Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Принципы оптимизации иммуносупрессии при аллотрансплантации органов

Министерство здравоохранения

СССР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

На правах рукописи

Сускова Виктория Сергеевна

УДК 612.017.1:616-089.843:57.016.4

РИНЦИПЫ ОПТИМИЗАЦИИ ИММУНОСУПРЕССИИ ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ОРГАНОВ

(экспериментально-клиническое исследование) .00.41. - Трансплантология и искусственные органы

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1989

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

академик АМН СССР, профессор В.И.ШУШКОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Н.Г.АЩИМОЕИЧ

доктор медицинских наук, профессор И.В.ПЕГРОВА

доктор медицинских наук, профессор Э.Р.ЛЕВИЦКИЙ

ВЕДУЩЕЕ УЧРВДКНИЕ - Всесоюзный научный Центр хирургии АМН СССР

Защита диссертации состоится " "_198 г. в час.

на заседании Специализированного Учёного Совета (Д 074.34.01) го залдате докторских диссертаций в Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов ЫЗ СССР по адресу: 123436,Москва, ул. Щукинская, д. I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИГиИО ЫЗ СССР. Автореферат разослан " " _ 198 г.

Учёный секретарь Специализированного Учёного Совета доктор медицинских наук, профессор

А.А.Писаревский

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. До настоящего времени единственным ¡пособом преодоления тканевой несовместимости .позволяющим проводить трансплантацию органов и тканей в клинике,остается подавление иммунных реакций реципиента различными фармакологическими средствами и способами,влияющими на иммунокомпетентные метки и их взаимодействие в иммунном ответе. Антигеннеспецифи--¡ескяя иммуносупрессия,использующая в качестве базисных препаратов глюкокортикоиды и азатиоприн, а в последние годы циклоспорин А, остается ведущей (В.И.Шумаков и соатхДЭвй; Р.Л.Розен -галь,А.М.Сочнев,1984; КаЬап У.Б.,1984;Свгре^ег Сй.В.,1984;Кишат et а1.,1988 и др.).Она служит основой для составления схем комбинированной иымуно супрессивной терапии при аллотрансплантации органов и тканей в клинике.

Однако иммуносупрессивная терапия обладает рядом серьёзных недостатков,которые снижают общие результаты аллотрансплантаций и не приносят удовлетворения клиницистам. Так,1/- большинство из используемых средств при длительном их применении наряду с основным иммуносупресеивным действием оказывает побочные токсические эффекты,такие как угнетение кроветворения,нефро- и гепа-тотоксичность,нарушение обменных процессов в организме,деструктивные изменения в желудочно-кишечном тракте и др. ( Г.М. Соловьев и соавт.,1973; В.И.Шумаков,М.Я.Ратнер,1976; И.В.Петрова, 1982; Э.К.Шхинек и соавт.,1984;ВасЬ .7.Р. ,1979,1980;Са1пе 1980;>Уцап1,1982^гот, 1984 и др.).

Современное состояние иммуносупрессии при трансплантации органов и тканей характеризуется включением в схемы иммуносупрессивной терапии циклоспорина А (сандиммуна),который является прототипом нового ряда перспективных иммуносупреорров.Однако общее увлечение циклоспорином,а также применение в последние годы антилимфоцитарных препаратов нового поколения" ( АТГ, лимфоглобулин), моноклональных антител против Т-лимфоцитов не только не уменьшило,а даже обострило проблемы,связанные с побочным токсическим их действием и сопутствующими осложнениями, к числу которых относится нефротоксичность циклоспорина, боль-лая иммуногешость антилимфоцитарных препаратов и другие,требующие при назначении этих,средств специального контроля (Со-

simi,1981; Bach,Chatenoud,1984; Birkeland et al. ,1988;Kumar et al.,1988; White et al. ,1988).

2/-Используемые в клинике иммуносупрессоры недостаточно специфичны,так как воздействуют практически на все фазы иммунного ответа,подавляя пролиферацию иммунокомпетентных клеток и синтез иммуноглобулинов,также как и митотическую активность любых нормально функционирующих пролиферирующих йлеток, важных для жизнедеятельности организма (Петров Р.В.,Манько В.М.,1971;У.А. Арипов и соавт.,1976;Говалло В.И.,1979; Н.Г.Арцимович и соавт., 1979 ;Л.П.Алексеев,1978; Braun,1981 ;Myburgh,1981).

3/-Несистематический контроль за адекватностью иммуносуп -рессивной терапии может приводить либо к недостаточной её эффективности, либо к токсическому воздействию высоких доз. имму-носупрессантов на другие системы организма, в том числе и систему иммунитета,что способствует развитию тяжелых инфекционных осложнений (В.И.Шумаков, Э.Р.Левицкий и соавт.,1982,0.С. Белорусов и соавт. ,1983; Нелиус Д. ,1984; Brunham et al., 1983; Kaplan,1986 , И Др.).

Из вышесказанного следует, что)цальнейшие успехи в области аллотрансплантации органов будут во многом зависеть от разработки методов направленного изменения иммунных реакций организ-, ма путем применения высокоэффективных избирательно действующих и малотоксичных препаратов,как специфически, так и неспецифически влияющих на лимфоидную ткань. В этом плане поиск новых средств и способов иммуносупрессии,проводишй в последние годы в разных странах,в том числе и в нашей стране,является актуальным. Главная его задача в изыскании средств,избирательно регулирующих активность определенных субпопуляций иммунокомпетентных клеток ( Р.В.Петров,1982,1984;Burton et al.,1983;Braun et al., 1981;Spreafico,1985 И др.).

Открытие циклоспорина А,до некоторой степени удовлетворяющего этим требованиям,подтвердило перспективность поиска новых эффективных средств избирательной иммуносупрессиф регуляции иммунного ответа при аллотрансплантации.

Одной из основных задач по-прежнему остается оптимизация дозовых и временных режимов применения как известных,так и новых иммуносупрессоров,разработка методов оценки эффективности терапии и индивидуализации режимов иммуносупрессии,особенно глю-

<окортикоидов ( Ades,1982;Hall,1982;Wuani,1982; diApice et al. , 1984; White et а1.,1988 и др.).

Снижение побочных эффектов и профилактика и лечение ослож-¡ений является также одной из первоочередных задач,в реше-ши которой наметилось два пути: I/- создание новых менее ток-¡ичных иммуносупрессоров и 2/-дальнейшее совершенствование схем гммуносупрессии и методов своевременной диагностики осложнений, разработка новых принципов оценки адекватности иммуносупрессии. I этих двух направлениях.и были проведены исследования.

Цель и задачи исследования. Целью работы явился поиск и характеристика новых средств и способов иммуносупрессии направлен-юго действия,экспериментальная разработка и обоснование рени-юв их применения,оптимизация схем иммуносупрессии на основе !ндивидуальн0г0 подхода и комплексной оценки иммунного статуса реципиента.

Для решения, этих вопросов были поставлены следующие задачи: I/ Отобрать комплекс адекватных тестов и моделей для проведения иммунологического скрининга.

2/ Выявить новые классы соединений,перспективные для скрининга иммуносупрессантов.

3/ Провести изучение иммуносупрессивной активности новых пре-таратов с учетом избирательности их действия на отдельные звенья шмуннай системы и субпопуляции иммунокомпетентных клеток.

4/ Разработать схемы иммуносупрессии новыми препаратами в экс-юрименте.

5/ Провести комплексную оценку состояния иммунной системы реципиентов для разработки новых принципов оценки адекватности им-луносупрессивной терапии.

б/ Разработать дополнительные тесты для определения чувствительности реципиентов к иммуносупрессантам.в частности к глю-«жортикоидам, и обоснования их индивидуальных доз,а также для }иагностики нефротоксичности циклоспорина.

Научная новизна.

В работе приводятся новые данные .полученные в результате проведенных экспериментально-клинических исследований,вносящие существенный вклад в проблему иммуносупрессии.

Впервые разработан и обоснован принцип экспресс-скрининга новых иммуносупрессоров. С помощью разработанного подхода выявлены

и охарактеризованы среди синтетических антиоксидантов из класса 5-оксипиримидина перспективные препараты с принципиально новым для иммуносупрессоров механизмом действия.

Получены ранее неизвестные данные о влиянии хорионического гонадотропина на иммунный ответ .которые позволяют рассматри -вать его как иммуномодулятор.Впервые в тестах клеточного и гуморального иммунитета показан синергизм действия глюкокор-тикоидов и хорионического гонадотропина,что послужило основа -нием для включения его в комбинированную иммуносупрессивную терапию при аллотрансплантации.

Впервые проведен иммунологический скрининг среди отечественных соединений циклоспоринового ряда. Выявлен препарат с иммуно-супрессивной активностью, идентичной активности циклоспорина А фирмы "Сандоз".

Получены новые данные о влиянии соединений природного происхождения, вырабатываемых самим организмом- танглиозидов.интерферо-нов, кватерина,также как глюкокортикоидов и хорионического го -надотропина,на разные звенья иммунной системы и субпопуляции им-мунорегуляторных клеток. Эти средства ,наряду с другими гордонами, медиаторами и т.д.,могут быть использованы для достижения физиологической иммуносупрессии,разрабатываемой в качестве нового направления.

Разработан и предложен новый подход к иммунологическому контролю за адекватностью иммуносупрессии,основанный на комп -лексной оценке иммунного статуса реципиента с включением нагрузочных тестов и тестов на индивидуальную чувствительность к иммуносупрессантам.

Выявлены варианты комбинаций количественных взаимоотношений регуляторных субпопуляций лимфоцитов при низких и средних дозах циклоспорина в условиях комбинированной иммуносупрессивной терапии у реципиентов с почечным аллотрансплантатом.

Практическая значимость работы.

Выявлены классы соединений,перспективные для поиска новых иммуносупрессоров,к которым относятся антиоксиданты растительного и химического происхождения,гормоны,продукты мицелия грибов.

Разработан и внедрен экспресс-скрининг новых иммуносупрес-

)ров ,позволяидий в короткий срок и с использованием малых ко-шеств препарата сделать заключение о биологической активности целесообразности дальнейшего синтеза исследуемого соединения.

Новый иммуносупрессант из класса 5-оксипиримидина под шиф->м ОПМ-Ш внедрен в практику при экспериментальных исследова-1ях.Показана перспективность создания нового иммуносупрессан-I для клинического применения на основе этого класса соедине-1Й.

Исследована эффективность различных режимов комбинированно) применения глюкокортикоидов и "-хорионического гонадотропина и клинического их применения.

Впервые выявлен и охарактеризован отечественный аналог цик->спорина А.Подготовлена документация для Фармкомитета на клини-;скую апробацию.

Разработан новый подход к контролю за адекватностью иммуно-гпрессивной терапии как при пересадке почки,так и других органов.

Впервые применительно к аллотрансплантации разработаны и гедрены иммунограммы на основе комплексного иммунологического 5следования реципиентов и выявлены типовые варианты соотноше-1я показателей иммунного статуса,характерные для разных кли-гаеских состояний.

Разработан новый тест определения чувствительности лимфо-1тов реципиентов", к глюкокортикоидам,основанный на модификации ¡цепторов к ЭБ.

Предложен дополнительный способ определения нефротоксич ->сти циклоспорина .основанный на одномоментной оценке каналь-;вой и клубочковой функции почечного аллотрансплантата (или . )бственной почки) с помощью бета-2-микроглобулина.

Внедрение в практику. По материалам исследований изданы ме->дические рекомендации "Первичный экспресс-скрининг иммуномоду-1торов синтетического и природного происхождения"(Минмедбиопром :СР,М.,1989).Получено авторское свидетельство № 933096;опубл. 6.1982г.Бюлл.№21.и №2162015 ,1984г. на новые иммуносупрессан-I из класса 5-оксипиримидина. Получено рационализаторское пред-жеиие "Способ определения нефротоксичности циклоспорина". 1зработанные в диссертации новые подходы к оценке адекватности ¡муносупрессии внедрены в практику НИИТиИО Минздрава СССР и :авном клиническом военном госпитале им.Бурденко. По результатам следований прочитана лекция на Всесоюзной школе иммунофармако-гов ( Челябинск,1985). 5

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на совместной конференции теоретического и клинического.отделов НИИ трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР 28.12.1988г.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзных научных конференциях и симпозиумах по пересадке органов и тканей (Рига,1972; Тбилиси,1982; Киев,1985{Ташкент,1977 ),на Международных симпозиумах по иммунологии репродукции (Болгария, 1985,1988);на Международном симпозиуме по проблемам тестирования и оценке иммуномодуляторов в эксперименте и клинике(ЧССР,1988), на Всесоюзном съезде фармакологов (Ереван,1982),на Всесоюзных симпозиумах по регуляции иммунного гомеостаза (Ленинград,1982, Суздаль,1986), на Бюро Комиссии по научным основам медицины при Президиуме АН СССР(Москва,1980),на Пленумах и Бюро Всесоюзной проблемной комиссии "Трансплантация органов и тканей"(Москва, 1982,1987,Рига 1980,1984),на московском обществе трансплантоло-.-гов (1980,1984,1988).

Публикации.По теме диссертации опубликовано 39 работ в центральных журналах,трудах съездов и конференций,научных сборниках, три аналитических обзора отражают современное состояние проблемы

Связь задач исследований с проблемными планами. Диссертационная работа является фрагментом трех тем народно-хозяйственного пятилетнего плана по проблеме 0.69.03"Разработать методы и средства преодоления тканевой несовместимости','а именно: 1976-1980г.г тема 0.69.03.01 Нба "Установить механизмы действия химических би ологически активных веществ на функциональную активность лимфо -Цитов"; 1981-1985г.г. тема "Выявить влияние новых иммуносупрес -сивных веществ на Т- и В- системы лимфоцитов,систему комплемента и создать рациональные схемы для клинической проверки"; 1986-1690г.г. тема "Создать средства и способы направленной иммуносуп рессии при трансплантации органов? По перечисленным темам автор является ответственным исполнителем.

Объём и структура диссертации.Диссертация состоит из введет обзора литературы,пяти глав собственных исследований,заключения, выводов и указателя литературы ( источников,из которых оте -чественных ,зарубежных ). Работа изложена на стра-

ницах машинописного текста,содержит таблицы и рисунка.

Место выполнения работы. Работа выполнена в лаборатории им-нуносупрессии (руководитель - профессор Б.И.Шальнев) Научно-ис-гледовательского института трансплантологии и искусственных органов Минздрава СССР (директор - академик АМН СССР В.И.Шумаков).

В работе исследованы препараты,переданные для изучения ря-цом научно-исследовательских институтов АН СССР (Ин-т химфизики, &-т биохимии юл.Баха,Ин-т биоорганической химии им.М.М.Шемякина), ШН СССР и Мшмедбиопрома (И-ч фармакологии,Ин-т иммунологии,ВНКи антибиотиков и-ВНИХФИ им.С.Орджоникидзе) и др.

Положения,выносимые на защип.

I/ Разработанный экспресс-скрининг шыуномодуляторов позволя-;т в короткий срок и при наличии малых количеств препарата сделать включение о биологической их активности и целесообразности даль -(еЙЕего синтеза и может с успехом использоваться при первичном ст-юре новых иммуносупрессантов,-

2/ Среди 'отобранных для проведения иммунологического скрин:ш-■а классов соединений выявлены новые препараты с избирательный гсм-[уносупрессивным действием,перспективные для клинической апробации, 'акие соединения,как синтетические и природные антиоксиданты с прин-;ипиально новым для иммуносупрессоров механизмом действия,а тают ещества эндогенного происхождения могут быть средства;.«! для до-тижения"физиологической" тгмуносупрессии с минимальными токсиче-кими и побочным эффектен.

3/ Выявленный и впервые охарактеризованный отечественный ана-ог циклоспорина фирмы "Сандоз" рекомендован для создания препа-ата с целью клинического применения.

4/ Предложенный новый подход к иммунологическому контролю за декватностью иммуносупрессии,основанный на комплексной оценке ин-унного статуса реципиента с включением нагрузочных тестов и тес-ов на индивидуальную чувствительность к иммуносупрессорам обеспе-ИЕает эффективность такого контроля при аллотрансплан

ации почки и других органов-

5/Разработакные дополнительные методы оценки чувствительнос-и к глюкокортикоидам и нефротоксичности циклоспорина расширяют озмолшости своевременной диагностики осложнений и оптимизацию хек иммуносупрессивной терапии.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Общая характеристика и методы экспериментальных и клинических исследований.

Диссертация включает два раздела : экспериментальный и клинический.

Основной задачей экспериментальных исследований явился поиск новых перспективных иммуносупрессоров избирательного действия и разработка схем их применения на трансплантационных моделях.

Задача клинических исследований состояла в разработке пйзэн-ципов оптимизации схем иммуносупрессивной терапии,усовершенствовании диагностики осложнений и побочных токсических эффектов иммуносупрессоров,выявление новых подходов к оценке адекватности иммуносупрессии при трансплантации органов.

Благодаря достижениям иммунологии последних лет созданы теоретические предпосылки для поиска иммуносупрессоров избирательно го действия ,в основе(которого лежит селективное воздействие на

отдельные субпопуляции лимфоцитов,на отдельные этапы иммуноге -неза. Конечная цель таких исследований - создание управляемой иммуносупрессии с максимально возможной сохранностью противоин-фекционной защиты организма.(Р.В.Петров, 1982,1984; Brent,1981; Burton et.al.,1983;Myburgh,1983;Yammura et.al.,19S4;Lafferty, 1988) и др.

В этом направлении и был предпринят поиск новых перспективных иммуносупрессоров,который проводился нами как среди традиционных классов веществ,таких как антиметаболиты,антилимфоцитарные сыворотки,гормоны,так и среди новых природных и синтетических соединений, обладающих антиоксидантным действием,биологически активных веществ природного происхождения,антибактериальных и противогрибковых средств,переданных для испытания рядом научно-исследовательских институтов АМН СССР.Минмедбиопрома СССР и АНСССР (табл.1).

При изучении иммуносупрессивных свойств вышеназванных соединений был использован комплекс тестов и моделей,рекомендованных для этих целей советскими и зарубежными учеными ( У.А.Арипов и соавт.,1976; Н.Г.Арцимович и соавт.,1979;Р.В.Петров,P.M.Хаитов и соавт.,1984;Lefkovits et.al.,1979;iTiemel et.al..1983),

шолица х

КЛАССЫ СОЕДИНЕНИЙ 4ИССЛЕДУЕМЫХ С ЦЕЛЬЮ НАПРАВЛЕННОГО ПОИСКА НОВЫХ ИММУНОСУПРЕССОРОВ

Исследованные классы соединений ! Препараты ! Производство _|_(шифры)_!_

Антиметаболиты:производные пурина, КИ-7,КИ-42,КВС-1,КВС-128, ВНИХФИ им.С.Орджоникидзе, производные бензамидазола КВС-140, СБ 1-6, СБ 35-38 Ростовский гос.университет

Антилимфоцитарные сыворотки АЛС^^1,АЛГ-^"^1,АТГ-^1, Лаб.иммунвсупрессии

Н1ГГ НИИТиИО МЗ СССР

"'ормоны:глюкокортикоиды,гормоны метипред,гидрокортизон, Официнальные фармакологи-беременности преднизолон,дексаметазон ческие средства

хорионический гонадотропин

Соединения,обладающие' антиоксидант- 0ПМ-111,0ПМ-2П,0ПМ-ЗП, Институт химфизики АН СССР ньзл действием:произБодные 5-оксипи- ОПМ-ИЗП,0ПМ-5П,олигофурс-Ин-т биохимии им.Баха АН римидина,стероидные гликозиды рас- станозиды,томатин,меланго- СССР,Ин-т экологической ге-тительного происхождения зид нетики АН МССР

Биологически активные препараты кватерин,рекомбинантные Ин-т органической химии АН природного происхождения и их по- интерфероны,ганглиозиды, ЛаССР,йн-т иммтаологии Мин-дусинтетические аналоги поливалентный гамма-глобулин медбиопрома СССР.И-тбиоор-

ганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР

Антибиотики: полусинтетические ампициллин,карбенициллин, Официнальные фармакологиче-пенициллины,цефалосп.оринц небцин, цефамезин.цепорин ские средства

Производные мицелия грибов циклоспорин (сандиммун) фиЕ"3- "СандОз"

отечественные препараты ВНИИ антибиотиков Минмед-циклоспоринового ряда биопром СССР

который позволил в единых экспериментальных условиях и по воз -можности на одних и тех же объектах максимально оценить влияние исследуемых препаратов на клеточный и гуморальный иммунитет. Как правило »такие исследования включают большое количество тестов как "ин витро", так и "ин виво",требуют много времени,большого количества препарата и экспериментальных животных. С ис -пользованием такого расширенного набора тестов 'изучены иммуносу-прессивные свойства новых производных 5-оксипиримидина,хориони-ческогргонадотропина.и др. (рис.1).

При проведении экспериментальных исследований использовано 3000 половозрелых мышей линии СВА.С^В^^ ,(СВАхС^В1^^ и 1000 беспородных мышей,50 морских свинок,100 крыс линии В^стар, 30 кроликов и 25 беспородных собак.Исследовано влияние препаратов на первичный и вторичный иммунный ответ и формирование иммунологической памяти,дифференцировку полипотентных стволовых клеток и на процессы взаимодействия Т- и В-лимфоцитов в культуре клеток "ин виво','$а развитие гиперчувствительностй замедленного типа, реакцию"трансплантат-против*-хозяина",миграцию макрофагов и их фагоцитарную активность.Оценивали митостатическое и лиы-фотоксическое действие препаратов, а также влияние на отдель -ные субпопуляции иммунокомпетентных клеток в соответствующих тестах "ин витро"с использованием лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.

Экспериментальная разработка схем применения новых препаратов проведена на трансплантационных моделях,таких как "реакция трансплантат против хозяина"(РГПХ),пересадка кажного лоскута (КЛ у мышей,гетеротопическая трансплантация сердца у крыс-и собак, моделях аутоиммунных заболеваний и вирусных инфекций у мшей,а также на моделях иммунодефицитов.

Многолетний опыт работы в области иммунологического скрининга позволил разработать новый подход,а именно,экспресс-скрининг, для отбора иммуносупрессантов (и иммуномодуляторов) и подобрать комплекс методик для его применения.Необходимость такого подхода продиктована : I/ - малым количеством первоначальных партий новых соединений,позволяющим проводить первичный скрининг только в тест-системах"ин витро", 2/ - необходимостью получения быстрого заключения о-биологической активности и токсичности препаратов. для решения о целесообразности дальнейшего их синтеза, что

экономически весьма важно, и наконец, 3/ - экспресс-скрининг позволяет за короткий срок провести исследование иммуносупрессив -ли (иммуномодулирующих) свойств большого количества новых соедиг-

16НИЙ.

Подбор тестов экспресс-скрининга был подчинен основной зада- выявлению иммуносупрессоров избирательного действия, при этом тесты должны быть современными и адекватными (табл.1).

КОМПЛЕКС МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС-СКШНИНГА

1 - лимфотоксичноеть

2 - ебтл,индуцированная фга и шн-а; ил-2

3 - Кон-А-Т-супрессоры

4 - ЁКК и индуцированные киллеры

5 - активность макрофагов и моноцитов, ил-1

1 - Смешанная культура лимфоцитов Ш1С)

2 - реакция"трансплантат против хозяина" (РГПХ)

3 - кожный аллотрансплантат у мышей

4 - гетеротопическая аллотранс-плантация сердца у крыс

Экспресс-скрининг проводится в 2 этапа.Цель 1-го этапа -выявить избирательность действия препаратов на отдельные звенья лммунного ответа и субпопуляции лимфоцитов.Цель 2-го этапа - подтвердить иммуносупрессивное действие препаратов на трансплантационных моделях, после чего перспективные препараты подвергаются расширенному изучению в соответствии с требованиями Фармкоми-гета СССР.Подробное описание методов дано в методических реко -лендациях."Первичный экспресс-скрининг иммуномодуляторов химического и природного происхождения"(М.,1989).

С помощью разработанного подхода была исследована иммуносуп^ рессивная активность большого количества новых природных и синтетических соединений.

В короткий срок отобраны перспективные классы соединений для цальнейнего иммунологического скрининга,такие как растительные ан-гиоксиданты,производные мицелия грибов и др.

i этап

иммунологические тесты

ii этап

трансплантационные модели

Выявлены препараты с иммуносупрессивной активностью,которые целесообразно исследовать по полной схеме для обоснования клинической апробации.Экспресс-скрининг позволил оперативно осуществлять иммунологический контроль на этапах отработки получе -ния отечественного препарата циклос.поринового ряда и способствовал быстрому созданию отечественного циклоспорина.

В клиническом разделе обобщены результаты!иммунологических исследований у 157 больных с почеоным аллотрансплантатом и II бо льных с облитерируюшшэндартериитом. В динамике обследовано 83 больных, 50 из которых получали интенсивную иммуносупрессивную терапию и 33 поддерживающую по схемам,принятым в отделении пересадки почки НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ СССР (руководитель - профессор Э.Р.Левицкий).Группой сравннния явились 25 здоровых донора и и 30 больных с ХПН.

Оценку иммунного статуса в клинике проводили согласно рекомендациям ВОЗ (1973,1979) и методическим рекомендация:.! (И.В.Петрова и соавт,1980; А.Н.Чередеев и соавт.,под ред.Р.В.Петрова, 1984).Определяли относительное и абсолютное количество Т-,В- и "О"-лимфоцитов и их иммунорегуляторных субпопуляций ( Т-хелпе-ров и Т-супрессоров) методом спонтанного розеткообразования ( jocdal et al.,l972;Moretta et al.,1976 )> а такие методом непрямой-флуоресценции с использованием моноклональных антител 0КТЗ,4 и 8 фирмы "Ortho Diagnostic Systems" и ЛП,4 и 8 Института иммунологии МЗ СССР (Уракова Е.В.,Филатов A.B. и соавт.,1987, Acuti et а1.,1982}1р S.N. ,нтегвЬаив,1982).0пределяли также количество нейтрофилов и их розеткообразующих субпопуляций,"актив ных"Т-лимфоцитов ( Wybran et al.,1973),лимфоцитов и нейтрофилов с высокой плотностью рецепторов к маркёрам. Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали в тесте РВТЛ,индуцированной ФГА и Кон-А и в однонаправленной MLC, В-лимфоцитов - по уровню сывороточных иммуноглобулинов классов М,А,G,определяемых методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. О состоянии неспецифической защиты судили по активности комплемента и С3,а также фагоцитарной активности нейтрофилов.Кроме того,определяли уровень комплементфиксируюцих антител к суммарному почечному антигену в сыворотке реципиентов .Статистическая обработка результатов про водилась с использованием критерия Стьюдента и на ЭЕМ фирмы "Хьюлей-Паккард"(США).

2. Изучение иммуносупрессивных свойств новых соединений разных классов

Среди новых соединений известных классов иммуносупрессоров и -ювых классов веществ синтетического и природного происхождения зтобраны и охарактеризованы как перспективные следующие препараты: антиоксиданты из класса 5-оксипиримидина с принципиально новым для яммуносупрессоров механизмом действия; природные соединения,такие как стероидные гликозиды растительного происхождения и природные ганглиозиды.хорионический гонадотропин ,и как наиболее перспективой .отечественный препарат циклоспоринового ряда.

Иммуносуттрессивные свойства производных 5-оксипиримидина

К числу соединений,оказывающих влияние на иммунный ответ,относятся синтетические и природные антиоксиданты. Иммуномодулиру-ицее их действие может быть обусловлено изменением физико-химича-ских и функциональных свойств биологических мембран лимфоцитов и подавлением свободно-радикальных реакций, играющих существенную роль в активации эффекторных клеток,опосредующих иммунные реакции (Н.М.Эмануэлй,1976,1981,-Е.Б.Бурлакова,1982; Мак мосЗап, 1976; Во<16е1;1 ег а1.,1981; >/а1Гог<1,198г И др.).

В продолжение работ по изысканию биологически активных веществ на основе антиоксидантов гетероциклического ряда проведен синтез алкил- и арилзамещенных 5-оксипиримидина (Л.Д.Смирнов, С.Б.Гашев,1979,1982).Доказано их антирадикальное действие,не уступающее по активности известным антиоксидантам фенольного типа.Иммунофармак'ологические свойства такого типа соединений ранее не изучены.

Основываясь на положении,по которому ингибиторы радикальных процессов могут обеспечивать модуляцию иммунного ответа за счет модификации структуры и функции биологических мембран,было логичным предположить,что среди производных 5-оксипиримидина-наиме-нее изученных представителей антиоксидантов- могут быть выявлены новые перспективные иммуносупрессоры.

Сравнительное изучение токсичности и иммуносупрессивных свойств пяти новых производных 4,б-диметил-5оксипиримидина под шифрами 0Ш-211,0Ш-Ш,0Ш-ЗИ,0ПМ-ИЗГ1 и 0ПМ-511,синтезированных в Институте химфизики АН СССР д.х.н.проф.Л.Д.Смирновым и к.х.н.С.Б. Гашевым,проведено на 1800 линейных мышах и лимфоцитах периферической крови 30 здоровых доноров.

он

К=сн3 шифр - ОПМ-Ш

-К=С2% шифр - ОПМ-2П

ЕгСз^ шифр - ОПМ-ЗН

Н=изоС3Н7 шифр - ОПМ-ИЗН

К=С5НП шифр - 0ПМ-5П

Я.

Бьшо показано,что с усложнением химической структуры препаратов повышается их токсичность .уменьшается широта биологического действия. При 6-10-кратном в/бр и пероральном введении в дозах от 50 до 2500 мг/кг массы наименее токсичным оказался препарат 2,4,6-триметил-5-оксипиримидин (ОПМ-Ш),МПД которого составляла ЮООмг/кг.ДЦзд - 1500мг/кг.Выраженная биологическая активность препарата проявлялась в диапазоне доз от 50 до-500 мг/кг. ОПМ-Ш был отобран для дальнейшего углубленного исследования.

Изучение влияния ОПМ-Ш на гуморальный ответ показало,что при введении до антигенного стимула препарат несколько снижает число АОК при первичном иммунном ответе за счет воздействия на Т-хелперн,участвующие в запуске иммунного ответа, при вторичнон ответе этот эффект связан с воздействием препарата на клетки-памяти. На зрелые антителопродуценты препарат не'действует.,титры гемагглютининов в сыворотке мышей после обработки ОПМ-Ш не изменяются .СПМ -III оказывает супрессивное действие на клеточно-опо-средованные иммунные реакции: угнетает кооперацию Т-иВ-лимфоци-тов, в зависимости от дозы снижает проявление реакции "трансплан-тат-против-хозяина", в 2-4 раза угнетает реакцию гиперчувстви -тельности замедленного типа как к ЭБ.так и динитрохлорбензолу,ин-гибирует литическую активность сенсибилизированных лимфоцитов , не обладает митостатическим действием при выраженной лимфотокси-ческой активности (число выживших КОЕ 46% при 100 в контроле).

При сравнении с известными иммуносупрессорами аналогичное действие отмечено у гидрокортизона при введении 10 мг/кг ( 44% выживших КОЕ).Однако при введении животным 25 мг/кг и выше цито-токсическое действие гидрокортизона быстро нарастает.Доза 5 иг/ кг резко снижает избирательное лимфотоксическое действие,т.е. гидрокортизон обладает малой широтой специфического лимфотокси-ческого действия.Циклофосфамид при высоком лимфотоксическом эффекте токсичен,6-меркаптопурин оказывает низкое избирательное действие на лимфоциты при значительном митостатическом эффекте.

В отличие от известных иммуносупрессоров ОПМ-III не обладает митостатическим действие в большом диапазоне доз (от 50 до 500 мг/кг),имеет большую широту избирательного действий,в чем имеет преимущество перед используемыми в клинике иммуносупрессо-рами.

0ПМ-П1 в зависимости от концентрации ингибирует или стимулирует пролиферативную активность лимфоцитов человека"ин вит-ро" в тесте РБТЛ,индуцированной ФГА. В концентрациях от 0,1 до 50 мкг/мл препарат стимулирует синтез ДНК в 1,5 раза,тогда как в концентрации 250 мкг/мл он снижает пролиферативный ответ лимфоцитов на 35%.С увеличением концентрации ингибирующий эффект препарата не увеличивается(рисЛ).

Аналогичные результаты получены при изучении влияния ОПМ-Ш на способность лимфоцитов и нейтрофилов к спонтанному розеткооб-разованию с ЭБ "ин витро".Препарат снижает уровни цАМФ в клетках тимуса и повышает в клетках селезенки.

В результате проведенных исследований было показано,что в основе иммуносупрессивного действия ОПМ-Ш лежит разная чувствительность к нему отдельных субпопуляций лимфоцитов.Способность препарата оказывать лимфотоксическое действие,подавлять розетко* образование лимфоцитов и изменять интенсивность пролиферативного их ответа в тесте РБТЛ .стимулированной ФГА,свидетельствует о чувствительности Т-лимфоцитов к препарату. ОПМ-III избирательно блокирует активность Т-хелперов и угнетает активность цитотокси-ческих лимфоцитов,а также Т-клеток-эффектороврдг^,нарушает кооперативные процессы Т- и B-лимфоцитов. На Т-супрессоры препарат не оказывает повреждающего действия.(табл.3).

Опм-Ш удлиняет приживление коДжного аллотрансплантата у мышей до 29+1,9 дней при 11+1,5 днях в контроле при введении его за два дня до пересадки и далее с 5-го дня после пересадки ежедневно.Препарат внедрен в экспериментальную практику при аллотрансп-лантации органов и тканей у животных при проведении иммуносупрес-сии.При эндолимфатическом введении ОПМ-III собакам с аллогенным сердечным трансплантатом для лечения криза отторжения срок выживания трансплантата составлял 21-28 дней при 5-7 в контроле (A.A. Врробьев).ОПМ-III задерживает развитие экспериментальной вирус -ной инфекции у мышей.

ГУМОРАЛЬНЫЙ

ИММУННЫЙ

ОТВЕТ

Первичный иммунный ответ (кол-во АОК)

Вторичный иммунный ответ (кол-во АОК)

КЛЕТОЧНЫЙ

ИММУННЫЙ

ОТВЕТ

Митостатическое действие

Лимфотоксическое действие

Гиперчувствительность замедленного типа к ЭБ и ДНЮ

Циклические нуклеотиды

Кооперация лимфоцитов

Реакция " трансплантат--против-хозяина"

Выживаемость кожного аллотранс-плантата

Титры

гемагглютининов

функция

сердечного

аллотрансплантата

Розеткообраэущая

способность

лимфоцитов

Бласттрансформация лимфоцитов, стимулированная ФГА

Генерация и активность Т-супрессоров

Активность *цитотоксических Т-эффекторов

'Вирусная инфекция у мышей

Рис.1. МОДУЛЯЦИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА СИНТЕТИЧЕСКИМ АНТИОКСИДАНТОМ ИЗ КЛАССА 5-ОКСИПИРИМИДИНА

2,4,6-тримегил-5-0ксипиримидин0м топм-ш) ш-шшдапя

Влияние ОПМ-Ш на иммунокомпетентные клетки и Таблица 3. их субпо-

пуляции

показатель тесты эффект препарата

Т-клетки Гиперчувствительность замедленного типа,бластогенный ответ на митогены,Е-Р0К,кооперация Т- и В-лимфоцитов ш

В-клетки „ЕМ-РОК, кооперация Т- и В-лимфоцитов,АОК и

Т-хелперы Т-супреесоры

Индукция ^морального ответа , | | i

PET к ФГА,Ё-Р0К-тфр,А0К,кооперация Ш

клеток в иммунном ответе----------

Формирование Т-супрессоров "ин

виво",Кон-А-Т-супрессоры "ин -

витро ,Е-Р0Ктфч

Т-эффекторы Т-киллеры

РГЗТ.РШХ. трансплантационные ,1 _____модели' _ _ ________I.

Цитотоксические тесты,,ЕКК,формирование сенсибилизированных киллеров

Макрофаги Миграция макрофагов,Е-Р0Н,фаго-(нейтрофилы) цитарная активность

Т.о.,в результате проведенных исследований впервые показанов го синтетические антиоксиданты из класса 5-оксипиримидина являются перспективными для целенаправленного поиска новых эффективных им-муносупрессоров. Избирательная супрессия пролиферативной и цито-токсической активности лимфоцитов наилучшим образом может объяснить иммуносупрессивное действие препаратов этого класса.Наряду с подавлением лммунных реакций за счет наличия пиримидино-вого кольца в основе химической структуры этого класса соединений 'по аналогии с антиметаболитами), иммуносупрессия этими препаратами является результатом ингибиции свободно-радикальных процессов.Это приводит к изменению физико-химических свойств ^.биологических мембран лимфоцитов и их биологической активности и обуславливает принципиально новый для иммуносупрессоров механизм действия в многофакторном иммуносупрессивном их эффекте. Тот. фант,что независимо от увеличения дозы препарата ингибирунций его эффект не пре -вышает 35-40% в разных тестах "ин виво" и "ин витро",говорит в пользу последнего.

Влияние этого класса соединений на молукулярный ,клеточ -ный и медиаторный механизш регуляции иммунной системы,в частности через систему циклических нуклеотидов,обеспечивает у них иммуномодулирущие ( и иммуносупрессивные) свойства и делает возможным направленные изменения иммунных реакций.Имму -носупрессоры с таким механизмом действия особенно перспективны в тех случаях,когда имеется ряд противопоказаний для приёма иммуносупрессоров-цитостатиков,таких как заболевания паренхиматозных органов. Выявленный новый иммуносупрессор под шифром ОПМ-1II,является перспективным для клинической проверки.

Помимо синтетических антиоксидантов пиримидинового ряда , исследована группа антиоксидантов растительного происхождения, а именно,стероидных гликозидов ряда фуростана(препарат олиго-фуростанозидов из диоскореи дельтовидной ,Ин-т биохимии им.Баха АН СССР) и 4 препарата ..выделенных из томатов (НИИ экологической генетики АН МССР).Иммуносупрессивная активность этих классов соединений не исследовалась ранее.Методом экспресс-скрининга изучено влияние препаратов на иммунокомпетентные клетки и их субпопуляции в концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл.В качестве тест-препаратов использовали циклосприн А и левамизол.

Выявлен иммуномодулирующий эффект препаратов, • которые в концентрациях от 0,01 до 0,1 мкг/мл оказывали стимулирующее действие,тогда как при концентрациях 1,0-100,0 мкг/мл ингиби-ровали пролиферативный ответ лимфоцитов,усиливали генерацию и активность Т-супрессоров,индуцированных Кон-А.На активность естественных киллеров препараты влияния не оказывали.

Т.о.,среди антиоксидантов растительного происхождения выявлены новые препараты с избирательным иммуномодулирующим действием, конечным суммарным эффектом ко?рого является супрессия иммунного ответа.Также как и синтетические,антиоксиданты растительного происховдения являются перспективными для проведения иммунологического скрининга с целью выявления новых малотоксичных иммуносупрессоров избирательного действия. Эти исследования приоритетны.

Иммуносупрессивные свойства природных биологически активных соединений В настоящее время все более очевидна перспективность проведения иммунологического скрининга среди биологически активных

соединений природного происхождения.Иммуносупрессивная активность естественных для организма малотоксичных веществ,таких как хорионический гонадотропин (ХГ) и гепарин, а также глюко-кортикоиды в низких дозах,исследована в эксперименте (И.В.Петрова и соавт.,1976-1980,В.С.Сускова и соавт.,1976-1982,А.А.Су-здальцева и соавт.,1982 и др.).Продолжается исследование ее -тественной иммуносупрессивной активности плацентарных гормонов и белков (Т.С.Татаринов.И.Н.Головистиков ,1980-1984).

Установлено^Дж.Талвар,1982; Говалло В.И.,1983; Звпдог,1Э82; :e^lгotгa,1982;Matejcic et а1. ,1983;К^г,1984 ) ,что естественная иммуносупрессия при беременности,которая рассматривается как уникальная физиологическая модель трансплантации,достигается по крайней мере тремя путями:1-усилением выброса стероидных гормонов надпочечников,2-временным снижением функциональной активности тимуса, 3- иммуносупрессией -биологически активных веществ, вырабатываемых организмом матери.Плацентарный гаммаглобулин может быть йримером таких веществ и оказался эффективным иммуносупрес-сором у реципиентов с пересаженными почками.

Среди большого количества факторов »обеспечивающих угнетение иммунного ответа материнского организма во время беременности хорионический гонадотропин привлек внимание тем,что его концентрации в крови возрастают в сотни раз в ситуациях,сравнимых с кризами отторжения,такими как угроза выкидышей и преждевремен -ных родов.

При изучении влияния ХГ на клеточный и гуморальный иммуни -тет использован как фармакопейный препарат,так и очищенный от балластных белков гормон.Исследованные дозы сопоставимы с физиологическими концентациями ХГ,определяемыми в крови в разные сроки беременности.Данные,полученные при углубленном изучении имму-носупрессивных свойств ХГ »расширили представление о действии этого гормона на иммунный ответ .ХГ следует рассматривая» как иммрномодулятор.Иммуносупрессивная активность его проявляется в высоких дозах (от 375до 1000 МЕ/мл).В меньших доаах ХГ действует в зависимости от исходного состояния иммунной системы.Эффект ХГ проявляется как на уровне Т-,так и В-клеток,более выражен в условиях антигенной стимуляции.

В результате проведенных исследований выявлены ранее неизвестные особенности влияния ХГ на функциональную активность лим-

фоцитов и их субпопуляции.ХГ оказывает ингибирущий эффект на спонтанные киллеры,предшественники Т-супрессоров и эффекторные клетки (Трз^-эффекторы и индуцированные клетки-киллеры) как в культурах лимфоцитов,так и при введении кивотным(табл.4).

Таблица 4

ШМУНОМОДУШРУЩИЕ СВОЙСТВА Х0РИ0НИЧЕСК0Г0 ГОНАДОТРОПИНА

Ингибирует ин витро: ЕБТЛ на ФГА при высоком индексе стимуляции и не влияет при низком индексе стимуляции, ЕКК,Е-РОК,Т-эффекторы, предшественники Т-супрессоров ин виво : синтез РНК,ДНК,белка в сплено-цитах мышей;киллерный эффект лимфоцитов; РГЗТ;кооперация ____________Т-_и В-лимфоцитов,цАШ? тимуса

не действует на зрелые Кон-А-Т-супрессоры

стимулирует Генерацию Т-супрессоров ин виво и ин витро •

Активирует комплемент по классическому пути

Выявлены некоторые возможные механизмы действия ХГ,такие как конкурентное взаимодействие с рецепторами клеточных мембран лимфоцитов, опосредованное действие через аденилатциклазную систен му клетокСв частости цАМФ).активацию комплемента,что позволяет отнести его к иммуномодуляторам,обладающим избирательным действием на субпопуляции иммунокомпетентных клеток.

Иммуномодулируиций эффект ХГ,выявленный у экспериментальных животных и в тестах"ин витро!!,подтвержден при клиническом применении гормона у больных с облитерирующим эндартериитом в качестве средства,коррегирующего иммунные реакции.

Исходя из того, что ХГ тесно связан со стероидогенезом,является естественным регулятором синтеза стероидных гормонов при беременности ,можно было предположить потенцирующее действие его на иммуносупрессивную активность глюкокортикоидов при их совместном применении. Было впервые показано усиление иммуносупрес -сивной активности при совместном применении этих двух гормонов. Эффект зависел от структуры глюкокортикоидов (табл.5).-наибольший отмечался у дексазона,наименьший -у преднизолона.Терапевтические дозы гормонов при этом могут быть снижены в 2-6 раз. Потенцирующий эф$кт комбинированного применения двух гормонов показан не только в тестах ин витро ( РБТЛ,индуцированная ФГА, ЕКК,КонА-Т-супрессоры),но и при введении животным и на транс..-20

Таблица 5.

Влияние хориониче.ского гонадотропина и глюкокортикоидов на бласттрансформацию лимфоцитов

Концентрация Процент включения 3Н-тимидина по отношению к

ХГ в МЕ/мл _контролю_

Оез пре- предни- гидрокор- ь-метил- декса-

паратов золон тизон преднизолон зон __ __ _ _ _ _

5 82 65 90 55 49

20 51 46 50 20 10

х- стероидные препараты применяли в концентрации 0,1мкг/мл.

Каждая цифра соответствует усредненным величинам 5 опытов.

плантационных моделях.При введении ХГ мышам с кожным аллотран-сплантатом в комбинации с глюкокортикоидами отмечалось не только удлинение сроков выживания трансплантата на 3-4 суток по сравнению с введением отдельных препаратов,но и характер отторжения. Начавшееся острое отторжение при введении ХГ на протяжении нес -кольких дней не прогрессирует и переходит в хроническое.

Эти данные явились обоснованием возможности вклюяения ХГ в комбинированную иммуносупрессивную терапию,с успехом примененную проф.И.Д.Кирпатовским при аллотрансплантации тестикул.

В настоящее время получена бета-фракция ХГ,обладающая имму-номодулирующими свойствами и минимальным гормональным действием. Исследования в этом направлении продолжаются.

В процессе скрининга среди биологически активных природных соединений были выявлены новые иммуномодуляторы,такие ганглиози-ды ,эффект которых зависел не только от происхождения ,но и от структурных различий. Некоторые из них,такие как СМ3,являщиеся основным ганглиозидным компонентом экстраневральных тканей и сы-Еоротки крови,обладали способностью избирательно активировать Т-супрессоры,индуцированные Кон-А; Другие,в частности СД3,характерные для опухолевой ткани,вдвое снижали пролиферативный ответ лимфоцитов в тесте РБТЛ на ФГА и при стимуляции аллогенными клетками.Как было показано ранее,ингибирующий эффект ганглиозидов обусловлен образованием неактивного комплекса с ИЛ-2.В НАСТОЯщее время разрабатывается получение синтетических аналогов ганглиозидов как перспективных иммуномодуляторов (Э.В.Дятловицкая.Л.Д. Бергельсон).

Т.о., в результате проведенных исследований получены новые б^ШЬши некоторых соединений природного происхождения,вырв^ батываемых организмом (ганглиозиды,ХГ,глюкокортикоиды и др) на разные звенья иммунной системы и субпопуляции иммунокомпетен-тных клеток.Эти средства,наряду с другими гормонами, медиаторами и т.д.,могут быть использованы для достижения"физиологи-ческой"иммуносупрессии,разрабатываемой в качестве нового направления. Но вый качественный уровень такого подхода заключается в применении естественных для организма '¡малотоксичных веществ и возможности управления иммунным процессом.Подтверждение ем перспективности такого направления может служить комбинированная иммуносупрессивная терапия глюкокртикоидами,гепарином и хорионическим гонадотропином при пересадке тестикул {И.Д.Кир-патовский и соавт.).

Изучение иммуносупрессивной активности отечественного препарата циклоспоринового ряда

Наиболее перспективными являются исследования,проведенные в последние годы совместно с ВНИИ антибиотиков Минмедбиопрома СССР(член-корр.АМН СССР проф.Л.П.Иваницкая'', М.В.Бибикова.М.К. Кудинова и др.),в результате которых в короткий срок с помощью экспресс-скрининга выявлен отечественный препарат циклоспорином вого ряда.

Циклоспорин А среди новых иммуносупрессоров занимает .особое положение,являясь :препаратом ,индуцирующим избирательную модуляцию определенных субпопуляций иммунокомпетентных клеток (воге1, 1978;ТЛевз.г^ег еЪ а1. ,198о;»Ж1ге et а1. ,1983Г»адко1;1;,1983;11аоа-гхап еЬ а1.,1933;КаЪап,1988> .Он может быть расценен как прототип нового ряда иммуносупрессивных агентов,перспективных для клинического применения. Его открытие подтвердило актуальность и реальность поиска новых средств - иммуносупрессоров избира -тельного действия.

С помощью разработанной во БНИИА трехэтапной системы направленного поиска соединений циклоспоринового ряда-Ш.В.Бибикова, Л.П.Иваницкая) был выявлен отечественный препарат под шифром 2223,иммуносупрессивная активность которого изучена в тестах клеточного иммунитета "ин витро" и "ин виво" и на трансплантационных моделях.

Изучение пролиферативной активности лимфоцитов как в тесте бласттрансформации.так и в однонаправленной смешанной культура показало, что эффект испытуемого препарата зависит от его концентрации .Так при концентрациях от 0,01 до 0,05 мкг/мл препарат не оказывал статистически достоверного влияния на пролиферацию лимфоцитов. 50% ингибиция РБТЛ достигалась 0,1 мкг/мл. При 5 мкг/мл отмечалось практически полное угнетение пролифера-тивного ответа.Аналогичные результаты получены при стимуляции лимфоцитов аллогенными клетками .Эффект исследуемого препарата на пролиферативную активность лимфоцитов был сходен с действием циклоспорина А(ЦА).

Следует отметить,что концентрация препаратов,угнетающая пролиферацию лимфоцитов,зависела от исходной отвечаемости донора. Подавление РБТЛ у доноров с высокой пролиферативной активностью лимфоцитов (индекс стимуляции 30-37) требовало в 3-5 раз больших концентраций препарата,чем у доноров с низкой пролиферативной активностью (индекс стимуляции 7-10).Аналогичный эффект наблюдался и при использовании циклоспорина А.

Активность ЕКК под влиянием как испытуемого препарата,так и циклоспорина А,имела некоторую тенденцию к снижению только при концентрации 50 мкг/мл(Р=0,05).Не было обнаружено существенного влияния препаратов и на активность Кон-А-Тсупрессоров.Исследуемый препарат,также как и ЦА ,в конечных концентрациях от 0,01 до 1,0 мкг/мл не влиял- на генерацию Кон-А-Т-супрессоров.При индуцировании Кон-А-Т-супрессоров в присутствии испытуемого препарата в концентрации 10 мкг/мл отмечалось снижение включения 3Н~ткмидина клетками тест-системы в 2 раза,что могло быть связано с некоторой генерацией Кон-А-Т-супрессоров,как это показано для ЦА.

Исследуемый препарат удлинял срок выживания кожного алло -трансплантата у мышей до 20+0,63. дня при 10-кратном введении с момента пересадки,что на 9 дней больше,чем в контроле.Начало отторжения трансплантата происходило на 8 день после окончания введения препарата.Аналогичные результаты получены в группе животных, получавших циклоспорин А по той же схеме.При гетеротопи-ческой трансплантации сердца у крыс (рис.2),отмечалось увеличение продолжительности функционирования трансплантата в 3 раза по сравнению с контролем (16,63+1,66 и 5+С;5 дня соответственно).

Сравнительное изучение иммуносупрессивного действия

отечественного препарата циклоспоринового ряда(2223) и цд на трансплантационных моделях

Дни после

аллотранан-

лантации<"3'

20 15 10

5

ца

К I

2223

¡3

I

ца

2223

I

Рис.2. Выживаемость кожного Срок функционирования

аллотрансплантата у мышей сердечного аллотрансплан-

тата у крыс

Проведенные исследования показали,что отечественный препарат циклоспоринового ряда по иммуносупрессивной активности не уступает циклоспорину фирмы"Сандоз" и является перспективным для клинического применения.Результаты-исследований включены в материалы доклинической апробации »подготовленные для Фармкомите-та,являющиеся обоснованием для его клинической апробации.

Таким образом, в результате иммунологического скрининга среди производных 5-оксипиримидина выявлен новый иммуносупрессант избирательного действия, показана перспективность поиска новых

иммуносупрессоров среди разных классов антиоксидантов как растительного ,так и химического происхождения.Изучена иммуно-супрессивня активность ряда естественных для организма малотоксичных соединений,которые могут быть средствами для достижения физиологической иммуносупрессии,являющейся качественно новым по; ходом в иммуносупрессии. Выявлен и охарактеризован отечественны! аналог циклоспорина А,перспективный для клинической апробации.

3. ПБЩИПЫ ОПТИМИЗАЦИИ СХЕМ ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ ТЕРАПИИ В КЛИНИКЕ

Создание новых менее токсичных средств и разработка способов избирательной иммуносупрессии для достижения иммунологической неотвечаемости является основным в проблеме преодоления тканевой несовместимости при пересадке органов. В то же время не менее важным остается постоянное совершенствование схем иммуносупрессивной терапии, применяемой в клинике.при алло -

трансплантации (В.И.Шумаков и соавт.,1982; Розенталь Л.Д.,1984, А.М.Сочнев ,1984; О.С.Белорусов и соав.,1988,Дж.Нелиус ,1984; ¿Арзхе et а1.,1984;Ва11агс11е, 1984;1)ироп,1984;Не1<1етал et а1., 1985; Ка1тп,1988).

Современное состояние иммуносупрессии при пересадке органов характеризуется включением в схемы иммуносупрессивной терапии диклоспорина А (ЦА)¿расширившего возможности трансплантологии, то одновременно осложнившего проведение иммунологического контроля за иммуносупрессией в силу его нефротоксичности и связан-шми с эти^деструктивными изменениями в ткани почки,способству-эщими дополнительной активации иммунной системы.

В этих условиях устоявшиеся тесты контроля за иммуносупрес-;ией не всегда коррелируют с нарушением функции трансплантата I адекватностью проводимой терапии.

Поэтому актуальной задачей является разработка новых подходов и методов иммунологического контроля за адекватностью имму-гасупрессивной терапии ,провдения дифференциальной диагностики [езвду нефротоксичностью фризом отторжения ,между нефротоксич-:остью,кризом отторжения и инфекционными осложнениями.

Опыт прошлых лет показывает,что это должен быть комплекс тес-ов,направленных на выявление клеточных взаимодействий при им-унном ответе в условиях аллотрансплантации и проводимой имму-осупрессивной терапии.

Стабильная функция аллотрансплантата не является исчерпыва-щим показателем .характеризующим адекватность иммуносупрессии. а фоне функционирующего пересаженного органа могут развиваться нфекционные осложнения и нарушения,связанные с токсическими про-влениями в результате завышенной иммуносупрессии.

Не опровергая существующие принципы иммунологического контроля (Ю.М.Зарецкая, Л.П.Алексеев, А.М.Сочнев, Г.Н.Дранник,С.Т.Цыганкова и flp.)j сделана поаытка расширить это направление главным образом за счет акцента на раннее выявление побочных эффектов, обычно сопровождающих применение иммуносупрессоров,таких как не-фротоксичность,изменение чувствительности к препаратам,инфекционные осложнения и ряд других,часто связанных с неадекватностью иммуносупрессивной терапии.

В основу контроля за адекватностью иммуносупрессии положен принцип комплексной оценки состояния иммунной системы реципиентов в единстве клеточного и гуморального иммунитета и неспеци -фических факторов защиты. Такой подход с включением нагрузочных проб "ин витро" в отличие от "тестов тревоги",используемых для своевременного выявления криза отторжения, позволяет оценить не только степень иммуносупрессии,но и состояние защитных механизмов ,важных при инфекционных осложнениях и для их диагностики.

Для оценки иммунного статуса реципиентов в динамике до и после аллотрансплантации использованы стандартные тесты,принятые для этих целей в клинических иммунологических лабораториях как в нашей стране, так и за рубежом,при определении количественных и функциональных иммунологических показателей.Разработана карта иммунологического обследования реципиентов и применительно к аллотрансплантации иммунограммы для анализа состояния разных звеньев иммунной системы (рис.3).

В результате динамического наблюдения за иммунным статусом 83 реципиентов с почечным аллотрансплантатом выявлены типичные варианты клеточных взаимоотношений,характерные для стабильной функции трансплантата и адекватной иммуносупрессивной терапии , предкризового состояния и криза отторжения,таких осложнений иммуносупрессии, как нефротоксичность,локальные и генерализованные инфекции .Все реципиенты получали комбинированную иммуносупрессив-ную терапию (преднизолон или метипред,азатиоприн и ЦА) по схемам, принятым в отделении пересадки почки НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ СССР (Э.Р.Левицкий и coàBT.,1976,1977, 1982,1983-1988).При кризах отторжения проводилась пульс-терапия метипредом,АТГ,в отдельных случаях ОКГЗ моноклональным^антителам!-лечебного назначения.

Иммунологические показатели при адекватной иммуносупрес,, сивной терапии ,включающей средние дозы ЦА (6-8 мг/кг/сутки) колебались в пределах колебаний у здоровых лиц и,как правило, сопровождались стабильной функцией аллотрансплантата(рис.З,в).

Состояние иммунной системы при обусловленной ЦА нефроток-сичности,инфекционных осложнениях и предкризовом периоде имели ряд о.бщих закономерностей.Проведение дифференциальной диагностики между этими состояниями весьма сложно,т.к.вызываемые нарушения функции почек не носят специфического характера и зачастую являются результатом смешанного или последовательного патологического йроцесса,усугубляются влиянием других лекарственных зредств. Тем не менее попытки найти новые тесты для такой дифференциальной диагностики не прекращаются.Однако не следует упро-цать такую сложную проблему ,как установление истинной причины нарушения функции трансплантата,особенно в раннем послеопераци-энном периоде,сводить её к постановке одного-двух экспрессных и ^трудоемких тестов.Эти тесты могут быть "тестами тревоги"флу-кить основанием для проведения расширенного комплексного обследования.

Для этих целей могут быть использованы и особенности сдвигов з иммунной системе реципиентов на фоне общих закономерностей , сарактерных для разных посттрансплантационных состояний.К таким особенностям при нефротоксичности следует отнести резкое увели-*ение уровня КЗА к суммарному почечному антигену при снижении активности комплемента и СЗ,умеренную активацию Т-звена (но не 3-звена) иммунитета,увеличение числа розеткообразугацих субпопу-1яций нейтрофилов ( рис.3,А).

"Тестом тревоги" на возникновение (или обострение)инфекцион-шх осложнений служит увеличение числа высокорецепторных субпо-гуляций нейтрофилов (Е-РОН II) при относительно нормальном соот-юшении других исследованных иммунологических показателей,осо-5енно после купирования криза отторжения. При развившемся инфекционном процессе отмечается активация В-звена иммунитета на фо-1е активации других систем иммунитета,возникающей несмотря на доводимую интенсивную иммуносупрессивную терапию (рис.3,Г).

Особенности активации иммунной системы в предкризовый пери->д зависят от характера и тяжести течения криза отторжения ,его сипа.

Рис.3. ВАРИАНТЫ ИММУНОГРАШ.СШТВЕТСТВУЩИЕ СОСТОЯНИЮ ПОСЛЕ АЛЛОФРАНСПЛАНТАЦШ

Вой' Д. , 56 лет.

А. 28 ДЕНЬ

ТИАБ

бета-2-МГ

^ л*

нефроток- сыворотка-

сичность, 1,5 мг/л

остаточные моча -

явления; 8 мг/л без криза

ИС - стандартная

Кон-я ЦА в сыворотке 450 нг/мл

НЕФРОТОКСИЧВОСТЬ

НЕАДЕКВАТНОСТЬ

ИШУНОСУПРЕССИИ

Б.35 ДЕНЬ

ТИАБ

бета-2-МГ

подозрение сыворотка-на инфек - 5,8 мг/л

цию,без криза

моча -50 мг/л Кэ=9,2

ИС - стандартная Кон-я ЦА в сыворотке 75 нг/мл

КРИЗ ОТТОРЖНИЯ

с В. 47 ДЕНЬ

ТИАБ

бета-2-МГ

ИС - интенсивная с 40 дня с включением МП и АТГ

Г. 54 ДЕНЬ

диагносци- сыворотка

рованный 14 мг/л

на 40 день моча -

криз купи- 10 мг/л рован

КШЗ КУПИРОВАН

ТИАБ

бета-2-МГ

без криза

сыворотка-9,0 мг/л моча-5,6мг/

ИС - стандартная

Кон-я ЦА в сыворотке 100 нг/мл

ИНФЕКЦИЯ

Для подтверждения выявленных закономерностей был проведен ретроспективный анализ результатов иммунологического обследования, клинических и патоморфологических данных 18 реципиентов, которым по разным причинам был удален трансплантат.Согласно клиническим данным такими причинами нарушения функции почки были:1/ острая почетная недостаточность или разрыв трансплантата,- 2/ некупирующийся острый криз отторжения, 3/хронический криз отторжения на фоне локальной инфекции, 4/хронический криз отторжения на фоне генерализованной инфекции.

В случаях острой-почечной недостаточности и разрыва трансплантата изменения в иммунной системе соответствовали изменениям, обусловленным деструктивным нарушениям ткани пересаженной почки. Отмечалось снижение активности комплемента и СЗ в 1,5.1 раза, повышение уровня КФА к суммарному почечному антигену до 1,4-1,бед.(в норме 0-0,2 ед.),увеличение в 2 раза числа нейтро-филов,способных к розеткообразованию.из которых 50% имело бы -сокую плотность рецепторов к маркерам.Состояние Т- и В-звена иммунитета было адекватно стандартной иммуносупрессивной терапии, включающей меткпред,азатиоприн и ЦА (сандкммун),у ряда больных отмечалась умеренная активация Т-звена иммунитета.Соответственно при морфологическом исследовании удаленного трансплантата определялась умеренная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация преимущественно периваскулярной ткани и стенок кровеносных сосудов в юкстамедулярной зоне мозгового вещества,деструктивные изменения в зоне коркового вещества при отсутствии какой-либо местной клеточной реакции.

В тех случаях,когда острая недостаточность трансплантата не заканчивалась разрывом трансплантата и,несмотря на активную им-муносупрессивную терапию,развивался острый криз отторжения, в предкризовый период ,как правило, определялись описанные выше иммунологические ' отклонения в сочетании с активацией Т-клеточ-ного звена с возрастанием количественных параметров и функциональной активности Т-лимфоцитов и их субпопуляций.Активация В-звена иммунитета для этого состояния была нехарактерной^1^.5,

Развившийся острый криз отторжения сопровождался резким снижением количества иммунокомпетентных клеток и их субпопуляций в периферической крови. При некупирующемся кризе отторжения даже на фоне интенсивной иммуносупрессивной терапии наблюдается

активация всех звеньев иммунной системы и снижение активности системы комплемента.Количественные показатели Т- и В-лимфоци-тов и их субпопуляций увеличивается в 2-2,5 раза по сравнению с нормальным уровнем.При микроскопическом исследовании удаленных трансплантатов обычно наблюдается слабо выраженная иммуно-клеточная реакция и наличие признаков обычного воспалительного процесса в виде обширных интерстициальных инфильтратов из сег-ментоядерных лейкоцитов,острого нарушения микроциркуляции•и ди-строфически-некробиотических изменений паренхимы.

Длительно текущие хронические кризы с вялой функцией алло -трансплантата в условиях интенсивной иммуносупрессивной терапий в ряде случаев, сопровождаются обострением или присоединением локальной инфекции (нагноение гематомы в трансплантационном ложе, абсцедирование трансплантата и др.) или генерализацией внепоче-чной инфекции,приводящей к сепсису и интоксикационному синдрому. У таких больных на высоте обострения инфекционного процесса отмечается активация неспецифических факторов защиты в виде повышения активности комплемента и ■ СЗ в 1,5-2 раза,увеличение числа розеткообразунцих субпопуляций нейтрофилов,фагоцитоза с одновременным увеличением числа В-лимфоцитов и уровня сывороточных Iжму ноглобулинов класса М и 6.Число Т-лимфоцитов и их субпопуляций, несмотря на интенсивную терапию также возрастает.

При морфологическом исследовании трансплантатов обнаруживалось сочетание лимфо-гистиоцитарной инфильтрации с примесью сег-ментоядерных лейкоцитов и глубоких некробиотически-дистрофичес-ких изменений канальцевого эпителия. В случае развития сепсиса и интоксикационного синдрома определяются признаки истощения иммунной системы.Количественные показатели Т- и В-систем иммунитета, активность комплемента и СЗ были снижены в 3-4 и даже 5 раз. В таких случаях при паталогоанатомическом исследовании определя -лись признаки гипоплазии костного мозга и лимфатического аппарата селезенки, а в случае наличия гнойных очагов в пересаженной почке ,явления гнойного расплавления ткани трансплантата на фоне изменений, соответствующих хроническому отторжению или неспецифическому склеротическому процессу.

Таким образом, в результате сравнительного анализа иммунологических и морфологических данных,была подтверждено соответствие выявленных закономерностей различным пострансплантационным состояниям . 30

При индивидуализации схем иммуносупрессии при аллотранспланта-ции органов особые треббвания предъявляются к глюкокортикоидам, эффективность лечения которыми должна быть гарантирована не только потому, что они являются базисными препаратами в схемах иммуно-супрессивной терапии в клинике,но и в связи с тем ,что это препараты выбора при лечении криза отторжения.

Поэтому перед началом лечения необходимо выяснить индивидуальные особенности иммунологического фона,на котором будет начата стероидная, терапия.Особенно это касается количественных соотно -шений стероидрезистентных и стероидчувствительных субпопуляций и характера чувствительности лимфоцитов реципиента к глюкокортикоидам,что также является важным фактором снижения побочного их действия и токсических эффектов.

Для определения чувствительности лимфоцитов к глюкокортикоидам могут быть использованы разные тесты "ин витро",позволяющие оценить их функциональное состояние и количественные соотношения при обработке разными концентрациями препарата.Так используют лимфотокси-ческие свойства глюкокортикоидов,способность их снижать пролифера-тивную активность лимфоцитов в тесте неспецифической бласттранс-формации,индуцированной ФГА,или в условиях аллогенной стимуляции АГ донорского генотипа в МЬС.

Нами предложен дополнительный метод определения чувствительности лимфоцитов к ГКК,коррелирующий с ингибицией пролиферативной активности и лимфо литическим действием гордонов. Метод ос-

нован на модификации ГКК экспрессии рецепторов к ЭБ на мембране Т-лимфоцитов,определяемую в тесте розеткообразования.Преимущество метода в том, что оценка кортизолчувствительной популяции лимфоцитов проводится одномоментно с определением иммунного статуса(не требуется специальных исследований) включением в спектр иммунологических тестов нагрузочных проб на ГКК.Метод прост(не требуется стерильных условий и импортных реактивов) и экспрессен (ответ может быть дан в тот же день)учитывается не только ингибиция,но и стимуляция экспрессии рецепторов к ЭБ.

Критерием снижения чувствительности лимфоцитов к ГКК явилось уменьшение ингибирующего действия препарата (менее 50по сравнению с максимальным эффектом).Выявлена четкая зависимость между дефицитом- Т-лимфоцитов и степенью снижения чувствительности их к ГКК.

Не менее важным является и индивидуальный подход при назначении ЦА (сандиммуна),который в настоящее время строится на выборе начальной дозы препарата и его фармакокинетике.Следует подчеркнуть,что пределы терапевтических и токсических доз ЦА близки.Как и при приеме других иммуносупрессоров ,приходится балансировать мевду иммуносупрессией и токсичностью,что требует строгого количественного контроля за его концентрациями в крови.Самым трудным при лечении ЦА является дифференциальная диагностика между кризом отторжения и обусловленной препаратом нефротоксичностью.Нами впервые для этих целей применен метод одномоментного определения концентрации бета-2-микроглобулина (МГ) в моче и сыворотке реципиентов.При этом проводится дифференциальный диагноз преимущественного поражения клубочков или канальцев почечного аллотрансплантата (или собственной почки). Повышение концентрации бета-2-МГ только в моче свидетельствует о нормальной фильтрационной функции трансплантата (ФСК) и остром поражении почечных канальцев (ОКН),причиной которой может быть применение ЦА.Повышение концентрации бета-2-МГ только в сыворотке крови указывает на поражение клубочков и нарушение ФСК,что наиболее типично для острого криза отторжения.Повышение концентрации бета-2-МГ одновременно в моче и сыворотке свидетельствует об одновременном нарушении клубочковой и канальце -вой функции почек.

Таблица 6.

Определение уровня бета-2-микроглобулина в сыворотке и моче реципиентов с почечным аллотрансплантатом

Б - ой ! З'ровень бета-2-микроглобулина,мг/л ! Примечание

1 в сыворотке ! в моче Кэ г

до АТ 3,5-6,0 ! — хпн

Т-ов У,4Ь ! 1 1,38 ! 0,85 ! 1,08 ! нет 18,5 14,5 18,5 7,6 17,0 18,0 адекватная доза ЦА доза токсична токсичность на растает,дозу снижать

П-о 3,75 ! 4,38 ! 7,8 ! ооо 0,15 0,1 0,09 предкризовое состояние

Вводимое понятие о"коэффициенте экскреции"(Кэ),отражающем отношение концентрации бета-2-МГ в моче к концентрации его в сы-

воротке ,позволило выявить типичные варианты,характерные для нефротоксичности ЦА,криза отторжения и промежуточных состояний (табл.6).Так,при Кэ большем 1,5 делается заключение о токсическом синдроме,при Кэ меньшем 0,5 - о предкризовом состоянии,при Кэ=1,0+0,5 проводится индивидуальный анализ с учетом клинических и других данных.

Динамика бета-2-МГ в сыворотке крови и моче коррелировала с клиническими проявлениями и концентрацией ЦА в сыворотке.Метод может быть использован как при аллотрансплантации почек,так и других органов,в частности,сердца,при которых в комбинированной иммуносупрессивной терапии используется ЦА.

Кроме того, проведенные исследования подтвердили полученные рядом авторов данные о(!корреляции между ранней нормализацией уровня бета-2-МГ в сыворотке реципиентов после пересадки почки с высокой выживаемостью трансплантата,что может служить прогностическим тестом.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлены подтвержденные патоморфологически (А.Е.Иванов и соавт.) параллели между иммунологическими данными и клиническими и лабораторными показателями состояния реципиента и аллотрансплантата.Характер изменения соотношения иммунокомпетентных клеток и показателей неспецифической защиты в динамике может служить ориентиром для суждения о направленности патологического процесса при нарушении функции трансплантата и успешно использоваться в комплексном обследовании реципиентов при пересадке почки и других органов. Выявлены параллели между клиническим эффектом ЦА и иммунологическими показателями при применении средних и низких доз препарата.Показана необходимость! комплексной оценки состояния иммунной системы как для дооперационной подготовки реципиента с включением иммунокоррегирующих мероприятий,так и выбора индивидуальных режимов иммуносупрессивной терапии и комплекса методов иммунологического контроля за адекватностью её в послеоперационный период.

ВЫВОДЫ

I. Разработан и внедрен комплексный метод экспресс-скринин-,позволяющий в короткий срок и с использованием минимальных ко-честв препарата оценить токсичность .иммунологическую активность избирательность действия испытуемых.средств,что весьма важно я оценки перспективности дальнейшего их синтеза. 33

2. В результате такого подхода среди известных классов иммуносупрессоров и новых классов веществ химического и природного прдисхождения отобраны и охарактеризованы как перспективные следующие препараты: антиоксиданты из класса 5-оксипи-римидина с принципиально новым для иммуносупрессоров механизмом действия,стероидные гликозиды,хорионический гонадотропин и, как наиболее перспективный,отечественный препарат циклоспори-нового ряда-

3.ВперЕые изучены иммуносупрессивные свойства пяти новых производных 5-оксипиримидина,активность которых связана с модификацией структуры и функции биологических мембран лимфоцитов. Показано,что наиболее эффективный из них иммуносупрессор под шифром ОПМ-Ш избирательно угнетает активность Т-хелперов,цито-токсических лимфоцитов и Т-клеток-эффекторов ГЗТ,не влияет на Т-супрессоры, удлиняет приживление кожного лоскута у мышей в 2,5 раза,функцию гетерогенного сердечного аллотрансплантата в

4 раза по сравнению с контролем,задерживает развитие вирусной инфекции у мышей.Новый иммуносупрессор перспективен для клинической проверки при аллотрансплантации органов.

4. Выявлены ранее неизвестные особенности влияния хориони-ческого гонадотропина на иммунный отиет,которые позволяют рассматривать его как иммуномодулятор. Иммуносупрессивная активность препарата проявляется в высоких дозах,в меньших дозах он действиует в зависимости от исходного состояния иммунной системы.Эффект гормона проявляется как на уровне Т-,так и В-клеток более выражен в условиях АГ-стимуляции.Он оказывает действие

на Т-хелперы,£КК,Т-клетки-эффекторы,снижая их активность,стимулирует генерацию Т-супрессоров. Впервые в тестах клеточного и гуморального иммунитета показан синергизм действия глюкокорти-коидов и хорионического гонадотропина, что послужило основанием для включения их в комбинированную иммуносупрессивную терапию при трансплантации эндокринных желез.

5. Впервые проведен иммунологический скрининг среди отечественных препаратов циклоспоринового ряда.Выявлен препарат,который оказывает избирательное действие на Т-хелперы и Т-эффек-торы,угнетает трансплантационный иммунитет на моделях"ин ви-тро" и "ин виво" аналогично циклоспорину А фирмы"Сандоз" и является перспективным для клинического применения иммуносупрео-сором,

3<

6. Намечены пути оптимизации схем иммуносупрессивной тера-таи в клинике. В основу* контроля за адекватностью иммуносупрес-:ии положен принцип комплексной оценки состояния иммунной сис-гемы реципиента с включением нагрузочных тестов и тестов на индивидуальную чувствительность к препаратам,который обеспечиЕа-эт эффективность иммунологического контроля при транспланта -дии почки и других органов.

7. Определены варианты клеточных взаимоотношений ,типичных уш стабильной функции трансплантата и адекватной иммуносупрес-1иеной терапии,предкриз0Е0Г0 состояния и криза отторжения,та -<их осложнений,как нефротоксичность, локальные и генерализованные инфекции,а также промежуточных состояний. Характер изменения соотношения иммунокомпетентных клеток и показателей неспецифя-веских факторов защиты в динамике могут служить ориентиром для :уждения о направленности патологического процесса при нару -зенип функции аллотрансплантата и успешно использоваться в комплексном обследовании реципиентов при пересадке органов. Для ¡Еоевременной диагностики инфекционных осложнений после интен-:ивной иммуносупрессивной терапии и купирования криза отторжения обязательно проведение расширенного иммунологического обсле-ЮЕания реципиентов.

8. Выявлены закономерности сдвигов иммунокомпетентных и им-¡унорегуляторных субпопуляций лимфоцитов при средних дозах ци-глоспорина А(сандиммуна) в условиях комбинированной иммуносупрес-'.ивной терапии при аллотрансплантации почки,которые наряду с :линическими данными, результатами тонкоигольной биопсии и дру-•ими исследованиями являются обоснованием целесообразности та-:их дозовых режимов препарата.

9.Разработаны и внедрены дополнительные методы оценки чувствительности лилфоцитов к глюкокортикоидам,основанные на способности их модифицировать рецепторы клеточных мембран к мар-:ерам,а также способ определения нефротоксичности циклоспорина ю комплексной оценке канальцевой и клубочковой функции почки или почечного трансплантата) с помощью бета-2-микроглобулина, 'аработанные методы расширяют возможности своевременной диагностики осложнений и оптимизации схем иммуносупрессивной терапии.

10. В основу оптимизации иммуносупрессии при аллотрансплан-тации положено два основных принципа: I- создание новых менее токсичных иммуносупрессоров избирательного действия и 2- дальнейшее совершенствование схем иммуносупрессии,.. методов своевременной диагностики осложнений и оценки адекватности иммуносупрессивной терапии. Полученные новые данные об иммуносупрессивной активности ряда соединений эндогенного происхождения позволили рекомендовать их в качестве средств для осуществления "физиологической" иммуносупрессии,разрабатываемой в плане нового направления.Новый качественный уровень такого подхода заключается в применении естественных для организма мало то кскчнкх веществ 'и возможности управления иммунным ответом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный экспресс-скрининг новых иммуносупрессантов (И иммуномодуляторов) следует использовать при наличии малых количеств препарата и необходимости быстрого заключения о его активности.

2. Поиск новых иммунологически активных соединений целесообразно продолжить среди антиоксидантов химического и природного происхождения,продуктов мицелия грибов,а также соединений эндогенной природы.

3. Разработанные дополнительные методы оценки чувствитель -ности к глюкокортикоидам и нефротоксичности циклоспорина могут быть использованы как при трансплантации почки,так и других органов.

4.Варианты иммунограмм, характерные для разных клинических состояний при пересадке почки,могут служить ориентиром для суждения'; направленности патологического процесса при нарушении функции аллотрансплантата и успешно использоваться в комплексном обследовании реципиентов при аллотрансплантации разных органов.

5. Для своевревременной диагностики инфекционных осложнений после интенсивной иммуносупрессивной терапии и купирования криза отторжения следует обязательно проводить расширенное иммунологическое обследование реципиентов.

6. При выборе индивидуальных доз циклоспорина в начале лечения следует учитывать уровень исходного иммунного ответа на ми-тогены и аллогенную стимуляцию.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Иммунотропная активность новых производных оксипиримидина // //Фармакл токе.-1979.-№4.-С.413-417 (Авт.В.С.Сускова, Л.М.Му-ховатова, Л.В.Сутшева, Р.Д.Сейфулла).

Selective suppression of cell immunity by derivatives of hydroxypyrimidine //1Y Internat. Congress Immunology.-Paris, 1980.-P.34-57 (V.S.Suskova, V.N.Petrosova, D.L.Beljaev). Сравнительное изучение ингибиции ФГА стимулированной трансформации лимфоцитов различными глюкокортикоидами //Деп. ВИНИТИ-1980.-№12 б/о 132'(Авт.Сускова B.C.,Муховатова Л.М.,Сейфулла Р.Д., Сутюшева Л.В.)

Закономерности распределения и выведения АЛГ и АТГ из организма при однократном и многократном введениях (экспериментальное исследование)// В кн. Трансплантология и искусственные органы. -М.,1981.-С.45-48. (Авт.Емец В.И.,Сускова B.C.). Поиск иммунореактивных препаратов избирательного действия в ряду производных 5-оксипиримидина. // Матер. 8 съезда фармакологов.--Ереван, I982.-C.II8-I2I. (авт.Сускова B.C., Гашев С.Б., Петро-йова В. Н. .Мацуленко E.H. и др.)

Совместное действие глюкокортикоидов и хорионического гонадо-тропина на активность Т-лимфоцитов в эксперименте ин виво и ин витро //Матер. III Всес. симпозиума по регуляции иммунного го-меостаза.-Ленинград, 1982.-С.54-55. (Авт. Муховатова Л.М., Сускова B.C., Сутюшева Л.В., Шальнев Б.И.). Новые подходы к применению кортикостероидов при аллотрансплан-гации // В кн."Вопросы трансплантологии и искусственных органов", ч -M.1982.-С.66-69 (Авт. Сускова B.C., Шальнев Б.И.). Закономерности распределения и выведения гамма-фракции АЛГ (экспериментальное исследование) // В кн. "Проблемы трансплантологии и искусственных органов". М.,1983.-0.60-62 (Авт.Емец В.И., Сускова B.C.).

Влияние хорионического гонадотропина на некоторые показатели иммунного ответа у больных с облитерирующим эндартериитом // В кн. "Проблемы трансплантологии и искусственных органов",-М., 1983.-С.73-74 (Авт. Сускова b.c., Муховатова Л.М., Сутюшева Л.В., Мкервали Н.Г.).

Иммунорегуляторное действие дипразина // В кн. "Трансплантология и искусственные органы.-M.1984.-С.69-71. (Авт. Сускова B.C., Мацуленко E.H.). 37

11. К вопросу о рациональных схемах применения глюкокортикоидов при аллотрансплантации почки // Матер. III Всес.симпоз. по пересадке почки.-Рига.-С.84-86.(Авт.Сускова В.С.,Шальнев Б.И.)

12. Effect of the chorionic gonadotrophin on immune response //Amer.J.Reproduction Immunol, a. Microbiology.-1985.-vol.17.■ abstr.71 ( B.I.Shalnev.V.S.Suskova.O.A.Gotseridze).

13. Иммуносупрессия при аллотрансплантации органов // Аналитичесга обзор ВНИИМИ серия хирургия.-1985.-86с. (Авт. Шальнев Б.И., Сускова B.C.,Петросова В.Н.).

14. Влияние ганглиозидов сМ^ HG Дд на активацию Т-супрессоров человека лектинами //ДАН СССР.-1966.-т.288.~J?6,-СЛ497-1500 (Авт.Дятловицкая Э.В.,Сускова B.C.,Емец В.И..Бергельсон Л.Д.),

15. Механизмы иммунорегуляторного действия хорионического гонадо-трогшна // В кн. Нейро-гуморальная регуляция иммунного гомео-стаза.Матер.1У Всес.симпозиума "Регуляция иммунного гомеостаз! -Л.-1986.-С.68-69 (Авт. Сускова B.C..Сутюшева Л.В.,Суздальцев; А.А..Рахманова Г.А., Емец В.И.).

16. Неспецифическая иммунотерапия 2,4,6-триметилоксипиримидином (ОПМ-III) при инфекции мышей //Антибиотики и медицинская биотехнология.-1986.-№12.-С.914-917 (Авт.Раковс: И.В., Беляев Д.Л.,Сускова В.С.,Смирнов Л.Д.,Ахмедов Э.Ф.).

17. Hew immunorefeulation from a class of 5-hydroxypyrimidines //Abstracts, .¿th Cyprus Conference on a new Methods in drug Research. Limassol.-1987.-P.29-51 (V.S.St^skova.E.M.Matzulenkc S.V.Gasev, L.D.Smirnov.B.I.Shalnev.E.F.Achmedov).

18. Иммуносупрессивные свойства хорионического гонадотропина и ег использование в комплексной иммуносупрессивной терапии при пересадке яичек // Урология и нефрология.-1987.-№3.-С.50-53 (Авт.И.Д.Кирпатовский, С.С.Гамбаров, А.А.Суздальцева ,Г.А.Pax манова, B.C.Сускова, В.И.Емец).

19. Влияние гликосфинголизидов на бласттрансформацию и активацию Т-супрессоров человека // Иммунология.-1987.-Ji6.-С. 69-72 (Авi Э.В.Дятловицкая, В.С.Сускова, В.И.Емец, А.Б.Королёва,Б.И. Шальнев, Л.Д.Бергельсон).

20. Модуляция иммунного ответа мембраноактивными соединениями //тезисы научных докладов и сообщений I болгаро-советского симпозиума "Свободные радикалы и биостабилизаторы, София // 1987.-С.133 (Авт. B.C.Сускова, Е.Н.Мацуленко, Л.Д.Смирнов,

С.Б.Гашев, Б.И.Шальнев). . Модудяция иммунного Ответа синтетическими антиоксидантами из класса 5-оксипиримидина //В кн. Актуальные вопросы иммунофар-макологии.-М,-,1987.-С.47-59 (Авт.В.С.Сускова, Е.Н.Мацуленко, С.Б.Гашев, Л.Д.Смирнов). , Современные направления иммуносупрессивной терапии // В кн. Актуальные вопросы иммунофармакологии.-М.,I987.-C.I8-2I (Авт. В.С.Сускова).

, Иммунологические и морфологические параллели при нарушении функции почечного "аллотрансплантата // В кн. Трансплантация и искусственные органы.-М.-,1988.-С.53-56 (Авт.В.С.Сускова, Н.П.Теплякова, О.Ю.Арапова, Л.А.Макарова,Ю.В.Перекосова, В.В.Тырин).

. Оценка адекватности иммуносупрессивной терапии у больных с почечным аллотрансплантатом.//В кн.Актуальные вопросы трансплантологии и искусственных органов.-М.,1989.-0.47-51 (Авт.

B.С.Сускова,В.И.Емец,Е.Н.Мапуленко,Л.П.Ермакова,В.Н.Петросова).

, Оценка нефротоксичности циклоспорина А по уровню ^-микроглобулина в сыворотке и моче больных с почечным аллотрансплантатом //В кн."Трансплантология и искусственные органы".-М.,1988,-

C.8I-84 (Авт.Сускова В.С.,Емец В.И.,Мацуленко Е.Н.,Ахмедов Э.Ф.). . йглунокоррекция при иммунопатологических состояниях в клинике

//Аналитический обзор ВНИИМИ серия Медицинская генетика и иммунология. -1988.-№ 2.-80с. (Авт. Б.И.Шальнев, В.Н.Петросова, B.C. Сускова).

Chorionic gonadotropin:Effect on limphocyte subpop ulatinn // J. Internal.Symposium on Immunology of Beproduction.Abstracts.-Varna.-Bulgaria.-1988.-P.69-72 (V.S.Suskova.L.V.Sutjusbeva,V.I. Emets,A.A.Suzdaltseva,G,A.Rakhmanova, B.I.Shalnev).

Влияние нового отечественного препарата из класса циклоспорина на субпопуляции лимфоцитов // Тезисы 9 конференции "Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях.-Челябинск.-1988.-С.35-38 (Авт. В.С.Сускова, Л.В.Сутюшева, Л.П.Иваницкая, Б.И.Шальнев). Immunomodulation by membranoactive 5-hydroxypyrimidine derivatives // Abstracts 2nd Symposium on current problems in testing and evaluation of experimental and clinical effects of immunomodulators., Kosice, Czechoslovakia.-1988,-P.(V.S.

Suskova,E.M.Mat sulenko,В.X.Shalnev,S.B.Gashev, L. D.Smirnov, V.H.Petrosova).

30. 0 возможности включения хорионического гонадотропина в схему иммуносупрессии при аллотрансплантации //Хирургия.-1988.3 -C.I54-I55. (Авт. Сускова B.C.,Сутюшева Л.В.,Ыацуленко E.H., Шальнев Б.И.).

31. Иммуносупрессивные свойства отечественного препарата циклосп ринового ряда.// Гематология и трансфузиология.-1988.-К» 10.-С. 23-32.(Авт. Б.И.Шальнев, В.С.Сускова, Л.В.Сутюшева,В.И. Емец, Л.П.Иваницкая).

32. Иммуномодуляция новыми производными 5-оксипиримидина.// Хирургия. -1988.-№ II.-С.153-156. (Авт.В.С.Сускова, Е.Н.Мацулек Б.И.Шальнев, Л.Д.Смирнов).

33. Phytoimmunoiaodulatora of Oioscorea Deltoidea cellular eesper sion culture //Abstracts. 4-th. Cyprus Conference on Hew methc in drug Research.Cyprus.-1989.-P.(V.S.Suskova, B.I.Shalne V.l.Emets, E.H.Matzulenco, V;A. Paseshnichenko).

34. Модуляция иммунного ответа антиоксидантами и другими мембра) активными соединениями // Хим.фарм.ж..-1989.2.-С.103-106 (Авт.Л.Д.Смирнов, В.С.Сускова).

35. Первичный экспресс-скрининг иммуномодуляторов химического и природного происхождения. Методические рекомендации // М.-198Э.-29с. (Авт.В.С.Сускова,Е.Н.Мацуленко,Б.И.Шальнев,Л.В. Сутюшева,Л.Д.Смирнов).

36. Средство, обладающее иммунодепрессивным действием.Авторское свидетельство № 933096 //Бюлл.Изобр.-1982.-№ 21 (авт.В.И.Шу маков, Р.Д.Сейфулла,Л.Д.Смирнов, В.С.Сускова и др.).

37. 2- Зт-метоксифенил-4,6-диметил-5-оксипиримидин, обладающий иммуномодулирущим действием. Авторское свидетельство

№ 1252915 // Бюлл.Изобр.-1984,-J» 6. (Авт.Л.Д.Смирнов, Б.И. Шальнев, С.Б.Гашев, B.C.Сускова, Е.Н.Мацуленко).

38. Влияние отечественого препарата циклоспоринового ряда на выживаемость аллотрансплантатов //В кн. Актуальные вопросы сплантологии и искусственных органов.-М.,-1989.-С.87-91. (Авт. Шальнев Б.И., Сускова B.C., Сутюшева Л.В., и др.).

39. Иммунокоррекция при иммунопатологических состояниях в клик //Аналитический обзор ВШИМИ серия иммунология.-М.,-1988,-80с. (Авт. Б.И.Шальнев, В.Н.Петросова, В.С.Сускова).