Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологические и молекулярно-биологические критерии прогноза протоковой аденокарциномы поджелудочной железы

На правах рукописи

Сетдикова Галня Равилевна

Морфологические и молекулярно-биологические критерии прогноза протоковой аденокарциноми поджелудочной железы

14.03.02- патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

З Ш 2012

Москва, 2012

005016371

Работа выполнена в ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН, ФГБУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна Федерального медико-биологического агентства России

Научный руководитель:

Зав. патологоанатомическим отделением ФГБУ ФМБЦ им А.И. Бурназяна ФМБА России

доктор медицинских наук О.В. Паклина

Официальные оппоненты:

Зав. лабораторией клинической морфологии ФГБУ «НИИ МЧ» РАМН

доктор медицинских наук, профессор, JI.M. Михалева

Профессор кафедры патологической анатомии Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

доктор медицинских наук, профессор A.C. Тертычный

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

во

Защита диссертации состоится «31» мая 2012 г. в часов

на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) при ФГБУ «Научно-исследовательского института морфологии человека» РАМН по адресу: 117418 Москва, ул. Цюрупы, д.3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ « НИИ морфологии человека» РАМН

Автореферат разослан «_» апреля 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Рак поджелудочной железы занимает 13-е место по частоте встречаемости среди всех злокачественных новообразований и 6-е место по онкологической смертности [Давыдов М.И., 2005]. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в изучении протокового рака поджелудочной железы (ПЖ) и совершенствование его хирургического лечения, выживаемость больных остается на низком уровне. Местный рецидив и отдаленные метастазы при панкреатическом раке обусловлены распространенным характером заболевания в момент его диагностики у абсолютного большинства больных. Следует отметить, что пятилетняя выживаемость пациентов, которым удается выполнить радикальное хирургическое лечение, превышает 5% лишь в крупных специализированных центрах [Dhar D.K., Naora Н., Kubota Н. et al., 2004]. По данным патологоанатомических исследований, при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы, радикальный характер проведенной операции, как правило, не исключает его прогрессирования в ближайшее время.

Эти данные обуславливают необходимость поиска достоверных диагностических маркеров и факторов, определяющих клиническое течение заболевания. На сегодняшний день не существует надежных прогностических критериев выживаемости и эффективности различных методов лечения в каждом конкретном случае.

По данным литературы большинство случаев рака поджелудочной железы описываются как RO-резекции, заведомо уменьшая процент R1-статуса [Attri J., Srinivasan R., 2005; Шалимов С.А., 2007]. Несмотря на наличие четких критериев степени радикальности хирургического лечения, на практике они не используются, что затрудняет объективную оценку проведенного оперативного лечения, а, следовательно, и прогноза выживаемости больных при протоковом раке поджелудочной железы.

3

Актуальной является проблема изучения фенотипа протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и ее гистологических вариантов, как новых прогностических факторов. В литературе данному вопросу посвящено недостаточное количество работ, несмотря на существующие убедительные данные о различиях в фенотипе внутри группы протоковой аденокарциномы (ПАК), влияющих на прогноз заболевания [Волошенко К.В, 2003].

Цель исследования - комплексное клинико-морфологическое и молекулярно-генетическое изучение факторов, определяющих прогноз и биологическую агрессивность протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.

Для достижения указанной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить прогностическую значимость таких факторов, как пол и возраст больных при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы.

2. Изучить прогностическую значимость таких факторов, как стадия, степень дифференцировки, гистологический вариант опухоли, периневральную инвазию у больных раком поджелудочной железы.

3. Изучить особенности экспрессии молекул межклеточной адгезии и их связь с инвазивным и метастатическим потенциалом протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.

4. Изучить экспрессию гена опухолевой супрессии метастина при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы и определить его прогностическую значимость.

5. Исследовать некоторые характерные хромосомные нарушения генов р16, р53, МУС и Нег2-пеи при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы.

6. Разработать математическую модель индивидуального прогнозирования продолжительности жизни больных панкреатической протоковой аденокарциномой, основанную на прогностически значимых факторах.

Научная новизна

В работе представлены данные о необходимости обнаружения микрометастазов в лимфатических узлах и влиянии различных типов периневральной инвазии на исход заболевания как самостоятельного фактора прогноза.

Впервые показана связь между выраженностью экспрессии гена опухолевой супрессии метастина и общей выживаемостью больных после проведенного оперативного лечения при протоковом раке поджелудочной железы. Выделены гистологические типы протоковой аденокарциномы поджелудочной железы на основании изучения группы генов муцинов. Установлена прямая зависимость между повышением экспрессии муцина 4 типа клетками протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и наличием метастазов.

Проведен Р18Н-анализ генов р16, р53, Нег-2пеи и МУС при протоковой аденокарциноме. В работе представлены данные о молекулярных изменениях при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы. Впервые показана связь между абберациями гена МУС, являющегося фактором транскрипции, и общей выживаемостью больных при раке поджелудочной железы.

На основе полученных морфологических и молекулярно-генетических данных разработана математическая модель прогнозирования выживаемости

больных протоковой аденокарциномой поджелудочной железы.

Практическая значимость работы

Разработан протокол детального морфологического исследования операционного материала с уточнением понятия «линия резекции» при протоковом раке поджелудочной железы, что поможет улучшить его диагностику.

Выделение гистологических типов протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и определение экспрессии муцинов 1, 2 и 5 АС типов клетками опухоли позволяет рекомендовать использование данных онкомаркеров в диагностике и прогнозировании выживаемости больных при протоковом раке поджелудочной железы.

Разработанная математическая модель позволяет клиницисту, используя параметры морфологических признаков, определить индивидуальный прогноз продолжительности жизни для каждого больного после проведенного оперативного лечения. Научно обоснованная оценка прогноза с помощью математической модели индивидуального прогнозирования продолжительности жизни больных протоковой аденокарциномой поджелудочной железы, позволяет не только получить представление об адекватности проведенного оперативного лечения, но и наметить пути правильной организации диспансерного наблюдения, планирования лечебно-профилактических мероприятий, оценки трудоспособности больных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Соблюдение стандартизированного протокола при гистологическом исследовании протокового рака поджелудочной железы, с обязательным включением определения иммунофенотипа на основании экспрессии

муцинов 1, 2 и 5АС типов позволяет дифференцированно подойти к лечению данных больных.

2. Молекулярные нарушения при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы в виде аббераций генов р16, р53, MYC, инактивации гена опухолевой супрессии метатсина и адгезивных молекул свидетельствуют об агрессивном биологическом потенциале данного вида опухоли и неблагоприятном прогнозе заболевания.

3. Предложенная математическая модель прогноза при раке поджелудочной железы позволяет клиницисту, используя параметры морфологических признаков, определить индивидуальный прогноз продолжительности жизни для каждого больного после проведенного оперативного лечения.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования используются в работе патоморфологических отделов ряда лечебных учреждений г. Москвы: КБ им. С.П. Боткина, ФГБУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, НИИ хирургии им. A.B. Вишневского, ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова.

Апробация материалов диссертации

Основные материалы диссертации были представлены на Всероссийском конкурсе молодых ученных в рамках XIV и XV Онкологического конгресса (Москва, 2010, 2011гг.); Международной конференции и научно-практической школе «Новые горизонты в лечении гепатопанкреатодуоденального рака и гастроинтестинальных стромальных опухолей» (Москва, 2011г.); 23th European Congress of Pathology (Хельсинки, 2011г.); межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (февраль, 2012г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, и приложения. Текст диссертации изложен на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирован рисунками, таблицами, схемами, гистограммами и графиками.

Библиографический указатель включает 170 литературных источников, из них 30 отечественных и 140 зарубежных.

Материал и методы исследования

Материал для исследования получен из хирургических отделений Клинической больницы 119 ФМБА, ГУ Клинической больницы им. С.П. Боткина и ФГБУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России.

Выполнен анализ операционного материала 74 больных ПАК ПЖ, находившихся на лечении в указанных выше медицинских учреждениях за период с 2005 по 2009 гг.

Среди больных ПАК ПЖ преобладали мужчины (М:Ж=44:30). Возраст больных колебался от 40 до 80 лет. Средний возраст мужчин составил 62,3 года, женщин - 54 года.

Для контроля и сравнительного анализа было исследовано 7 образцов ткани неизмененной поджелудочной железы (аутопсийный материал лиц, не страдавших заболеваниями поджелудочной железы).

Особое внимание при макроскопическом исследовании уделяли поверхностям железы. Для удобства микроскопического исследования статусов R0 и/или R1, поверхности ткани поджелудочной железы окрашивали специальными красками фирмы MARK-IT tissue marking dye

(схема. 1), согласно рекомендациям I. Esposito (2009). Затем проводили параллельные срезы в аксиальной плоскости железы, что обеспечивало хорошее представление о расположении опухоли к поверхностям железы, к общему желчному и главному панкреатическому протокам, а также к стенке двенадцатиперстной кишке (рис.1.).

В работе использовалась гистологическая методика: окраска гематоксилином и эозином. Материал фиксировали в 10% забуференном растворе формалина. Для иммуногистохимического исследования (ИГХИ) были использованы маркеры: Ki-67, р16, р53 (Dako), метастин (Abeam), цитокератины 7 и 19, CD44, Е-кадгерин, муцин 1,2,4 и 5АС типов, CDX2, Her2-neu (Dako).

Интенсивность пероксидазной метки для каждого плазматического или мембранного маркера оценивалась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. Иммуногистохимическая реакция оценивалась как негативная («-» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10% окрашенных клеток), умеренная («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и выраженная («+++» ->50% клеток высокой интенсивности окраски).

Рис.1. Макропрепарат головка ПЖ с опухолевым узлом. Стрелками показаны поверхности железы: синяя - задняя, красная - передняя

Оценку индекса пролиферации Кл67, а также выраженность экспрессии протеинов р53 и р ] 6 в ядрах клеток проводили по той же методике, но вычисляли их как среднее значение от числа меченых ядер на 100 учтенных (при анализе 500-1000 опухолевых клеток). Подсчет меченых ядер проводили в репрезентативных полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо. Клетки на периферии срезов, где чаще всего наблюдается неспецифическое фоновое окрашивание, не учитывали. Больных распределили по группам в зависимости от уровня экспрессии антигена (таблица 1).

Таблица 1

Распределение уровней экспрессии антигенов по группам Маркер Группа Уровень экспрессии _антигена, %_

<25 25,1-50 50,1-75 >75,1

+ ++ +++

<"5,0 5,1-15,0 15,1-25,0 >25,1

ЦП

„., „„ П(2)

р!6, р53 щ

1У(4) 1(1)

Метастин III (3)

____________IV (4)

1(1)

К! 67 И(2)

III (3)

IV (4)

Сила и значимость связи между анализируемыми признаками оценивалась с помощью корреляционного-регрессионного анализа. Для количественных признаков вычислялся корреляционный коэффициент Пирсона. За уровень статистической значимости принимали р< 0,05. Для анализа выживаемости (по методу Каплана-Мейера) использовалась регрессионная модель пропорциональных интенсивностей Кокса. Достоверность различий между кривыми выживаемости подтверждалась с помощью лог-рангового теста, критериев Гехана и F-критерия Кокса, с использованием пакета программ Statistica для Microsoft Windows версия 6.0

Для проведения флуоресцентной гибридизации in situ (FISH - анализа) применялась техника tissue microarrays (ТМА), сконструированная в формате multitumor arrays. Данная модель состояла из 48 образцов первичной опухоли от разных больных, при этом от одного больного использовались образцы с разной степенью дифференцировки опухолевых клеток. Таким образом, это позволило осуществить скрининг определенного молекулярного повреждения во всем разнообразии представленных опухолей с наименьшей затратой реактивов и времени. Двухцветная интерфазная FISH-реакция выполнялась на парафиновых срезах толщиной 4 мкм. Использовались локус специфические ДНК-пробы (молекулярные зонды) к локусам 9р21/р1б; 17pl3/tp53, 17qll/her2, 8q24/ c-myc («Vysis», Abbott Inc.) и соответствующие им центромерные - СЕР8, 9,17.

Сигналы подсчитывапись в 100 отдельно лежащих ядрах каждого образца, при этом не учитывалось число сигналов в плохо очерченных ядрах (внеядерный сигнал), а также лежащих друг на друге. Неизмененная ткань поджелудочной железы использовалась как контроль. Кариотипический профиль считался нормальным (сбалансированным), если более 50% ядер опухолевых клеток содержали по 2 сигнала от каждой из локуспецифической и центромерной проб.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологическая характеристика поджелудочной железы в норме

В результате проведенного иммуногистохимического исследования установлено, что в группе контрольных образцов ткани отмечалась выраженная экспрессия (+++) метастина в цитоплазме протоковых и ацинарных клетках. Экспрессия онкобелка р16 расценена как интенсивная (>75%), а реакции с антителами к р53 не превышали 5%. Экспрессия гена Нег-2-пеи - отрицательная. Индекс мечения с К1-67 не превышал 3%.

При РКН-анализе установлено, что в группе контроля был сбалансированный (диплоидный) профиль генов р16, р53, Нег-2пеи, Мус.

При исследовании профиля муцинов отмечена положительная экспрессия муцина 1 типа в апикальной части протоковых клеток. Экспрессия муцинов 2 и 4 типов полностью отсутствовала, экспрессия муцина 5 АС типа встречалась в цитоплазме вставочных бокаловидных клеток эпителия крупных и средних протоков.

Морфологическая характеристика протоковой аденокарциномы поджелудочной железы

При макроскопическом исследовании в представленном материале 96% (71/74) случаев опухолевые узлы локализовались в головке поджелудочной железы, только 4% (3/74) случая в теле железы. Отмечена прямая корреляционная зависимость, слабой интенсивность между размером первичной опухоли и инвазией в стенку двенадцатиперстной кишки (г=0,26 р=0,03). Частота развития инвазии увеличивалась с размером опухоли в 4 раза [1,90 2,82] при размере опухоли от 2,1 до 5,0 см и в 3 раза [1,34 2,78] при размере опухоли до 2 см.

Общая выживаемость пациентов была выше в группе наблюдений, в

12

которой размер опухоли менее 2 см, т.е. на стадии рТ1. По нашим данным медиана выживаемости после проведенного хирургического лечения при размере опухоли более 2 см составила 11 месяцев, а при размере опухоли до 2 см - 15 месяцев. С биологической точки зрения, размер опухоли не может являться показателем прогноза, тем не менее, определение порогового значения размера опухоли, после которого прогноз заболевания ухудшается, остается актуальным. В 4% (3/74) случаев протоковый рак поджелудочной железы, при размере опухоли менее 2 см, характеризовался более агрессивными признаками. В этих опухолях отмечено наличие экстрапанкреатической периневарльной инвазии, высокий индекс мечения с К-67 (>20%), слабая экспрессия гена опухолевой супрессии метастина.

Одним из несомненных прогностических факторов является степень радикальности резекции опухоли. Это один из немногих независимых показателей, который можно улучшить на практике. В нашем материале ЯI статус обнаружен в 16% (12/74) случаев. Такой небольшой процент Ю-резекций, по нашим данным, связан с отсутствием стандартизированного морфологического протокола, позволяющего правильно оценить результаты хирургического лечения, так как обрабатываемый материал забирался из 3-х учреждений. В результате этого не удалось выявить корреляции между II-статусом и продолжительностью жизни больных (р=0,37). Однако, получены данные от 30 из 74 больных, находившихся на лечении во ФГУЗ КБ№119 ФМБА РФ, где материал обрабатывался согласно разработанному нами протоколу. Кумулятивная доля выживших (КДВ) при Щ0) составила 0,92, что в два раза больше, чем при ИЛ-статусе спустя 12 месяцев после поведенного оперативного лечения. Продолжительность жизни больных раком ПЖ при Я1-статусе III стадии составила 9 месяцев.

Степень дифференцировки опухолевых клеток является важным показателем ее агрессивности: в высокодифференцированных протоковых аденокарциномах индекс мечения опухолевых клеток с К1-67 не превышал 5%, но увеличивался с падением дифференцировки. Проведенный

в

регрессионный анализ выживаемости пациентов показал, что дифференцировка опухолевых клеток не имела прогностической значимости при оценке скорректированной выживаемости больных раком поджелудочной железы (р>0,05). Требуется разработка надежной и легко воспроизводимой системы балльной оценки степени злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.

Отличительной чертой панкреатического протокового рака является распространение опухолевого роста по протокам и периневральным пространствам. Периневральную инвазию (ПНИ) при протоковом раке поджелудочной железы необходимо разделять на два подтипа: интрапанкреатическую периневральную инвазию (ИПНИ) (рис.2) и экстрапанкреатическую периневральную инвазию (ЭПНИ) (рис.3).

Рис.2. Интрапанкреатическая периневральная инвазия; Окр. гематоксилином эозином; х200

Рис.З. Экстрапанкреатическая периневральная инвазия; Окр. гематоксилином эозином; хЮО

Рис. 4. Общая выживаемость пациентов в зависимости от наличия экстрапанкреатической периневральной инвазии при раке ПЖ

По нашим данным, экстрапанкреатическую периневральную инвазию можно рассматривать как независимый прогностический фактор. Выявлена обратная корреляционная зависимость между продолжительностью жизни больных после проведенного оперативного лечения и ее наличием (г=-0,52 р=0,0002). Так, спустя 6 месяцев после хирургического лечения кумулятивная доля выживших составила 0,85 без- и с наличием экстрапанкреатической периневральнрой инвазии. В дальнейшем данные разнились, и спустя 12 месяцев после оперативного лечения кумулятивная доля выживших составила 0,58 и 0,38 без- и с наличием экстрапанкреатической периневральной инвазии, соответственно (рис.4).

ВЛ. Зшапэоп е1:. а1. (2007) показали, что практически все культуры клеток рака поджелудочной железы экспрессируют избыточное количество муцина 1 типа, который активно взаимодействует с миелин-связанным гликопротеином олегодендроцитов и швановских клеток и, тем самым, способствует периневральной инвазии опухолевых клеток. В нашем материале не выявлено зависимости между экспрессией муцина 1 типа и наличием интра- и/или экстрапанкреатичекой периневральной инвазии. При наличии как интра-, так и экстрапанкреатическая периневральная инвазии выявлена высокая (2+/3+) экспрессия муцина 1 типа.

Метастазы в региональных лимфатических узлах (РЛУ) обнаружены в

47% (36/74) случаев протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, из которых, в 22% (8/36) случаев выявлены в виде микрометастазов. Отсутствовала корреляционная зависимость между поражением регионарных лимфатических узлов и размером опухолевого узла. Однако, отмечено, что чаще поражались лимфатические узлы при размере опухоли от 2,1 до 5,0 см. Кроме того, между поражением лимфатических узлов и наличием экстрапанкреатической периневральной инвазией выявлена статистически значимая корреляция (г=0,41 р=0,002), в отличие от случаев с интрапанкреатической периневральной инвазией, что объясняется прогрессированием заболевания и синхронизацией путей метастазирования. Обнаружена зависимость слабой силы, между поражением регионарных лимфатических узлов и продолжительностью жизни больных (г=-0,24 р=0,04). Медиана общей выживаемости больных без поражения регионарных лимфатических узлах составила 16 месяцев, в отличие от 11 месяцев у пациентов с наличием метастазов (рис.5).

Рис.5. Общая выживаемость пациентов в зависимости от поражения лимфоузлов при раке ПЖ

Гематогенные метастазы обнаружены у 20% (15/74) больных. Во всех исследованных случаях метастазы выявлены в печени. При этом, у одного пациента наряду с печеночным метастазом был обнаружен метахронный метастаз в кожу передней поверхности верхней трети бедра; а у другого -синхронный метастаз в кожу околопупочной области. Кроме того обнаружен

гематогенный метастаз протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в ствол головного мозга. В литературе описано всего 18 случаев подобных метастазов [Ротин Д.Л., и соавт., 2011].

Отмечена прямая корреляционная зависимость слабой силы между наличием экстрапанкератической периневральной инвазии и обнаруженными гематогенными метастазами (г=0,27 р=0,02). Вероятность возникновения гематогенных метастазов увеличивается в 4 раза [1,19 5,19] при наличии экстрапанкреатической периневральной инвазии.

На основании критериев pTNM в исследуемом материале преобладали опухоли IIA и IIB стадий заболевания, что составило по 27% (20 из 74 больных) и 24% (18/74), соответственно. IV стадия (Т-любая N-любая Ml) выявлена у 20% (15/74) больных. Доля IA-стадии (где опухолевый узел не превышает 2см в диаметре и отсутствуют метастазы), при которой отмечается самый благоприятный прогноз, составила всего 10% (8/74).

В настоящее время открыто и изучено множество генетических и молекулярных изменений при раке поджелудочной железы [Hruban R.H. et.al., 2000; Hahn. S.A. et.al., 2003; Stafford L.J. et.al., 2008.]. Выявлено, что большинство протоковых аденокарцином поджелудочной железы имели делеции гена р 16, обнаруженные в 57% случаев (42/74). Из которых в 55% (23/42) - при умеренно-дифференцированных формах (grade 2) , 17%(7/42) -при высоко- (grade 1), 26% (11/42) . при низко- (grade 3) и при анапластическом раке (grade 4) в 2% (1/42). В 15% (11/74) случаев установили моносомию 9р21 хромосомы. Абберации гена р53 аналогичны гену р16. Во всех случаях с моносомией гена р16, его иммуногистохимическая экспрессия в опухолевых клетках была определена как отрицательная. Кроме того, отмечена прямая корреляционная связь, слабой силы между экспрессией гена р53 и продолжительностью жизни больных (г=-0,28 р=0,015). Медиана жизни в I и II группах составила по 17 месяцев, а в III и IV - 11 и 12 месяцев, соответственно. Кроме инактивации в генах-супрессорах р16 и р53 обнаружены изменения и гене-супрессоре -

метастине. По мере снижения дифференцировки опухолевых клеток экспрессия метастина уменьшалась, вплоть до полного исчезновения (г= -0,42 р=0,0001), но в неизмененных протоках при раке поджелудочной железы его экспрессия оставалась высокой. Выявлено, что со снижением уровня экспрессии метастина нарастала вероятность поражения экстрапанкреатических нервов (г=-0,29 р=0,01) и наличия отдаленных метастазов опухоли (г=-0,24 р=0,03б). Замечено, что у больных с отсутствием экспрессии метастина медиана жизни составила всего 9 месяцев, против 16 месяцев при слабой и умеренной реакции и 17 месяцев при выраженной экспрессии.

По литературным данным, экспрессия гена HER2-neu является одним из наиболее ранних событий при развитии панкреатической интраэпителиальной неоплазии. Абберации этого гена обнаружены в 70% случаев при раке поджелудочной железы [Safran H. et al. 2001, Tsiambas E. et.al. 2006 , Dabbs J. D., 2010].0днако, в изученном материале ни в одном из образцов опухолевой ткани изменения этого гена не обнаружены ни иммуногистохимическим методом, ни при FISH-анализе. Возможно, это является генетической особенностью нашей популяции и требует дальнейшего изучения.

При раке поджелудочной железы происходила редукция экспрессии Е-кадгерина и изменение полярности его экспрессии, а именно исчезновение мембранного окрашивания и появление цитоплазматического с разной степенью интенсивности. Кроме того, отмечено наличие связи между исчезновением мембранной реакции Е-кадгерина и ухудшением клинического течения заболевания. Инактивация молекулы CD44 отмечена в 42% случаев. Анализ прогностической значимости содержания CD 44 в опухолевых клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы не выявил взаимосвязи маркера с показателем общей выживаемости у больных после проведенного оперативного лечения. Появление выраженной цитоплазматической реакции муцина IV типа было достоверно связано с

ухудшением общей выживаемости больных при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы после проведенного оперативного лечения (г=-0,24 р=0,044). Так, медиана общей выживаемости составила 10 месяцев при умеренно-выраженной реакции, против 15 месяцев при отрицательной экспрессии.

Проведенный регрессионный анализ общей выживаемости пациентов с учетом уровня амплификации гена МУС показал, что изменение в гене МУС является значимым предсказателем прогноза (р=0,0008). Так, при наличии аббераций в гене МУС кумулятивная доля выживших спустя 6 месяцев после оперативного лечения составила 0,70 против 0,95 без аббераций, а спустя 12 месяцев КДВ при наличии амплификаций в гене МУС составила всего 0,3 против 0,7 без амплификации (рис.6,7).

Рис.6. Амплификации гена МУС при протоковом раке ПЖ. хЮОО

Рис.7. Продолжительность жизни больных в зависимости от наличия аббераций гена МУС

Дисрегуляция генов муцинов часто сопровождает злокачественные эпителиальные опухоли желудочно-кишечного тракта, в частности при протоковом раке поджелудочной железы. Обнаружено, что продолжительность жизни больных после проведенного оперативного лечения варьировала в зависимости от иммунореактивности экспрессии муцина 1 типа, и отмечена прямая корреляционная зависимость, слабой силы (г=0,25 р=0,03).Так, при выраженной и умеренно-выраженной экспрессии медиана жизни составила 11 месяцев, а при наличии экспрессии только в апикальной части опухолевых клеток или при отсутствии реакции медиана составила 17 месяцев. Также обнаружено, что при уменьшении выработки опухолевыми клетками муцина 5АС типа вплоть до полного исчезновения, нарастала вероятность как интра- (г=0,24 р=0,038), так и экстрапанкреатической периневральной инвазии (г=0,24 р=0,041). Отмечено, что более продолжительный период жизни после проведенного лечения наблюдался у больных при выраженной экспрессии муцина этого типа (г=-0,31 р=0,018). В нашем материале большинство протоковых аденокарцином представлены как - MUC1+/MUC5AC+ и составили 42% случаев (31/74), наименьшей оказалась группа с кишечным фенотипом муцинов и составила всего 7% (5/74). Группа с желудочным фенотипом составила - 15% (11/74) (рис.8, таблица 2). Наиболее благоприятный прогноз отмечен при протоковых аденокарциномах с кишечным фенотипом. Кумулятивная доля выживших спустя 12 месяцев после проведенного оперативного лечения составила 1,0, медиана жизни составила 17 месяцев. Затем следовали опухоли с «пограничным» потенциалом - это протоковые аденокарциномы с желудочным (ПАК 3) и протоковым (ПАК 1А) фенотипами. Кумулятивная доля выживших спустя 12 месяцев после проведенного оперативного лечения составила 0,9 и 0,8, соответственно, медиана жизни составила примерно 14 месяцев в обеих подгруппах. Наиболее агрессивным потенциалом обладали протоковые аденокарциномы с «чистым» протоковым фенотипом (ПАК 1Б). Кумулятивная доля выживших спустя 12 месяцев после проведенного

оперативного лечения составила всего 0,25, что в 4 раза меньше, чем в протоковых аденокарциномах с кишечным фенотипом и примерно в 3 раза меньше, чем при ПАК 3 и ПАК ] А. Медиана жизни при ПАК 1Б составила всего 7,5 месяцев.

Таблица 2

Фенотип ПАК в зависимости от экспрессии типов муцинов

Фенотип Муцин 1 Муцин 2 Муцин 5АС

панкреато- ПАК 1А + - +

биллиарный ПАК 1Б + - -

кишечный ПАК 2 - + -

желудочный ПАК 3 - - +

35 31

0Н| 27

I і .1

-5 Iх ПАК 1А---ІТАК-1Б-ГШГ2-ГТАКЇ

Рис. 8. Распределение ПАК по фенотипам

Математическое моделирование как нормальных физиологических, так и патологических процессов является в настоящее время одним из самых актуальных направлений в научных исследованиях. Нашей задачей была разработка способа индивидуального прогнозирования ожидаемой продолжительности жизни после проведенного хирургического лечения. Были отобраны независимые друг от друга морфологические факторы, значимые для изучаемого события (ожидаемая продолжительность жизни) -5 признаков, характеризующих первичную опухоль, с помощью которых построена математическая модель индивидуального прогнозирования ожидаемой продолжительности жизни. А именно: 1. наличие экстрапанкреатической периневральной инвазии; 2.уровень экспрессии

муцина 1 типа; 3. уровень экспрессии муцина 5АС типа; 4. наличие абберация гена МУС; 5. уровень экспрессии метастина. При выборе наиболее значимых прогностических факторов для построения математической модели использована процедура пошагового дискриминантного анализа показателей у больных.

Уравнение регрессии:

Y = 6,82 - 0,39 • XI - 0,17 • Х2+ 0,11 • ХЗ - 0,31 • Х4 + 0,3 • Х5

где У - ожидаемая продолжительность жизни (месяцы), XI - наличие ЭПНИ, Х2 - уровень экспрессии муцина 1 типа, ХЗ - уровень экспрессии муцина 5АС типа, Х4 - наличие абберация гена MYC, Х5 - уровень экспрессии метастина.

Вклад пяти факторов, включенных в модель, составил 86 % от общей суммы квадратов отклонений прогнозируемого параметра Y. Наибольшее влияние на прогнозируемый параметр имел коэффициент XI - наличие экстрапанкреатической периневральной инвазии (29,9 %). Достоверность прогноза: оценка качества модели свидетельствует, что данная модель информативна, т.к. коэффициент детерминации R2 = 0,411. По величине F-критерия (3,70) = 16,37; с уровнем значимости р < 0,00001 — модель считается статистически значимой (по критерию F р < 0,05). Стандартная ошибка для прогнозируемого значения равна 7,6.

Выводы

1. При оценке выживаемости больных протоковой аденокарциномой поджелудочной железы установлено, что радикальность оперативного лечения, наличие экстрапанкреатической периневральной инвазии и размер первичного опухолевого очага являются ведущими прогностическими факторами, тогда как пол и возраст не влияют на исход заболевания.

2. Степень злокачественности протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, определяемая на основе пролиферативной активности и степени дифференцировки опухолевых клеток не является прогностическим значимым фактором (р>0,05).

3. Выявлена прямая зависимость между появлением отдаленных метастазов и инактивацией СБ 44, редукцией экспрессии Е-кадгерина, экпрессией муцина IV типа в протоковой аденокарциномы. Наличие выраженной цитоплазматической реакции Е-кадгерина и муцина IV типа ухудшают прогноз заболевания.

4. Важным этапом прогрессирования протоковой аденокарциномы является инактивация онкобелков р16 и метастина. Выявлены корреляционные связи между потерей экспрессии метастина и наличием экстрапанкреатической периневральной инвазией и отдаленными метастазами.

5. Амплификация гена МУС и полиплоидия 8-ой хромосомы являются независимыми прогностическими факторами, при наличии которых кумулятивная доля выживших больных с протоковой аденокарциномой спустя год составляет всего 0,3 против 0,7 без аббераций. Отсутствие аббераций в гене Нег2-пеи не позволяет рекомендовать таргетную терапию при протоковом раке поджелудочной железы.

6. Разработана модель прогнозирования ожидаемой продолжительности жизни больных

Y = 6,82-0,39 • XI + 0,17 • X2 - 0,11 • ХЗ - 0,31 • X4 + 0,3 • X5

где Y - ожидаемая продолжительность жизни (месяцы), XI - наличие ЭПНИ, Х2 -уровень экспрессии муцина 1 типа, ХЗ - уровень экспрессии муцина 5АС типа, Х4 -наличие абберация гена MYC, Х5 - уровень экспрессии метастина.

Вклад пяти факторов, включенных в модель, составляет 86 % от общей суммы квадратов отклонений прогнозируемого параметра Y.

Практические рекомендации

Алгоритм исследования протоковой аденокарциномы в условиях патологоанатомического отделения

1. Подробное описание макропрепарата, с обязательным указанием размера опухоли и маркировкой поверхностей поджелудочной железы.

2. В повседневной практической деятельности патологоанатомов необходимо использовать протокол детального морфологического исследования операционного материала при протоковом раке поджелудочной железы с дополнительным иммуногистохимическим исследованием (приложение).

3. Для оценки объективного прогноза ожидаемой продолжительности жизни у больных протоковой аденокарциномой поджелудочной железы и правильной организации лечебных мероприятий, предлагаем разработанную математическую модель:

Y = 6,82 - 0,39 • XI - 0,17 • Х2+ 0,11 • ХЗ - 0,31 • Х4 + 0,3 • Х5

где Y - ожидаемая продолжительность жизни (месяцы), XI - наличие экстрапанкреатической периневральной инвазией, Х2 - уровень экспрессии муцина 1 типа, ХЗ - уровень экспрессии муцина 5АС типа, Х4 - наличие абберация гена MYC, Х5 - уровень экспрессии метастина.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р. /Иммунногистохимическое исследование муцинов при хроническом панкреатите и протоковой аденокарциноме поджелудочной железы.// Архив патологии. - 2008. - №4. - С. 13-17.

2. Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Цыганов С.Е., Израилов P.E. /Экспрессия генов-супрессоров опухоли при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы: клинико-морфологические корреляции и прогностическое значение./ "Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН". -2011. - Т.22,- №4 - С.73-77.

3. Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Рыжова М.В., Шабунин A.B., Бедин В.В., Тавобилов М.М., С.Е. Цыганов / FISH-анализ аббераций гена MYC и определение их прогностической роли при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы.// Анналы гепатологии. - 2012. - Т. 17. - №1. - С. 74-79.

4. Паклина О.В., Щеголев А.И., Скуба В.Н., Тинькова И.О., Богаутдннова Г.Р. (Сетдикова) / «Оптимальные иммуноморфологические панели антител для дифференциальной диагностики опухолей поджелудочной железы» / Актуальные вопросы организации патологоанатомической службы, паїологоанатомической диагностики и экспертизы/ Магнитогорск. - 2004. -С.225-226.

5. Паклина О.В., Щеголев А.И., Тинькова И.О., Кравченко Э.В., Богаутдннова Г.Р. (Сетдикова) / « Иммунологические панели антител для дифференциальной диагностики опухолей и опухолевоподобных процессов поджелудочной железы», «Актуальные вопросы абдоминальной хирургии», Ташкент. — 2004. — С. 100.

6. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р., Дралов В.Н, Никитин П.Н. /Исследование генов MUC при ХП и ПАК ПЖ// X Российский Онкологический конгресс, материалы. - 2006. - С.211.

7. Паклина О.В., Сетдикова Г.Р., Никитин П.Н. /Морфологические признаки ранних неопластических процессов поджелудочной железы// XI Российский Онкологический конгресс, материалы, - 2007. - С.204.

8. Балдин Д.Г., Цыганов С.Е., Сетдикова Г.Р., Паклина О.В. Методология патоморфологического исследования операционного материала при раке поджелудочной железы. — 3 науч. конфр. Клиническая Морфология новообразований эндокринных желез. — 2010. — С.15-16.

9. Цыганов С.Е. , Тавобилов М.М., Сетдикова Г.Р., Паклина О.В. и др. ав. /Изучение активности матрилизина при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы// - 3 науч. конфр. Клиническая Морфология новообразований эндокринных желез. - 2010. - С.105-106.

10.Сетдикова Г.Р., Цыганов С.Г., Паклина О.В., Тавобилов М.М. Изучение ангиогенеза при раке поджелудочной железы. Приложение к научно-теоретическому журналу «Вестник Санкт-Петербургского университета». — 2010, —№.11. —С. 644.

П.Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Цыганов С.Е. /Изучение активности метастина при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы// VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. - 2010. - С.224.

12.Никитин П.Н., Сетдикова Г.Р., Паклина О.В., Бедин В.В., Тавлобилов М.М., Цыганов С.Г. /Изучение экспрессии рецепторов TRPV1 при хроническом панкреатите и протоковой аденокарциноме поджелудочной железы.// Российский журнал боли. -2011. -2 (31). - С. 98.

13.Setdikova G.R., Paklina O.V., Shishkina L.V., Ryzhova M.Y. /Amplification of MYC oncogene in pancreatic ductal adenocarcinoma. Гепатогастроэнтерология// - 2011. - №1. — P. 102.

14.Paklina O.V., Setdikova G.R., Ryzhova M.V., Rotin D„ Izrailov R.. /FISH analysis of pl6, p53, MYC genes abnormalities in pancreatic ductal adenocarcinoma/ Virchows Archiv. -2011. - P. 180.

15.Сетдикова Г.Р., Паклина О.В. /FISH -анализ гена MYC при пртоковой аденокарциноме поджелудочной железы./ XV Российский Онкологический конгресс, материалы - 2011. - С. 276.

Соискатель

Г.Р. Сетдикова

Подписано в печать:

16.04.2012

Заказ № 7214 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru