенностях пролиферативной активности и содержания ДНК п новообразованиях различной тканевой природы (в том числе различных зпителиев), так как типы тканей обладают своими характерными чертами (в значительной степени тго касается кинетики клеточного обновления, а также оабильности генетического аппарата

в различных условиях нормы и патологию, что может найти отражение в возникших из них опухолях.

Цель к задачи исследования. Пр^рот" .ил^сдиышие осооенно-

. -------------м иролиферативнои активности клеток наиболее часто встре-

чающихся эпителиальных опухолей различного происхождения (эктодермального, энтеродермального, мюллерова) в аспекте использования этих параметров и морфологической структуры новообразований для оценки биологического поведения этих опухолей.

В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:

1. С помощью метода проточной цитометрии определить содержание ядерной ДНК и пролиферативную активность клеток в плоскоклеточном раке языка и дна полости рта, аденокарциноме ободочной и прямой кишок, инаазивном протоковом раке молочной железы и эндометриальной аденокарциноме тела матки, т.е. в типах опухолей, наиболее характерных для соответствующих органов.

2. Изучить те же параметры в исходных для перечисленных опухолей чпите-лиях у лиц без опухолевых заболеваний.

3. Сопоставить данные о содержании ядерной ДНК и пролиферативной активности изучаемых опухолей с особенностями их микроскопической структуры (степень дифференцировки, глубина инвазии, н-ипчие метастазов и др.).

4. Провести сопоставление полученных цитометрических параметров с агрессивностью течения болезни, определяемой по клинико-морфологическим критериям прогноза (степень гистологической злокачественности инвазивного протокового рака молочной железы, стадия распространения опухоли толстой кишки по Дюксу, клинический прогноз аденокарциномы тела матки) и выживаемости больных плоскоклеточным раком языка и дна полости рта для оценки возможности использования показателей плоидности и пролиферативной активности клеток в качестве прогностических критериев заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Анеуплоидия не встречается в микроскопически нормальном мпителии роговой полости, толстой кишки, молочной железы, матки лип без опухолевой патологии.

2. Анеуплоидия является характерной особенностью злокачественных новообразований, ее наличие и степень пыражениости связаны с агрсссишюстыо плоскоклеточиш'о рака дна полости рта, аденокарциномы прямой кишки, ипназив-

ного протокового рака молочной железы и лдемокарциномы гела матки. Клоны ане-уплоидных клеток встречаются в микроскопически неизмененной слизистой оболочке толстой кишки и матки при наличии в них аиеуплоидных новообразований, что может быть обусловлено распространением опухолевых клеток по слизистой оболочке органа.

3. Опухоли ¿'.несколькими клонами аиеуплоидных клеток характеризуются неблагоприятными клинико-морфологическнми показателями при плоскоклеточном раке языка, инвазивном протоковом раке молочной железы и аденокарциноме тела матки.

4. Увеличение индекса ДНК связано с неблагоприятными клинико-морфологическими показателями при аденокарциноме тела матки и плоскоклеточном раке языка. Тетраплоидия не связана с неблагоприятными факторами при плоскоклеточном раке дна полости рта, аденокарциноме прямой кишки и инвазивном протоковом раке молочной железы.

5. Пролиферативная активность микроскопически нормального эпителия ротовой полости, толстой кишки, молочной железы и матки здоровых лиц приблизительно в полтора раза ниже, чем в соответствующих опухолях. Индекс пролиферации может служить дополнительным критерием прогноза при аденокарциноме тела матки.

Научная новизна. Впервуе с использованием метода проточной цитометрии проведено сравнительное исследование содержания ядерной ДНК и интенсивности пролиферации клеток с определением их распределения по фазам митотического цикла в опухолях различной эпителиальной природы в сопоставлении с нормальными их прототипами. Степень анеуллоидии и изменения кинетических параметров пролиферации сопоставлены с макро- и микроскопической структурой изучаемых опухолей (размеры опухоли, степень их дифферонцироВкн/степень гистологической злокачественности, глубина инвазии, наличие метастазов), с предполагаемым прогнозом, определяемым по клинико-морфологическим данным при аденокарциноме тела матки, а при раке языка и дна полости рта цито метрические показатели сопоставлены с 2,5-лстпей выживаемостью пациентов. Выявлены различия п частоте встречаемости анеуплоидии и величины пролиферативной активности в злокачественных новообразованиях различной локализации. Установлена зависимость плоидиости и пролиферативной активное гн опухолей от возраста пациентов. Выявлена возможность использования пдоидцост и пролиферативной активности при некоторых типах новообразований (аденокарнинома гела матки и прямой кишки.

инвазивный протоковый рак молочной железы, плоскоклеточный рак дна полости рта) как дополнительных факторов прогноза новообразования.

Практическая значимость. Показано значение анеуплоипии 1-як

агрессивности течения ______„|и,ш1мии железы, аденокарци-

номы прямой кишки и тела матки, плоскоклеточного рака дна полости рта. Установлено, что высокая пролиферативная активность является неблагоприятным прогностическим фактором при аденокарциноме тела матки. Данные показатели можно использовать для дифференциального подхода к пациентам с целью динамичного наблюдения за больными, а в ряде случаев для назначения более интенсивного лечения. Показано, что в микроскопически нормальном эпителии тела матки и толстой кишки в случае анеуплоидных новообразований возможно нахождение клонов ане-уплоидных клеток, что может быть причиной рецидива опухоли.

Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на научных лабораторных конференциях НИИ онкологии им.проф. Н.Н.Петрова и ВЦЭМ, а также были доложены на заседании Санкт-Петербургского общества патологоанатомов (1994), на 23 научной сессии НИИАГ им. Д.О.Отта (1994), на Российском симпозиуме с международным участием по онкогинекологии "Скрининг и новые подходы к лечению начального гинекологического рака" (Новгород, 1994), на 28 ежегодном съезде Европейского обществе генетиков человека (Лондон, 1996), на Международной конференции "Спид, рак и сопутствующие проблемы" (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на /^страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. В диссертации приведены /^таблиц,рисунков и микрофотографий. Список использованной литературы содержит названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ

Изучение содержания ДНК и пролиферативной активности клеток методом проточном цнтометрии проведено и 405 образцах (табл.1).

Объект исследования Количество образцов Средний воз-

раст пациен-

тов

Плоскоклеточный рак ротовой полости 49 54.5 ±1,8

в т.ч.

языка 27 54,6±1,8

дна 22 54,5+1,9

Нормальный эпителий ротовой полости 7 51,2±2,4

Аденокарцинома толстой кишки 47 60,2±1,6

в т.ч.

ободочной кишки 27 62,9±1,4

прямой кишки 20 58,5±1,9

Эпителий ободочной кишки вне опухоли 27 62,9±1,4

Эпителий прямой кишки вне опухоли 20 58,5±1,9

Нормальный эпителий сигмовидной кишки 10 56,2+2,2

Нормальный эпителий прямой кишки 7 53,7+2,1

Инвазивный протоковый рак молочной железы 36 57,7+1,9

Нормальный эпителий молочной железы 8 54,8 ±2,9

Аденокарцинома эндометрия 89 59,2+1,0

Эндометрий вне опухоли 32 58,1 +1,3

Атипическая гиперплазия эндометрия 7 53,9 ±4,9

Гиперплазия эндометрия 15 51,9 ±2,4

Полипы эндометрия 6 57,7 ±4,7

Нормальный атрофичный эндометрий 6 58,6±3.5

Нормальный эндометрий 28 42,4 ±0,9

Примечание: кроме гого. исследовались редкие формы рака: по одному случаю слизистого и мелкоклеточного рака прямой кишки, а также 3 дольковых. 2 инутри-протоковых и по одному случаю медуллярного и слизистого рака молочной железы.

В контрольной фуппе женщин (оперированных по поводу заболеваний яичников и фибромиом матки), у которых при микроскопическом исследовании

не обнаружено опухолевых изменений эндометрия, в 9 случаях была пролифера-тивная, в 19 - секреторная фазы менструального цикла, у 6 женщин в менопаузе определялся атрофичный эндометрий.

fTf,„a,„ pulvd оценивали согласно критериям 4-ой Между-

народной классификации ВОЗ. Степень злокачественности рака молочной железы оценивали по H.J.G. Bloom и W.W. Richardson (1957) (табл.2).

Таблица 2. Степень дифференцировки новообразований различной локализации.

Тип опухоли

Степень дифференцировки высокая умеренная низкая

Плоскоклеточный рак ротовой полости Плоскоклеточный рак языка Аденокарцинома ободочной кишки Аденокарцинома прямой кишки Аденокарцинома эндометрия

14 4 4

17 3 7

6 19 2

1 17 2

15 51 23

Тип опухоли

Степень гистологической злокачественности низкая умеренная высокая

Инвазивный протоковый рак молочной железы

10

16

10

Разделение больных плоскоклеточным раком языка и дна полости рта на стадии заболевания проводилось в соответствии с Международной классификацией злокачественных опухолей по системе Т>М(1989).

Материал для исследования был получен главным образом от больных, проходящих обследование и лечение в НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова МЗ РФ, а также от пациентов Областного онкологического диспансера, Городских больниц N2 и 8 и Всероссийского Центра Экологической Медицины. За предоставление материала для исследования сотрудникам данных учреждений выражаем искреннюю благодарность.

Использовали свежий или замороженный операционный, биопсийиый и ау-топсийный материал. При возможности исследовали не только опухоль, по и образцы слизистой оболочки кишки и матки вне зоны опухолевого поражения. Взятый кусочек ткани делили на две части: одну использовали для нитометрического опреде-

ления содержания ДНК, из второй готовили i ис ^логические препараты для параллельного микроскопического исследования.

Механически дезагрегированный материал окрашивали бромистым >тилмем и оливомицином (Розанов Ю.М.. I9SS. Barlogie 1J. i-t.ai. 1976).

Исследование осуществляли па проточном питометре МД-116 (ГОИ им. С.И.Вавилова. Санкт-Петербург) со 128-канальным анализатором и ртутно-кварцевон лампой ДРШ-250-2 в качестве источника света.

В работе анализу подвергали только гс ДНК-гистограммы, на которых диплоидный пик имел коэффициент вариации не более 5,5 (Geisinger K..R. et al, 1986).

В результате обработки полученных гистограмм определяли плоидность клеток опухоли и долю <%) клеток в различных фазах митотического цикла. Популяцию с одним модальным пиком, находящимся в области диплоидного стандарта, считали диплоидной. Диплоидным стандартом являлись лимфоциты и клетки стромы. Клеточную популяцию с двумя главными пиками рассматривали как ане-уплоидную. В случае анеуплоидии оценивали долю (%) опухолевых клеток и определяли индекс ДНК как отношение интенсивности флуоресценции анеуплоидного пика к таковой диплоидного пика. Индекс ДНК показывает, во сколько раз отличается количество ДНК в анеуплоидных клетках по сравнению с диплоидными. Тет-раплоидной считали опухоль в случае, если минорный пик тетраплоидных клеток составлял не менее 18% (Meyer J. et al, 1984).

Индекс пролиферации (ИП) определяли как сумму клеток, находящихся в синтетической (S) и постсинтетической фазах и в митозе Юг+М). Для статистической обработки данных применяли непараметрические критерий U (Вилкоксона-Манна-Уитни) для сравнения средних, точный метод Фишера для выявления различий в форме распределения, гамму (G) Гудмана и Кендалла для оценки связи качественных признаков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Плоидность и пролифератнннан активность опухолей и нормальных жителиев .

Ни в одном из взятых образцов микроскопически нормальных >питслня ротовой полости и молочной железы, кишечного нштелия и эндометрия клинически здоровых лиц, а также при гипсрпластичссхих изменениях в эндометрии {железистые и железисто-фиброзные полипы, простая и атипическая гиперплазия) анеуплоидия не выявлена. Частота анеуплоидии при июкачанпеннмх новообразованиях зависит от локализации опухолей (рис.1).

40

зо

20

61,1

31,»

4 г* '

45,5

■ Инвазивный протокозый рак молочной железы

т Л " ---------. иииниЧПШ

КИШКИ

□ Плоскоклеточный рак дна

полости рта Я Плоскоклеточный ракязска □Аденокарцинома тела матки

29,6

Рис.1 Частота анеуплоидии среди раковых опухолей различного гистогенеза.

Большинство исследованных нами опухолей характеризовалось высокой частотой анеуплоидии. Так, при инвазивном протоковом раке наблюдалось 61,1% ане-уплоидных опухолей. В аденокарциномах прямой кишки частота анеуплоидии составила 60%, ободочной кишки - 51,9%, в плоскоклеточном раке дна полости рта - 45,5%. В то же время несбалансированное содержание ДНК в плоскоклеточном раке языка и, особенно, при аденокарциноме эндометрия наблюдалось гораздо реже: 29,6% и 23,6% соответственно.

Интересно, что в кишечнике частота анеуплоидии значительно выше в опухолях, локализующихся в левой части ободочной и в прямой кишках (60 и 59,1% соответственно), чем в правой половине ободочной и слепой кишках, где она наблюдалась лишь в 28,6% аденокарцином. Подобный факт обнаружили также О.Ьапга е1 а1 (1994) и А.С.Ьагаш (1994). Примечательно, что наблюдается четкая корреляция между частотой поражения отделов толстой кишки опухолями и частотой анеуплоидии при раках соответствующей локализации. Возможно, в обоих случаях действуют одинаковые патогенетические факторы.

В настоящее время нет конкретных объяснений причины различной степени грубых повреждений генома, выражающихся в несбалансированности количества ДНК, и клетках опухолей из мпителиев различного происхождения. Вероятнее »сего, частота анеуплоидии обусловлена количеством патологических ми-

газов, приводящих к неравномерном) распределению хромосом между делящимися клетками (асснмегрический и грехполюсный митозы, отставание хромосом н их фрагментов в ана- и телофазе. мосты!. При >том выраженную роль играют системы репарации и элиминации поврежденных клеток.

Согласно нашим данным, наивысшая пролиферативная активность наблюдается в опухолях и нормальном эпителии ободочной кишки и органов ротовой полости, наименьшая - в эпителии и новообразованиях тела матки (табл.3).

Таблица 3. Пролиферативная активность в нормальных эпителиях и в злокачественных новообразованиях.

Локализация рака Индекс пролиферации в норме, % Индекс пролиферации фонового эпителия, % Индекс пролиферации в раке, %

Дно полости рта 16,60±0,80'- - 24,40±6,531

Язык - - 23,90±1,452

Ободочная кишка 16,90± 1,803 4 17,60+3, ОО5 25,70+3,205-5-6

Прямая кишка IUO+1,004-7 15,10+2,71 16,60+2,00«"

Молочная железа 9,00+1,67'» - 17,30+1,50'»

Тело матки 8,65+0,62» 10,10+1,12" 13,20+1,39®9

3, 4, 5, 6, 8, 9 - р<0,05; 7 - р<0,025; 1,2, Ю-р<0,01

Пролиферативная активность эндометрия зависит от фазы менструального цикла: в пролиферативной и секреторной фазах ИП соответственно составляет 7,96 ±0,30% и 5,44+0,38% (р<0,001). ИП агрофичного эндометрия женщин в менопаузе (8,65±0,62%) находится на уровне индекса в пролиферативной фазе цикла. При железистой и атипической гиперплазия* ИП несколько увеличивается, составляя соответственно 9,89±1,00% и 8,76±1,60% и согласно точному методу Фишера с вероятность/о р< 0,025 и а простой и в атипической гиперплазиях чаще наблюдаются отклонения от среднего, чем в нормальном атрофичном эндометрии женщин соответствующего возраста.

В среднем ИП в раках всех нсследоианпых локализаций приблизительно а 1,5 раза выше, чем в нормальных чшислиях соответствующих органов (см.табл.З).

Пролиферативная активность и опухолях юлстои кишки снижается в дисталь-пом направлении. Так, н раках восходящей кишки ИП составил 29,70±6.34%, нис-

ходящем - 22.30 ±2.35%. прямой кишки - 16.60 ±2.00% (различия между ободочной и прямой кишками статистически значимы. р<0,05); в нормальном эпителии сигмовидной кишки индекс пролиферации был значимо выше ч<*м « -»^тед:;:; г.^лмий кишки (см. табл.31

Сопоставление плоидности и пролиферативиой активности с клинико-морфологическимк чертами новообразований, отражающими агрессивность опухоли.

В нашем исследовании связь плоидности и уровня дифференцировки опухоли четко прослеживается при аденокарциноме эндометрия и плоскоклеточном раке языка, где наблюдалось повышение частоты анеуплоидных опухолей с понижением степени дифференцировки рака (табл.4). Частота анеуплоидии связана с раз-

Таблица 4. Частота анеуплоидии и индекс пролиферации в зависимости от степени дифференцировки опухоли.

Тип опухоли Степень диф- Частота ане- Индекс пролифе-

ференцировки уплоидии, % рации, %

Плоскоклеточный рак

дна полости рта высокая 50 22,40±6,50

умеренная 50 19,49

низкая 25 23,50±4,60

языка высокая 23,5' 25,60+1,80

умеренная 33,3 20,40

низкая 42,9' 20,30+0,90

Аденокарцинома эндометрия высокая 6,72 12,70+1,633

умеренная 21,5 11,70+1,034

низкая 39,12 18,90±2,205'4

1,3- р<0,05; 4 - р<0,01; 2 - р<0.001

мерами плоскоклеточного рака дна ротовой полости и нарастает с их увеличением: при Т: - 20%, Тз - 44,4% и Та - 62,5% (0=0,74; р<0,01).

В низкодифференцированных аденокарциномах тела маски индекс пролиферации был значимо выше, чем при высокой и умеренной дифференцировке рака (см.табл.4).

1.1

При аденокаршшоме эндометрия п.тоидность связана с наличием метастазов: анеуплондные опухоли чаще метастазируют в лимфатические узлы, яичник и влагалище, чем диплоидные раки (55.6% против 20"». С=0.67; р<0,001). Подобная же закономерность о высокой метастатической потенции анеуплоидных новообразова-ниий наблюдается при плоскоклеточном раке дна ротовой полости (57.1 % против 25%, 0=0.6; р<0,01) и в аденокарциномах прямой кишки (61,6% против 33,3%, С=0.52; р<0.05).

Зависимость пролиферативной активности опухоли от наличия метастазов была найдена при раках прямой кишки и молочной железы, но имела противоположное значение. Так, если более высокий ИП в инвазивном протоковом раке молочной железы сочетается с метастазами (при их наличии составляя 22,00+1,69%, при отсутствии 16,00 ±1,67%, р<0,05), то в метастазирующих аденокарциномах прямой кишки ИП был значительно ниже, чем в опухолях, не сопровождающихся метастази-рованием (9,48+1,75% против 20,1 ±3,42%, р<0,05).

Анеуплоидия в случае рака эндометрия в опухолях с глубокой инвазией (> 1см) встречается в два раза чаще, чем с менее глубокой (35,7% против 16,2%, 0=0,43; р<0,05).

Пролиферативная активность раков эндометрия с глубокой (>1см) и низкой (<1см) степенью инвазии достоверно не различалась, но опухоли с глубокой инвазией имели тенденцию к увеличению ИП (15,70+1,90% против 12,50+0,99%).

Согласно нашим данным, несбалансированное содержание ДНК в опухолевых клетках и агрессивность новообразования часто связаны - частота опухолей с клонами анеуплоидных клеток во много раз выше в группе больных плоскоклеточным раком дна полости рта, не доживших до 2,5 лет наблюдения с момента операции по

Таблица 5. Частота анеуплоидии, индекс ДИК и индекс пролиферации в плоскоклеточном раке дна полости рта и языка в зависимости от 2,5-летней выживаемости больных.

Локализация Выживаемость Частота ане- Индекс ДНК Индекс пролифе-

опухоли уплоидии. рации, %

Дно полости < 2.5 лет 11,1' 2 24.90+2.47

рта > 2,5 лет 1,56±0,13 23,50±4,57

Язык < 2,5 лет 30 1,10+0,1 т- 24,10+2.77

> 2.5 лет 29,4 1,6|+0,042 23.9011,73

I - р<0.0<)1; 2 - р<1),05

сравнению ^ пациентами, пережившими _>тог срок (табл.5). Частота анеуплоидии увеличивается с повышением степени гистологической злокачественности ин-вазивиого протокового рака молочной железы (табл.6), ухудшением

1 аилица Ь. Частота анеуплоидии. индекс ДНК и индекс пролиферации в инвазивном протоковом раке молочной железы при различной степени гистологической злокачественности.

Степень гистологической злокачественности Частота анеуплоидии, % Индекс ДНК Индекс пролиферации, %

Низкая 501 1,28 18,50+2,96

Умеренная 62,5 1,72±О,06 15,80±2,21

Высокая 70' 1,94±0,16 18,30±3,21

1 - р<0,05

иокарцином тела матки, определяемого по клиническим данным (табл.7), в более

Таблица 7. Частота анеуплоидии, индекс ДНК и индекс пролиферации в аденокарциноме эндометрия в зависимости от предполагаемого прогноза.

Предполагаемый прогноз * Частота анеуплоидии, % Индекс ДНК Индекс пролиферации, %

Благоприятный 0' - 10,50+1,01««

Относительно благоприятный 5,3 1,08 13,40+1,632

Сомнительный 44,4 1,25±0,095 17,20+2,363

Неблагоприятный 50' 1,65+0,085 15,90±2,694

'Балльная оценка прогноза проведена по способу А.Т.Волковой (1975)

2 - р<0,05; 4 - р<0,025; 3, 5 - р<0,01; 1 - р<0,001

продвинутых стадиях распространения опухоли в прямой кишке, оцениваемых по Дюксу (табл.8).

Отсутствие в нашем исследовании связи между частотой анеуплоидии и стадией распространения аденокарциномы ободочной кишки по Дюксу (табл.8) согласуется с заключением 5.8.КоЬеу-Са1Ге«у и соавт. (1990) о гом, что для ободочной кишки

плоидность является менее важным прогностическим критерием, чем для прямой.

Таблица в. Частота ансуплопдии. нилскс ДНК и индекс пролиферации в аденокарциноме толстой кишки при различных стадиях распространения опухоли по Дюксу.

Отдел кишки Стадия по Частота ане- Индекс ДНК Индекс пролифе-

Дюксу уплоидии. рации, %

Ободочная А 54,5 1,58+0.16 26,80+5,50

В 55,6 1.59+0,11 26,00+5,90

С 42,9 1.74+0,04 24,10+3,80

Прямая А 40' 1,5 17,90+7.00

В 50 1,43 22.40±2.202

С 72.7" 1.52+0,11 9,50+1,801-

1,2- р<0,05

а, следовательно, необходимо раздельное рассмотрение раков прямой и ободочной кишки, что не соблюдается в большинстве исследований и служит источником противоречий. В нашем исследовании не было обнаружено разницы в выживаемости в течение 2,5 лет между больными с диплоидными и анеуплоидными плоскоклеточными раками языка (см.табл.5). W.B.Farrar и соавт. (1989) и Ь.О.Сооке и соавт. (1994) также пришли к мнению, что содержание ДНК не является прогностическим признаком для опухолей языка.

При аденокарциноме тела матки и толстой кишки, а также инвазивном протоко-вом раке молочной железы возможно было оценить примерное соотношение ане-уплоидной и диплоидной популяций в опухоли. Преобладание в опухоли анеупло-идной линии клеток, как правило, сочетается с другими неблагоприятными признаками опухоли. Так, частота больных инвазииным протоковым раком молочной железы с большой долей (более половины) клеток с несбалансированным количеством ДНК увеличивается с повышением степени гистологической злокачественности рака: при низкой 20%, при умеренной 60% и при высокой 71,4% (0=0,82; р<0,01). Та же закономерность наблюдается при сопровождающейся метастазами аденокарциноме тдочетрия (80",;, против 31,3% в опухолях без метастазов, 0=0,8; р«),00!).

По нашим данным, в аденокарциноме юла матки индекс ДНК значимо увеличивается с ухудшением клинического прогноза (габл.7), Такая же тенденция наблюдается в инвазивном протоколом раке молочной железы, где данный параметр растет с увеличением степени злокачгавенноеги опухоли (табл.6), а в 3 случаях

1А

его величина превышает 4 гаплоидных набора, что особенно неблагоприятно (раки в этих наблюдениях были высокой степени злокачественности). В плоскоклеточном раке языка индекс ДНК и группе умерших в течение 2.5 лет после операции достоверно ВЫШе. Чем и гтопп. 1(.М.|ийлО|. ПРИ ПЛОСКОКГГРТптт" ч.. р.и, к сожалению, не удалось оценить значимость индекса ДНК в выживаемости больных, так как все пациенты с анеуплоидными опухолями умерли в течении первых 2,5 лет после операции. В нашем исследовании рассматриваемый параметр не связан с агрессивностью рака исключительно в случае толстого кишечника (табл.8), где она оценивалась по распространенности опухоли, определяемой по схеме Дюкса.

Интересно отметить, что кратное диплоидному увеличение хромосомного материала (тетраплоидия) практически всегда сочетается с более благоприятными морфологическими чертами новообразования, чем анеуплоидия, что может быть связано с сохранением имеющегося в диплоидной клетке баланса регулятор-ных генов при кратном увеличении их числа. Так, в нашем исследовании наблюдалась обратная связь между частотой тетраплоидии и степенью гистологической злокачественности рака молочной железы: 60% - при низкой, 30% - при умеренной степени, в опухолях высокой степени злокачественности тетраплоидия не отмечалась, 0=0,99; р<0,001). Аналогичная ситуация наблюдалась также в опухолях с различными стадиями распространения по Дкжсу в прямой кишке (в стадии А тетраплоидия была в 50% наблюдений, в стадии В - в 33,3% и в стадии С - в 12,5%, 0=0,6; р<0,05). У единственного больного плоскоклеточным раком дна полости рта, прожившего более 2,5 лет, недиплоидная опухоль содержала клон тетраплоидных клеток. Все 3 больные, имеющие аденокарциномы тела матки с клоном тетраплоидных клеток, относились к группе с предполагаемым неблагоприятным клиническим прогнозом, но следует отметить, что опухоли у двух пациенток были многоклоновые.

Количество опухолей с несколькими клонами анеуплоидных клеток среди изученных нами новообразований не превышало 4-12% и лишь при аденокарциноме эндометрия наблюдалось 19% таких опухолей (рис.2).

Однако многоклоновость сочетается с неблагоприятными клинико-морфологическими признаками онкологическогр заболевание. Так, инвазивный про-токовый рак молочной железы, где наблюдалось два клона анеуплоидных клеток, был высокой степени злокачественности, многоклоновые опухоли тела матки имели низкую дифференцировку, чаще мстастазировали (75 против 11,8%, С=0,92; р<0,001), чем одноклоновые апеуплоидные опухоли. Оба пациента с многоклоно-

Ппоскокпеточный рак дна полости рта

Инвазивный протоковый рак молочной железы

90%

■ Многоклоновые ООднсжлоновье анвуплоиднье огтухош анеуплсццнье опухоли

95%

5%

I Мнопжлоиорые ПОднсклоновые анеуллоидныз опухоли анеуплоидные опухолк

Плоскоклеточный рак языка

Аденокарцинома тела матки

9 Многоклоновые ООднсжпомоаыв анеуплоидные опухоли анеуплоидные опухоли

19%

■ Многтжлоновьв ООджжлоноеыв

аие/ппоидныв опухоли анеуплоидные опухоли1

Рис.2. Частота многоклоновых анеуплоидных опухолей при раках различной локализации.

вым плоскоклеточным раком дна ротовой полости и языка не дожили до 2,5-летнего срока наблюдения. В раке толстой кишки многоклоновых опухолей выявлено не было.

Пролиферативная активность изученных нами опухолей оказалась малоинформативной: она не была связана с 2,5-летней выживаемостью при плоскоклеточном раке языка и дна полости рта. со стадией распространения опухоли по Дюксу в аде-нокарииноме ободочной кишки, со степенью гистологической злокачественности инвазивного протокового рака молочной железы. Многие исследователи также не находили подобной взаимосвязи (Hemmer J., 1990, Wahlstrom В. et al, 1992, Gasparini G., 1994, Araya J.C. et al, 1994). В опухолях прямой кишки стадии С по Дюксу в нашем исследовании выявлена более низкая пролиферативная активность по сравнению со стадией В (см.табл.8). Только в случаях адснокарцином тела матки у больных с благоприятным прогнозом выявляется значимо более низкий уровень пролифера-гивной активности по сравнению с относительно благоприятным, сомнительным и неблагоприятным прогнозом (см.табл.7), а высокая пролиферация (>|7,5%) со-

металась с неблагоприятным клиническим прогнозом. Возможно, сама по себе интенсивность пролиферации неопластичсских клеток не определяет биологического поведения опухоли, гак как скорость ппт мвисит не только от

„п„„„1,„«.„....;:-.......„..„„.и, „о н о| клеточной потери.

Сопоставление плоидности н пролифсративной активности с возрастом пациентов.

В инвазивном протоковом раке молочной железы и аденокарциноме эндометрия существует возрастная зависимость частоты обнаружения анеуплоидных опухолей. Средний возраст пациенток с диплоидными раками достоверно ниже при но-вобразованиях эндометрия (57,8±1,07 против 63,9+1,85, р<0,05), но значимо выше при опухолях молочной железы (61,8+2,62 против 54,3+2,87, р<0,05). Возможно, известные факты, что рак молочной железы имеет более агрессивное течение в молодом возрасте, а пожилой возраст является неблагоприятным прогностическим фактором при раке эндометрия, можно объяснить преобладанием анеуплоидных опухолей, агрессивность которых выше, в молодом возрасте у больных инвазивным прото-ковым раком молочной железы и в пожилом возрасте у пациенток аденокарци-номой эндометрия. Возможно, данные особенности связаны с возрастным изменением гормонального фона при различных локализациях новообразований.

Практически при всех локализациях опухолей (за исключением толстой кишки), по нашим данным, пролиферативная активность опухолей повышается с увеличением возраста пациентов, хотя достоверных значений эта тенденция достигает только при раке эндометрия (10,80±1,73% у женщин моложе 50 лет и 14,00±1,01% у пациенток старше 50 лет). Это повышение, вероятнее всего, объясняется гормонально-метаболическими сдвигами (гиперлипидемия, гиперинсулинемия, гиперхо-лестеренемия), наблюдающимися при старении и способствующими делению соматических клеток (Дильман В.М., 1983).

В пашем исследовании наблюдалось снижение индекса пролиферации клеток в аденокарциномах ободочной кишки у пациентов старше 60 лет (21,70+2,48% против 35,60+7,15, р<0,05), аналогичная тенденция, не достигающая достоверных значений, отмечалась и в аденокарциномах прямой кишки (12,90+3,2% против 21.20+4,48%, р=0,089).

Сопоставление илоидности и пролифсративной активности в опухоли и фоновом эпителии пораженного органа.

При исследовании 32 пациентов с аденокарциномой эндометрия и всех больных

раком толстой кишки возможно было взять материал параллельно из опухоли и слизистой оболочки органа без микроскопических неопластических изменений.

Из 7 больных с анеуплоидными опухолями эндометрия в 4 наблюдениях клоны клеток с ненормальным содержанием ДНК выявлялись также и в фоновом эндометрии Из 27 анеуплоидных опухолей толстой кишки в 9 случаях (33,3%) ане-уплоидия была обнаружена и в микроскопически неизмененном эпителии на расстоянии 5-20 см от края новообразования. Такие случаи не были связаны с величиной клеточного клона с ненормальным содержанием ДНК раковой опухоли. Фоновый эпителий диплоидных раков носил всегда диплоидный характер. Подобные находки анеуплоидии в микроскопически нормальной ткани различных органов с опухолевой патологией встречаются в литературе (Van-Dam Р.А. et al, 1990, Camargo R.S. et al, 1993, Vijayan V. et al, 1995, Porshen R. et al, 1995, Remmelink M. et al, 1995). Можно предположить, что эти аномальные клетки представляют собой проявления микроинвазии или микрометастазирования рака. Нельзя исключить, что они могут быть источником рецидива опухоли.

Пролиферативная активность микроскопически нормальных эндометрия больных с диплоидными аденокарциномами тела матки (25 пациентов) и эпителия ободочной кишки пациентов с диплоидными аденокарциномами (13 пациентов) была незначительно выше, чем у здоровых лиц (см.табл.З), но достоверно ниже, чем в опухоли. В прямой кишке исследованных нами пациентов с диплоидными аденокарциномами (9 человек) индекс пролиферации фонового эпителия был высок и находился на уровне такового в раке (см.табл.З).

ВЫВОДЫ

1. Анеуплоидия не встречается в микроскопически нормальном эпителии матки, толстой кишки, ротовой полости и молочной железы лиц без опухолевой патологии, а также при железистых и железисто-фиброзных полипах, простой и атипической гиперплазии эндометрия.

2. Анеуплоидия является характерной особенностью злокачественных новообразований и частота ее встречаемости служит одним из признаков типа опухоли: она часта (40-60%) в инвазивном протоковом раке молочной железы, плоскоклеточном раке дна полости рта, аденокарциноме ободочной и прямой кишок и редка (20-30%) в плоскоклеточном раке языка и эндометриалыюй аденокарциноме тела матки. Клоны анеуплоидных клеток встречаются в микроскопически нормальной слизистой оболочке толстой кишки и матки при наличии в них анеуплоидных новообразований.

?п

3. Анеуплоидия сочетается с неблагоприятными клинико-морфологическими признаками опухоли: частота анеуплоидии нарастает с увеличением размеров опухоли и степени ее распространения (плоскоклеточный рак дна полости рта, аде-нокарцинома прямой кишки), с понижением упоиня (плоскоклеточный ряк- — пнвазивиыи протоковый рак молочной железы), с увеличением способности новообразования к метастазирова-нию (аденокарцинома эндометрия), ухудшением клинического прогноза (аденокарцинома эндометрия) и укорочением продолжительности жизни после операции (плоскоклеточный рак дна полости рта). Анеуплоидные опухоли чаще встречаются в более молодом возрасте (до 50 лет) при инвазивном протоковом раке молочной железы и в старшей возрастной группе при аденокарциноме тела матки, когда наблюдается худший прогноз. Таким образом, плоидность может служить дополнительным критерием течения онкологического заболевания при раке изученных локализаций (рак дна полости рта, прямой кишки, молочной железы и тела матки).

4. Опухоли с несколькими клонами анеуплоидных клеток связаны с неблагоприятными клинико-морфологическими показателями: с высокой степенью гистологической злокачественности при инвазивном протоковом раке молочной железы, неблагоприятным клиническим прогнозом при аденокарциноме тела матки и укорочением выживаемости при плоскоклеточном раке языка и дна полости рта.

5. Увеличение индекса ДНК сопровождается ухудшением клинического прогноза при аденокарциноме тела матки и меньшей выживаемостью больных плоскоклеточным раком языка; особенно неблагоприятно наличие в опухоли клонов клеток с высоким индексом ДНК, превышающем 4 гаплоидные набора. В то же время тетраплоидия, т.е. высокое, но сбалансированное содержание ДНК, не сочетается с неблагоприятными клинико-морфологическими характеристиками инвазив-ного протокового рака молочной железы, аденокарциномы прямой кишки и плоскоклеточного рака дна ротовой полости.

6. Индекс пролиферации микроскопически нормальных эпителиев полости рта, толстой кишки, тела матки и молочной железы лиц без опухолевой патологии приблизительно в полтора раза ниже, чем в опухолях этих органов. Пролиферативная активность микроскопически неизмененного эпителия вне опухоли в матке и ободочной кишке ниже, чем в соответствующих опухолях, а индексы пролиферации фонового эпителия и рака прямой кишки имеют одинаковое значение.

7. Индекс пролиферации служит дополнительным критерием прогноза при раке тела матки. Он у больных аденокарциномой эндометрия старше 50 лет досто-

верно выше, чем у более молодых пациенток. Пролиферативная активность адено-карциномы ободочной и прямой кишок снижается с возрастом больных.

Практические рекомендации

1. Проточная цитометрия ДНК является высокоинформативным способом получения важных сведений о клинико-морфологических особенностях опухоли, определяющих ее биологическое поведение.

2. Наиболее практически важными для онкологии показателями цитометрии ДНК служат акеуплоидия и степень ее выраженности (доля анеуплоидных клеток в опухолевой популяции клеток и индекс ДНК).

3. Высокая выраженность этих показателей сопровождается неблагоприятным течением онкологического заболевания. Особенно неблагоприятно наличие в опухоли нескольких клонов анеуплоидных клеток.

4. Индекс пролиферации может быть дополнительной характеристикой опухоли, уточняющей прогноз при некоторых типах рака (аденокарцинома эндометрия).

Список публикаций по теме диссертации.

1. Розанов Ю.М., Бычкова Н.В., Коробкин В.А., Чепик О.Ф., Пожарисский K.M. Содержание ДНК в ядрах клеток плоскоклеточного рака языка и слизистой оболочки дна полости рта как показатель биологического поведения опухоли (проточно-цитометрический анализ)// Вопр. онкол. - 1994. - Т.40, N7-12. - С.294-298.

2. Бычкова Н.В., Мешкова И.Е., Пожарисский K.M. Роль проточной цитометрии ядерной ДНК в диагностике гиперпластических изменений и рака эндомет-рия//Скрининг и новые подходы к лечению начального гичекологического рака: Материалы Российского симпозиума с международным участием, - Новгород, 1994. -С.31.

3. Мешкова И.Е., Бычкова Н.В., Айламазян Э.К. Роль содержания ДНК и про-лиферативной активности клеток в диагностике лредрака и рака эндомет-рия//Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины: Материалы 23 научной сессии НИИАГ им. Д.О.Отга РАМН. - СПб, 1994. -С.243.

4. Bychkova N., Meshkova 1., Pozharisski К.. Aneuploidy as indicator of aggressiveness of endometrial cancer (Flow cytometry study) - 28th Annual Meeting European Society of Human Genetics on 11th- 13th April 1996, London, P.57.

5. Бычкова Н.В., Мешкова И.Е.. Пожарисский K.M. Проточно-цитометрическое исследование анеуплоидии и пролиферативной активности клеток рака эндометрия как показателей агрессивности ппугол'.г/.Иом^. онкол. - 1У96. -7.42,1NZ. - С.57-62.

6. Bychkova N., Meshkova I., Pozharisski К. Aneuploidy and proliferative activity as indicators of aggressiveness of endometrial cancer - 4-rd International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" 22-26 May 1996, St-Petersburg, P.67.

7. Мешкова И.Е., Цырлина E.B., Чепик О.Ф., Бычкова Н.В., Клецель А., Софроний М.Ф., Микая H.A. Проточная цитометрия ДНК как дополнительный метод оценки гормоночувствительности рака эндометрия//Актуальные вопросы онкологии (Материалы международного симпозиума), 1996, С.40-45.

8. Бычкова Н.В., Пожарисский K.M. Анеуплоидия и пролиферативная активность рака толстой кишки//Вопр. онкол. - 1996. - Т.42, N5. - С.40-45.

9. Бычкова Н.В., Пожарисский K.M. Анеуплоидия и пролиферативная активность рака молочной железы//Вопр. онкол. - 1997. - Т.43, N2.- C.17I-175.

Подписано к печати 7.05.1997. За к. 421. Формат бумаги 60x84 1 /16. Печ. л. 1,2. Тип. ВТИ.