Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Профилактика гемофилии А у детей с использованиемклинических и молекулярно-генетических методов

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

ГОРНОСТАЄВА НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА

ПРОФІЛАКТИКА ГЕМОФІЛІЇ А У ДІТЕЙ З ВИКОРИСТАННЯМ КЛІНІЧНИХ ТА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ МЕТОДІВ

14.01.10 — Педіатрія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Одеса — 1996

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті.

Наукові керівники: академік АМН України, доктор медичних наук,

професор Резиік Борис Якович, доктор медичних наук, професор Баранов Владислав Сергійович Офіційні опоненти: доктор медичних наук,

Розанов Всеволод Анатолійович, доктор медичних наук,

Бебешко Володимир Григорович Провідна організація: Київський інститут гематології та переливання крові

Захист дисертації відбудеться «20» червня 1996 року о__________годині на

засіданні спеціалізованої ради Д.05.04.0І. Одеського державного медичного університету за адресою: 270000, м. Одеса, пров. Валіховський, 2. Автореферат розісланий «______»______________ 1996 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат медичних наук

І

А

Котова Н.В.

І. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Бурхливий розвиток методів молекулярної генетики у розшифруванні тонкої структурно-функціональної організації генома людини, картування на хромосомах багатьох структурних генів призвело до значного прогресу в галузі медичної генетики, посутньо розширило і збагатило знання про молекулярну природу спадкових хвороб, способах їх точної діагностики і профілактики.

Гемофілія А належить до найпоширеніших спадкових коагулопатій.

Це захворювання проявляється в ранньому віці, характеризується загостреннями та прогредієнтним перебігом, рано призводить до інвалідності й обмеження чи втрати працездатності.

Протягом усього життя хворі потребують спеціалізованого лікування з використанням препаратів плазми, що дорого коштують (Барка-ган 3. С., 1980; Баркаган 3. С., 1988; Святковський В. А. зі співавт., 1980; Плющ О. П., 1993; Федорова 3. Д. зі співавт., 1985; Biggs, 1985; Wemeret al., 1982).

Успіхи в діагностиці і лікуванні гемофілії А призвели до зниження дитячої смертності і збільшення тривалості життя хворих. Вони одружуються і народжують дітей, внаслідок чого накопичується аномальний ген в популяції як за рахунок збільшення кількості хворих, так і гетерозиготних носіїв. Отже, хвороба набуває не лише медичного, але й соціального характеру. У зв’язку з цим усе актуальнішою виявляється проблема профілактики гемофілії А.

Одним із шляхів профілактики гемофілії А є медико-генетичне консультування безсимптомних гетерозиготних носіїв мутантного гена.

Протягом останнього часу з’явилася можливість лабораторної діагностики гетерозиготного ураження гемофілією А за допомогою спеціальних серологічних методів дослідження, котрі, проте, недостатньо надійні (Папаян Л. П. і співавт., 1979, 1981; Федорова 3. Д., 1984; Баркаган 3. С., 1971, 1985, 1991; V. Chan et al., 1986; D. N. Cooper et al., 1993).

Принципово новим і значно ефективнішим підходом у виявленні гетерозиготних носіїв і пренатальній діагностиці є молекулярно-генетичні методи.

Ген гемофілії А виявлено у 1984 році й описано незалежно одна від одної двома групами американських дослідників — Gitscher et al.; Tul-lo. Встановлено, що ген фактора VIII, розташований у дистальному відділі довгого плеча Х-хромосоми в локусі Xq27 — Xq28 і складається з 186 тисяч пар нуклеотидів (Meyer et al., 1972; Barrow та Graham, 1974; Федорова 3. Д., 1977; Баркаган 3. С., 1980).

Донині у гені фактора VIII виявлено більше 60 точечних мутацій,

З

14 делецій, 5 інсерцій (В. Bardoni, М. Sampietro, М. Romano et al., 1988; М. D. Tragstman, M. Higushi, C. K. Kasper et al., 1990).

Протягом останніх років (1993 — 1994) у гені фактора VIII виявлена одна і поки що єдина домінуюча за частотністю мутація (Lallis et al., 1993). Принципово важливою є наявність її майже у половини родин з важкою формою гемофілії А. Використання непрямих методів молекулярної діагностики дозволяє Виявляти гетерозиготних носіїв гемофілії А і впроваджувати пренатальну діагностику в сім’ях високого ризику.

МЕТА РОБОТИ.

• Розробити комплексну раціональну профілактику гемофілії А шляхом активного виявлення гетерозиготних носіїв і пренатальної діагностики у родинах високого ризику. > .

ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ.

1. Встановити популяційну частотність гемофілії А в Одеській області.

2. Виявити родини з хворими на гемофілію А дітьми у популяції Одеської області.

3. Визначити інформативність сімей високого ризику для ДНК-діагностики. Провести аналіз з метою вивчення, чи є гетерозиготні носії гемофілії А серед родичів пробанда жіночої статі.

4. Запровадити пренатальну діагностику гемофілії А в практику роботи Одеського медико-генетичного центру.

НАУКОВА НОВИЗНА РОБОТИ.

В даній праці вперше проаналізовано клінічні прояви й особливості перебігу гемофілії А в одеській популяції. Встановлено, що найбільш маніфестною є патологія у віці 2-4 років, переважною формою гемофілії А є неінгібіторна середнього рівня ускладненості. :

Виявлена чітка сезонність загострень гемофілії А навесні (в березе-ні — травні) і восени (в жовтні — листопаді). '

Вперше визначено популяційну частотність гемофілії А в Одесі та області; створено банк із 123 зразків ДНК крові хворих та членів їх родин з високим ризиком гемофілії А; зібрані дані, уточнюючі молекулярні особливості гемофілії А залежно від рівня складності перебігу; вперше ^молекулярними Методами проаналізовано 31 сім’ю — гетерозиготних носіїв патологічного гена фактора VIII.

Уперше в популяції Одеської області і м. Одеси методом поліме-разної ланцюгової реакції (ПЛР) вивчені особливості внутрішньо- і позагенних поліморфних сайтів рестрикції, визначено частотність алелів та їх інформатиність для ДНК-діагностики гемофілії А. Встановлено, що в Одеській області найбільш інформативними є внутрішньогенні поліморфні сайти Hind-III і Xba-І у поєднанні з позагенним локусом St-14.

Розроблена оптимальна стратегія ДНК-діагностики гемофілії А в одеській популяції, що дозволяє провести ДНК-діагностику гемофілії А і розпочати масове виявлення гетерозиготних носіїв, уперше в Одесі та області пренатально діагностовано гемофілію А у трьох родинах.

ПРАКТИЧНА ЦІННІСТЬ РОБОТИ. Встановлення сезонних загострень у хворих на гемофілію А в Одесі та області з двома піками — навесні (березень — травень) і восени (жовтень — листопад) зумовлюють конкретні рекомендації по проведенню профілактичних курсів гемостатичної терапії напередодні очікуваного загострення.

Внаслідок аналізу інформативності найважливіших поліморфних маркерів визначено оптимальну стратегію ДНК-діагностики в родинах високого ризику захворювання на гемофілію А в одеській популяції, котра забеспечуватиме швидке і надійне обстеження членів родин хворих і їх родичів. Ця стратегія дозволяє ефективно і своєчасно виявляти носіїв мутацій і впроваджувати пренатальну діагностику в ранніх строках вагітності. .

Досягнуті результати дослідження сприяють обмеженню накопичення патологічного гена в популяції, внаслідок чого значно зменшиться ризик народження хворих дітей.

ВПРОВАДЖЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ В ПРАКТИКУ.

Наслідки дослідів і основні рекомендації впроваджені в практику Одеського міжобласного медико-генетичного центру, гематологічного кабінету спеціалізованої дитячої обласної поліклініки і відділення гематології обласної клінічної лікарні.

НА ЗАХИСТ ВИНОСЯТСЯ ТАКІ ПОЛОЖЕННЯ:

1. Надійний вияв гетерозиготних носіїв гена гемофілії А можливий тільки за допомогою молекулярно-генетичних методів дослідження.

2. Використання молекулярно-генетичної методики дозволяє проводити пренатальну діагностику гемофілії А в родинах зі значним ризиком.

3. Уперше визначена популяційна частотність гемофілії А в Одесі та Одеській області.

4. Сворено банк ДНК-даних хворих на гемофілію А і.членівїх родини.

5. Вперше молекулярними методами вивчена інформативність сімей високого ризику захворювання на гемофілію А з метою ДНК-діагностики.

6. Молекулярними методами вперше обстежено гетерозиготних носіїв гемофілії А у родинах зі значним ризиком і проведено пренатальну діагностику.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали дисертаційного дослідження доповідались і обговорювалися:

1. В школі-семінарі юних генетиків (Іваново, 1989 р.).

2. На міжнародному симпозіумі підіатрів міст-побратимів (Одеса, 1990 р.).

3. На засіданнях кафедри дитячих хвороб педіатричного факультету Одеського медичного університету (1993, 1994, 1995 рр.).

4. В обласному науковому товаристві лікарів-педіатрів (Одеса, 1990, 1993, 1995 рр.).

5. На IX з’їзді дитячих лікарів України (Одесса, 1993 р.).

6. На II з’їзді медичних генетиків України (Львів, 1995 р.).

ПУБЛІКАЦІЇ. За матеріалами дисертації опубліковано 9 друкованих праць.

ОБСЯГ РОБОТИ, її СТРУКТУРА. Реферована кандидатська дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису обсягу і методів дослідження, отриманих результатів та їх обговорення, висновків і списку використаних літературних джерел. Текст дисертації викладено на 147 сторінках машинопису, містить 15 таблиць і 18 малюнків.

ДЕКЛАРАЦІЯ ОСОБИСТОГО ВНЕСКУ ДИСЕРТАНТА. Всі клінічні та лабораторні дослідження виконані при особистій участі автора на базі обласної дитячої клінічної лікарні. Розроблена комплексна раціональна система профілактики гемофілії А шляхом активного виявлення гетерозиготних носіїв і пренатальної діагностики у родинах високого ризику в оптимальні строки — І триместрі вагітності. Автором роботи самостійно розроблені та впроваджені практичні рекомендації по профілактиці сезонних загострень гемофілії А.

II. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Робота виконана внаслідок систематичного обстеження хворих, поставлених на облік у гемофілічному центрі Одеси, їх сімей, найближчих і далеких родичів, котрі мешкають на різних територіях України і Росії. Збір генеалогічної інформації проводився шляхом опитування й індивідуального обстеження членів сім’ї як у клініці, так і на місцях, під час бригадних виїздів у райони області. Вивчаючи родовід, знаходили родичів пробанда, котрі потребували додаткового обстеження з погляду того, чи є вони гетерозиготними носіями гемофілії А. Автором даного дослідження вивчено 31 сім’ю гемофіліків —мешканців області, в складі яких наявні 31 пробанд, 87 батьків і близьких родичів та 5 здорових сібсів.

Форми гемофілії визначалися за аутокоагулограмою за методикою В. І. Шевченко та ін., 1969; Л. 3. Баркагана, 1973; у модифікації Є. П. Іванова, 1979.

Коагуляційна активність фактора VIII (антигемофільного глобуліну) досліджувалася з використанням компонента, що посилює його дію —суспензії коаліну, а джерелом фосфоліпіду був стабільний препарат парціального тромбопластина.

Активність інгібітора до фактора VIII визначали за методикою Biggs, A. Bidwell, Br. J. Haemathol, 1959, 5, 375; Kasper, Thromb, Diath, Hae-morr, 1974, 34, 869.

Молекулярно-генетичні дослідження проведені в Інституті акушерства і гінекології АМН Росії під керівництвом професора В. С. Баранова. В зв’язку з цим професор В. С. Баранов призначений вченою радою другим офіційним керівником роботи.

Молекулярно-генетичні дослідження проведені з участю М. В. Асеева. Висловлюю щиру вдячність професору В. С. Баранову, колегам з даного інституту за підтримку творчих ініциатив і за надану можливість здійснити молекулярно-генетичні досліди.

ДНК виділяли з лейкоцитів периферичної крові модифікаційним безфенольним методом. Резтрикційне розщеплення ендонуклеазою TaqI тривало 6 годин при 65°, якість реакції перевірялась на мікрофорезі. Рестрикційну ДНК (10 мкг) кожного члена сім’ї ділили за допомогою електрофорезу в 0,8 % агарозу і переносили на капроновий фільтр «Хійлу Калур» (Таллін) за стандартною методикою.

Зонд St-14 виділяли з культури клітин лужним лізисом з наступним центрифугуванням у градієнті щільності хлористого цезія за наявності бромистого етидія, позначали в реакції ник-трансляції 32р (питома активність (2-4)х10 8 імп. х хв-1 мкг-1), гибридизували на фільтрах (6xSSC, 5хрозчин Денхарда, 0,1 %-вий DS-Na, 100 мкг/мл ДНК сперми лосося, 10 %-вий декстрансудьфат, 18 г, 65°С) з рестриційованою ДНК на фільтрах за методом Maniatis Т., Fritsh Е., Sembook J. і після відмивання експонували з рентгенівською плівкою в касетах з посилюючим екраном при 20° С.

Олігопраймери для проведення полімеразної ланцюгової реакції синтезу ДНК синтезували у Всесоюзному гематологічному центрі Міністерства охорони здоров’я Росії на приладі «Pharmacia Gene Assembler» фос-фоамитидним методом. Ампліфікацію проводили в інкубаційному середовищі обсягом 50 мкл (67 мм трис-НСІ, pH 8,8; 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ меркаптоетанол; 16,6 мМ (ND)2S04; 6,7 мкм ЕДТА, 170 мкг/мл бичачої сироватки альбуміна; 4dNTP (1,0 мМ кожний), пари праймерів (0,03 мкг кожний), 1 мкг ДНК. Після денатурації протягом 10 хвилин за 98° додавали 2 одиниці активності ДНК — полімерази Thermus thermophilus і синтезували на термоциклері («Techue», Великобританія). Режим ПАР: денатурація — 1 хв., 94°С, обпалювання праймерів — 1 хв., 54°С, синтез ДНК — 3-5 хв., 73° С (для ампліфікації фрагмента 730 п. о. рестриційова-ного ендонуклеазою Hind-III). Денатурація — 0,5 хв., 94°С, обпалювання праймерів, синтез — 0,3 хв., (для ампліфікації фрагмента 96 п. о., ресгри-ційованого ендонуклеазою Xba-І). Отримані таким чином гідролізати ДНК тестували після офарблення бромистим етидієм в УФ-світлі (трансілюмі-натор, «4КВ», Швеція) при довжині хвилі 302 нм.

Здобуті цифрові дані оброблялися методом варіаційної статистики з використанням параметричного критерія Ст’юдента. Оцінка зв’язку між однорідними властивостями встановлювалася за допомогою крит тсрія X2.

III. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Частотність гемофілії А в популяції Одеської області складає 1 : 6000 серед чоловічого населення, що менше, ніж в Англії (1 : 5000), Польщі (1 : 5500), але більше, ніж у Фінляндії (1 : 6500), Данії (1 : 7000), збігається з популяційною частотністю гемофілії А в Росії (1 : 6000) (3. Д. Федорова та співавт.).

Клінічно гемофілія А характеризується періодично повторюваними кровотечами різноманітної локалізації. Протягом семилітнього періоду в гематологічному відділенні і гематологічному кабінеті Одеської обласної дитячої лікарні спостерігалось 31 хворий на гемофілію А. Більшість з них поверталася до лікарні знову і знову (часто-густо до 5-10 разів на рік) з геморагіями різноманітних локалізацій.

Максимально захворювання виявляє себе у віці пацієнтів 2-4 роки. У таблиці 1 наведено діагностування гемофілії А в залежності від віку хворих.

, Таблиця 1.

Діагностика гемофілії А в залежності від віку хворих

Вік у роках Кількість хворих

абсолютна відносна

0-1 І-"- : ‘ 3,2 % Л

1-2 2 6,5 %

2-3 6 19,3 %

3-4 14 45,3 %

4-5 — —

5-6 1 3,2 %

6-7 5 16,1 %

7-8 1 3,2%.

9-10 1 3,2 %

старше 10 — —

Автором даної дисертаційної роботи, як і іншими дослідниками,

помічено прямий взаємозв’язок між силою кровотечі при гемофілії А і рівнем активності фактора VIII у крові хворих.

Для визначення форми гемофілії А та її складності використано два критерії: 1) клінічний та 2) лабораторний.

У таблиці 2 представлено дані про форми гемофілії А в одеській популяції.

Таблиця 2.

Форми гемофілії А в одеській популяції

Ступінь ускладнення Кількість хворих

абсолютне число відносне число

Важкий 1 3,2 %

— неінгібіторний 4 12,9 %

— інгібіторний 2 6,5 %

Середній 23 74,1 %

Легкий 2 6,5 %

Всього 31 100 %

Як видно з таблиці 2, найпоширенішою серед обстежених хворих є форма гемофілії А середнього ступеня ускладнення (74,1 %), друге місце посідає тяжка, неінгібіторна форма (12,9 %).

Аналіз даних щодо частотності загострень у хворих на гемофілію А в Одесі та Одеській області свідчить про чітку сезонність погіршення стану навесні (в березні — травні) і восени (у жовтні — листопаді).

Аналогічне збільшення загострень у весняний і осінній періоди відзначали А. М. Абергауз, 1963; і І/пск, 1973; 3. Д. Федорова зі

співавто., 1977. Більшість авторів пов’язує сезонність загострень з рівнем гідрокортизону в крові (Сог<Запо сі ІІас1ІУ0§епіІс!і, 1970; 3.1. Ефен-дієв зі співавт., 1978; X. М. Маматкулова, 1983).

Цілковито закономірною для гемофілії А слід вважати різноманітність геморагічних проявів. У таблиці 3 показана частотність геморагій різних локалізацій у хворих на гемофілію А в одеській популяції.

Як видно з таблиці 3, найпоширенішою локалізацією геморагій у обстежених хворих є суглоби (29,8 %). Інші, доволі поширені форми прояву гемофілії А — кровотечі після екстракції зуба (25,2 %) і крововиливи в м’які тканини (22,6 %).

Вид кровотечі Число хворих

абсолютне число відносне число

1. Гемартрози 117 29,8 %

2. Кровотечі після ектракції зуба 99 25,2 %

3. Крововиливи в м’які тканини 89 22,6 %

4. Кровотечі зі слизистих носа і ротової порожнини 22 5,6 %

5. Шлунково-кишечні кровотечі 20 5 %

6. Обстеження 19 4,8 %

7. Гематурія 16 4 %

8. Кровотечі з ран шкіряного покриву 11 3 %

Всього 393 100 %

Раннє і достатньо розповсюджене ураження суглобів — прикметна ознака вияву хвороби. Виникнення гемартрозів, як правило, спонукалося травмою. У важкій формі гемофілії А крововиливи у суглоби викликалися такою мізерною травмою, що остання залишалася непоміченою. У хворих на гемофілію А були уражені переважно крупні суглоби

— колінні, ліктеві, гомілкові, — котрі найчастіше травмуються. В таблиці 4 представлена частотність ураження окремих суглобів у обстежених дітей, хворих на гемофілію А.

З таблиці 4 видно, що основна кількість уражень суглобів припадає на колінні (41,6 %), плечові (21,3 %), ліктеві (21,3 %), котрі сумарно складають 182 ураження з 216, тобто 84,3 %, що збігається з літературними даними. Інші суглоби уражаються значно менше. Якоїсь посутньої різниці в частоності уражень правих і лівих суглобів не вдалося виявити.

Суглоби Число хворих

абсолютне число відносне число

Колінні правий, 48 22,2%

лівий 42 19,4%

Ліктеві правий, ЗО 14%

лівий 16 7,4%

Гомілкові правий, 14 6,5%

лівий 10 4,6%

Плечові правий, 24 11,1%

лівий 22 10,2%

Кульшові правий, 2 0,9%

лівий — —

Луче-зап’ясні правий, 4 1,9%

лівий 2 0,9%

Дрібні суглоби правий, — —

кисті 1 стопи лівий 2 0,9%

Всього 216 100%

У процесі даного дослідження спостережено значну кількість гематом м’яких тканин. їх виникнення у переважній більшості було пов’язано з травмою (63 %). Однак, як свідчить досвід автора даної дисертації, крововиливи в м’які тканини можуть виникнути без видимої причини

— спонтанно. За авторськими даними, частотність спонтанних крововиливів у м’які тканини складає 37 %, що узгоджується зі свідченнями інших дослідників (К. А. Міткус, 1966; Г. А. Абдулаєв, 1973; 3. Д. Федорова, 1977; 3. С. Баркаган, 1988 та ін.). У таблиці 5 представлена найпоширеніша локалізація гематом у обстежених хворих.

Локалізація Абсолютне число Відносне число

Голова 3 3,4%

Шия 3 3,4 %

Верхні кінцівки: 8 9,0%

плече 6

передпліччя 2

кисть —

Лопатка —

Живіт: 47 52,8 %

передня черевна 9

стінка 38

зачеревний простір кишкова стінка

Нижні кінцівки: 25 28,0 %

стегно 5

гомілка 20

Відділ сідниці 3 3,4 %

Всього 89 100 %

Як видно з таблиці 5, найпоширенішими в обстежених хворих є геморагії у м’які тканини живота — 47 випадків з 89 (52,8 %), серед котрих переважає локалізація у зачеревний простір (38 випадків з 47). Гематоми, що виникали у зачеревній порожнині, досягали великих розмірів, викликали різкий біль, зсування кишечника, супроводжувалися анемією. 28 % усіх спостережених крововиливів у м’які тканини припадають на гематоми нижніх кінцівок (25 випадків з 89). Трохи меншим числом характеризувалося виникнення гематом верхніх кінцівок у пацієнтів, уражених гемофілією А, — 9 % (8 випадків з 89). Значно рідше спостерігалися гематоми м’яких тканин голови та шиї (З гематоми голови і 3 шиї з 89, що складає 3,4 %). Аналогічними за кількістю (3,4 %) були гематоми, що з’являлися в сідниці, переважно пов’язані з внутрішньом’язевим щепленням. При цьому важкого клінічного перебігу хвороби не було, як і ускладнень.

Найпоширенішою локалізацією геморагій після крововиливів у м’які тканини були кровотечі зі слизової оболонки ротової і носової порожнин. Вони виявлені у 22-х випадках з 293 спостережень, що складає 5,6 %. Цей вид геморагій виникав у дітей раннього віку і реально не загрожував тривалими й інтенсивними кровотечами. Наші спостере-

ження цілковито збігаються з літературними даними (Rizza, Biggs, 1971;

3. С. Федорова, 1977; 3. С. Баркаган, 1988 та ін.). Майже так само часто, як кровотечі зі слизових оболонок ротової і носової порожнин, зустрічаються шлунково-кишкові кровотечі — у 20 випадках з 393, що відповідає 5 %. Отримані внаслідок даного дослідження результати посутньо відрізняються від літературних. Чимало авторів свідчать, що саме цей вид кровочивості спостерігається в середньому у 17-27 % усіх хворих на гемофілію А (Д. М. Дроздов, М. Д. Паціора, 1962; В. С. Абрамов, 1966; Г. М. Абдулаєв, 1973; 3. С. Баркаган зі співавт., 1987 та ін.). Наближеними до такої ж частотності шлунково-кишкових кровотеч, як у даній роботі, є наслідки, отримані лише ленінградськими вченими (3. Д. Федорова зі співавт., 1977), — 7 %. Спостереження, здійснені як у даному дослідженні, так і в працях багатьох авторів, підтверджують той факт, що шлунково-кишкові кровотечі найчастіше трапляються у дітей старшого віку, як те маємо, у 20-ти випадках саме таких кровотеч у дітей після 12-ти років, зафіксованих у перебігу хвороби. У 85 % випадків цей підвид геморагій розвивався без видимих причин і тільки в трьох випадках (15 %) гастроінтестинальні кровотечі спонукалися травмою живота.

Доволі поширеним проявом гемофілії А є кровотечі з каналів сечовиділення. В одеській популяції гематурія спостерігалася в 16 з 393 випадків, що складає 4 % і цілком збігається з літературними даними. Так, Green і Smith (1972) визначають цей показник в межах 6-16,3 %, Г. М. Абдулаєв (1973) — 4-10 %, 3. Д. Федорова (1977) -16-31 %, 3. С. Баркаган (1988) — 5-8 %. У всіх 16 випадках кровотеча зі шляхів сечовиділення виникала раптово, без суб’єктивних відчуттів хворих і виявляла себе темно-червоним кольором сечі і поступово зростаючою слабкістю; у 9-ти пацієнтів з 16 періодично ускладнювалося сечовипускання.

Основним методом лікування гемофілічних геморагій є замісна терапія. Під час розробки схеми лікування кожного хворого враховували чимало факторів, у тім числі локалізацію й інтенсивність геморагії, її тривалість, ступінь втрати крові і можливі ускладнення. Основним же орієнтиром для розрахунку препаратів, які мали вводитися, слугувала активність фактора VIII у крові хворого і той рівень антигемофільного фактора, котрого треба було досягти у даного хворого.

Під час лікування гемартрозів застережливі заходи грунтувалися на декількох моментах:

1) попередження гемартрозів; 2) спинення кровотечі, зменшення гострого болю; 3) запобігання вторинних змін у суглобах.

Оскільки гемартрози виникають внаслідок травм, детально інформуємо всіх хворих на гемофілію А та їх батьків про необхідність уникнення травм, а в разі загострення якнайшвидше звертатися до лікаря.

Дане дослідження аргументовано переконує, що за умови рано ро-

зпочатого лікувнаня — протягом першої доби від початку крововиливу

— в 113 випадках одиничного введення препарату було достатньо для зупинення кровотечі, а тим часом у 280 випадках припізнілого звертання — на 2-3 добу — застосування гемостатичних препаратів продовжувалося 3-4 доби і більше.

При гострих гемартрозах використовували тимчасову іммобілізацію ураженої кінцівки, а також, при значних гемартрозах, ранню аспірацію крові, що вилилася в суглоб. Доза препаратів при гострих гемартрозах розраховувалася так, щоб підняти рівень фактора VIII не менше, аніж на 20 %. Повний курс замісної терапії продовжувався протягом 7-10 днів. Підтримуюча терапія антигемофільними препаратами дозволяла рано, з перших же днів лікування, підключати фізіотерапевтичні методи і заняття лікувальною фізкультурою, що сприяло швидкому і повному “ідновленшо функції ураженої кінцівки, запобігало атрофії м’язів.

Для лікування хронічних артропатій використовувався метод сино-вектомії під захистом антигемофільного глобуліну. У двох пацієнтів було прооперовано праві колінні суглоби, що запобігло наступним геморагіям у даний суглоб і гарантувало збереження його функції.

Вибираючи тактику лікування хворих з крововиливами у м’які тканини, враховували інтенсивність і поширеність кровотечі. Так, при поміркованих крововиливах у м’які тканини для досягнення гемостазу достатньо було підвищити рівень фактора VIII до 10-20 % і підтримувати його протягом 2-3 діб. При значних за обсягом гематомах гемостаз досягався шляхом підвищення рівня антигемофільного глобуліну в крові хворого до 20-40 %. Далі підтримували активність фактора VIII аж до спинення кровотечі з наступним застосуванням половини дози кріопреципітату протягом 2-3 днів.

Зовнішні кровотечі з пошкодженої шкіри, носові кровотечі і геморагії з ранок ротової порожнини купирувалися як трансфузійною терапією (кріопреципітат, антигемофільна плазма), так і місцевими заходами —обробкою ділянки кровотечі тромбопластином, тромбіном, розчином епсилон-амінокапронової кислоти.

Аналогічно спинялися кровотечі після видалення зубів. Профілактика таких кровотеч досягалася трансфузіями малих чи середніх доз антигемофільної плазми чи невеликої кількості кріопреципітату.

При кровотечах з каналів сечовиділення у хворих на гемофілію А малі дози кріопреципітату були неефективні. Під час ниркових кровотеч використосувалися середні та великі дози, котрі підтримували рівень активності фактора VIII у плазмі хворого понад 50 %. Гематурії лікувалися також преднизолоном у середніх терапевтичних дозах (1-2 мг/кг на добу).

Отже, основним методом лікування гемофілічних геморагій різно-

манітної локалізації є замісна терапія, ступінь ефективності котрої залежить від багатьох чинників. Однак впроваджувана терапія при гемофілії А не радикальна. Вирішити проблему кардинально здатна лише генопрофілактика, котра стала можливою з використанням у практичній медицині молекулярно-генетичних методів дослідження.

Для діагностики гемофілії А використовуються біохімічні і серологічні методи, спрямовані на визначення типу гемофілії за аутокоагу-лограмою; активності фактора VIII; рівня інгібітора до фактора VIII. Ці тести широко застосовуються в гематологічних центрах України. Проте вони не гарантують цілковитої достовірності у процесі вияву гетерозиготних носіїв і мало придатні для пренатальної діагностики. Тому саме автор даного дослідження встановлював носіїв і пренатально діагностував гемофілію А за допомогою методу ДНК-діагностики, зокрема, її варіанту — ПДРФ-аналізу (поліморфізм довжини рестрик-ційних фрагментів) (В. С. Баранов зі співавт., 1989, 1992).

Подібне вивчення гена фактора VIII в Україні не проводилося, а в країнах СНД аналогічні дослідження — одиничні (В. С. Баранов зі співавт., 1992). Не вивчені особливості алельних частот поліморфних сайтів, котрі використовуються для виявлення гетерозиготних носіїв і пренатальної діагностики.

ПДРФ виникає через наявність чи відсутність у ДНК поліморфних сайтів, які пізнаються специфічними ендонуклеазами. ПДРФ-аналіз здійснювався методами блот-гибридизації чи за допомогою поліме-разної ланцюгової реакції (В. С. Баранов та ін., 1993).

У спільних з лабораторією пренатальної діагностики Інституту акушерства і гінекології АМН Росії (зав. лабораторією професор В. С. Баранов) дослідженнях уперше на молекулярному рівні вивчено родини з дітьми, хворими на гемофілію А. Досягнуті результати узгоджуються з даними молекулярної діагностики гемофілії А в інших країнах і передусім — Росії. Вони свідчать про те, що найінформативнішим є позагенний поліморфний локус DXS-52, котрий ідентифікується ДНК-зондом St-14 (В. С. Баранов зі співавт., 1989; В. JI. Сурін зі співавтр., 1991; Kaufman К. J., 1989; Kogan S. G., 1987; Oberle I. B., Gamerino, R. Heiling et al., 1985).

На жаль, доводиться враховувати, що цей локус розташований на віддалі 3 санптортанід від гена фактора VIII, у зв’язку з чим точність діагностики складає 94 %. Саме тому особливо важливо поєднувати позагенні поліморфізми з внутрішньогенними, застосування котрих сприяє значно більшій точності діагностики.

Найбільш зручними внутрішньогенними поліморфними сайтами для проведення молекулярної діагностики гемофілії А в популяції Одеської області є Hind-III і Xba-І сайти, розташовані в інтронах 19 і 22 відповідно.

Крім того, методом блот-гібридизації була вивчена інформативність екстрагенного поліморфного сайта рестрикції Taq-I у локусі DXS-52, розташованому ближче до гена фактора VIII, а також визначена його частотність і обчислена інформативність кожного з перерахованих поліморфних сайтів в одеській популяції. Для кожного з цих сайтів розроблені оригінальні системи олигопраймерів і широко застосовувався метод ПЛР (М. В. Асєєв зі співавт., 1994).

Дослідження частотності поліморфного сайта рестрикції Hind-III методом ПЛР показано наявність значної кількості гетерозиготних алелей —52,8. Користуючись рівняннями Харді-Вайнберга, можна передбачити частотність гетерозигот: інформативність дорівнює 40 % (0,40).

ПДРФ-аналіз ХЬа-сайта рестрикції методом ПЛР виявив велику інформативність даного поліморфізму для ДНК-діагностики гемофілії А. Частотність наявності Xba-І сайта рестрикції склала 48 %, а інформативність його — 50 %. Отримані нами результати цілком відповідають даним по європейських популяціях і свідчать про досить високу інформативність даних поліморфізмів при встановленні діагнозу — носій чи ні, і проведені пренатальної діагностики гемофілії А в популяції Одеської області.

З метою збільшення числа інформативних родин, придатних для ДНК-діагностики гемофілії А, використовували позагенний маркер — поліморфний сайт рестрикції Taq-I в локусі DXS-52 поруч із геном фактора VIII. Для дослідження даного локуса застосовували ДНК-зонд St-14. Тестування проводилося методом блот-гібридизації за Саурзе-ном. У даному дослідженні цей сайт рестрикції виявився найбільш інформативним. Йому властивий особливо виражений поліморфізм, котрий виявився інформативним практично в усіх проаналізованих нами сім’ях. Встановлено, що носіями гемофілії А є 2 близьких родичів пробанда, і заперечено в 1 з вірогідністю понад 95 %. Діагностовано носіїв гемофілії А з вірогідністю понад 90 % у 3 з 4 віддалених родичів з пробандом (двоюрідні сестри і тітки).

Результати ДНК-діагностики в сім’ях з гемофілією А в одеській популяції представлені в таблиці 6.

Поліморфні сайти рестрикції Всього сімей Інформативні сім’ї Визначення носіїв Спростування того, чи є носієм

НіпсЗ-ІІІ 3 2 ' 2 1

ХЬа-І 2 2 1 1

Локус БХ8-52 2 1 1 —

Тая-І^-Н 24 23 20 1

Всього 31 28 24 3

На малюнку 1 наведено приклад ДНК-діагностики у родіні Н. методом полімеразної ланцюгової реакції по внутрішньогенному поліморфному сайту Ніпб-ІІІ.

а

о

6

/

480

250

160

90

и и и и и и

и и и и

и

и

1 3 4 5 6 7

Мал. 1. ДНК-діагностика у родіні Н. методом полімеразної ланцюгової реакції по внутрішньогенному поліморфному сайту НШ-ПІ.

Однорічна дитина Н. (7) успадкувала важку форму гемофілії А (рідний брат матері (2) помер у молодому віці від цієї хвороби). Рідна сестра матері (1) має сина (5), шести років, котрий уражений гемофілією А. Для встановлення, чи є гетерозиготними носіями родички пробанда, визначався рівень глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, який у матері дитини (3) і його тьоті виявився заниженими — 4,2 ммоль/хв на 1 г гемоглобіну, а в рідної сестри (6) — нормальним — 6,0 ммоль/хв на 1 г гемоглобіну. Активність фактора VIII у плазмі крові сестри (6) і матері (3) складала 105 %, а у тьоті (1) — 51 %. Внаслідок отриманих даних достовірно можна було встановити, що гетерозиготним носієм є

тільки тьотя дитини, у котрої був заниженим рівень глюкозо-6-фос-фатдегідрогенази й активності фактора VIII. Так само достовірно можна було заперечити, що гетерозиготним носієм є сестра дитини, в якої рівень глюкозо-6-фосфатдегідрогенази й активність фактора VIII були в межах норми. Достовірно підтвердити чи відкинути думку, що гетерозиготним носієм є мати дитини, біохімічними методами не вдавалося. За допомогою молекулярних методів встановлено, що хромосома з геном гемофілії А несе алель 250 т. п. о. Наявність цього алеля у хворих хлопчиків (5, 7), їх матерів (1,3) доводить, що мати дитини (3) та її рідна сестра є гетерозиготними носіями. Відсутність фрагмента, котрий передає мутантний ген, у сестри хворого (6) спростовує, що вона є носієм патологічного гена.

Проте є ряд чинників, які посутньо ускладнюють молекулярну діагностику. Це такі:

1) оманливе батьківство, внаслідок чого може бути неправильною відповідь про носія гена гемофілії А Застосування методу геномної дактилоскопії для обстеження ДНК батьків та їх доньок дозволяє уникнути цієї помилки.

2) Недостатня інформативність молекулярно-генетичних методів. П’ятирічний досвід роботи переконав у тому, що інформативними, тобто придатними для діагностики, є лише 94 % сімей високого ризику. Прямий аналіз мутацій у хворих та їх родичів здатен вирішити цю проблему. Перспективним є також пошук нових поліморфних сайтів в інтронних —тих, що не транскрибуються, частинах гена.

3) Виникнення мутацій de novo, себто в оогенезі чи сперматогенезі матері хворого та родичів по материнській лінії відповідно.

Проблема мутацій de novo — цікава і важлива не тільки з цієї позиції, а ще й у зв’язку з екологічною кризою, котру переживає сучасна людина. Проявом мутаційного впливу чинників навколишнього середовища є збільшення відсотка так званих спорадичних випадків гемофілії А, мутацій de novo. За результатам даного дослідження виходить, що серед хворих одеської популяції порівняно незначна частотність спорадичних випадків гемофілії А (3,6 %). Ці дані посутньо відрізняються від даних інших популяцій (Mufred Wehnert et al., 1988; A. В. Асєєв зі співавт., 1992).

. У ряді випадків застосування ПРДФ-аналізу дає можливість визначити, у кого саме з родичів пробанда виникла спонтанна мутація.

о

250

160

90

и и и и и и

ІГ

и

12 3 4

Мал. 2. ДНК-діагностика у родіні Ш. методом полімеразної ланцюгової реакції по внутрішньогенному поліморфному сайту НШ-ІІІ.

У сім’ї Ш. мати двох дітей є гетерозиготною за алелями поліморфного сайта НіпсЗ-ІІІ, хоча обидва її сини — здоровий і хворий на гемофілію А

— несуть один і той же алель — 250 п. о. Остання обставина, а також те, що у жінки не спостерігалося зниження фактора VIII у крові, дозволяє прийти до висновку про виникнення мутації в оогенезі.

ПДРФ-аналіз значної кількості родин зі спонтанною формою гемофілії А (дані власного дослідження і літературні відомості) показав, що близько 75 % випадків захворювання пов’язано з мутацією, котра виникла в сперматогенезі, і лише 25 % — в оогенезі.

Здається перспективним виявлення в гені фаткора VIII додаткових високополіморфних сайтів і передусім — це так звані СА-повтори 13 інтрона. Застосування цього поліморфізму дозволяє посутньо підвищити інформативність сімей, що передбачається використати у нашій подальшій роботі.

Щоправда, протягом останніх років (1993 — 1994) в гені фактора VIII описана одна і поки що єдина домінуюча за частотністю мутація. Вона представляє собою інверсію центральної частини гена внаслідок порушення процесу рекомбінації, що призводить до помилок у транскрипції і появи аномальних, функціонально неактивних продуктів генів. Мутація наявна майже у половини сімей з важкими формами гемофілії А (ЬаШв еі аі., 1993). Можливість детекції цієї мутації дозволить уперше провести молекулярну діагностику гемофілії А, особливо в родинах з важкими формами.

Таким чином, впровадження в молекулярні дослідження аналізу (СА)п поліморфізмів 13 інтрона й ідентифікація інверсійної мутації 22 інтрона відкриває нові перспективи для глибшого вивчення гемофілії А і сприятиме підвищенню ефективності молекулярної діагностики даної хвороби в Україні.

У трьох з 28 інформативних сімей проведена дородова діагностика.

J' ІД 4 Ds

*2 v -'З ^4

480 U U и и U

250 U и и U

160 U U

90 U и

1 2 3 4 5

Мал. 3. Пренатальна діагностика гемофілії А методом пол-імеразної ланцюгової реакції у сім’ї М. в першому триместрі вагітності по поліморфізму Hind-111.

Мати дитини (1) з нормальною активністю фактора VIII (102 %) є гетерозиготною по Hind-III сайту рестрикції (+, -). Хромосома з мутантним геном фактора VIII характеризується апелем, котрий має сайт рестрикції (+), визначений під час аналізу хворої дитини (2). Оскільки донька (3) успадкувала від батька алель (-) і від матері аналогічний (-), то, таким чином, вона не є носієм гемофілії А, цебто, вона не отримала Х-хромосому, що транспортує мутантний ген. Під час вагітності сроком у 8 тижнів дородова діагностика у цій сім’ї була проведена невипадково. Плід чоловічої статі (4) також успадкував здорову хромосому (-) від матері (1), а тому йому не загрожує гемофілія А. Від моменту народження в січні 1990 року до сьогоднішнього дня дитина знаходиться під нашим ретельним контролем. Результати клінічного і параклінічного обстеження народженного хлопчика, котрому цього року виповнилося 6 років, підтверджують, що він здоровий.

Отже, всі розділи, розглятуі в дисертаційній роботі, свідчать про те, що розроблена її автором уперше в Україні оптимальна стратегія ДНК-діагностики гемофілії А дозволяє своєчасно виявити носіїв захворювання і в оптимальний термін — перший триместр вагітності — вдатися до пренатальної діагностики.

ВИСНОВКИ

1. На основі медико-генетичних, клінічних і лабораторних досліджень встановлена частотність гемофілії А в одеській популяції. Вона складає 1: 6000 чоловіків.

2. Ступінь ускладненості гемофілії А знаходиться у прямій залежності від активності фактора VIII і в зворотній залежності від рівня інгібітора до фактора VIII.

3-. У 45,3 % пацієнтів клінічна маніфестація гемофілії А спостерігається у віці 2-4 роки.

4. Домінуючою за частотністю (74,1 %) у популяції Одеської області є неінгібіторна форма гемофілії А середнього ступеня ускладненості.

5. Найпоширенішими клінічними проявами хвороби виступають гемартрози великих суглобів (29,8 %), кровотечі після екстракції зуба (25,2 %) та крововиливи у м’які тканини (22,6 %).

6. Профілактичні курси гемостатичної терапії доцільно проводити напередодні сезонних загострень, які в усіх хворих на гемофілію А одеської популяції спостерігаються у весінні (березень — травень) і осінні (жовтень — листопад) періоди.

7. З 31 родини, обстежених молекулярними методами, 28 сімей виявилися інформативними, придатними для ДНК-діагностики. Під час аналізу внутрішньогенних і позагенних поліморфних сайтів найбільш інформативним у обстежених хворих був позагенний поліморфізм DXS-52, ідентифікуючий ДНК-зонд St-14 — справді ефективний у 23 сім’ях.

8. Серед досліджених внутрішньогенних поліморфних сайтів найбільш зручними для ДНК-діагностики виявилися поліморфні сайти Hind-1II і Xba-І. їх одночасне використання дозволило встановити інформативність у 4 сім’ях.

9. На основі застосування молекулярно-генетичних методів у 24 випадках встановлено гетерозиготних носіїв, у 3 випадках — спростовано це, а в 3 родинах високого ризику проведена пренатальна діагностика.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Враховуючи сезонне загострення клінічних проявів гемофілії А з двома піднесеннями (березень — травень і жовтень — листопад), доцільно в ці періоди проводити профілактичні курси гемостатичної терапії.

2. В разі виявлення хворого на гемофілію А кожній новій родині необхідно забезпечити обстеження біохімічними і молекулярними методами з метою створення банку ДНК для данної сім’ї, визначення її інформативності (придатності для ДНК-діагностики) й обстеження всіх сібсів жіночої статі для виявлення чи спростування того, чи є носієм.

3. З метою ефективного діагностування і профілактики гемофілії А забезпечити забір крові хворих на гемофілію А для наступного йиді-лення ДНК і створення банку ДНК даних хворих.

4. За наявності інформативності в даній конкретній сім’ї здійснити забір крові в усіх сібсів жіночої статі для виявлення чи заперечення: є гетерозиготним носієм чи ні.

5. Створити комп’ютеризований регістр результатів біохімічного, клінічного і молекулярного обстеження кожної родини з гемофілією А.

6. У разі вагітності жінок високого ризику з гемофілії А необхідно перевірити за регістром інформативність даної сім’ї. Коли ж вона відсутня — забезпечити негайне ДНК-обстеження цієї родини з наступним направленням на пренатальну діагностику для проведення її в оптимальні строки — перший триместр вагітності.

7. За наявності інформативності даної сім’ї вагітна зобов’язана пройти пренатальну діагностику.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. «Некоторые проблемы диагностики гемофилии А и возможные пути их решения» (разом з М. В. Асеевим, В. С. Барановим). — «Биополимеры и клетка». — 1991. — N. 2. — С. 92-98.

2. «Диагностика гемофилии А» (разом з М. В. Асєєвим, В. С. Барановим). - ПАГ. - 1991. - N. 6. - С. 20-23.

3. «Allele frequencies and molecular diagnosis in haemophilia A and В patients from Russia and fron some Asian republics of the former USSR» (разом з M. В. Асєєвим, В. Суріним, В. С. Барановим) «Prenatal diagnosis» Vol. 14, 1994, 5 crop.

4. «Medical and genetic aspccts of early and prenatal diagnostics of the inherited diseases (cystic fibroses, haemomilia) in children of south Ukraine» (разом з Б. Я. Резніком, Ж. В. Крайньой) «Prenatal «diagnosis» Vol. 14, 1995, 3 стор.

5. «Allele frequencies and molecular diagnosis in haemophilia A and В patients from Russia and fron some Asian republics of the former USSR» (разом з M. В. Асєєвим, В. С. Барановим, В. Суріним ) «Prenatal diagnosis» Vol. 14, 1994, 10 стор.

6. «Старые и новые мутации при ензимопатиях у детей в связи с состоянием окружающей среды» (разом з 3. М. Живац). Институтский сборник N. 1 «Проблемы здоровья матери и ребенка», 1990, с. 12-15.

7. «Роль молекулярно-генетичних методів дослідження у ранній і пренатальній діагностиці спадкових захворювань». Тези доповідей IX з’їзду дитячих лікарів України, м. Одеса, 1993 (разом з JI. А. Лів-шиць, Б. Я. Резніком, Ж. В. Крайньою, 3. М. Живац).

8. «ПДРФ-аналіз у сім’ях з гемофілією А в Одеському регіоні». Тези доповідей II з’їзду медичних генетиків України, м. Львів, 1995, с. 48.

9. «Значення молекулярно-генетичних методів дослідження в педіатрії» (разом з Б. Я. Резніком, Ж. В. Крайньою, В. С. Барановим, Л. А. Лівшиць). Тези доповідей II з’їзду медичних генетиків України., м. Львів, 1995, с. 48.

Горностаева Наталья Юрьевна. Тема диссертации «Профилактика гемофилии А у детей с использованием клинических и молекулярно-генетических методов».

Диссертация на правах рукописи представлена на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.10 — педиатрия. Защита состоится на заседании специализированного совета Д.05.04.01. Одесского государственного медицинского университета в 1996 году.

Диссертация суммирует семилетний опыт работы по изучению клинических и молекулярно-генетических особенностей гемофилии А в одесской популяции.

Обследовано 31 семья (123 человека).

Установлено, что преобладающей формой гемофилии А в одесской популяции является неингибиторная форма средней степени тяжести. Четкое сезонное обострение заболевания весной и осенью позволяет проводить профилактические курсы гемостатической терапии.

Из 31 семьи 28 были информативными для ДНК-диагности-ки. У 24 родственниц пробанда установлено носительство гемофилии А, у 3 — отвергнуто. В 3 случаях в I триместре беременности проведена дородовая диагностика этого заболевания.

Gornostaeva Natalya Yurievna.

The theme of the dissertation is «Prophylaxis of hemophilia A in children by clinical and molecular-genetic methods».

The dissertation with authers rights is presented to confer a degree of candidate of medical science on Pediatrics. The defence of dissertation will be at the sitting of special Science Council D.05.04.01 of Odessa State Medical University in 1996.

Seven years experience in molecular diagnosis of hemophilia A by means of RFLP studies and PCR analysis of F VIII gene is summarized.

There were examined 31 families (123 persons).

It was established that prevalent form of hemophilia A in Odessa region is noninhibitory form of moderate severity. The obtained data about seasonal exacerbations of hemophilia A will be permit to administer hemostatic therapy as preventiv treatment.

28 out of 31 families studied were found to be informative for DNA analysis. 24 hemophilia A carries have been detected and in 3 female relatives the presence of hemophilia A has been rejected. The results of 3 cases of prenatal diagnoses of hemophilia A at the 1-st trimester of pregnancy are reported.

Ключові слова: гемофілія А, ПДРФ-аналіз, полімеразна ланцюгова реакція, пренатальна діагностика.