Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Прогностическая значимость диагностики молекулярно-генетических изменений и их корреляция с клинико-морфологическими характеристиками при увеальной меланоме

На правах рукописи

ЦЫГАНКОВ Александр Юрьевич

Прогностическая значимость диагностики молекулярно-генетических изменений и их корреляция с клинико-морфологическими характеристиками при увеальной меланоме

14.01.07. - глазные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

15 О 2015

Москва - 2014

005557375

005557375

Работа выполнена на кафедре глазных болезней факультета дополнительного профессионального образования ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. Л. И. Евдокимова» Минздрава России (ректор - заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор О.О. Янушевич) и в ФГБУ «(Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (директор института - заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Нероев В. В.)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Саакян Светлана Ваговна

Официальные оппоненты:

Гришина Елена Евгеньевна - д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник отделения офтальмологии ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Хлебникова Ольга Вадимовна — д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии ФГУ «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Ведущая организация: ФГБУ «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ.

Защита диссертации состоится «10» февраля 2015 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.042.01. при ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (105062, Москва, ул. Садовая-Черногрязская, д.14/19).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (105062, Москва, ул. Садовая-Черногрязская, д.14/19).

Автореферат разослан « » г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

Филатова И.А.

Общая характеристика работы Актуальность темы и степень ее разработки

Увеальная меланома (УМ) - злокачественная внутриглазная опухоль ме-ланоцитарного генеза, представляющая угрозу не только для зрения, но и для жизни пациента. УМ составляет до 88% всех первичных внутриглазных злокачественных новообразований. В России заболеваемость УМ колеблется от 6,23 до 8 человек на 1 млн. взрослого населения в год по обращаемости (Бровкина А.Ф. с соавт., 2002; Саакян C.B. с соавт., 2002). Установлено, что через 5 лет у 50% пациентов с УМ после проведенного лечения диагностированы метастазы в печень (Bergman L. et al, 2006; Barak V. et al, 2011).

УМ характеризуется агрессивным течением, высокой вероятностью мета-стазирования и летального исхода. Поиску факторов прогноза течения опухолевого процесса при УМ уделяется особое значение (Boldt Н.С., 2006). Доказано, что такие анатомические, клинические и патоморфологические факторы, как локализация опухоли в цилиарном теле, большие размеры опухоли, экстрабульбарный рост, эпителиоидноклеточный (ЭК) и смешанноклеточный (CK) тип УМ и большое число митозов в клетке негативно влияют на витальный прогноз при УМ (Бровкина А.Ф. с соавт., 2000; Ширина Т.В., 2013). Выбор метода лечения также играет роль в выживаемости пациентов (Стоюхина A.C., 2011). В последние годы значимую роль приобретают молекулярно-генетические факторы прогноза, включающие потерю одной копии хромосомы 3 (моносомию хромосомы 3), дупликацию всего короткого плеча хромосомы 8 и профиль экспрессии генов класса 2 (GEP2) (Манохина И.К., 2009; Prescher G. et al, 1996; Landreville S.A. et al, 2008; Onken M.D. et al, 2004;). Ряд авторов указывают на большее значение молекуляр-но-генетических факторов в определении метастатического потенциала первичной УМ (Саакян C.B. с соавт., 2013; Harbour J.W., 2009).

Особое внимание уделяется мутациям в генах при УМ. Так, показана высокая частота мутаций в генах GNAQ/GNA11, отвечающих за дерегуляцию пути А/ЛР-кипазы (Van Raamsdonk C.D. et al, 2010). Мутации в пути RAS-RAF-MEK-

N i

\

\ /

ERK и ассоциированное с ними метилирование гена RASSFJA, метилирование ге-нов-семафоринов (SEMA3B), а также мутации в генах-транспортерах АТФ (ген АВСВ1/MDR1) - все эти изменения могут влиять на патогенез УМ (Calipel А. et al, 2011; Landreville S.A. et al, 2011).

Смертность при УМ остается высокой вследствие метастатической болезни, однако промежуток между диагностикой первичной опухоли и выявлением метастазов даже для пациентов с моносомией хромосомы 3 может составлять от нескольких месяцев до десятков лет (Ehlers J.P. et al, 2006). На сегодняшний день не выработаны четкие критерии прогнозирования течения неопластического процесса при УМ, а также не разработан алгоритм по раннему выявлению метастатической болезни. Вышеперечисленные меры позволят проводить более эффективную диагностику, а также повысить продолжительность жизни больных УМ. Анализ молекулярно-генетических изменений (МГИ) проводится по ограниченному количеству генетических маркеров, что требует введения дополнительных критериев для оценки данных изменений (мутации в гене GNAQ/GNA11, определение полиморфизма различных аллелей гена ABCB1/MDR1, метилирование генов RASSF1A, SEMA3B и другие).

Цель исследования

Прогнозирование течения увеальной меланомы на основе анализа терминальных и соматических хромосомных нарушений и мутаций в генах.

Задачи

1) Определить общую 5-летнюю онкологическую выживаемость при увеаль-

ной меланоме и ее взаимосвязь с соматическими молекулярно-генетическими изменениями (моносомия хромосомы 3, делеция всего короткого плеча хромосомы 1, метилирование гена RASSF1A);

2) Определить частоту соматических хромосомных изменений при увеальной

меланоме;

3) Определить терминальных и соматических мутаций в генах при увеальной

меланоме;

4) Выявить клииико-морфологические закономерности течения опухолевого

процесса у больных с увеальной меланомой в соответствии с терминальными и соматическими молекулярно-генетическими изменениями;

5) Выявить клинические, патогистологические и молекулярно-генетические

особенности увеальной меланомы с высоким риском метастазирования.

Научная новизна исследования

1) Определены клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности УМ с высоким риском метастазирования;

2) Впервые на значительной выборке больных УМ показана частота таких МГИ, как полная и частичная моносомия хромосомы 3, потеря всего короткого плеча хромосом 1 и 8, метилирование генов RASSF1A и SEMA3B, мутации в онкогенах GNAQ и GNA11, мутации в различных аллелях гена ABCB1IMDR1.

3) Проведенный комплексный анализ взаимосвязи вышеперечисленных изменений с клиническими и патогистологическими особенностями УМ позволил выявить благоприятные и неблагоприятные в отношении витального прогноза молекулярно-генетические факторы.

4) Показана роль моносомии хромосомы 3 в снижении продолжительности жизни пациентов с УМ, а метилирования гена RASSF1A - в ее увеличении.

5) Впервые в мире в эксперименте in vivo показана роль генотипов сайта ABCB1/MDR1 в развитии УМ, при этом установлено, что наличие генотипа СС достоверно свидетельствует о худшем витальном прогнозе.

Практическая значимость На основании проведенного исследования доказано, что наличие моносомии хромосомы 3 наблюдается при неблагоприятном, а метилирования гена RASSF1A — при благоприятном витальном прогнозе. Выполненные исследования показали значимость определения статуса хромосомы 3 и метилирования гена RASSFIA для прогнозирования выживаемости при УМ. Выявление данных МГИ при выполнении энуклеации, блокэксцизии или ТИАБ позволит спрогнозировать течение опухолевого процесса у пациента для определения его витального прогноза.

Убедительно показана роль гена АВСВ1 в развитии УМ и ассоциация пигментации опухоли, высоты опухоли и неблагоприятных морфологических типов УМ с генотипом СС сайта С3435Т гена АВСВ1. Определена высокая частота мутаций в онкогенах ОЫА<2/СЫА11 при УМ. Определение вышеперечисленных изменений в лейкоцитах крови пациента с УМ или у человека, находящегося в группе риска, позволяют выявлять УМ на доклинической стадии, а также прогнозировать возможность развития опухоли.

Методология и методы исследования Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне ретроспективного и проспективного когортного открытого исследования с использованием клинических, инструментальных, молекулярно-генетических и статистических методов.

Положения, выносимые на защиту

1. Моносомия хромосомы 3 свидетельствует об ухудшении, а метилирование гена - об улучшении витального прогноза при УМ. Делеция всего короткого плеча хромосомы 1 не влияет на витальный прогноз.

2. С помощью доказательной медицины определены клинические, морфологические и молекулярно-генетические особенности УМ с высоким риском метастазирования.

3. Проведенный анализ позволил определить частоту терминальных и соматических хромосомных молекулярно-генетических изменений при УМ.

4. Моносомия хромосомы 3 и генотип СС сайта С3435Т гена АВСВ1 коррелируют с неблагоприятными прогностическими клиническими и патомор-фологическими признаками.

Внедрение результатов исследования Результаты данного исследования внедрены в лекционную программу кафедры глазных болезней ФДПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова и в клиническую практику отдела офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца для определения витального прогноза у группы пациентов с УМ.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности проведенных результатов исследования определяется достаточным и репрезентативным объемом выборок исследований и обследованных пациентов с использованием современных инструментальных и моле-кулярно-генетических методов исследования.

Основные положения работы доложены и обсуждены на Spring Meeting of the European Ophthalmic Oncology Group (Paris, 2012; Ivalo, 2013; Krakow, 2014), на Научно-практической конференции с международным участием «Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2012, 2013, 2014), на Междисциплинарном конгрессе по заболеваниям органов головы и шеи (Москва, 2013, 2014), Congress of the European Society of Ophthalmology (Copenhagen, 2013), на Межрегиональной видеоконференции молодых ученых "Актуальные вопросы офтальмологии" (Москва, 2014), на XXXVI Итоговой научной конференции ОМУ МГМСУ им. А.И. Евдокимова (Москва, 2014), на межотделенческой конференции ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (Москва, 2014 год).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 7 - в центральной печати, 3 — в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 135 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материала и методов исследования, две главы результатов исследования и их обсуждения), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 15 таблиц, 35 рисунков и 5 графиков. Список литературы включает 172 источника (30 отечественных и 142 зарубежных).

Диссертация выполнена на кафедре глазных болезней ФДПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова (ректор - заслуженный врач РФ, д.м.н., проф. Янушевич О.О.) и в отделе офтальмоонкологии и радиологии (руководитель - д.м.н., проф. Саакян C.B.) ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (директор - д.м.н. проф. Нероев В.В.).

Содержание работы Материал и методы исследования

Клиническое-инструментальное исследование выполнено у 278 пациентов, которым проведена энуклеация в период 2005-2007 и 2012 гг. Средний возраст пациентов составил 52,9±11,9 лет. В настоящее исследование включены 134 пациента. Критерием отбора пациентов стало наличие ткани опухоли в базе Института и наличие образцов периферической крови, а также наличие хладагента в момент исследования. Пациенты разделены на 2 группы: ретроспективная - 104 пациента, получивших лечение в период 2005-2007 г., период их наблюдения до 2012 гг., и проспективная группы - 30 пациентов, получивших лечение в 2012 году.

В ретроспективной группе возраст пациентов составил 22 - 84 года (средний возраст 53,7 ±12,2 лет). Распределение по полу: женщин - 66 (63,4%), мужчин - 38 (36,6%). Срок наблюдения составил 41-84 месяцев (в среднем 60,9 ±8,8 месяцев). В проспективной группе возраст пациентов составил 23 — 72 года (средний возраст 51,3±11,9 лет). Распределение по полу: женщин - 18 (60,0%), мужчины — 12 (40,0 %). Срок наблюдения составил 13-23 месяца (в среднем 17,4±3,1 месяца). Таким образом, обе группы однородные и достоверно различались только по длительности наблюдения.

Диагностика УМ основывалась на данных стандартного офтальмологического обследования (визометрия, тонометрия, периметрия, биомикроскопия, офтальмоскопия (см. рис.1), гониоскопия). Весь комплекс клинических исследований в проспективной группе выполнен автором самостоятельно. Всем пациентам проводили эхографию глазного яблока. При непрозрачных оптических средах, малых размерах опухоли по показаниям проводили дуплексное сканирование в режиме ЦДК (см. рис.2) (аппарат GE Voluson 730 Pro, ФРГ) совместно с к.м.н., Амирян А.Г. в отделе ультразвуковых методов исследования (руководитель -профессор, д.м.н. Киселева Т.Н.), флюоресцентную ангиографию (к.м.н., Склярова Н.В.), оптическую когерентную томографию (к.м.н., Мякошина Е.Б.)(отдел оф-

тальмоонкологии и радиологии, руководитель - проф., д.м.н. Саакян C.B.) и компьютерную томографию орбит (по стандартной методике по месту жительства).

Рис. 1. Клиническая картина УМ по данным офтальмоскопии Рис.2. Кровоток в УМ по данным ЦДК

Во всех случаях при проведении патогистологического исследования удаленного глаза по стандартной методике верифицирована увеальная меланома (см. рис. 3 и 4). Исследования проводили совместно с к.м.н. Захаровой Г.П. (отдел патологической анатомии и гистологии глаза, руководитель — проф., д.м.н. Хороши-лова И.П.)

Рис. 3. Веретеноклеточная УМ, окраска НЕ, увеличение 40х Рис. 4. Эпителиоидноклеточная УМ, окраска НЕ, увеличение 40х При сборе анамнеза выясняли факт проживания в местах с неблагоприятной экологической обстановкой, наличие профессиональных вредностей, отягощенной наследственности по онкологическим заболеваниям, сопутствующей патологии, времени от начала появления первых жалоб до обращения к врачу.

Образцы тканей. После энуклеации пораженного глаза биопсийный материал опухоли и интактной хориоидеи, а также образцы периферической крови (консервант: 0.5М раствор ЭДТА) сохраняли при -20°С. Для исследования образцов ТИАБ материал собирали с цитологических препаратов.

Исследования у ретроспективной группы пациентов (п=104) проводили на базе лаборатории молекулярной генетики Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (заведующий лабораторией - д.б.н., проф. Залетаев Д.В.) совместно с к.м.н. Скляро-вой Н.В. (отдел офтальмоонкологии и радиологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца, руководитель отдела - профессор, д.м.н. Саакян С.В). У проспективной группы пациентов (п=30) исследования проводили на базе лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (заведующий лабораторией - д.б.н., проф. Носиков В.В.) совместно с к.б.н. Логиновым В.И. и Бурденным A.M., по расширенной методике (полная и частичная моносомия хромосомы 3, метилирование гена SEMA3B, мутации в генах GNAQ и GNA11, мутации в гене АВСВ1).

Геномную ДНК из образцов опухолей, условно нормальной хориоидеи и периферической крови выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. При выделении ДНК из цитологических препаратов собранный со стекла материал обрабатывали лизирующим буфером, содержащим протеиназу К и полученный лизат использовали в качестве матрицы для постановки ПЦР. Потерю гетерозиготности (ПГ) в хромосомных районах 1р36, 1р31.3, 3р25.3, 3р21.3, Зр14.2, 3ql2, 3q26.3, 3q28 идентифицировали с использованием набора высокополиморфных маркеров. Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови. Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей генов применяли метод метил-чувствительной ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК из клеток УМ, предварительно гид-ролизованную рестриктазами Hpall (для генов RASSF1A, SEMA3B).

На основе проведенного молекулярно-генетического анализа все пациенты ретроспективной группы (п=104) разделены на 4 подгруппы: 1 группа - с моносо-мией хромосомы 3 (п=45, 43,3%), 2 группа - с ПГ в коротком плече хромосомы 1 (п=30, 28,8%), 3 группа - с метилированием гена RASSF1A (п=23, 22,1%) и 4 группа сравнения (п=29, 27,9%), у которых не выявлено ни одного из исследуемых МГИ. Отмечалось сочетание нескольких МГИ у ряда пациентов.

По степени риска развития метастатической болезни все пациенты ретроспективной группы (п=104) были разделены на 2 подгруппы - с высоким (группа А) и низким (группа Б) риском. Для сравнения при выявлении мутаций в гене АВСВ1 выделена контрольная группа (п=60), которую составили относительно здоровые лица из различных регионов РФ, сопоставимые по полу и возрасту с проспективной группой (п=30).

Диспансерное наблюдение осуществляли совместно с к.м.н. Амирян А.Г. в соответствии с приказом № 135 МЗ РФ от 19.04.1999 один раз в 3 месяца в течение первого года, затем один раз в 6 месяцев в течение второго года, в дальнейшем — один раз в год во взрослом консультативно-поликлиническом отделении МНИИ ГБ им. Гельмгольца. Пациенты, которые по различным причинам не могли приехать на осмотр, сообщали о себе по телефону, факсу и через родственников путем передачи справок от врачей по месту жительства. Часть данных получена путем запросов в департаменты здравоохранения по месту жительства пациентов.

Статистическая обработка результатов выполнена автором самостоятельно. Для исследования выживаемости пациентов после лечения использовался статистический метод множительных оценок Каплана-Мейера, а для оценки различия между двумя выборками - двухвыборочный критерий Вилкоксона и регрессионная модель Кокса. Для анализа полученной информации все наблюдения разделены на 2 типа: цензурированные (незавершенные), в которых исход не наступил на момент окончания исследования (пациенты живы), либо пациенты выбыли из исследования (в том числе смерть от других причин) и нецензурирован-ные (завершенные), при которых зафиксирована смерть пациента от метастатической болезни. Статистическую обработку результатов при оценке полиморфизма генов проводили с использованием закона генетического равновесия Харди-Вайнберга для аутосомных признаков. При сравнении частот встречаемости генотипов применяли критерий Пирсона, а для малых выборок - точный критерий Фишера. Комплексную оценку взаимосвязей между исследуемыми группами проводили с использованием логистической регрессии, определяя отношение шансов

(OR) с 95%-ным доверительным интервалом (CI) с уровнем значимости принятым равным 0,05. Рассматривали также результаты статистически маргинально значимые (0,05 < Р < 0,1), что соответствует доверительному интервалу 94% (в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при р = 0,05). Расчеты проводили в пакетах программ для Windows (Microsoft Excel, Statistica 6.1).

Результаты собственных исследований Особенности клинико-морфологической картины ретроспективной и

проспективной групп В ретроспективной группе у 101 (97,1%) пациента проведено ликвидационное лечение (энуклеация), у 3 (2,9%) пациентов по показаниям выполнена блокэксцизия опухоли. У 4 (3,9%) пациентов ликвидационному лечению предшествовало органосохранное (курс брахитерапии с применением Ru/Rh офтальмо-аппликаторов). По локализации выделяли меланому ЦХ зоны - 26 пациентов (25,0%), хориоидеи - 67 пациентов (64,4%), радужки - 4 пациента (3,9%) и ИЦХ зоны — 7 пациентов (6,7%).

В проспективной группе у всех 30 пациентов проведена энуклеация. У 2 пациентов (6,7%) ликвидационному лечению предшествовало органосохранное (курс брахитерапии с применением Ru/Rh офтальмоаппликаторов в комбинации с транспупиллярной термотерапией). По локализации выделяли меланому ЦХ зоны - 5 пациентов (16,7%), хориоидеи - 22 пациента (73,3%) и ИЦХ зоны - 3 пациента (10,0%).

При оценке клинической картины исследовали такие параметры, как возраст и пол пациента, высота и диаметр основания опухоли, гистологический тип, вовлечение в процесс ЦТ, наличие пигментации, гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, видимых собственных сосудов опухоли, экстрабуль-барного роста и отягощенного семейного анамнеза по онкопатологии. В проспективной группе изучали также параметры акустической плотности, выраженной в условных единицах, в различных отделах опухоли, и ее усредненное значение. В ретроспективной группе выявляли высокую долю УМ с вовлечением ЦТ (35,6%) и вторичной отслойкой сетчатки (71,1%). В проспективной группе доля УМ с экс-

трабульбарным ростом выше, чем в ретроспективной (16,7% против 10,6%). Также отмечали более высокую частоту отягощенного семейного анамнеза по онкологической патологии (36,7% против 18,3% в ретроспективной группе).

Ассоциация клинико-морфологических особенностей с молекулярно-генетнческими изменениями в клетках УМ

В 13,5% случаев (п=14) определяли наличие у одного пациента как моно-сомии 3, так и ПГ в коротком плече хромосомы 1. В 5,8% случаев (п=6) выявлены моносомия 3 и метилирование гена ЯАЗБРМ. Сочетание ПГ в коротком плече хромосомы 1и метилирования гена ЯАЗБРМ у одного пациента обнаружено у 8,7% исследуемых (п=9). Наконец, сочетание трех МГИ выявлено у двоих пациентов (1,9%).

Статистически значимые (р<0,05) ассоциации удалось выявить при сопоставлении пациентов из группы 1 и гистологических типов опухоли. Для данной группы характерно преобладание прогностически неблагоприятных типов - СК и ЭК (77,8%). Анализ ассоциаций гистологических типов УМ с опухолями из групп 2, 3 и 4 не выявил значимых отличий между различными типами УМ. В группе 4 отмечали преобладание веретеноклеточного (ВК) типа УМ (более 65%), что может косвенно свидетельствовать об относительно благоприятном течении процесса, значения статистически значимы (р<0,05). Несмотря на отсутствие МГИ в группе 4 частота ЭК и СК типов УМ составила 34,5%. Распределение типов УМ во всех группах представлено на рис. 5.

Группа МЗ Группа 1р Группа Группа

ЯА55ПА сравнения

Рис.5. Распределение гистологических типов УМ в группах.

Также в группе 1 выявлена ассоциация с вовлечением ЦТ в опухолевый процесс, фактором, ухудшающий витальный прогноз, что подтверждается в большинстве исследований (Damato В., 2007; Damato В. et al., 2009). В данной группе наблюдали больше половины (51,1%) пациентов с ЦХ и ИЦХ локализацией УМ, при этом ассоциация статистически значима (р=0,038). Данное отличие представляется значимым по сравнению с группами 2, 3 и 4, а также общей когортой пациентов, где преобладали новообразования хориоидальной локализации без вовлечения ЦТ. В группе 2 выявлена значимая ассоциация с экстрабульбарным ростом опухоли, одним из наиболее неблагоприятных прогностических факторов, увеличивающих вероятность развития метастатической болезни. Частота данного признака в группе 2 была максимальной по сравнению с другими группами и составила 16,7%. В группе 3 статистически значимых ассоциаций с клиническими и морфологическими группами не выявлено.

Выживаемость больных УМ в зависимости от молекулярно-генетических изменений Работа выполнена совместно с к.м.н. Амирян А.Г. под руководством проф., д.м.н. Саакян C.B. При анализе общей пятилетней выживаемости пациентов ретроспективной группы (п=104) смертность составила 30,8% (п=32), при этом учитывалась только смертность от метастатической болезни (группа А). Живые на момент исследования (п=65, 62,5%) и умершие по другим причинам (п=7, 6,7%) составили 69,2% от общего количества пациентов в исследуемой группе (группа Б). Средний срок наблюдения в общей группе пациентов составил 60,1±9,30 месяца, при этом средняя продолжительность жизни пациентов от ликвидационного хирургического лечения до гибели вследствие метастатической болезни - 62,9±10,10 месяца. Следует отметить, что в исследование вошли пациенты с «большими» УМ (средняя высота опухоли — 9,3±2,7 мм, диаметр основания -15,7±3,6 мм). Отдельный интерес представляло изучение кумулятивной доли выживших в группе 1 (с моносомией 3) (п=45) по сравнению с группой без моносо-мии (п=59) (см. Рис. 6). Анализ данных показал, что в группе 1 смертность от метастатической болезни превысила выживаемость (53,2% против 46,8%, р=0,0005),

что свидетельствует о значимой роли моносомии хромосомы 3 в выживаемости пациентов с УМ.

Кумулятивная доля выживших (Каплам-Мейер) о Заверш. + Цеизурир.

Рис. 6. Ассоциация выживаемости пациентов со статусом хромосомы 3 При анализе выживаемости в группах 2 (п=30) и в группе без ПГ в коротком плече хромосомы 1 (п=74), смертность в группе 2 составила 36,7%, а в группе без ПГ - 28,4%. Различия в выживаемости в двух подгруппах не были статистически значимыми (р=0.064), что свидетельствует об отсутствии роли ПГ в хромосоме 1р в витальном прогнозе при УМ. Схожие данные получены при сопоставлении пациентов из группы 3 (п=23) и группы без метилирования (п=81) (смертность 26,1% и 32,1%, соответственно).

Кумулятивная доля выживших (Каппан-Мейер) о Заверш. ♦ Цензурир.

Рис. 7. Влияние исследуемых молекулярно-генетических изменений на выживаемость по сравнению с группой сравнения.

Следует отметить, что в отличие от группы 2 данные различия статистически достоверны (р=0,037 по регрессионной модели Кокса), что свидетельствует о более благоприятном характере течения опухолевого процесса в новообразованиях с метилированием гена ЯАББРЫ.

В группе пациентов с сочетанием моносомии хромосомы 3 и ПГ в коротком плече хромосомы 1 (п=12) смертность составила 75%, что значительно превышает общую онкологическую смертность (р=0,001). При сочетании моносомии хромосомы 3 и метилирования гена КАББЕ1А (п=6) мы выявляли смертность в двух третях случаев, то есть в 67,0% (р=0,03), а при сочетании ПГ в коротком плече хромосомы 1 и метилирования гена ЯАБЗПА (п=9) - в 22,2% случаев (р=0,068). Из двух пациентов, имевших все три МГИ, один умер от метастатической болезни через 51 месяц после лечения. Таким образом, сочетание МГИ при УМ ухудшает витальный прогноз.

Проведен анализ выживаемости в группе пациентов с наличием хотя бы одной из исследуемых МГИ (п=75) и в группе 4 (п=29) (см. рис. 7). В группе пациентов с наличием МГИ выживаемость составила 62,7%, что несколько ниже, чем в общей когорте пациентов (69,2%). При этом в группе 4 выживаемость существенно выше и составила 86,2% (р=0,057), что обусловлено как отсутствием вышеупомянутых МГИ, так и преобладанием более благоприятных клеточных типов УМ (65,5% ВК меланом).

При построении модели Кокса мы рассматривали влияние моносомии хромосомы 3, ПГ в коротком плече хромосомы 1, метилирования гена НАЭБРЫ, а также отсутствие любого из вышеупомянутых изменений на выживаемость (см. табл. 1). Наиболее значимый вклад в снижение выживаемости (1=3,47; р=0,0005) вносит наличие моносомии хромосомы 3. ПГ в коротком плече хромосомы 1 не оказывает статистически значимого влияния на выживаемость. Метилирование гена ЯАБ5Р1А достоверно увеличивает выживаемость пациентов с УМ (1=-2,08; р=0,037). Отсутствие исследуемых МГИ также достоверно улучшает прогноз (1=-1,9; р=0,057).

Таблица 1.

Модель Кокса для оценки выживаемости в различных группах больных с УМ.

Бета Стан д. t-знач. Экспон. Вальда Р

Группа 1 2,63815 0,759308 3,47442 13,98738 12,07160l|0,000513

Группа 2 0,74855 0,404218 1,85185 2,11394 3,42936 0,064056

Группа 3 -1,20183 0,576599 -2,08435 0,30064 4,34451 0,037136

Группа 4 -0,61814 0,324739 -1,90350 0,53895 3,62330 0,056985

Клинические, патоморфологические и молекулярно-генетические особенности УМ с высоким риском метастазирования

Работа выполнена совместно с к.м.н. Амирян А.Г. под руководством проф., д.м.н. Саакян C.B. Для выявления особенностей УМ у пациентов с метастатической болезнью по сравнению с группой контроля проведен анализ клинических, патогистологических и молекулярно-генетических характеристик. Пациенты, умершие в результате метастатической болезни, составили 30,8% (п=32, Группа А) от общего количества больных; пациенты, живые на момент исследования или умершие по другим причинам составили 69,2% (п=72, Группа Б).

Средний возраст на момент начала лечения в группе А составил 56±9,4 лет, а в группе Б — 52±8,8 года. По полу и возрасту группы статистически не различались. Также не выявлено статистически значимых отличий между группами по таким параметрам, как высота и диаметр основания опухоли. Необходимо отметить, что в исследование вошли пациенты с «большими» УМ (средняя высота опухоли 9,3±2,7 мм) и соответствующими показаниями для проведения энуклеации. Таким образом, в данном исследовании не представляется возможным оценить роль размеров УМ как прогностического фактора в связи с однородностью выборки.

Статистически значимые различия между группами выявлены в распределении патогистологических типов опухоли. Так, в группе А частота ВК типов УМ, характеризующихся наиболее благоприятным течением опухолевого процесса, на 12,9% меньше чем в группе Б и составила 34,3%. В то же время количество пациентов с неблагоприятными типами УМ (СК и ЭК) в группе А составило 2/3

(n=21; 65,7%) от общего количества пациентов в группе. Следует отметить, что доля ЭК УМ в обеих группах (А и Б) отличалась (21,9% и 20,8%, соответственно). В группе А доля УМ с вовлечением в опухолевый процесс цилиарного тела (ЦХ и ИЦХ локализации) достоверно выше, чем в группе Б (43,8% против 30,6%, см. рис. 8). Данный признак, как показано в ряде исследований, относится к наиболее неблагоприятным в отношении витального прогноза (Damato В., 2007; Damato В. et al., 2009).

При сопоставлении двух групп по таким клиническим признакам, как наличие пигментации, гемофтальма, вторичной отслойки сетчатки, субретинального экссудата и видимых собственных сосудов, статистически значимые различия не выявлены. Необходимо отметить, что разница между группами А и Б по наличию вторичной отслойки сетчатки составила 17,4% (56,2% и 73,6%, соответственно), однако данная закономерность может носить случайный характер. При статистической обработке результатов оценки клинических параметров у пациентов учитывался такой фактор, как прозрачность сред глаза.

Отдельный интерес представляет ассоциация с развитием метастатической болезни такого неблагоприятного фактора, как наличие экстрабульбарного роста. Большинство авторов рассматривают экстрабульбарный рост опухоли как фактор, значительно ухудшающий витальный прогноз (Gamel G.W. et al., 1992; Harbour J.W., 2009; McLean I.W. et al., 2004). Анализ пациентов из групп А и Б не выявил статистически значимых отличий между группами (р=0,074), при этом частота УМ с наличием экстрабульбарного роста в группах статистически не различалась (12,5% и 9,7%, соответственно; р=0,079). При более детальном анализе размеров экстрабульбарного роста показано, что в группе А из 4-х случаев в 3-х выявлены большие узлы размерами до 9x7 мм, а в одном - небольшие скопления клеток, в то время как в группе Б в 5 случаях из 7 обнаруживали небольшие экстрабульбар-ные узлы размерами до 1x2 мм.

При сопоставлении различных нозологических форм онкологической патологии у родственников пациентов с УМ в группах А и Б выявлены значимые (р=0.002) отличия между группами. Так, процент отягощенного семейного онко-

логического анамнеза в группе А составил 31,2%, а в группе Б - 12,5%. Данные различия могут свидетельствовать о значимости семейного фактора в развитии метастатической болезни при УМ. В литературе данный фактор остается несколько недооцененным в связи с его субъективностью.

Без вовлечения ЦТ

С вовлечением ЦТ

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Рис. 8. Распределение УМ по локализации в группах А и Б.

Наибольшие различия между двумя группами получены при анализе статуса хромосомы 3. Так, доля УМ с моносомией хромосомы 3 в группе А превысила таковую в группе Б практически в 3 раза (78,1% против 27,8%). Данные различия статистически значимы (р=0,0001). Несмотря на некоторое преобладание УМ с ПГ в хромосоме 1р в группе А (34,3% против 26,4%), отличия статистически незначимы (р>0,05). Вместе с тем доля УМ с метилированием гена ЯАББПА в группах А и Б различалась и составила 18,8% и 23,6% соответственно (р=0,04), что свидетельствует о положительной роли данного фактора в развитии УМ. Отсутствие какого-либо из исследуемых МГИ выделено как отдельный прогностический фактор. При сопоставлении пациентов из группы А и Б выявлены статистически значимые различия между группами (р=0,035). Так, в группе А доля пациентов с отсутствием исследуемых МГИ составила 12,5%, в то время как в группе Б - 34,7%.

Таким образом, для пациентов с УМ с высоким риском метастазирования характерно наличие больших размеров экстрабульбарных очагов, большая частота УМ с вовлечением цилиарного тела, преобладание СК и ЭК увеальных мела-ном и моносомии хромосомы 3. У пациентов с УМ с низким риском метастазирования достоверно чаще отмечается метилирование гена КАББГЫ.

Влияние мутаций в онкогенах GNAQ/GNA11 на клинические и морфологические характеристики УМ

Исследование выполнено совместно с к.б.н. Логиновым В.И. и Бурденным A.M. При ПДРФ-анализе лейкоцитов периферической крови мутации в генах GNAQ и GNA11 выявлены у 27 (90,0%) из 30 обследованных пациентов. Как следует из данных, представленных в таблице 2, мутации в 5 экзоне гена GNAQ найдены у 5 пациентов (16,7%), в 5 экзоне гена GNA11 у 50% обследованных пациентов. В 4 экзоне гена GNAQ у 12 (40%) пациентов найдены гомозиготные мутации. В 4 экзоне гена GNA11 мутаций не найдено. В 93% случаев (25/27) мутации глутамина в 209-м положении и аргинина в 183-м положении в генах GNAQ и GNA11 взаимоисключающие, что согласуется с данными литературы (Van Raamsdonk C.D. 2009, 2010).

В 3 случаях из 27 выявлены одновременно две мутации. В случае мутации в генах GNAQ (С/и209)/ GNA11 (<3/я209) опухоль имела ЦХ локализацию. В другом случае при выявлении мутации в генах GNAQ (Argl83)/ GNAQ (<3/и209) опухоль имела CK тип строения, у пациента присутствовал отягощенный семейный анамнез (у матери выявлен рак молочной железы). В третьем случае, при наличии мутаций в генах GNAQ (Argl83)/ GNA11 (Gln209) опухоль располагалась в хорио-идее и имела CK тип строения. В одном случае удалось выявить 3 мутации в генах GNAQ (Argl83)/ GNAQ (G/«209)/ GNA11 (G/n209). У данного пациента опухоль располагалась также в хориоидее и имела ВК тип строения.

В литературе активно обсуждается роль мутаций в генах GNAQ и GNA11 как механизмов, запускающих опухолевый процесс при УМ (Van Raamsdonk C.D. et al., 2009, 2010; Bauer J. et al., 2009). В нашем исследовании проведена оценка ассоциаций между мутациями в генах GNAQ и GNA11 и комплексом клинических и патоморфологических характеристик. Определена статистически значимая ассоциация частоты мутации глутамина в 209-м положении гена GNAQ с высокой отслойкой сетчатки (4/11 против 1/19, р=0,0472), в то время как с другими клиническими признаками значимых связей не выявлено. Частота мутации в экзоне 5

гена СЫАИ в опухоли ВК типа 2,8 раза выше, чем ЭК типа (9/16, 56% против 1/5, 20%).

Таблица 2.

№ случая GNAQ ArglS3Gln GNAQ Gln209Leu GNAU Gln209Leu

1 - - Gln'Leu

2 - Leu/Leu Gln/Leu

3 - - Gln/Leu

4 - - Gln'Leu

5 - - Gln/Leu

б - Leu/Leu -

7 Gln'Gln - -

8 Gln'Gln - -

9 Gln'Gln - -

10 Gln'Gln - -

11 - - Gln/Leu

12 - - Gln/Leu

13 - - Gln/Leu

14 - - Gln/Leu

15 - - Leu/Leu

16 - - Leu/Leu

17 - - Leu'Leu

18 - - Gln/Leu

19 - - -

20 - Gln'Leu -

21 Gln'Gln - -

22 Gln'Gln - Gln'Leu

23 Gln'Gln Gln'Leu Gln/Leu

24 GlnGln - -

25 Gln'Gln - -

26 GlnGln - -

27 Gln'Gln - -

28 Gln'Gln Leu/Leu -

29 - - -

30 - - -

«-» - мутаций не обнаружено.

Ассоциация мутаций в гене ABCBHMDR1 с риском развития УМ

Исследование выполнено совместно с к.б.н. Логиновым В.И. и Бурденным А.М. Впервые в эксперименте in vivo проведен анализ мутаций в гене АВСВ1 в лейкоцитах периферической крови при УМ. Распределение частот аллелей и генотипов сайта С3435Т гена АВСВ1 в контрольной группе и группе больных УМ представлено в таблице 3. В 80% случаев выявлен аллель С, что свидетельствует о

высокой специфичности данного аллеля для УМ. При этом в опытной группе аллель С встречался почти в 2 раза чаще, чем в контрольной (80% против 41,7%). Показана достоверная ассоциация предрасполагающего генотипа СС гена АВСВ1 с риском развития УМ. Так, частота данного генотипа в проспективной группе (п=30) оказалась в 4 раза выше по сравнению с группой контроля (п=60), в тоже время генотип ТТ у больных обнаружен не был. Ассоциация генотипа СТ с риском развития УМ отмечалась в 40% случаев от общего количества аллелей С, тем не менее, данная ассоциация статистически не значима (р>0,05). Можно предположить, что наличие аллеля С является неблагоприятным фактором при развитии УМ, в то время как аллель Т можно рассматривать как благоприятный фактор.

Таблица 3.

Распределение частот аллелей и генотипов сайта С3435Т гена АВСВ1 среди больных УМ.

Ген УМ п = 30 Контроль п = 60 Х2 Р ОЯ

знач. С1«%

АВСВ1 Аллель С 0,800 0,417 23.70 1,0х 1 (У6 5.60 2.70-11.61

Т 0,200 0,583 0.18 0.09-0.37

Генотип СС 0,600 0,150 23.73 7.0x10"6 8.50 3.07-23.52

СТ 0,400 0,533 0.58 0.24-1.42

ТТ 0,000 0,317 0.03 0.00 - 0.60

* Жирным шрифтом выделены частоты предрасполагающих аллелей и генотипа и соответствующие им значения ОН.

Корреляция частот генотипов СТ и СС сайта С3435Т гена АВСВ1 с параметрами профессии УМ представлены на рис. 9.

Диаграмма X"

Рис. 9. Корреляция частот генотипов СТ и СС сайта С3435Т гена АВСВ1 с параметрами прогрессии УМ. Диаграмма А: пигментация опухоли, выраженная- п=13, умеренная или бес-

пигментная п=17; Диаграмма Б: высота опухоли (<10 мм/ >10 мм), с <10 мм - п=18, с >10 мм -п=12; Диаграмма В: состояние сосудов, видны - п=23, не видны - п=7; Диаграмма Г: по гистологическому строению, ВК типа - п= 16, СК - п=9 и ЭК типа - п=5.

Выводы

1) Выявлено, что общая 5-летняя онкологическая выживаемость при УМ составила 69,2%. Наличие моносомии хромосомы 3 значимо снижает выживаемость до 46,8% (р=0,0005). Значимых различий в выживаемости при наличии де-леции всего короткого плеча хромосомы 1 и в группе сравнения не выявлено. Выживаемость при наличии метилирования гена значимо выше, чем в группе сравнения, и составила 73,9% (р=0,037).

2) Установлена частота терминальных и соматических хромосомных и генных нарушений у больных увеалыюй меланомой: моносомия хромосомы 3 -52,2% (полная - 37,3%, частичная - 14,9%), делеция всего короткого плеча хромосомы 1 - 29,1%, хромосомы 8 - 20,0%; метилирование гена ЯАББПА - 23,9%, мутации в генах СЛГЛ<2/СА'/Ш - 90,0%. Метилирование гена БЕМЛЗВ ни в одном из исследуемых образцов не выявлено, генотип СС сайта С3435Т гена АВСВ1 выявлен в 60,0%, генотип С'Г-в 40,0% случаев, генотип 7Тне выявлен.

3) Выявлена группа неблагоприятных для витального прогноза при уве-альной меланоме молекулярно-генетических факторов: взаимосвязь между цили-арной локализацией опухоли (51,1%; р=0,024), эпителиоидноклеточным и сме-шанноклеточным гистологическими типами увеальной меланомы (26,7% и 51,1%, соответственно; р=0,0384) и моносомией хромосомы 3 (р=0,001). Доказано, что экстрабульбарный рост увеальной меланомы значимо чаще сопровождается наличием делеции всего короткого плеча хромосомы 1 (16,7%, р=0,04). Впервые удалось установить, что высота опухоли (р=0,0391), эпителиоидноклеточный и сме-шанноклеточный гистологические типы увеальной меланомы (р=0,0493) и умеренная пигментация опухоли (р=0,05) коррелируют с генотипом СС сайта С3435Т гена АВСВ1.

4) Установлен ряд молекулярно-генетических факторов, улучшающих витальный прогноз при увеальной меланоме. Прогностически наиболее благоприятный веретеноклеточный тип увеальной меланомы значимо чаще отмечался при

наличии метилирования гена ЯАББРМ (р=0,023) и мутации в экзоне 5 гена йЫА 11 (р=0,03). Показано, что небольшая высота опухоли (7,4±1,4 мм; р=0,039), низкая встречаемость экстрабульбарного роста (6,2%; р=0,044) и сниженные значения акустической плотности в области верхушки опухоли (80,3±14,2 у.е.; р=0,041) коррелировали с метилированием гена КАББПА. Ни в одном из исследуемых образцов увеальной меланомы нам не удалось обнаружить генотип ТТ сайта С3435Т гена АВСВ1.

5) Выявлено, что для больных увеальной меланомой с высоким риском метастазирования характерно наличие моносомии хромосомы 3 (78,1%, р=0,0001), преобладание смешанноклеточного и эпителиоидно клеточного варианта опухоли (65,7%, р=0,018), более высокая частота увеальной меланомы с вовлечением цилиарного тела (р=0,026), а также увеличенные размеры экстрабульбар-ных узлов (р=0,034).

Практические рекомендации

1) При выявлении в ходе офтальмологического обследования пациентов таких признаков, как вовлечение в опухолевый процесс цилиарного тела и/или экстрабульбарного роста увеальной меланомы рекомендуется проведение моле-кулярно-генетического анализа на моносомию хромосомы 3 и делецию всего короткого плеча хромосомы 1, что свидетельствует о худшем витальном прогнозе.

2) При сомнении в патогистологическом диагнозе или для проведения дифференциального диагноза рекомендуется комплексный молекулярно-генетический анализ полученного материала, включающий оценку статуса хромосом 3, 1 и 8.

3) Для проведения скрининга лиц из группы риска (родственники пациентов с увеальной меланомой) рекомендуется проведение анализа статуса таких генов, как ПАББР1А, АВСВ1, GNAQ/GNA¡ 1. Определение последних двух маркеров возможно в лейкоцитах периферической крови.

4) Создание генетических лабораторий при крупных офтальмоонкологи-ческих центрах и обучение персонала генетических лабораторий общего профиля для работы с образцами опухолей глаза и придаточного аппарата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Saakyan S.V. Histopathological findings correlating with monosomy 3 and RASSF1A methylation in uveal melanoma / S.V. Saakyan, A.G. Amiryan, A.Yu. Tsygankov, N.V. Sklyarova // OOG 2013 Ivalo Spring Meeting Abstract book p. 12.

2. Saakyan S. Prognostic value of monosomy 3 and RASSF1A methylation in uveal melanoma / S. Saakyan, A. Amiryan, A. Tsygankov, N. Sklyarova // Congress of the European Society of Ophthalmology (SOE) 8-11 June, 2013, Copenhagen, Denmark - Abstract Book p.148.

3. Саакян C.B. Молекулярно-генетические нарушения при увеальной меланоме / С.В. Саа-кян, А.Г. Амирян, АЛО. Цыганков, Н.В. Склярова // Онкохирургия. - 2013. - Том 5. -спецвыпуск №1. - Стр.117.

4. Саакян С.В. Мутации в онкогенах GNAQ и GNA11 у больных увеальной меланомой / С.В. Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков, В.И. Логинов, A.M. Бурденный // Сборник научных трудов VI Российского общенационального офтальмологического форума. - М. - 2013. -Т.2. - стр. 543-546.

5. Саакян С.В. Особенности клинического течения и витальный прогноз при увеальной меланоме у пациентов молодого возраста / С.В.Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков // Вестник офтальмологии. - 2013. - №6. - стр. 4-9.

6. Цыганков А.Ю. Ассоциация гена АВСВ1 с риском развития увеальной меланомы у российских пациентов / А.Ю. Цыганков, С.В. Саакян // Сборник тезисов 36 итоговой научной конференции ОМУ МГМСУ им. А.И. Евдокимова. - 2014. - стр. 162-163.

7. Саакян С.В. Мутации в онкогенах GNAQ и GNA11 у больных увеальной меланомой / С.В. Саакян, А.Г. Амирян, А.Ю. Цыганков, В.И. Логинов, A.M. Бурденный // Молекулярная медицина. - 2014. - №2. - стр. 34-37.

8. Saakyan S.V. GNAQ/GNA11 mutations and ABCB1/MDR1 polymorphism in uveal melanoma: association with clinical and morphological features / S.V. Saakyan, A.G. Amiryan, A.Yu. Tsygankov, V.I. Loginov, A.M. Burdenny // OOG 2014 Krakow Spring Meeting Abstract book p.23.

9. Цыганков А.Ю. Взаимосвязь полиморфизма гена ABCB1/MDR1 с клинико-морфологическими характеристиками при увеальной меланоме / АЛО. Цыганков, С.В. Саакян, А.Г. Амирян, В.И. Логинов, A.M. Бурденный // Онкохирургия. - 2014. - т.6. -стр.65-66.

10. Цыганков А.Ю. Влияние молекулярно-генетических изменений на прогноз при увеальной меланоме / А.Ю. Цыганков, С.В. Саакян, А.Г. Амирян, В.И. Логинов, A.M. Бурденный // Онкохирургия. - 2014. - т.6. - стр.66-67.

11. Саакян С.В. Ассоциация гена АВСВ1 с риском развития увеальной меланомы / С.В. Саакян, А.Г. Амирян, АЛО. Цыганков, В.И. Логинов, A.M. Бурденный // Архив патологии. - 2014. - №2. - стр. 3-7.

12. Цыганков А.Ю. Роль молекулярно-генетических факторов в выживаемости пациентов с увеальной меланомой цилиохориоидапьной локализации / А.Ю. Цыганков, С.В. Саакян, А.Г. Амирян // Медицинский вестник Башкортостана. - 2014. - т. 9. - №2. - стр. 147-150.

13. Саакян С.В. Мутации в генах GNAQ и GNA11 и полиморфизм гена ABCB1/MDR1 при увеальной меланоме / С.В. Саакян, А.Ю. Цыганков, А.Г. Амирян, В.И. Логинов, A.M. Бурденный // Сборник научных трудов VII Российского общенационального офтальмологического форума. - М. - 2014,-т. 1,-стр. 257-261.

Список сокращений

УМ — увеальная меланома

МГИ - молекулярно-генетические изменения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

МАРК - митоген-активируемый протеин-киназный путь

GNAQ — гуаниновый нуклеотид-связывающий протеин

ОКТ — оптическая когерентная томография

ТИАБ — тонкоигольная аспирационная биопсия

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ПГ — потеря гетерозиготности

ЦТ - цилиарное тело

ЦХ - цилиохориоидальный

ИЦХ - иридоцилиохориоидальный

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

Arg — аргинин

Gin — глутамин

Подписано в печать:

15.12.2014

Заказ № 10415 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru