Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Применение штаммов собственных лактобактерий для восстановления нарушенного биоценоза влагалища

003474227

На правах рукописи

ДЕНИСОВА НАТАЛЬЯ ГЕОРГИЕВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММОВ СОБСТВЕННЫХ ЛАКТОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НАРУШЕННОГО БИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА

14.00.01 - акушерство и гинекология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

? 5 И ЮН 2003

Самара - 2009

003474227

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ».

Научные руководителя:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Мельников Владимир Александрович Жесткое Александр Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Целкович Людмила Савельевна

доктор медицинских наук, профессор Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Ведущая организация: ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Защита диссертации состоится-«—а-мая 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.085.04 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» (443079, г.Самара, пр-т К.Маркса, 165 "б").

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»» (443001, г.Самара, ул.Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан Ж плюшл 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

С.Н.Черкасов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Несмотря на значительные успехи в фармакологии и клинической микробиологии, вопросы лечения бактериальных вагинозов (БВ) и, в особенности, восстановления биоценоза после антибактериальной терапии БВ продолжают оставаться актуальным в гинекологии и акушерстве. Среди заболеваний бактериальной этиологии большой удельный вес составляют патологические состояния, связанные с нарушениями нормальной микрофлоры женского репродуктивного тракта. Частота возникновения таких заболеваний, как вагиниты, бактериальные вагинозы, первым этапом лечения которых является антибактериальная терапия, не имеет тенденции к снижению (Анкирская A.C., 2005; Мельников В. А. и соавт., 2006).

Опубликованные результаты И.С. Сидоровой и соавт. (2005) позволили доказать существование прямой связи между дисбиозом влагалища и осложнениями в первом триместре беременности, таких как самопроизвольный выквдыш, неразвивающаяся беременность и риск развития внутриутробного инфицирования плода.

Нарушение биоценоза влагалища возникает при ряде инфекционных и соматических заболеваний, широкого использования антибактериальных и контрацептивных препаратов, вследствие неблагоприятных внешних воздействий, подавления локального и общего иммунного ответа (Буданов П.В., Стрижакова М.А., 2005; Серов В.Н., Тихомиров А.Л., Олейник Ч.Г., 2005).

Одним из распространенных заболеваний, связанных с нарушением биоценоза, является бактериальный вагиноз - полимикробный клинический синдром, в основе которого лежит нарушение нормального микробиоценоза влагалища (Кира Е.Ф., 2001; Hiller S. L., 2002).

К настоящему времени сформулирована и обоснована этапность в лечении бактериального вагиноза: I -этап - санация влагалища, II - восстановление микробиоценоза влагалища (Сметник В.П., Тумилович Л.Г., 2001; Подзолкова Н.М., 2005).

Однако бактериальные препараты (аллогенные лактобациллы), предназначенные для восстановления микробиоценза влагалища, не оправдали надежд из-за их не высокой эффективности. Это связано с их низкой колонизацией и быстрой элиминацией вводимых бактериальных штаммов из влагалищной среды, а наблюдаемый кратковременный эффект по сути ложноположительный и не предотвращает рецидив бактериального вагиноза. По-видимому, использование чужеродных штаммов лактобацилл не приводит к формированию индивидуального биоценоза влагалища.

Применение биопрепаратов для восстановления биоценоза влагалища, содержащих аллогенные лактобактерии вагинального происхождения «Жмелик» также не оправдали надежды на устойчивое восстановление биоценоза.

В последние годы в России (Ван Ликуй, 2006) и Германии (Я.Кпкаат, 2001) осуществлены попытки выделения аутоштаммов лактобактерий у женщин, страдающих бактериальным вагинозом, до начала антибактериальной терапии. Однако первый автор применил этот способ у 9 женщин с БВ и отметил эффективное приживление собственных лактобактерий во влагалище и снижение рецидивов заболевания. Второй автор предложил только технологию выделения аутоштаммов лактобацил. Маточные культуры, по данным обоих авторов, сохранялись путем лиофилизации.

Предложенные технологии селективного выделения аутолактобацилл трудоёмкие и дорогостоящие, что ограничивает их применение в клинике. Применение живой культуры собственных лактобацилл в доступной литературе нами не найдено.

Таким образом использование аутоштаммов лактобацилл для восстановления биоценоза влагалища является перспективным направлением и требует глубокого клинического изучения.

Цель исследования: оптимизация технологии выделения аутоштаммов лактобацилл и изучение терапевтической и профилактической эффективности коррекции нарушенного биоценоза живой культурой собственных лактобацилл у женщин с бактериальным вагинозом.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние биоценоза влагалища после лечения бактериального вагиноза метранидозолом.

2. Освоить выделение аутоштаммов лактобактерий у женщин, страдающих бактериальным вагинозом с использованием стандартной среды.

3. Усовершенствовать технологию выращивания аутолактобацилл путем использования среды, состоящей из растительного гликогена.

4. Провести рандомизированное исследование для изучения эффективности использования живой культуры аутолактобацилл при восстановлении биоценоза влагалища.

Научная новизна.

Впервые проведены клинические исследования эффективности восстановления биоценоза влагалища живой культурой собственных лактобацилл.

Модифицирована технология выращивания собственных штаммов лактобацилл с использованием среды из растительного гликогена (рац. предложение № 586 от 02.04.08)

Доказано, что у женщин страдающих бактериальным вагинозом применение живой культуры собственных штаммов лактобацилл позволяет эффективно восстанавливать дефицит молочнокислой флоры.

Предложен комплекс современных микробиологических технологий по эффективному восстановлению биоценоза влагалища (рац. предложение № 579 от 5.02.08).

Практическая значимость.

Предложены микробиологические клеточные технологии по аутотрансплантации собственных бактерий.

Разработанные технологии выращивания и трансплантации собственных влагалищных лактобактерий дают возможность эффективно восстанавливать микробиоценоз влагалища, нарушение которого обусловлено воздействием различных факторов.

Применение живой культуры собственных влагалищных лактобактерий имеет явное преимущество перед чужеродными биопрепаратами, доказанное проведенным рандомизированным исследованием.

Положения, выносимые на защиту.

1. Применение санации влагалища па первом этапе лечения бактериального вагиноза приводит к дисбиотическим процессам во влагалище, что удлиняет процесс восстановления нормального биоценоза, а в части случаев приводит к рецидиву заболевания.

2. Стандартные микробиологические технологии селективного выращивания штаммов лактобацилл трудоемки, что затрудняет внедрение их в практическую медицину.

3. Использование растительного гликогена в качестве селективной среды для выращивания лактобацилл позволяет упростить технологию культивирования и получить живую культуру собственных влагалищных лактобацилл.

4. Способ восстановления нарушенного биоценоза влагалища, основанный на использовании живой культуры собственных лактобактерий, позволяет с высокой эффективностью восстанавливать молочнокислую флору влагалища при дисбиотических состояниях.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на Межвузовской конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (г. Самара, 2003, 2004, 2005, 2006). Регионарном научном форуме по вопросам акушерства, гинекологии и педиатрии «Дитя и Мама, Самара 2006», Всероссийском научно-практическом семинаре «Инновационные технологии в акушерстве и

гинекологии» Москва 2006, УШ Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» Москва 2006,1 Международном Семинаре «Инфекция в акушерстве и перинатологии» Москва 2007, Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы репродуктивного здоровья и безопасного материнства» Пермь 2007, Республиканской научно-практической конференции «Инновационные технологии в охране репродуктивного здоровья женщины» Екатеринбург 2007.

Диссертационная работа апробирована на совместном заседании кафедр акушерства и гинекологии №1, общей и клинической микробиологииБ иммунологии и аллергологии, акушерства и гинекологии №2, акушерства и гинекологии ИПО СамГМУ.

Внедрение результатов исследования в практику.

Материалы диссертации внедрены в практическую работу «Клиники репродуктивного здоровья ЭКО», женской консультации муниципальной поликлиники № 1, отделения ВРП «Клинического центра клеточных технологий». Полученные данные используются в учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии № 1 СамГМУ.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них в журналах, рекомендуемых ВАК РФ - 3.

Получено два удостоверения на рационализаторское предложение: № 579 от 5 февраля 2008 г. СамГМУ, № 589 от 2 апреля 2008 г. СамГМУ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, главу результатов собственных исследований и их обсуждения, выводы, практические рекомендации, 8 таблиц, 30 рисунков. Библиография содержит 175 источников, в том числе 110 отечественных и 65 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Настоящая работа состоит из двух частей: микробиологичесих исследований, в которых отработаны методы забора вагинального содержимого, культивирования собственных лактобацилл и заселения влагалища собственными лактобациллами, и клинической части, в которой проведено рандомизированное исследование у пациенток с бактериальным вагинозом с целью изучения терапевтической и профилактической эффективности восстановления

биоценоза плагалнща собственной лактофлорой и аллогепными биопрепаратами (в наших исследованиях был использован «Ацилакт»),

Микробиологические исследования проведены в микробиологической лаборатории ГУЗ СО К В им. МП.Калинина и на кафедре общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ГОУ Ш10 СамГМУ, Росздрава.

Рандомизированное исследование проведено в «Клинике репродуктивного здоровья» г. Самары. В исследование были включены 165 пациенток с бактериальным вагинозом. Микробиолог ические технологии были отработаны на 15 больных.

Для рандомизированного исследования было определено 150 пациенток с бактериальным вагинозом. Данное исследование продолжалось 12 месяцев. На контрольных осмотрах присутствовало 132 пациентки: 70 женщин, которым проведено восстановление биоценоза собственными лактобациллами - I группа, и 62 женщины, которым проведено восстановление биоценоза «Ацилактом» - II группа.

Диагноз бактериального вагиноза верифицировался во время первого посещения на основании наличия трйх из следующих критериев: бели, влагалищное рН > 4,5, обнаружение «ключевых клеток» в микроскопическом препарате, положительные результаты КОН-теста (критерии Амеела) и исключения специфической инфекции.

15 исследуемой группе женщин с бактериальным вагинозом проведено анонимное анкетирование для выявления определяющих (['акторов развития заболевания.

Все проводимые мероприятия были разделены на клинические и лабораторные. Клинические включали общегинскологическое и специальное обследование, проводимые во время приема и консультирования пациенток.

Для исследования отбирались женщины с первым эпизодом БВ. Пациентки, принимавшие в последние две недели перед осмотром антибиотики или использовавшие спринцевания, влагалищные души и место действующие препараты, исключались из исследования. Обязательным условием являлось отсутствие полового контакта в последние 72 часа до обследования. При первом визите проводилось анонимное анкетирование пациенток для получения демографических и анамнестических данных для решения ряда интересующих нас вопросов.

При нервом визиге оформлялось письменное информированное согласие на проведение исследования. Для сбора демографических и других данных использовалась стандартизованная анкета, которая включала вопросы о частоте половых контактов, используемой контрацепции, особенностях интимной гигиены, таких как спринцевание, вид белья и одежды, использования нижнего белья во время спа и т.д.

Планировалось четыре повторных визита: первый через десять дней после 1-го этапа лечения БВ (метроиидазол но 500 мг в течение 7 дней); второй через деся ть дней после 11-го этапа лечения (восстановление биоценоза влагалища культурой собственных штаммов лактобацилл); третий и четвертый визиты соответственно через шесть и двенадцать месяцев. При возникновении рецидива БВ пациентка самостоятельно обращалась к врачу.

Ключевым моментом при проведении лабораторных исследований является изучение параметров влагалищной жидкости (ВЖ).

Проведение микробиологического анализа предусматривало изучение прежде всего биоценоза влагалища у пациенток с БВ с целыо диагностики и эффективности его восстановления в процессе лечения и стойкости излеченное™ данного заболевания.

Влажные препараты для микроскопии готовили тщательным перемешиванием петли выделений с петлей 0,85% нормального физиологического раствора (1-й влажный мазок) и такое же количества белей с петлей 10% раствора КОП (2-й влажный мазок). Эти препараты рассматривали в нескольких нолях при 900-кратном увеличении. В первом случае обращали внимание на наличие ключевых, эпителиальных и ггарабазальпых клеток, скопление бактериальных телец, трихомонад и лейкоцитов. Во втором препарате определяли наличие или отсутствие псевдогифов грибов.

Мазок с левой стснки влагалища наносился на предметное стекло, высушивался и пересылался в лабораторию для окраски но Граму и микроскопии. Микробиолог, проводящий исследование, не знал о том, какой препарат был использован для восстановления биоценоза и нацистки. Для определения среднего количества морфотипов бактерий Lactobacillus, Gardnerella, Bacteroidcs и Mobiluncus использовалась стандартная система подсчета в ноле зрения при 900-кратном увеличении и оценка по шкале Патента (Nugent R.P et all., 1991). После доставки транспортной среды Кэри Блэйр для бактерий-анаэробов образец сразу же помещался в 1,5 мл фосфатного буферного раствора и центрифугировался, затем 100 мкл помещалось на селективный шар Rogosa Lactobacillus. Данная среда содержит Caseinpepton, экстракт дрожжей, глюкозу, TVeen, Kaliumdihydro-тепный фосфат, Ammoniumeitrat, Natriumacttat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, сульфат железа, Calciumcarbonat и Agar.

Засеянный агар Rogosa Lactobacillus икубировался при 37°С в анаэробной камере (Sheldon Laboratories, Cornelius, OR) в течение 48 - 72 часов. Затем чашка использовалась для качественного определения лактобактерий.

После ипден'шфнкации колоний лактобацилл путем микроскопии мазков из них, окрашенных по Граму, производился посев лактобацилл в маточную среду из растительного гликогена, которая также инкубировалась при 37°С в анаэробной камере (Sheldon Laboratories, Cornelius, OR) в течение 48 - 72 часов.

В табл. 1 представлены основные методы, использованные нами для решения поставленных задач исследования.

Таблица 1

Методы мсслслопашш женщин с Ы$ Юшшпсский этан

У Гинекологическое обследование У Анонимное анкетирование У Посев влагалищного содержимого

> Взятие влагалищного мазка

У Определение Ри влагалищного содержимого У Аминотест (реакция с гидроокисью калия)

> Колыюскопия

У Изучение психофизиологического статуса Лабораторным этан

У ПЦР диагностика (исследование специфической микрофлоры влагалища с

помощью полимеразной цепной реации; У микроскопия влагалищного мазка, окрашенного по Граму;

> цитологическое исследование влагалищных мазков;

У определение степени чистоты вагинального содержимого;

> определение кариопикнотического индекса (КГИ);

У бактериологическое исследование - выделение собственных штаммов лактобактернй из вагинального содержимого на селективной среде агар Rogosa Lactobacillus;

> культивирование собственных лактобактерий в среде из растительного

гликогена, после переноса из селективной среды; Вспомогательные исследонашга

> эпидемиологический анамнез; У сбор, хранение, математический анализ; У фотографическое документирование материалов.

С целью изучения терапевтической и профилактической эффективности восстановление биоценоза культурой собственных штаммов лактобацилл п нашей работе использовано рандомизированное двойное слепое исследование.

Сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии № 1 ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава был разработан график рандомизации и обеспечена верификация распределения. Для случайного распределения пациенток с БВ на группы, получавшие культуру штаммов собственных лактобацилл или «Лцилакт», использовалась компьютерная программа -генератор случайных чисел с балансом по десяткам (без участия и информирования врачей, проводящих подбор пациенток). Непрозрачные конверты были пронумерованы случайным образом и содержали информацию об исследуемом препарате для их распределения по группам.

Для получения объективных данных и выявления закономерностей течения, изучаемых процессов применяли стандартные и модифицированные методы статистического исследования.

В работе использован этапный метод математической обработки получаемых результатов, который состоял из следующих последовательных стадий: обоснование однородности и сравнимости исследуемых групп, определение закона распределения случайной величины, выбор метода обработки результатов, статистический анализ полученного материала и компьютерная обработка с использованием как стандартных, так и авторских компьютерных программ (Черкасов С.Н., 1995, 2002).

Полученные данные подвергались статистической обработке, которая осуществлялась с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1, фирмы Stat Soft). Для оценки статистической достоверности различий между категориями использовались метод хи-квадрат и критерий Фишера, а для оценки непрерывных переменных применялся t- тест с поправкой для неравной дисперсии. Оценка различий для количеств и результатов проводилась при помощи регрессионной модели. Логистическая регрессия использовалась для бинарных результатов с целыо расчета уровня Р для сравнения между группами пациенток. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стыодсита и его аналогу для непараметрических распределений - Критерию Маппа-Уитни. Достоверными считали различия при степени доверительной вероятности 95% и выше (Углов Б.А., Котельников Г.П., Углова М.В., 1994).

Для анализа и интерпретации результатов исследований использовали средства обработки данных статистического пакета STATISTIKA (версия 6) фирмы StatSod (Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1998; Боровиков В.П., 2003), табличного процессора Microsoft Excel 2002 (Новиков Ф.А., Яценко А.Д., 1999) и пакета MathCad 2001 (Макаров Е.Г., 2003).

Для процесса статистического анализа использовалась ПЭВМ класса Pentium-lV с тактовой частотой 2,4 Ггц, ОЗУ 512 Мб и операционной системой Windows-XP.

Результаты исследовании и их обсуждение

Все 165 пациенток были репродуктивного периода, средний возраст составил 31,0±2,27 год. Из них 29 (17,6%) женщин были связаны с физическим трудом и 117 (70,9%) - с интеллектуальным, 19 (11,5%) являлись домохозяйками. Из всех женщин 81 (49,1%) имели высшее образование, 32 (19,4%) - среднее специальное и 52 (31,5%) - только среднее.

Из опрошенных женщин больше всего было замужних (97 или 58,8%), к которым себя причисляли пациентки, ведущие совместное проживание без регистрации брака (23 или 13,9%), Остальные были одинокие, разведенные и вдовы. Возраст вступления в брак варьировал от 18 до 35 лег, но в среднем был равен 22,1,6 года.

Анализ анкетирования показал, что 63,7% нацисток с БВ начали половую жизнь до замужества и 36,3% - в браке. Обращают на себя внимание данные о периоде между началом половой жизни и вступлением в брак. Так, среди 105 анкетированных больных, которые начали половую жизнь до замужества, 34% вступили в брак через год, 16% - через два, 15% - через зри, 20% - через четыре, 15 - через пять и более лет после начала сексуальной жизни. То есть у 63,7% больных с БВ до замужества был довольно продолжительный период с относительно частой сменой половых партнеров.

Анализ активности сексуальной жизни среди 165 пациенток с БВ показал, что у 27,7% больных отмечена моногамность в сексуальных отношениях, 2-3 половых партнеров имели 48,3% и более грех - 24%. Среднее число половых партнеров составило 3,3 ± 0,28.

Ритм половой жизни в данной группе женщин составил: у 17,5% меньше одного раза в педелю, у 39,1% - 2 - 3 в педелю и у 39,4% - 4 - 8 в неделю.

Контрацепцию использовало 72% женщин: ВМС применяли 15,5% пациенток, ГОК -6,7%, механическую -25,3%, физиологическую - 9%, спринцевания - 15,5%.

В настоящее время достаточно четко сформулированы подходы к лечению дисбиоза влагалища. Европейские стандарты предлагают одпоэтапное лечение, заключающееся в применении антибактериальных препаратов воздействующих на анаэробную флору. Российские стандарты предполагают второй этап лечения - восстановление микробиоценоза влагалища пробиотиками и снмбиотнками (Кира Е.Ф., 1995, 2001, 2007; Сметник В.П., Тумнловнч Л.Г., 2001; Серов ВН., 2005; Подзолкова U.M., Глазкова О.Л., 2005).

Однако бактериальные препараты (аллогенпые лактобациллы растительного или кишечного происхождения), предназначенные для восстановления микробиоценза влагалища, не оправдали надежд из-за их малой эффективности. Это связано с низкой колонизацией и

бысгрой элиминацией вводимых чужеродных бактериальных штаммов из влагалищной среды, которая является для них нехарактерным биотопом. Наблюдаемый кратковременный бактериологический эффект по сути ложноположительный и не предотвращает рецидив бактериального вагиной. Применение биопрепаратов для восстановления биоценоза влагалища, содержащих аллогенные лактобактерии вагинального происхождения «Жмелик» также не позволили достичь устойчивого восстановления биоценоза.

Кроме того, интенсивная антибактериальная терапия, в которой препаратами выбора являются мстронидазол и клиндамицин, ликвидируя условно-патогенные микроорганизмы, не создает условий для восстановления нормальной микрофлоры влагалища, что в свою очередь приводит к развитию рецидивов вагиноза в различные сроки лечения (Ван Ликуй, 2006).

В ходе проведенного нами рандомизированного исследования в рамках данной работы рецидивы бактериального вагиноза через 6 месяцев после восстановления биоценоза «Ацилактом» у 60 пациенток были в 10% случаев, а в течение года в 25% случаев.

Эти результаты согласуются с данными других авторов. Hiller S., Holmen K.K, (1990) указывают на рецидивы бактериального вагиноза через 3-6 месяцев после лечения в 15 - 30% случаев, а Wilson J. (2004) через 1 год после лечения выявил рецидив заболевания в 50 - 70% случаев.

Аналогичные проблемы возникают у женщин во время беременности. Так, по данным Стрижакова А.Н. и соавт., (2003) в 10 - 15% наблюдений после лечения бактериального вагиноза у беременных отмечаются рецидивы заболевания, в 6 - 12% случаев развивается вагинальный кандидоз.

Эти же авторы отмечают, что необходимым условием для начала восстановления биоценоза влагалища является бактериоскопичсское подтверждение эффективности воздействия антибактериального препарата и отсутствие элементов грибов.

Состояние микробиоцеиоза влагалища на 3 сутки после лечения метронидазолом нами изучено у 125 пациенток с ВВ. У всех пациенток при предварительном обследовании были исключены хламидиоз, трихомопиаз, гонорея, сифилис, ВИЧ-инфекция.

Терапия назначалась в соответствии с Европейскими стандартами лечения БВ (2003): мстронидазол по 500 мг два раза в день в течение 7 дней.

При микроскопии окрашенных по Граму ваг инальных мазков на 3 сутки после лечения метронидазолом в вагинальном микробиоцензе было выявлено четыре варианта бактериально-клеточных ассоциаций.

Вариант I-41,0 %

Рис 1. Вариант! - «стерильный биотоп» влагалища

1 вариант биоценоза характеризовался почти полным отсутствием как лактобациллярной флоры, так и отсутствием бактериальной микрофлоры, спор, мицелия, псевдогифов, наличием единичных лейкоцитов и «чистых» эпителиальных клеток. Подобная картина встречается у 41% женщин после санации метроиидазолом и мы его условно назвали «стерильным битопом» влагалища (рис. 1).

Рис. 2. Вариант II - «формирующийся биотоп» влагалища

II вариант биоценоза характеризовался умеренным количеством лактобацилл, которые, однако, значительно доминируют над другой бактериальной флорой: грамположительными кокками, храмотрицательными палочками и др.; обнаруживаются единичные лейкоциты, эпителиальные клетки. Подобная картина встречается у 27,9% женщин после санации метронидазолом и мы его условно назвали «формирующийся биотоп» влагалища (рис. 2).

Вариант III-15,2 %

Рис. 3. Вариант III - «воспалительный биотоп» влагалища

/// вариант биоценоза, выражался в незначительном количестве или полном отсутствии лактобацилл, в наличии большого количества лейкоцитов и эпителиальных клеток, обильной полиморфной грамотрицательиой и грамположительной палочковой и кокковой микрофлоры. Подобная картина встречается у 15,2% женщин после санации метронидазолом и мы его условно назвали «воспалительный биотоп» влагалища (рис. 3),

IV вариант биоценоза - полимикробная картина мазка, большое количество лейкоцитов, эпителиальных клеток, наличие спор, мицелия, псевдогифов. Подобная картина встречается у 15,9% женщин после санации метронидазолом и мы его условно назвали «кандидозным биотопом» влагалища (рис. 4).

Вариант IV - 15,9 %

Рис. 4. Вариант IV - «кандидозный биотоп» влагалища.

Анализируя сформировавшийся микробиоценоз влагалища после лечения БВ метропидазолом, можно предположить, что третий и четвертый варианты являются основными источниками возможного рецидива БВ и развития вагинального кандидоза.

Для подтверждения данной гипотезы мы провели ретроспективный анализ исходного состояния биоценоза среди женщин, у которых в течение 12 месяцев после восстановления микробиоценоза влагалища «Ацилактом» и культурой собственных лактобацилл был отмечен рецидив заболевания.

Всего с рецидивом заболевания оказалось 25 женщин: из группы, где использован «Ацилакт» - 20 пациенток, а из другой группы - 5 пациенток.

Как видно из представленной диаграммы (рис. 5) II вариант биоценоза, при котором преобладают лактобациллы над остальной флорой, даёт всего 4% рецидивов БВ, / вариант биоценоза (условно стерильный биотоп) - 24% рецидивов заболевания. При IV варианте биоценоза в 24% случаев также выявлены рецидивы, однако у 2/3 женщин с данным вариантом биотопа развивается кандидозный кольпит.

Наибольшая частота случаев рецидивов заболевания выявлено при /// варианте биоценоза влагалища (48%), что статистически достоверно выше по сравнению с группой женщин со II вариантом биоценоза (р < 0,01). Также достоверные различия получены в сравнении с группами женщин с I и IV вариантом биоценоза (р < 0,05).

я I вариант я II вариант ■ III вариант ш IV вариант

Рис. 5. Соотношение рецидивов БВ в зависимости от варианта сформировавшегося микробиоцепоза после лечения метронидазолом

Таким образом, наиболее благоприятным является формирование второго варианта биоценоза влагалища после лечения метронидазолом. Формирование «условно стерильного биотопа» и «воспалительного биотопа» приводит в основном к рецидиву БВ, а IV вариант биоценоза в большинстве случаен является источником кандидозного кольпита.

Учитывая высокую частоту рецидивов заболевания при восстановлении биоценоза влагалища «Ацилактом», можно утверждать, что использование чужеродных штаммов лактобацилл не приводит к формированию индивидуального биоценоза влагалища.

В этой связи целесообразен поиск способов восстановления именно индивидуального микробиоценоза.

Использование аутоштаммов лактобактерий для восстановления биоценоза после антибактериальной терапии бактериального вагиноза применил Ван Ликуй (2006) у 9

пациенток. Выделение чистой культуры собственных штаммов лактобактерий, полученных из влагалища до начала антибактериальной терапии, производилось путем неоднократного пересева в ламинарном боксе на среде MRS, маточные культуры сохранялись путем лиофнлизации. Аутоштаммы вводились в течение 10 дней интраватинально. Согласно полученным данным, после комплексного лечения у всех женщин в мазке исчезали «ключевые клегки», значения pH вагинального отделяемого не превышало 4,5, амшшый тест был отрицательным.

В 2001 году в Германии R. Kirkaam и Е. Becker запатентовали средство для лечения дефицита бактерий и метод его производства (DE 199 63 104 Л I). Основу лекарства составляли аутоштаммы бактерий, полученных от человека или млекопитающих животных, а метод заключался в последовательном культивировании на селективной среде бактерий из взятой пробы. После получения достаточного количества бактерий, производилась лекарственная форма. Технологию селективного выращивания аутоштаммов бактерий авторы рассмотрели па примере выращивания вагинальных лактобацилл и предложили лечение недостатка лактобацилл при бактериальном вагинозе собственными вагинальными лактобактериями.

Следует отмстить, что использование аутоштаммов лактобацилл для коррекции биценоза и лечения бактериального вагиноза до сих пор не применяется в практическом здравоохранении. По-видимому, что связано с дорогостоящей и трудоемкой технологией селективною выращивания собственных лактобацилл.

Для коррекции дисбнотических состояний во влагалище аутоштаммами лактобацилл нами разработана и предложена модификация способа селективного выделения и культивирования аутоштаммов лактобацилл с использованием маточной среды из растительного гликогена, в которую заселяются лактобациллы после первого выращивания их па селективной среде (рационализаторское предложение СамГМУ № 589 от 9 апреля 2008 г).

Как известно, питательным субстратом для рассматриваемой группа бактерий является гликоген эпителиальных клеток влагалища. В результате температурного и кислотного гидролиза во влагалище гликоген расщепляется до полисахаридов. Их полный гидролиз в присутствии кислот и специфических ферментов дает моносахариды, которые и включаются в анаэробный гликолиз. Преобладающей моносахаридной единицей полисахаридов является D-глюкоза.

Главными резервными полисахаридами в природе являются у животных гликоген и крахмал у растений. Они состоят из D-глюкозидных единиц и представляют собой гомополисахариды (рис. 6).

C.IUHI

\.............—()

ц;и (in

Вся юь

о '¡мкиввпидашя

¡СИ

пыш г:н,С1Н

J--......н. .........

\ /

П 1,011

/ \.

.....1 !

.....,JW[+.....IW

а. ( t-+4 )-це/ib

Рис. 6, Строение крахмала и гликогена (Л. Ленипджер, Биохимия. М.: Мир, 1974, с. 272).

Крахмал существует в двух формах, а именно в форме • -амилозы и форме амилоиектина. Первая форма (I -амилоза) состоит из длинных неразвегвленных цепей, в которых все D-глюкозидные единицы сосденены Г 1,4 связями. Амилоза может быть гидролизирована до глюкозы и мальтозы. Остов молекулы амилоиектина имеет гликозидные связи П 1,4 - тина, но связи в точках ветвления относятся к I 1 1,6 - типу. Амилопектин полностью расщепляется на глюкозу и мальтозу. Содержание амилозы в крахмале составляет 10 - 30%, амилоиектина - 70-90%.

Гликоген представляет собой полисахарид, в котором D- глюкозидные единицы соединены I I 1,4 связями. Связи в точках ветвления принадлежат к II 1,6 типу. Гликоген легко гидрализуется до глюкозы и мальтозы.

Таким образом, гликоген по своему строению идентичен крахмалу, а их эмпирическая формула единая (С6НЮ05)п.

Учитывая однородное строение гликогена и крахмала, последний был нами использован как накопительная среда растительного происхождения для культивирования лактобацилл.

Микроскопия мазков из накопительной среды (рис. 7, 8, 9, 10, 11) показала, что процесс размножения в среде из растительного гликогена идет динамично и через 4 - 5 дней определяются однородные грамположительные палочки в количестве 60 - 100 в каждом поле зрения при 600-кратиом увеличении, другая флора не виализируется. Среднее значение рН среды снижается 3,8 ± 0,11.

При идентификации микробных культур в маточной среде из растительного гликогена после культивирования установлено, что Ьас/оЬос/11п.1 хрр. выявляются в количестве 104 и более КОЕ/г и в концентрации 6,5±0,2| КОЕ/г, В$с1оЬас1епит хр/>. в количестве 10 и менее КОЕ/г и в концент рации 1,17 ± 0,11 КОН/г. Другая микрофлора не выделялась.

При анализе данных, полученных от 15 пациенток, оказалось, что семидневный период инкубации от забора материала до готовой маточной среды достаточен, после чего её можно использовать для восстановления индивидуального микробиоценоза влагалища женщины.

Рис.7. Мазок из стерильной маточной среды перед заселением в неё лактобактерий. х 600. Окраска метиленовым синим.

;. ' •.■ -....

Щ 1Щ

Рис. 8. Лактобактерии и стрептококки в маточной среде после однодневного культивирования. Пациентка С. х 600. Окраска метиленовым синим.

Рис. 9. Лактобактерии в маточной среде после трёхдневного

культивирования. Пациентка В. х 600. Окраска по Граму.

I-

Ж ' ■

Ш

Ц

§

Ш

Рис. 10. Лактобактерии в маточной среде после четырехдневного

культивирования. Пациентка С. х 600. Окраска метиленовым

Рис. i 1. Лактобактерии в маточной среде после пятидневного

культивирования. Пациентка К. х 600. Окраска метиленовым синим.

Использование растительного гликогена в качестве маточной среды упрощает и удешевляет получение в достаточном количестве собственных штаммов лактобацилл, что существенно отличает нашу технологию получения аутоштаммов лактобацилл от классических технологий, которые применили R. Kirkaam, Е. Becker (2001) и Ван Ликуй (2006).

Терапевтическая и профилактическая эффективность собственных штаммов лактобацилл при лечении БВ была изучена путем проведения рандомизированного исследования, в которое был включено 150 женщин с данным заболеванием. В результате рандомизации 66 женщинам восстановление биоценоза проведено культурой собственных штаммов лактобацилл (! группа) I и 65 женщинам аллогенным препаратом «Ацилакг» (II группа). Данное исследование

продолжалось 12 месяцев.

Терапевтическая эффективность была исследована с применением критериев клинического улучшения, восстановления микробиоценоза влагалища и исчезновением объективных симптомов, сопровождающих эту инфекцию. Профилактическая эффективность определилась но количеству повторных инфекций, которые имели место в течение всего I периода наблюдения, т. е. мы применили те показатели, которыми пользуются большинство

исследователей этой проблемы (Кира А.Ф., 2001; Будаиов П.В., Баев О.Р., 2002; Ван Ликуй, 2006).

При анализе данных динамического наблюдения и клнннко-лабораторных исследований результаты, полученные после применения культуры собственных штаммов лактобацилл для восстановления индивидуального микробиоценоза, были существенно выше, чем в группе женщин с использованием чужеродных лактобацилл.

В результате изменения состава микробиоценоза влагалища иод воздействием жизнедеятельности бактерий в 1-й группе значительно улучшились его показатели, которые характеризовались при микроскопии мазков окрашенных по Граму у 51 (82,2%) женщин как нормоценоз, у 11 (17,8%) - как промежуточный тип уже к третьему месяцу наблюдения. Во 11-ой группе к третьему месяцу наблюдения женщин с нормоценозом было достоверно ниже, чем в 1-й группе: нормоценоз - у 37 (61,7%), промежуточный тип - у 19 (31,7%), дисбиоз влагалища - у 3 (5%), микотический вагинит - у 1 (1,7%).

Через зри месяца после окончания лечения стойкий клинический эффект (нормоценоз влагалища) отмечен 82,2% пациенток, применявших для восстановления биоценоза влагалища культуру собственных штаммов лактобацилл, и у 61,7% - применявших препарат «Ацилакт».

Ни у одной женщины из 1-й группы в мазках не были обнаружены элементы грибов, в то время как во П-й группе у одной женщины клинически развился микотический вагинит и у двух женщин из трех с дисбиозом влагалища была отмечена смешанная кандидозно-бактериальная инфекция.

Динамика восстановления биоценоза влагалища до нормоценоза достоверно различается в зависимости от способа его восстановления. При использовании культуры собственных лактобактерий уже через три месяца у большинства женщин (82,2%) формируется нормоценоз, достигая максимальных цифр (88,7%) к шести месяцам после лечения, а концу исследования прирост составил всего 1,5%.

При использовании чужеродных бактерий, препарат «Ацилакт», нормоценоз восстанавливается к трем месяцам у 61,7% пациенток, к шести месяцам - у 71,4% и к двенадцати месяцам - у 78%. Темп и объём восстановления во 11-й группе женщин достоверно отличался от значений их в 1-й группе (р<0,05).

Промежуточный тип биоценоза влагалища в три раза чаще формировался у пациенток 2-й группы, и такое соотношение сохранялось до конца исследования. Так, при последнем контрольном исследовании данный тип биоценоза выявлен у 2 (3,3%) пациенток 1-й группы и у 6 (12%) женщин П-й группы. Во все контрольные обследования изменения значений между группами женщин были статистически значимы (р<0,05). По-видимому, группа пациенток с промежуточным типом биоценоза чаще дает рецидивы заболевания.

Во П-й группе женщин рецидивы заболевания были выявлены при каждом контрольном осмотре: через 3 месяца - у 4 пациенток, через 6 месяцев - у 6 пациенток, через 12 месяцев - у 5 пациенток. При бактериоскопии и клинически из них у 5 пациенток выявлен кандидозпый вагинит и у 10 - бактериальный вагнноз, при чем у 4 из 10 пациенток с бактериальным вагинозом бактериоскопически определялась смешанная кандидозно-бактериальная инфекция.

В 1-й группе женщин был рецидив заболевания у 1 пациентки через шесть месяцев и у 4 пациенток через двенадцать месяцев. Следует отметить, что в этой группе женщин не было случаев кандидозных вагинитов и бактериоскопически не выявлялась смешанная кандидзно-бактериальная инфекция.

Другие объективные параметры, такие как бели и запах, влагалищное pH, аминный тест также имели свою динамику в зависимости от способа восстановления биоценоза влагалища.

Как следует из результатов проведенного рандомизированного исследования, применение собственных штаммов лактобацилл позволяет значительно эффективнее, чем аллогенными штаммами, восстанавливать уровень молочнокислых бактерий во влагалище и снижать риск возникновения рецидивов бактериального вагиноза.

Как известно, эффективный препарат-пробиотик должен обладать набором биологических свойств, позволяющим ему колонизировать определенную микроэкологическую нишу и успешно конкурировать с потенциальными патогенами (Шляпников М.Е., 2005; Кафарская Л.И., Инжеваткина С.М., 2005).

Способность к адгезии является одним из важнейших свойств микроорганизмов, способствующих формированию определенных микробных ценозов, в том числе и аутохтонных ценозов, ведущая роль в которых принадлежит лактобактериям (Кафарская Л.И., Тарабрина Н.П., Ефимов Б.А., 2005).

Наши данные подтверждают эти положения. Высокая адгезивность и колонизационная способность аутоштаммов лактобактерий по сравнению с аллогенными штаммами обеспечивает достоверные различия в формировании нормоценоза влагалища и развитии рецидивов бактериального вагиноза при их применении.

Суммируя результаты испытаний аллогенных штаммов и аутоштаммов лактобацилл, мы пришли к заключению, что лактобациллы обладают генетической гетерогенностью, обуславливающую определенную специфичность по отношению к хозяину. Таким образом, аутоштаммы - это тот фенотип лактобактерий, который формирует индивидуальный биоценоз влагалища женщины.

ВЫВОДЫ

1. Антибактериальная терапия бактериального вагиноза метранидазолом приводит к

снижению уровня неспорообразующих анаэробных бактерий, в том Числе и лактобацилл, но не влияет на популяционные уровни грибов рода Candida, которые формируют в 15,9% случаев «кандидозный биггоп» влагалища.

2. Санация влагалища метронидазолом приводит к формированию четырёх вариантов

биоценоза: вариант I - «стерильный биотоп» влагалища (41%), вариант И -

«формирующийся биотоп» влагалища (27,9%), вариант III - «воспалительный биотоп» влагалища (15,2%) и вариант IV - «кандидозный биотоп» влагалища (15,9%). Рецидивы бактериального вагиноза достоверно связаны с формированием после антибактериальной терапии «воспалительного биотопа» в 48%, «стерильного биотопа» в 24% и «кандидозного биотопа» в 24% случаев.

3. Использование растительного гликогена в качестве накопительной среды упрощает

получение в достаточном количестве собственных штаммов лактобацилл.

4. Аутоштамы вагинальных лакгобактерий обеспечивают эффективное восстановление молочнокислой флоры влагалища и формируют индивидуальный биоценоз влагалища, с чем связано достоверное снижение рецидивов бактериального вагиноза по сравнению с использованием для восстановления флоры влагалища аллогенных штаммов лакгобактерий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Следует учитывать, что после лечения бактериального вагиноза формируется четыре

варианта биоценоза: условно «стерильный биотоп», «формирующийся биотоп», «воспалительный биотоп» и «кандидозный биотоп», которые соответственно встречаются в 41%, 27,9%, 15,2% и 15,9% случаев.

2. Наиболее благоприятным является формирование второго варианта биоценоза

влагалища после лечения метронидазолом. Формирование «условно стерильного биотопа» и «воспалительного биотопа» приводит в основном к рецидиву БВ, а IV вариант биоценоза в большинстве случаев является источником кандидозного кольпита.

3. Необходимым условием для начала восстановления биоценоза влагалища является

бактериоскопическое подтверждение эффективности воздействия антибактериального препарата и отсутствие элементов грибов.

4. Гликоген растительного происхождения может быть использован как накопительная

среда для молочнокислых бактерий.

5. Собственные лактобациллы влагалища могут быть выделены у женщин до начала

лечения бактериального вагиноза, их применение снижает риск возникновения рецидивов заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРАЦИИ

1. Миронова Н.Г. Восстановление нарушенного биоценоза влагалища культурой собственных лактобацилл /В.А. Мельников, H.A. Краснова, О.Б. Калинкина, Н.Г. Миронова, Э.Т. Нурмухаметова, О.В. Тюмина // Материалы 8-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - Москва, 2006. - С. 456.

2. Миронова Н.Г. Бактериальный вагиноз. Новый метод восстановления биоценоза влагалища / H.A. Краснова, Н.Г. Миронова // Вестник Самарского государственного университета. - Самара, 2006. - № 6/2 (46). - С. 95 - 99.

3. Миронова Н.Г. Снижение частоты осложнений беременности при восстановлении биоценоза влагалища у женщин с синдромом поликистозных яичников / О.Б. Калинкина, В.А. Мельников, Н.Г. Миронова, Т.С. Высоцких, М.А. Усова // Материалы первого регионального научного форума «Мать и Дитя». - Казань, 2007. - С,254-255.

4. Миронова Н.Г. Состояние биоценоза влагалища при беременности. Эффективность ранней коррекции / H.A. Семенова, Е.В. Павленко, М.А. Усова, Т.С. Высоцких // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск, 2007. -С.173.

5. Миронова Н.Г. Клиническая эффективность применения культуры собственных лактобацилл для восстановления биоценоза влагалища / В.А. Мельников, H.A. Краснова, Т.С. Высоцких, Н.Г. Миронова, Е.А Чернышева // Пермский медицинский журнал. - 2007. - Т. 24, №1-2. - С.36-38.

6. Миронова Н.Г. Восстановление нарушенного микробиоценоза влагалища у беременных в I триместре беременности / В.А. Мельников, Э.Т. Нурмухаметова, Е.А. Чернышева, Н.Г. Миронова, М.А. Усова // Материалы I Международного семинара «Инфекция в акушерстве и перинатологии». - Москва, 2007. - С.101 -102.

7. Миронова Н.Г. Основные репродуктивные проблемы молодежи в современных условиях / В.А. Мельников, H.A. Краснова, О.Б. Калинкина, О.В. Тюмина, Е.Е. Пилягина, М.А.Усова, А.П.Тикина, H.A. Семенова, Н.Г. Миронова, В.Ю. Щукин, Д.М. Юсупов, М.Х. Беккиева, Е.А.Чернышова, Е.В. Ермолаева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2008. - Спец. выпуск. -Том 1.С. 34-41.

СВИДЕТЕЛЬСТВА НА РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ:

1. Миронова Н.Г. Способ коррекции дисбиоза влагалища после антибактериальной терапии / Т.С. Высоцких, Е.А. Чернышева, Н.Г. Миронова, Д.М. Юсупов. Рационализаторское предложение № 579, принятое СамГМУ от 14.02.08 г.

2. Миронова Н.Г. Способ выращивания культуры влагалищных аутолактобацилл /В.А. Мельников, Т.С. Высоцких, Н.Г. Миронова, О.Б. Калинкина, H.A. Краснова, М.А. Усова, А.П. Тикина. Рационализаторское предложение № 589, принятое СамГМУ от 02.04.08 г.

ДЕНИСОВА

НАТАЛЬЯ ГЕОРГИЕВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММОВ СОБСТВЕННЫХ ЛАКГОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НАРУШЕННОГО БИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА

14.00.01 - акушерство и гинекология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук ГОУ ВПО

«Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Подписано в печать: 22.05.2009 г. Формат: 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем: 1,63 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 593

Отпечатано в типографии ООО «Издательство СНЦ» 443001, Самара, Студенческий пер., За тел.: (846) 242-37-07