Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМНОЙ ОЗОНОТЕРАПИИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ И ПРОФИЛАКТИКЕ ИНФИЦИРОВАННОГО ПАНКРЕОНЕКРОЗА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

На правах рукописи

ЦЕДРИК НИКОЛАЙ ИГОРЕВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМНОЙ ОЗОНОТЕРАПИИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ И ПРОФИЛАКТИКЕ ИНФИЦИРОВАННОГО ПАНКРЕОНЕКРОЗА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 1 МАР 2013

Красноярск - 2013

005050857

Работа выполнена на кафедрах общей хирургии и патологической анатомии им. проф. П.Г. Подзолкова ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.

Научный руководитель

кандидат медицинских наук, доцент

Научный консультант

кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

Теплякова Ольга Валериевна Шестакова Людмила Анатольевна

Сухорукое Александр Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» СО РАМН, хирург-консультант.

Волков Юрий Михайлович, доктор медицинских наук, НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Красноярск ОАО «РДЖ», заведующий хирургическим отделением №1.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации».

Защита диссертации состоится «09» апреля 2013 г. в 10 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.02, созданного при ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, по адресу: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России по адресу: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д, 1.

Автореферат разослан « ^^ » "-¿г- 2013 г.

Учёный секретарь ' У '

диссертационного совета, ' £'¿¿-е-^^¡Ое^.---

кандидат медицинских наук,

профессор Кочетова Людмила Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Острый панкреатит остается одной из самых актуальных проблем современной хирургии, стабильно занимая второе-третье, а в ряде регионов России - первое место в структуре неотложной абдоминальной патологии (Благовестнов Д.А. с соавт., 2004; Савельев B.C. с соавт., 2008; Ермолов A.C. с соавт., 2009; Афанасьев А.Н. с соавт., 2010). Деструктивная форма заболевания до настоящего времени удерживает лидирующую позицию среди причин летальности при острой хирургической патологии органов брюшной полости (Бурневич С.З. с соавт., 2005; Гальперин Э.И., 2007; Балныков С.И. с соавт, 2010; Тарасенко B.C. с соавт., 2013).

Несмотря на достигнутые в последние десятилетия успехи в области изучения патогенеза, стандартизации терминологии, диагностики и тактики при этом заболевании, большинство исследователей в качестве результата единодушно отмечает лишь произошедшее перераспределение летальности из группы ранней -от органной дисфункции - в группу поздней - от септических осложнений (Гучев И.А. с соавт., 2007; Ермолов A.C. с соавт., 2007; Кондратенко П.Г. с соавт., 2009; Власов А.П. с соавт., 2010; Bakoyiannis А., 2010). Инфекционные осложнения, сопровождающие течение панкреонекроза у 16-47% больных, до настоящего времени обусловливают до 80% всех летальных исходов заболевания (Гостищев В.К. с соавт., 2003; Дэллинджер И.П., 2003; Добровольский С.Р. с соавт., 2004; Григорьев Е.Г. с соавт., 2010; Ahmad H.A. et al., 2011; Lankish P.G. et al., 2012).

Одной из наиболее актуальных проблем ургентной панкреатологии остается совершенствование методов оценки тяжести деструктивного панкреатита и прогноза его исхода (Вашетко Р.В. с соавт., 2000; Буткевич А.Ц. с соавт, 2007; Ярема И.В., 2009; Méntula P. et al., 2005; Anderson В. et al., 2011). Несмотря на широкое распространение интегральных многопараметрических систем, разработанных как специально для оценки тяжести острого панкреатита, так и неспецифических, а также наличие лабораторных критериев бактериального инфицирования при панкреонекрозе, течение последнего до настоящего времени остается мало предсказуемым (Багненко С.Ф. с соавт., 2006; Лебедев Н.В. с соавт., 2006; Пугаев A.B. с соавт., 2007; Кубышкин В.А. с соавт., 2012). В значительной степени это связано с недостаточной информативностью и малой специфичностью существующих предикторов на ранних фазах течения заболевания (Литвин A.A., 2009; Шугаев А.И. с соавт., 2009; Riche F.C. et al., 2003).

Известно, что прогрессирующая гипоксия и связанная с ней гиперактивация свободнорадикального окисления на фоне недостаточности антиоксидантной системы играют ключевую роль в механизмах развития патологического процесса при остром панкреатите (Винник Ю.С. с соавт., 2002; Пачечник И.Н., 2004; Ершов A.B., 2007; Орлов Ю.П. с соавт., 2010; Leung P.S. et al., 2009; Col С. et al., 2010). Несмотря на доказанную эффективность окислительных методов, в частности, озонотерапии, в лечении ряда заболеваний, механизмы подобного воздействия в условиях оксидативного стресса остаются дискутабельными (Конторщикова К.Н., 2004; Torossian A. et al., 2004; Silva R.A. et al., 2009; De Souza Y.M. et al., 2010; Bocci V. et al., 2011). При существующем многообразии средств и способов озонотерапии их выбор, в том числе, у больных острым панкреатитом, до настоящего времени осуществляется эмпирически (Якимов C.B., 2002; Алехина

С.П. с соавт., 2003; Анчиков Г.Ю., 2005; Портнягин Е.В., 2010; Щербатюк Т.Г., 2010).

Все сказанное выше послужило основанием для поиска новых возможностей комплексной диагностики и патогенетической терапии острого панкреатита.

Цель исследования: улучшение результатов профилактики и лечения инфицированного панкреонекроза.

Задачи исследования:

1. Разработать способ моделирования первично инфицированного панкреонекроза у экспериментальных животных - кроликов.

2. Изучить системные эффекты интраперитонеального введения озоно-кислородной газовой смеси в норме и при развитии инфицированного панкреонекроза в эксперименте.

3. Определить активность парамагнитных центров метгемоглобина, трансферрина, церулоплазмина крови больных тяжелыми формами острого панкреатита.

4. Оценить исходное функциональное состояние лейкоцитов крови больных стерильным и инфицированным панкреонекрозом.

5. Оптимизировать алгоритм патогенетического лечения больных тяжелыми формами острого панкреатита и определить его эффективность.

Научная новизна исследования

Разработан способ моделирования первично инфицированного панкреонекроза у экспериментальных животных-кроликов, основанный на механической травматизации ткани железы и интрапаренхиматозном введении аутожелчи и взвеси клинического штамма Ас1пе1оЬас1ег Ьаитаппи.

В эксперименте исследованы системные эффекты интраперитонеального введения газообразного озона в норме и в условиях оксидативного стресса при деструктивном панкреатите. Показано, что однократное интраперитонеальное введение медицинского озона в дозе 4,27 (4,08; 4,51) мг/кг) интактным животным сопровождается увеличением сигнала парамагнитного центра (ПМЦ) церулоплазмина и значимо не влияет на содержание метгемоглобина и трансферрина.

Установлено, что объективным критерием тяжести острого панкреатита при поступлении больных является снижение активности ПМЦ трансферрина в сочетании с увеличением содержания метгемоглобина и церулоплазмина. Предиктором бактериального инфицирования при панкреонекрозе является уменьшение скорости хемилюминесценции лейкоцитов крови, индуцированной клинически значимыми штаммами микроорганизмов, в сочетании с низкими значениями интенсивности свечения и светосуммы.

Разработан оптимизированный алгоритм патогенетического лечения больных тяжелыми формами острого панкреатита, предусматривающий возможность дифференцированного выбора методик системной озонотерапии в зависимости от результатов биофизического мониторинга.

Практическая значимость исследования

Экспериментальная модель первично инфицированного панкреонекроза у лабораторных животных-кроликов дает возможность воспроизвести заболевание с клинико-морфологическими проявлениями синдрома системной воспалительной реакции, распространенным бактериальным перитонитом и суперинфекцией, что позволяет использовать ее для оценки эффективности новых методов лечебного воздействия.

Применение оптимизированного алгоритма патогенетического лечения больных тяжелыми формами острого панкреатита способствовало сокращению частоты развития инфицированного панкреонекроза среди больных с исходно тяжелым острым панкреатитом на 7,4%, частоты распространенных гнойных осложнений (разлитого гнойного перитонита, флегмоны забрюшинной клетчатки) в 2,46 - 2,72 раза, уменьшению средней продолжительности стационарного лечения на 7,7 суток.

Внедрение результатов исследования в практику

Оптимизированный алгоритм патогенетического лечения больных тяжелыми формами острого панкреатита, а также критерии оценки тяжести острого панкреатита и прогнозирования течения панкреонекроза внедрены в практику хирургических отделений, отделений реанимации и интенсивной терапии МБУЗ «Городская клиническая больница №7» г.Красноярска и НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Красноярск ОАО «РЖД».

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры общей хирургии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России при обучении студентов Института стоматологии по дисциплине «Хирургические болезни. ВПХ», а также при подготовке врачей-интернов и клинических ординаторов по специальности: хирургия.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Системными эффектами интраперитонеального введения озоно-кислородной газовой смеси в условиях оксидативного стресса при панкреонекрозе являются снижение продукции метгемоглобина крови и поддержание физиологической концентрации трансферрина.

2. Биофизические методы в комплексной диагностике острого панкреатита позволяют своевременно оценить тяжесть патологического процесса и прогнозировать исход панкреонекроза.

3. Дифференцированный выбор методов системной озонотерапии на основе биофизического мониторинга процессов свободнорадикального окисления, гипоксии и функционального состояния фагоцитирующих клеток значимо улучшает результаты лечения больных панкреонекрозом.

Апробация материалов диссертации

Материалы исследований докладывались на Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь и наука - третье тысячелетие» (Красноярск, 2008); Региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной хирургии», посвященной 60-летию со дня рождения профессора Ю.С. Винника (Красноярск, 2008); IX Международном конгрессе студентов и молодых ученых «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008); Всероссийской конференции анестезиологов-реаниматологов (Омск, 2009); XVI международном конгрессе хирургов-гепатологов стран СНГ «Актуальные проблемы хирургической гепатологии» (Екатеринбург, 2009); Всероссийском форуме «Пироговская хирургическая неделя» (Санкт-Петербург, 2010); XIX Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2011), VII Всероссийской конференции общих хирургов с международным участием (Красноярск, 2012), заседаниях Красноярского краевого научно-практического общества хирургов (Красноярск, 2010, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 33 научные работы, из них пять статей -в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, две статьи - в англоязычном рецензируемом издании; зарегистрированы патенты РФ на изобретения №2398520 от 10.09.2010 «Способ прогноза вероятности неблагоприятного исхода панкреонекроза в послеоперационном периоде», №2445626 от 20.03.2012 «Способ определения функциональной способности фагоцитирующих клеток», №2465655 от 27.10.2012 «Способ моделирования инфицированного панкреонекроза».

Личный вклад автора

Соискателем лично проведены экспериментальные исследования, включая морфологические и лабораторные. Автор принимал непосредственное участие в обследовании и лечении всех больных, включенных в исследование, а также в осуществлении методик парамагнитно-резонансного и хемилюминесцентного анализа. Статистическая обработка и интерпретация полученных данных, написание диссертации выполнялись автором самостоятельно.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 21 рисунком, одной схемой. Библиография включает 141 отечественный и 77 иностранных литературных источников.

Содержание работы

Материал и методы исследования

Экспериментальная часть исследования выполнена на 38 кроликах породы Шиншилла обоего пола массой 2,52 - 3,17 кг (2,81 (2,66; 2,94) кг) в возрасте 4-5 месяцев. Животные содержались в условиях вивария в изолированных клетках с естественным световым режимом при температуре 18-20°С на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Комплекс экспериментальных исследований одобрен на заседании локального этического комитета ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России.

В соответствии с задачами исследования животные были разделены на четыре группы. Первая контрольная группа включала восемь интактных животных, у которых интраоперационно осуществляли срединную лапаротомию, биопсию ткани поджелудочной железы для определения параметров электронно-парамагнитно-резонансного (ЭПР) — сигнала трансферрина и свободного железа; торакотомию, пункционный забор крови из левого желудочка с оценкой параметров ЭПР-сигнала метгемоглобина, трансферрина, церулоплазмина.

Вторая контрольная группа включала 10 животных с моделью первично инфицированного панкреонекроза. После выполнения срединной лапаротомии осуществляли пункцию желчного пузыря иглой инсулинового шприца с забором 0,6 мл желчи и последующим закрытием пункционного отверстия г-образным

серо-серозным швом. Индукцию панкреонекроза осуществляли механическим сдавлением ткани поджелудочной железы браншами зажима Бильрота до фиксации замка-кремальеры на первую ступень в трех предварительно выбранных точках: в наиболее проксимальном (у пилоро-дуоденального изгиба) и наиболее дистальном отделах правой доли железы, а также в области хвоста левой доли органа (у селезенки). Продолжительность сдавления паренхимы в каждой точке составляла 30 секунд. Непосредственно после механической травматизации в каждой из трех выбранных точек в паренхиму железы последовательно вводили по 0,2 мл аутожелчи и взвеси клинического штамма А. Ьаитаппи в концентрации 105 КОЕ/мл.

Третья группа животных включала 10 особей, у которых производился лапароцентез с последующим наложением пневмоиеритонеума озоно-кислородной газовой смесью в концентрации 40 мг/л в количестве 300 мл. У этих животных озоно-кислородная смесь вводилась однократно, без десуфляции, доза введенного интраперитонеально озона составила 12 мг или, в среднем, - 4,27 (4,08; 4,51) мг/кг.

В четвертой группе у 10 кроликов спустя 24 часа после моделирования инфицированного панкреонекроза два раза в сутки (четырехкратно за период наблюдения) осуществляли введение озоно-кислородной газовой смеси в концентрации 40 мг/л в объеме 300 мл по интраоперационно установленному в брюшной полости фторопластовому перфорированному катетеру.

Релапаротомию, торакотомию с забором крови и биоптатов поджелудочной железы, печени, желудка, почек, легких, миокарда во второй и четвертой группах осуществляли через 72 часа после моделирования, в третьей группе — через 4 часа (пять особей, подгруппа 3.1) и через 72 часа (пять особей, подгруппа 3.2).

У всех животных оперативному вмешательству предшествовала премедикация атропином в дозе 0,2 мг/кг подкожно и ксилазином в дозе 4 мг/кг внутримышечно (за 30 минут до операции), внутрибрюшинная анестезия тиопентал-натрием (в дозе 30 мг/кг), фиксация на операционном столе, удаление волосяного покрова с передней брюшной стенки, антисептическая обработка операционного поля. С первых часов после операции особи 2-4 групп находились в условиях свободного доступа к воде и пище. Эвтаназию животных осуществляли в условиях общей анестезии путем интракардиального введения воздуха (воздушной эмболии) после забора биоптатов и крови при завершении повторной операции.

Объективная оценка состояния животных в каждой группе проводилась по балльной шкале, предложенной С.Б. Фадеевым и соавт., 2009. Шкала предусматривает характеристику двигательной активности и пищевого поведения, реакции на звуковой и болевой раздражители. У всех животных осуществляли лабораторное исследование крови, полученной пункционным забором из полости левого желудочка, которое предусматривало изучение параметров ЭПР-сигнала, а также оценку активности ферментов антиоксидантной системы и содержания оксида азота (N0). Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали в реакции ингибирования автоокисления адреналина в щелочной среде, каталазы - по интенсивности окраски комплекса с молибдатом аммония, содержание N0 в крови - методом определения суммарной концентрации нитратов и нитритов в воде и биологических жидкостях (П.А. Голиков, 2000).

Биоптаты органов (поджелудочной железы, печени, желудка, почек, легких, миокарда) фиксировали не менее 2 часов в 10% растворе нейтрального формалина. Обезвоживание проводили в спиртах восходящей концентрации и заливали в

парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Полученные гистологические препараты изучали при увеличении х200 и х400.

Клиническая часть работы включала результаты обследования 120 пациентов с исходно тяжелыми формами острого панкреатита. Критерием включения пациентов в исследование являлся диагноз острого панкреатита, установленный с учетом клинико-лабораторных и инструментальных данных, возраст от 21 до 55 лет, а также наличие минимум двух основных или одного основного и двух дополнительных признаков упрощенной критериальной системы В.Б.Краснорогова (1998), с 95% вероятностью свидетельствующей о развивающемся или имеющемся тяжелом остром панкреатите (ТОП).

Критериями исключения являлось наличие декомпенсированной сопутствующей патологии, острой алкогольной интоксикации, склонности к судорогам (эпилепсия в анамнезе), тромбоцитопении, травмы органов брюшной полости в анамнезе с развитием внутрибрюшного кровотечения, отсутствие информированного согласия на участие в научно-исследовательской работе, участие пациентов в других исследованиях клиники.

Согласно классификации IX Всероссийского съезда хирургов (Волгоград, 2000), у 60 пациентов (50,0%) верифицирован стерильный крупноочаговый и субтотальный панкреонекроз (СПН), у 17 (14,2%) - инфицированный панкреонекроз (ИПН). У 43 пациентов, поступивших в клинику с ТОП (35,8%), в связи с улучшением состояния в динамике лечения интраоперационной верификации диагноза не производилось; согласно инструментальным методам исследования у этих больных диагностирован мелкоочаговый панкреонекроз и острый отечный панкреатит (табл. 1). Исходная тяжесть состояния больных не имела достоверных различий в первой и второй группах, составляя в среднем 11,2±2,4 и 12,5±1,8 баллов по шкале БАРЗ-ГГ соответственно (р=0,740).

Таблица 1

Распределение больных по группам

Группа Форма острого панкреатита: кол-во больных, абс. (%) Дизайн исследования

ТОП СПН ИПН Итого

Первая 23 (37,1) 28 (45,2) 11 (17,7) 62 (100) традиционное лечение, ретроспективная оценка содержания ПМЦ крови, кинетики хемилюминесценции (ХЛ) лейкоцитов крови

Вторая 20 (34,5) 32 (55,2) 6 (10,3) 58 (100) анализ показателей ЭПР и ХЛ для уточнения тяжести ОП, прогнозирования развития ИПН и дифференцированного выбора способа системной озонотерапии на фоне традиционного лечения

Обследование всех больных с острым панкреатитом включало общеклинические, лабораторные и инструментальные методы. Общеклиническое обследование проводилось традиционно и включало сбор жалоб, анамнеза,

физикальное исследование с оценкой нарушения сознания по шкале комы Glasgow, тяжести состояния - по шкале SAPS-II, полиорганной недостаточности - по шкале SOFA.

Лабораторный метод помимо рутинного клинического и биохимического анализов, определения электролитного состава и кислотно-щелочного равновесия крови предусматривал оценку содержания С-реактивного белка в сыворотке методом латекс-агглютинации с помощью набора реагентов «СРБ-ольвекс» (Ольвекс Диагностикум, Санкт-Петербург), прокальцитонина с помощью полуколичественного теста «Brahms PCT-Q» («Brahms Aktiengesellschaft», Германия),

Ультразвуковое исследование органов брюшной полости и забрюшинного пространства выполнено всем пациентам с помощью двухмерного аппарата фирмы «Aloka» (Япония) конвексным датчиком частотой 3,5 Мгц. Компьютерную томографию с оценкой степени деструкции в поджелудочной железе и ЗК по шкале Balthazar выполнили у 14 (11,7%) больных. Исследование осуществляли на мультиспиральном четырехсрезовом компьютерном томографе производства «General Electrics» (США).

Видеолапароскопические операции осуществляли с применением оборудования фирмы «Karl Storz» (Германия). Решающим в верификации формы деструктивного панкреатита являлось бактериологическое исследование, материалом для которого служили перитонеальный экссудат, содержимое сальниковой сумки, биоптаты забрюшинной клетчатки, кровь.

Биофизические методы исследования.

Биофизические методы исследования включали оценку функциональной способности фагоцитирующих клеток в реакции люминолзависимой хемилюминесценции (XJI) и ЭПР-спектроскопию. Для определения допустимых значений определяемых параметров дополнительно проведено обследование 35 условно здоровых лиц (доноров) на базе КГУЗ «Красноярский краевой центр крови №1».

Методика определения функциональной способности фагоцитирующих клеток в реакции люминолзависимой хемилюминесценции.

Реакционная смесь, вносимая в измерительные кюветы хемилюминометра, включала 20 мкл донорской сыворотки AB(IV) резус-отрицательной, 50 мкл люминола, 240 мкл раствора Хенкса без красителя и 200 мкл лейкоцитарной взвеси для определения спонтанной хемилюминесценции или 200 мкл раствора Хенкса, 200 мкл взвеси лейкоцитов и 40 мкл взвеси индуктора - для индуцированной.

В качестве индукторов дыхательного "взрыва" использовали опсонизированный зимозан ("Sigma", США) и взвесь клинических штаммов (А. baumannii, Р. aeruginosa, метицилленрезистентный S. aureus (MRSA)) в изотоническом растворе хлорида натрия с концентрацией 108 КОЕ/мл. Регистрацию параметров хемилюминесценции лейкоцитов осуществляли в течение 90 минут на биохемилюминометре БЛМ 3606М (СКТБ «Наука», Красноярск) на базе лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии Института Медицинских проблем Севера СО РАМН (заведующий - д.м.н., проф. А.А.Савченко).

Методика ЭПР - анализа.

Объектом ЭПР-анализа в эксперименте являлись кровь, взятая пункционно из полости левого желудочка, а также биоптаты поджелудочной железы

экспериментальных животных (рис.1, 2); в клинике - образцы венозной крови, взятой из кубитальной вены больных, а также 35 условно здоровых лиц-доноров (рис. 3).

Амплитуда сигнала, отн. ед.

Магнитное поле, мТл

Рис. 1. Спектр крови экспериментального животного первой (контрольной) группы: 1 — ЭПР-сигнал метгемоглобина, 2 —трансферрина, 3 — церулоплазмина

Амплитуда сигнала,

Магнитное поле, мТл

Рис. 2. Спектр ткани поджелудочной железы животного первой (контрольной) группы: 1 — ЭПР-сигнал трансферрина, I (2-3) - свободного (негемового) железа

Амплитуда сигнала, отн. ед.

Магнитное поле, мТл

Рис. 3. Спектр крови условно здорового донора: 1 — ЭПР-сигнал метгемоглобина, 2 — трансферрина, 3 — церулоплазмина.

После забора исследуемые образцы сразу помещали во фторопластовый контейнер с внутренним диаметром 55 мм и объемом 0,95 мл, позволяющий фиксировать и извлекать пробы при температуре жидкого азота. После фиксации биологических объектов в жидком азоте последние извлекались из контейнера и помещались в резонатор ЭПР-спектрометра в поток охлажденного газообразного азота с температурой в интервале от 80 до 110 К.

Регистрация спектров ЭПР всех проб проводилась на радиоспектрометре «Е1сх5у,ч Е-580» (Вгикег, Германия) на базе лаборатории молекулярной спектроскопии и анализа Института химии и химической технологии СО РАН РАН (заведующий - д.х.н., проф. Рубайло А.И., в.н.с. Максимов Н.Г.) в широком интервале развертки магнитного поля при двух различных условиях записи спектров всех образцов: при мощности СВЧ 0,63 мВт и 20 мВт, модуляции магнитного поля 0,5 мТл и 1 мТл соответственно.

Для определения относительной концентрации содержания различных парамагнитных центров в спектрах ЭПР использовался внутренний стандарт, обусловленный сигналом от резонатора, а также проводилась регистрация спектров ЭПР в цифровом виде. Методом ЭПР были определены относительные концентрации содержания парамагнитных центров метгемоглобина (МеШЪ), трансферрина (ТГ), церулоплазмина (Ср) в крови (рис. 1, 3), а также трансферрина и свободного (негемового железа) в ткани поджелудочной железы (рис. 2).

Методы системной озонотерапии в клинике.

Методы озонотерапии использованы в лечении больных ТОП второй группы и включали инфузию озонированного физиологического раствора или проведение аутогемотерапии с озоном. Выбор дозировки, способа и кратности введения озона

осуществлялся в соответствие с рекомендациями, утвержденными Министерством здравоохранения РФ (2001), и декларацией Международной ассоциации озонотерапевтов (Мадрид, 2010) с учетом результатов биофизического обследования при поступлении. При инфузии озонированного раствора использовали концентрацию озона 2 мг/л в объеме 400 мл изотонического раствора хлорида натрия, который вводили внутривенно со скоростью 3-5 мл/ минуту через день с общим количеством сеансов 5-7.

Для аутогемотерапии осуществляли забор 100 мл венозной крови пациента при помощи роторного перистальтического насоса «Исток-2» производства ООО НПП «Исток» (Воронеж) со скоростью 10 мл/ минуту в специальный пластиковый контейнер производства НПП «Эконика» (Одесса, Украина), содержащий 50 мл изотонического раствора хлорида натрия и 5 ед. гепарина. После забора в контейнер через дополнительный порт вводили 100 мл озоно-кислородной газовой смеси с концентрацией озона 10 мг/л. В течение 30 секунд аккуратно перемешивали содержимое контейнера, затем при помощи реверса насоса возвращали кровь в вену пациента. Дозировка однократно вводимого озона составляла 1 мг. Сеансы проводили через день в общем количестве 7-10.

В качестве генератора медицинского озона использовали озонотерапевтическую установку УОТА-60-01 производства ООО «Медозон» (Москва).

Статистический метод.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы SPSS, версия 19.0. Описательная статистика результатов исследования представлена для относительных величин в виде процентных долей, для абсолютных — в виде средних арифметических (М) и стандартных отклонений (а). Значения средних арифметических имеют вид М±а. В случаях отсутствия нормального распределения признаков, в описательной статистике использовались медиана (Me) и перцентили (Р25, Р75). Значения средних величин отображались, в этом случае, как Me (P2s; Р75)

Проверка нормальности распределения значений переменных в группах наблюдения проводилась с использованием критериев Шапиро-Уилка.

При подтверждении нормального распределения значений переменных в исследуемых группах, проверку статистической значимости различий проводили при помощи t-критерия Стьюдента для связанных и несвязанных выборок. Для оценки значимости статистических различий между исследуемыми группами при отсутствии нормального распределения, проводили тестирование несвязанных групп по непараметрическому критерию Манна-Уитни, в случае сравнения связанных групп использовался непараметрический ранговый критерий Вилкоксона.

Значимость различий качественных и порядковых признаков в группах наблюдения оценивали при помощи непараметрического критерия %2 Пирсона с поправкой на непрерывность. При частоте встречаемости признака 5 и менее использовался точный критерий Фишера.

Различия во всех случаях оценивали, как статистически значимые при р<0,05.

Результаты исследований.

Системные эффекты интраперитонеального введения озоно-кислородной газовой смеси в эксперименте. В течение первых суток после моделирования ИПН изменения в поведении (вялость, уменьшение двигательной

активности, отказ от приема пищи) отмечены среди животных второй и четвертой групп. На 2-3 сутки эксперимента состояние особей второй группы прогрессивно ухудшалось: у всех животных регистрировались клинические проявления синдрома системной воспалительной реакции: тахипноэ, тахикардия, гипертермия, отмечена минимальная двигательная активность. Статистически значимые различия отмечены при сравнении средней температуры тела экспериментальных животных второй (41,5 (41,0; 41,8)°С) и четвертой групп (39,1 (38,3; 39,5))°С через 72 часа после моделирования инфицированного панкреонекроза (р=0,002). Значения температуры, частоты сердечных сокращений, частоты дыхательных движений, а также двигательная активность, пищевое поведение и реакция на внешние раздражители животных третьей группы в течение всего периода наблюдения не отличались от интактных.

Во время релапаротомии, выполненной спустя трое суток после моделирования панкреонекроза, в брюшной полости определялся экссудат (мутный, с наличием хлопьев фибрина — во второй группе и геморрагический - в четвертой), отмечалась дилатация желудка и тонкой кишки, желчное пропитывание в области гепатодуоденальной связки. Поджелудочная железа не дифференцировалась на фоне брыжейки тонкой кишки, представляя собой гомогенную массу сливающихся очагов стеатонекроза серого цвета.

Гистологически в биоптатах поджелудочной железы животных определялся лизис ацинарной и железистой паренхимы (рис. 4).

Рис. 4. Препарат поджелудочной железы кролика с моделью инфицированного панкреонекроза: лизис ацинарной и железистой паренхимы (отмечен стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. х200

У всех животных течение экспериментального панкреонекроза сопровождали системные воспалительные проявления. Так, при исследовании препаратов печени определялась картина вторичного острого гепатита: на фоне сохранения гистологической структуры органа отмечалось умеренное расширение портальных трактов, с выраженной лимфо-макрофагальной инфильтрацией,

местами разрушающей пограничную пластинку, проникающая в дольки (рис.5). По ходу инфильтратов отмечались некробиоз и некроз гепатоцитов.

Рис. 5. Препарат печени кролика с моделью инфицированного панкреонекроза: межуточный гепатит. Выраженная лимфо-макрофагальная инфильтрация указана стрелкой. Окраска гематоксилином и эозином.х400

В препаратах почек выявлена микроскопическая картина межуточного (интерстициального) нефрита: лимфогистиоцитарная инфильтрация интерстиция органа, полнокровие капилляров, единичные лимфоциты и нейтрофильные гранулоциты в большей части клубочков. Отмечены интерстициальный отёк с очаговой инфильтрацией лимфо-гистиоцитарными элементами и полиморфно-ядерными лейкоцитами; гиалиново-капельная, гидропическая дистрофия и фокальные некрозы в эпителии извитых канальцев проксимального и дистального отделов нефрона, в просвете канальцев определялись белковые цилиндры (рис.6).

В стенке желудка выявлена дистрофия покровно-ямочного эпителия с очагами некробиоза, полнокровием сосудов собственной пластинки слизистой оболочки, подслизистой основы, отмечена субсерозная инфильтрация лимфо-гистиоцитарными элементами и полиморфно-ядерными лейкоцитами.

Экстраабдоминальные воспалительные изменения отмечены в ткани легкого и миокарда. Гистологическая картина в легком характеризовалась наличием бронхопневмонии и обструктивной эмфиземы с формированием булл (рис.7). В просвете мелких бронхов выявлен экссудат, содержащий полиморфно-ядерные лейкоциты, слущенный эпителий; инфильтрация распространялась на стенки бронхов. Перибронхиально выявлены ацинозные сливные участки инфильтрации нейтрофильными гранулоцитами.

В препаратах миокарда на фоне сохранения гистологической структуры органа отмечены признаки интерстициального миокардита: межуточный отек, нейтрофильная и лимфогистиоцитарная инфильтрация (рис.8).

Рис. 6. Препарат почки кролика с моделью инфицированного панкреонекроза: Интерстициальный нефрит. Стрелками указана очаговая инфильтрация интерстиция органа лимфо-гистиоцитарными элементами и полиморфно-ядерными лейкоцитами. Окраска гематоксилином и эозином.х400

Рис. 7 Препарат ткани легкого кролика с моделью инфицированного панкреонекроза: обструктивная эмфизема с формированием булл (указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. х100

Рис. 8. Препарат ткани миокарда кролика с моделью инфицированного панкреонекроза. Межуточный миокардит. Отек интерстиция, инфильтрация нейтрофильными гранулоцитами и моноцитами (указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. х400

При бактериологическом исследовании биоптатов поджелудочной железы возбудитель экспериментального ИПН (A. baumannii) идентифицирован в среднем количестве 5,0*107 КОЕ/г. При этом у двух животных (20,0%) А. baumannii выделен в ассоциации с P. mirabilis и Е. faecalis.

Микробные ассоциации также изолированы при исследовании перитонеального экссудата, степень контаминации которого составила 107 КОЕ/мл. У четырех (40,0%) животных второй группы A. baumannii в перитонеальном экссудате обнаружен в сочетании с энтеробактериями [Р. vulgaris, P. mirabilis, Providencia spp.) и Enterococcus spp., что, возможно, объясняется транслокацией микрофлоры из просвета желудочно-кишечного тракта на фоне энтеральной недостаточности. Таким образом, использование разработанного способа моделирования позволило во второй группе воспроизвести инфицированный панкреонекроз с клинико-морфологическими проявлениями синдрома системной воспалительной реакции, распространенным бактериальным перитонитом и уровнем суперинфекции 40,0% через 72 часа с момента моделирования.

В четвертой группе степень контаминации поджелудочной железы к исходу третьих суток после моделирования была ниже этиологически значимой, составляя 104 КОЕ/г. A. baumannii обнаруживался только в монокультуре. Перитонеальный экссудат у большинства животных имел асептический характер; инфицирование выявлено у двух особей четвертой группы (20,0%) в среднем количестве 5*102 КОЕ/мл.

В третьей группе экссудат в брюшной полости не определялся, посевы биоптатов поджелудочной железы в сроки через 4 и 72 часа после введения озоно-кислородной газовой смеси роста не дали.

Через 72 часа после моделирования инфицированного панкреонекроза активность каталазы и супероксиддисмутазы крови значимо превышала аналогичный показатель интактных животных, при этом различий активности ферментов у животных второй и четвертой групп выявлено не было. В аналогичные сроки содержание оксида азота в крови животных второй группы превысило показатель первой и четвертой групп в 1,70 и 1,42 раза соответственно (р1-2=0,001, р2.4=0,012), что, возможно, объясняется максимальной бактериальной стимуляцией индуцибельной ЫО-синтазы у животных с развившимся ИПН в отсутствии терапии по сравнению с особями, у которых достигнуто снижение выраженности системного воспалительного ответа за счет интраперитонеального введения озоно-кислородной газовой смеси. Однократное интраперитонеальное введение медицинского озона экспериментальным животным в дозе 4,27 (4,08; 4,51) мг/кг не сопровождалось значимым отклонением от нормы активности каталазы, СОД и содержания оксида азота как в ранние сроки (через 4 часа), так и к окончанию третьих суток наблюдения.

По результатам ЭПР-спектроскопии нормированное число (НЧ) сигнала метгемоглобина (МеШЬ) крови животных с инфицированным панкреонекрозом через 72 часа после моделирования превышало аналогичный показатель первой группы в 1,67 раза (р=0,016), четвертой - в 1,54 раза (р-0,045, табл. 2), что свидетельствует о системном антигипоксическом эффекте повторно вводимого внутрибрюшинно медицинского озона. Однократное интраперитонеальное введение озоно-кислородной газовой смеси значимо не изменяло содержания метгемоглобина в крови интактных особей.

Таблица 2

Результаты ЭПР-анализа парамагнитных центров крови _экспериментальных животных_

Группа Показатель, о.е.

НЧ МеШЬ НЧТГ НЧСр

1 группа 1,58 (0,72; 2,42) 26,87 (22,33; 30,17) 17,44(13,91; 19,40)

2 группа 2,64(1,19; 3,63) 10,21 (6,88; 18,71) 47,97 (34,46; 60,78)

группа 3.1 1,65(1,45; 1,94) 25,48 (23,74; 27,69) 30,04(19,42; 33,13)

группа 3.2 1,52 (0,66; 2,38) 24,35 (21,41; 29,16) 22,12 (16,81; 25,32)

4 группа 1,71 (0,85; 2,56) 21,16 (18,78; 27,05) 26,52 (20,36; 33,18)

Р Р).2= 0,016, р,.3.1= 0,941, Р1_з.2=0,682, рм=0,621, р2.4=0,045 Р1-2<0,001, Р1-з.|= 0,661, Р,_з.2=0,921, Рм= 0,582, р2-4=0,005 р,.2<0,001, р,.з.1= 0,028, Р1-3 2=0,530, Рм= 0,026, Р2-4 =0,012

Примечание: данные представлены медианой (Ме) и межквартильным интервалом (Р25; Р75); НЧ - нормированное число; Р1_2, Р1-3.1, Р1-з.2> Р1-4, Р2-4 ~~ значимость различий между показателями соответствующих групп согласно критерию Манна-Уитни.

ЭПР-спектры крови животных второй группы отличались сравнительно низким значением сигнала парамагнитных центров трансферрина (Т1) и высоким -церулоплазмина (Ср). Минимальное значение сигнала парамагнитного центра ТГ

может свидетельствовать с одной стороны об абсолютном снижении концентрации транспортного белка в условиях реактивной структурно-функциональной недостаточности печени, с другой - о снижении сродства трансферрина к ионам железа и повышении концентрации апопротеина в условиях оксидативного стресса. Данное предположение подтверждается результатами ЭПР-спектроскопии ткани поджелудочной железы (табл. 3), согласно которым развитие острого деструктивного панкреатита в отсутствии лечения сопровождалось увеличением интенсивности сигнала свободного железа (Ре3+) в 2,78 раза по сравнению со здоровыми животными. Интраперитонеальное введение озоно-кислородной газовой смеси, помимо прямого бактерицидного эффекта, по-видимому, способствовало улучшению сродства трансферрина к ионам железа, о чем свидетельствует значимо более высокий сигнал ТГ и более низкий - Бе3+ ткани поджелудочной железы животных четвертой группы в сравнении со второй (табл. 3). Увеличение парамагнитной активности церулоплазмина, обладающего, как известно, феррооксидазной и антиоксидантной активностью, в том числе -способностью предупреждать повреждающее действие избыточной концентрации N0, отражает максимальную степень выраженности свободнорадикального окисления у животных второй группы и значимо более низкую — в четвертой.

Таблица 3

Результаты ЭПР-анализа парамагнитных центров ткани поджелудочной железы

экспериментальных животных

Группа Показатель, о.е.

ОЕ ТГ ОЕ Ре3+

1 группа 48,83 (36,32; 71,53) 13,55 (9,54; 18,35)

2 группа 20,74(15,97; 27,89) 37,67 (27,23; 45,64)

группа 3.1 56,52 (44,17; 68,77) 9,92 (5,55; 14,50)

группа 3.2 50,11 (39,13; 63,45) 12,16(7,51; 18,06)

4 группа 38,16 (25,61; 58,58) 22,16 (15,04; 28,49)

р,.2<0,001, Р1-2<0,001,

Р р,.з.,= 0,748, р,.3.1= 0,393,

Р1-з.2=0,941, р,.з.2=0,608,

Рм= 0,150, рм=0,021,

р2.4= 0,024 р2.4=0,017

Примечание: данные представлены медианой (Ме) и межквартильным интервалом (Р25; Р75); ОЕ - относительные единицы; р|.2, Р1.3.1, Р 1-3.2, Рм, Р2-4 ~ значимость различий между показателями соответствующих групп согласно критерию Манна-Уитни.

Состояние парамагнитных центров крови больных тяжелым острым панкреатитом.

Изучена активность ПМЦ крови 62 больных ТОП первой группы в течение первых 12 часов после госпитализации, а также 35 условно здоровых лиц -доноров. Учитывая наибольшую актуальность ранней оценки тяжести состояния больных острым панкреатитом, прогнозирования объема и своевременной диагностики исхода некроза поджелудочной железы, кроме сравнения полученных показателей с допустимыми физиологическими значениями (доноров) ретроспективно выполнена оценка значимости различий в когортах: острый отечный панкреатит — стерильный панкреонекроз, а также стерильный — инфицированный панкреонекроз.

Показано, что единственным параметром, значимо превышающим физиологический уровень у больных отечным панкреатитом при поступлении являлось НЧ Ср (в 1,46 раза, р=0,006), в то время как показатели НЧ MetHb и НЧ Tf отличались от донорских незначительно. У больных с развившимся СПИ и ИПН при поступлении содержание метгемоглобина превышало условно нормальное значение в 1,47 и 1,51 раза соответственно (р1.3=0,031, pi_4=0,045), церулоплазмина - в 1,37-1,56 раза (р!.з=0,005, pi.4=0,016). Исходное содержание трансферрина в крови больных с деструктивными формами панкреатита было снижено в 1,63-1,67 раза по сравнению с показателем условно здоровых лиц (р!.з=0,002, рм=0,001).

Значимых отличий между ретроспективно сформированными группами больных СПИН и ИПН по анализируемым признакам выявлено не было. Имевшее место при поступлении увеличение ЭПР-сигнала метгемоглобина, церулоплазмина и снижение - трансферрина среди больных с развившейся деструктивной формой заболевания свидетельствует об исходной напряженности оксидативного стресса и гипоксии, повторяет тенденции, отмеченные экспериментально, а также отражает возможность своевременной диагностики и коррекции вышеуказанных патогенетических процессов.

Состояние хемилюминесцеиции лейкоцитов крови больных тяжелым острым панкреатитом.

Нами ретроспективно изучены параметры спонтанной и индуцированной хемилюминесцеиции (XJT) лейкоцитов крови 35 условно здоровых лиц-доноров и 39 больных ТОП первой группы в течение 12 часов после госпитализации. У пациентов отмечалось достоверное по сравнению с донорами укорочение времени достижения пика спонтанной хемилюминесцеиции (р=0,001) при отсутствии значимых различий в интенсивности и светосумме. Анализ реакции, индуцированной активатором - зимозаном, не выявил достоверных отличий от показателей доноров. Реакция фагоцитов больных СПН на активацию P. aeruginosa выражалась в увеличении времени достижения пика (р=0,008) на фоне близких к допустимым значениях интенсивности и светосуммы. При индукции лейкоцитов взвесью культуры A. baumannii отмечено уменьшение интенсивности свечения и светосуммы (р=0,008, р=0,004 соответственно) в сочетании с нормальным значением времени достижения пика хемилюминесцеиции. Активация фагоцитов MRSA характеризовалась ускорением выхода кривой на максимум (р<0,001) при неизмененном уровне бактерицидной активности (интенсивности и светосумме).

У 11 больных первой группы, госпитализированных с клинической картиной ТОП, в дальнейшем - оперированных по поводу ИПН, верифицированного бактериологически, при поступлении спонтанная хемилюминесценция лейкоцитов характеризовалась значимо большей по сравнению с донорами скоростью реакции (р=0,001) и низкими значениями интенсивности и светосуммы (р=0,005 и 0,012, соответственно). Активация зимозаном сопровождалась увеличением времени достижения пика реакции (р=0,002) при допустимых значениях кислородопродукции (светосуммы и интенсивности хемилюминесцеиции).

Инкубация лейкоцитов с клиническими штаммами микроорганизмов позволила зарегистрировать недостаточность фагоцитарного ответа, в наибольшей степени по отношению к грамотрицательным микроорганизмам (A.baumannii и Р. aeruginosa): низкая скорость реакции хемилюминесцеиции (р=0,001, р=0,022 соответственно) сочеталась с малыми значениями интенсивности (р=0,002, р=0,001) и светосуммы (р=0,001, р=0,005). Стимуляция лейкоцитов взвесью MRSA

сопровождалась низкой интенсивностью, малоизмененной светосуммой и незначительным замедлением реакции по сравнению с донорами.

Оптимизация лечебно-диагностического алгоритма у больных тяжелым острым панкреатитом.

Под нашим наблюдением во второй группе находились 58 больных с наличием минимум двух основных или одного основного и двух дополнительных признаков упрощенной критериальной системы В.Б.Краснорогова (1998). Как и в первой группе, установленный диагноз тяжелого острого панкреатита являлся показанием к госпитализации пациентов в отделение интенсивной терапии и реанимации. Объем базисной терапии в группах не отличался и включал обеспечение функционального покоя поджелудочной железы, коррекцию гиповолемии, коагулопатии, водно-электролитного, кислотно-щелочного дисбаланса, купирование болевого синдрома.

ЭПР-маркерами развивающегося крупноочагового или субтотально-тотального панкреонекроза во второй группе считали одновременное превышение допустимого уровня метгемоглобина в 1,47 раза и более, церулоплазмина - в 1,37 раза и более, снижение содержания трансферрина в 1,63 раза и более по сравнению с показателями условно здоровых лиц. Наличие указанных изменений ПМЦ крови обнаружено у 40 больных второй группы (69,0%, р=0,767 по сравнению с аналогичным показателем первой группы (39 (62,9%)). У 18 пациентов второй группы (31,0%) НЧ MetHb, Tf, Ср незначительно отличалось от среднефизиологических значений. Эти пациенты продолжали получать базисную терапию, при этом сроки их нахождения в ОРИТ были минимальными (50,6 (36,7; 64,8 часов)) с учетом положительной динамики клинико-лабораторных и инструментальных данных. Операции данным пациентам не производились, клиническими диагнозами при выписке из стационара являлись острый отечный панкреатит (у 15 (83,3%)) или мелкоочаговый стерильный панкреонекроз (у трех больных (16,7%)).

С учетом риска инфицирования пациентам второй группы с наличием ЭПР-признаков распространенного панкреонекроза (п=40) в первые 12 часов с момента госпитализации оценивали состояние функциональной способности фагоцитирующих клеток в реакции XJI с клиническими штаммами микроорганизмов. В качестве предикторов риска возможного инфицирования рассматривали низкую скорость реакции и малые значения интенсивности и светосуммы XJI лейкоцитов при их стимуляции взвесью A.banmannii, P. aeruginosa или MRSA в сравнении со значениями доноров. Указанные изменения обнаружены у девяти больных (22,5% от общего числа анализов), что значимо не отличалось от аналогичного количества в первой группе (11 (28,2%), р=0,746). Как и у пациентов первой группы, дисфункция фагоцитов, в основном, определялась при индукции грамотрицательными штаммами микроорганизмов (A. baumannii, P. aeruginosa).

С учетом современных представлений о преимуществах экстракорпоральной иммунокоррекции в комплексном лечении девяти пациентов с наличием XJI-признаков фагоцитарной дисфункции использована методика аутогемотерапии с озоном. С учетом напряженности оксидативного стресса и гипоксии, выявленных по результатам ЭПР-спектроскопии, у 31 пациента второй группы в комплексном лечении дополнительно применялась внутривенная инфузия озонированного физиологического раствора в концентрации 2 мг/л.

В ранние сроки (в течение первой недели стационарного лечения) показания к оперативному лечению возникли у 32 больных второй группы (55,2%) и 28 больных первой (45,2%, р=0,222). У подавляющего большинства больных как первой (89,3%), так и второй группы (84,4%, р=0,680) в ранние сроки выполнены видеоэндоскопические операции. Вмешательство предусматривало рассечение желудочно-ободочной связки, эвакуацию ферментативного экссудата с дренированием сальниковой сумки и свободной брюшной полости полихлорвиниловыми трубчатыми дренажами. При необходимости для декомпрессии желчевыводящих путей накладывали подвесную холецистостому (5 больных в первой (17,9%) и 3 - во второй группе (9,4%, р=0,788). У всех больных, оперированных в ранние сроки, по результатам интраоперационного забора и последующего бактериологического анализа содержимого сальниковой сумки, свободной брюшной полости, биоптатов забрюшинной клетчатки верифицирован стерильный панкреонекроз.

Инфицированный панкреонекроз (ИПН) развился в динамике заболевания у 11 больных первой (17,7%) и 6 - второй группы (10,3%, р=0,368) и явился показанием к выполнению открытых дренирующих операций. При этом у больных второй группы преобладали локальные осложнения ИПН (парапанкреатический абсцесс, инфицированная псевдокиста). Частота развития распространенных осложнений инфицированного панкреонекроза (разлитого гнойного перитонита, флегмоны забрюшинной клетчатки) в первой группе превышала аналогичный показатель второй группы в 2,46 и 2,72 раза соответственно, что не обладало статистической значимостью (р=0,109 и р=0,333 соответственно), но оказало влияние на выбор оперативного доступа. Двухподреберных минидоступ удалось использовать только у двух больных в первой (18,2%) и четырех - во второй группе (66,7%, р=0,109).

Вмешательства из верхне-срединного лапаротомного доступа по поводу ИПН и его осложнений выполнены у девяти (81,8%) и двух (33,3%) больных первой и второй групп соответственно (р=0,109).

Релапаротомии выполнены у трех больных в первой группе (27,3%, в т.ч. у двух - по программе, у одного - по требованию) и у одного больного — во второй (16,7%, р= 1,000). Среднее количество релапаротомий у четырех пациентов составило 2,0.

Результаты ЭПР-спектроскопии, выполненной в динамике у больных деструктивным панкреатитом, свидетельствовали о более благоприятном течении заболевания во второй группе. Аутогемотерапия с озоном в комплексном лечении больных с предикторами ИПН способствовала ранней коррекции фагоцитарной дисфункции. При этом необходимо отметить, что у трех больных второй группы с наличием предикторов ИПН (30,0%) последний не развился, что возможно, связано со своевременным назначением экстракопоральной методики системной озонотерапии.

Нами проведен анализ сроков лечения больных в группах в зависимости от формы заболевания и с учетом его исхода (табл. 4). Статистически значимые различия отмечены как при сравнении среднего койко-дня, так и при дифференцированном сравнении продолжительности лечения стационарного лечения среди больных ИПН и СПН. Среди больных ИПН указанный результат достигнут в результате уменьшения числа больных с распространенными гнойными осложнениями и сокращением числа пациентов, требовавших

выполнения санационных релапаротомий. Среди больных СПН меньшая продолжительность стационарного лечения, по-видимому, объясняется эффективной коррекцией гипоксии и гиперпероксидации посредством периоперационной системной озонотерапии. Значение послеоперационной летальности при инфицированном панкреонекрозе не имело различий в группах, составив 18,2% в первой группе (двое больных) и 16,7 - во второй (один пациент), (р=1,000). Летальности при стерильном панкреонекрозе среди наблюдаемых пациентов не было.

Таблица 4

Сроки стационарного лечения больных панкреонекрозом (койко-дни)

Характеристика больных, группа Группа: койко-день/ кол-во больных, абс. Р/Р*

Первая (39) Вторая (38)

Среди всех больных СПН 18,1 (15,0; 23,4)/ 28 14,6 (11,1; 17,2)/ 32 р=0,012

Среди всех больных ИПН 39,2 (35,4; 43,6)А /11 26,2 (23,1; 32,7) л /6 р=0,036

Среди выздоровевших больных ИПН 37,6 (31,2; 40,4)/9 24,7 (21,3; 27,9)/5 р=0,298

Средний койко-день в группе 24,1±6,5 / 39 16,4±4,5 /38 р*=0,020

Примечания: р - вероятность ошибки согласно критерию Манна-Уитни,

р* - вероятность ошибки согласно ^критерию Стьюдента,

л - р<0,05 согласно критерию Манна-Уитни по сравнению с показателем у больных СПН в группе.

Таким образом, дифференцированное применение методик системной озонотерапии с учетов результатов биофизических методов исследования перекисного гомеостаза и фагоцитарной дисфункции не оказало значимого влияния на частоту развития инфицированного панкреонекроза в общем количестве больных, поступивших с тяжелым острым панкреатитом, однако позволило снизить частоту распространенных септических осложнений и длительность стационарного лечения.

Выводы:

1. Разработанный способ моделирования позволяет в эксперименте воспроизвести инфицированный панкреонекроз с клинико-морфологическими проявлениями синдрома системной воспалительной реакции, распространенным бактериальным перитонитом и уровнем суперинфекции 40,0% через 72 часа с момента индукции.

2. Однократное интраперитонеальное введение медицинского озона в дозе 4,27 (4,08; 4,51) мг/кг интактным животным (кроликам) сопровождается увеличением нормированного числа церулоплазмина крови в 1,72 раза в течение первых четырех часов с последующей нормализацией показателя к исходу третьих суток наблюдения.

3. Системными эффектами повторяющегося (четырехкратного) интраперитонеального введения 300 мл озоно-кислородной газовой смеси с концентрацией 40 мг/л животным с экспериментальной моделью инфицированного панкреонекроза являются нормализация содержания оксида азота, метгемоглобина

и трансферрина крови, значимое уменьшение содержания свободного железа и увеличение — трансферрина в ткани поджелудочной железы - к исходу третьих суток наблюдения.

4. ЭПР-маркерами развивающегося крупноочагового или субтотально-тотального панкреонекроза являются снижение содержания трансферрина в 1,63 раза и более, превышение уровня метгемоглобина в 1,47 раза и более, церулоплазмина - в 1,37 раза и более по сравнению с показателями условно здоровых лиц.

5. Предикторами возможного инфицирования панкреонекроза являются низкая скорость реакции и малые значения интенсивности и светосуммы XJI лейкоцитов при их стимуляции взвесью A.baumannii, P. aeruginosa или MRSA в сравнении со значениями доноров.

6. Дифференцированный выбор способа системной озонотерапии на основе биофизического мониторинга позволяет осуществить своевременную коррекцию гипоксии и гиперпероксидации, фагоцитарной дисфункции в периоперационном периоде, уменьшить частоту развития инфицированного панкреонекроза среди всех больных с исходно тяжелым острым панкреатитом на 7,4%, частоту развития распространенных гнойных осложнений инфицированного панкреонекроза в 2,46 -2,72 раза, сократить среднюю продолжительность стационарного лечения на 7,7 суток.

Практические рекомендации:

1. Для создания экспериментальной модели первично инфицированного панкреонекроза у экспериментальных животных кроликов в условиях общей анестезии следует производить механическую травматизацию поджелудочной железы в трех стандартных точках браншами зажима Бильрота с последующей инфильтрацией ткани органа аутожелчью и взвесью клинического штамма Acinetobacter baumannii в концентрации 105 КОЕ/мл в объеме по 0,2 мл.

2. Больным с клинической картиной острого панкреатита для уточнения тяжести состояния показано определение активности парамагнитных центров трансферрина, церулоплазмина и метгемоглобина.

3. Больным с клинико- инструментальными признаками крупноочагового и субтотально-тотального панкреонекроза для прогнозирования бактериального инфицирования показана оценка параметров индуцированной хемилюминесценции с использованием клинических штаммов микроорганизмов: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, MRSA.

4. При наличии предикторов бактериального инфицирования панкреонекроза в комплексном лечении больных следует использовать экстракорпоральную иммунокоррекцию путем аутогемотерапии с озоном в концентрации 10 мг/л через день с общим количеством сеансов 7-10. При отсутствии признаков фагоцитарной дисфункции в качестве метода коррекции гиперпероксидации и гипоксии у больных тяжелым острым панкреатитом целесообразно применение внутривенных инфузий озонированного раствора со скоростью 3-5 мл/ минуту в концентрации 2 мг/л в объеме 400 мл изотонического раствора хлорида натрия через день с общим количеством сеансов 5-7.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Цедрик Н.И. Применение хемилюмннесцентного анализа в оценке перекисного гомеостаза больных панкреонекрозом / Н.И. Цедрик, А.И. Дробушевская, Е.В. Онзуль, Ю.С. Винник, A.A. Савченко, О-В. Теплякова //Молодежь и наука - третье тысячелетие. Сборник материалов Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. -1 часть. - Красноярск, 2007. - С. 382-383.

2. Цедрик H.И. Хемилюминесцентные критерии дифференциальной диагностики различных форм острого панкреатита / Н.И. Цедрик, М.И. Гульман, Ю.С. Винник, A.A. Савченко, C.B. Якимов, О.В. Теплякова // Актуальные вопросы современной хирурги». Сборник, посвященный 60-летию со дня рождения профессора Ю.С. Винника. - Красноярск, 2008. - С. 143-145.

3. Цедрик Н.И. Окислительный гомеостаз при различных формах острого панкреатита: особенности диагностики и пути коррекции / Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, A.A. Савченко, О.В. Теплякова, C.B. Якимов // Успехи современного естествознания. - 2008. - №9. - С. 104-106.

4. Цедрик Н.И. Значение метода индуцированной хемилюминесценции в дифференциальной диагностике форм острого панкреатита / Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, C.B. Миллер, О.В. Теплякова, C.B. Якимов // Анналы хирургической гепатологии. - 2008. - Т. 13, №3. - С. 43.

5. Цедрик Н.И. Ранний способ диагностики бактериального инфицирования при панкреонекрозе / Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, C.B. Миллер, О.В. Теплякова, C.B. Якимов // Вестник хирургической гастроэнтерологии. - 2008. - №4. - С. 81.

6. Цедрик Н.И. Способ рациональной озонотерапии в лечении больных острым панкреатитом / Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, О.В. Теплякова // Здоровье и образование в XXI веке. Сборник научных трудов IX международного конгресса. - Москва, 2008. - С. 482-483.

7. Tsedrik N.I. Perfection of differential diagnostics and prognostication of acute pancreatitis destructive forms course / N.I. Tsedrik, Yu.S. Vinnik, A.A Savchenko, О. V. Teplyakova, S.V. Yakimov // European journal of natural history. - 2008. - №6. - P. 48-50.

8. Цедрик Н.И. К вопросу о ранней диагностике и прогнозировании течения панкреонекроза /Н.И. Цедрик, Ю.С. Вштик, C.B. Миллер, A.A. Савченко, C.B. Якимов // Сибирское медицинское обозрение. -

2009.-Ш.-С. 42-45.

9. Цедрик Н.И. Коррекция нарушений перекисного гомеостаза у больных различными формами острого панкреатита / Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, A.A. Савченко, C.B. Якимов, А.И. Дробушевская // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. — 2009. — Т. 2, №1. — С. 8-13.

10. Tsedrik N.I. Oxidative homeostasis condition in pathogenesis, diagnostics and prognostication of infected pancreatic necrosis / N.I. Tsedrik, Yu.S. Vinnik, S.V. Miller, O.V. Teplyakova // European journal of natural history. - 2009. - №6. - P. 8-10.

11. Цедрик Н.И. Возможности метода электронного парамагнитного резонанса в прогнозировании течения острого панкреатита / Ю.С. Винник, А.И. Рубайло, Н.Г. Максимов, О.В. Теплякова // Вестник хирургической гастроэнтерологии. - 2010. - №3. - С. 104-105.

12. Цедрик Н.И. Биофизические основы нового способа прогнозирования течения и оценки тяжести острого панкреатита/ Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, О.В. Теплякова // Медицинский академический журнал. -

2010. - Т.10, №5. - С. 46-47.

13. Tsedrik N.I. On the way to personalised correction of the oxidizing homeostasis disturbances with acute pancreatitis necrosis / N.I. Tsedrik, Yu.S. Vinnik, O.V. Teplyakova // European journal of natural history. - 2010. -№3. - P. 46-49.

14. Цедрик Н.И. Использование метода ЭПР-спектроскопии для оценки тяжести острого панкреатита /Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, О.В. Теплякова, Н.Г. Максимов //Врач-аспирант. - 2011. -

№5.2(48).-С. 249-254.

15. Цедрик Н.И. Эффективность применения L-opnumuH-L-acnapmama в комплексном лечении острого панкреатита алкогольной этиологии / Н.И. Цедрик, Ю.С. Винник, C.B. Миллер, О.В. Теплякова, Е.В. Онзуль //Вестник хирургической гастроэнтерологии. - 2011. -М2. - С. 70-76.

16. Цедрик. H.H. Возможности коррекции гепатопатии в комплексном лечении тяжелого острого панкреатита алкогольной этиологии / Н.И. Цедрик, C.B. Миллер, Ю.С. Винник, О.В. Теплякова, А.И Рубайло, Н.Г. Максимов//Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2012. - Серия 11. - Ml. - С. 124-132.

17. Цедрик. Н.И Системные эффекты интраперитонеального введения озонокислородной газовой смеси в норме и при моделировании инфицированного панкреонекроза в эксперименте / Л.А. Шестакова, Е.Ю. Сергеева, О.В. Теплякова, А.Б. Малков, Л.А.Шапиро, A.B. Ильинов // Актуальные вопросы современной хирургии: сборник научно-практических работ, посвященный 65-летию профессора Ю.С. Винника. -Красноярск, 2013.-С. 131-134.

Список используемых в работе условных сокращений

ИПН - инфицированный панкреонекроз КОЕ — колониеобразующая единица ОЕ - относительные единицы НЧ - нормированное число ПМЦ — парамагнитный центр СПН - стерильный панкреонекроз ТОП - тяжелый острый панкреатит

ХЛ — хемилюминесценция

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

Ср — церулоплазмин

MetHb - метгемоглобин

MRSA - метицилленрезистентный

Staphylococcus aureus

Tf - трансферрин