Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Применение препаратов коллагеназы для лечения ран и рубцов кожи

На правах рукописи

БОНДАРЕВ Сергей Викторович

ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ КОЛЛАГЕНАЗЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАН И РУБЦОВ КОЖИ

14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2005

Работа выполнена в Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова

Научный руководитель -

доктор медицинских наук профессор ПАРАМОНОВ Борис Алексеевич

Официальные оппоненты::

доктор медицинских наук профессор БАИНДУРАШВИЛИ Алексей Георгаевич

доктор медицинских наук профессор СИНЕНЧЕНКО Георгий Иванович

Ведущая организация: Центральный Военно-клинический госпиталь № 3 им. A.A. Вишневского

Защита состоится апреля 2005 г. в 1400 часов на заседании

диссертационного совета Д 215.002.10 в Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова

Автореферат разослан

«¿г»

марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор ДУЛАЕВ Александр Кайсинович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Лечение ран относится к числу наиболее древних, но не стареющих проблем практической хирургии. Несмотря на обилие препаратов для местного лечения ожогов и ран, совершенствование методов их лечения по-прежнему остается актуальной задачей [Кузин М. И., Костюченок Б.М., 1990; Парамонов БА и др., 2000]. В настоящее время 35-49% больных хирургического профиля составляют пациенты с гнойно-воспалительными заболеваниями [Даценко Б.М., 1995]. По данным Министерства Здравоохранения РФ, пациенты отделений гнойной хирургии составляют 5-7% от всех больных. Послеоперационные осложнения у плановых больных составляют около 1% всех оперируемых случаев. Пациенты с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами составляют до 1,5% от всего населения, 10% от числа всех больных общехирургических стационаров [Савельев B.C., 1972].

К настоящему времени для терапии ран, ожогов и трофических язв предложено большое количество (более 1000) препаратов и методов лечения [Гостищев В.К. и др., 1996; Машковский М.Д., 2000; Парамонов Б А. и др., 2000]. Расширение познаний о закономерностях заживления ран привело к тому, что их лечение стали проводить дифференцированно в зависимости от глубины поражения, стадии раневого процесса, локализации поражения и от ряда других факторов [Камаев М.Ф., 1989]. При этом, используются медикаментозные препараты с различным механизмом действия. Весьма важной задачей в лечении является активация отторжения некротических тканей, адсорбция токсического отделяемого раны, т.е. продуктов микробного и тканевого распада [Даценко Б.М., 1995]. Для этой цели целесообразно применять препараты, обладающие протеолитической активностью и сорбенты [Парамонов Б А. и др, 2000]. В связи с тем, что коллаген в коже и других тканях представлен широко, применение ферментов с коллагенолитической активностью является обоснованным. В настоящее время наиболее широко известен препарат «Ируксол», в состав которого входит коллагеназа, полученная из клостридий [Машковский М.Д., 2000].

Другой важной сферой применения коллагеназ является лечение патологических рубцов кожи [Парамонов БА и др., 2000]. Патологические рубцы кожи возникают после ожогов и травм, а также после выполнения плановых операций [Дельвиг A.A., 1995; Малыхина Т.В., 2000; Litoux P. et al., 1986; Norris J.E., 1991; Warwick D.J., Dickson WA, 1993]. Располагаясь на открытых участках кожи, а

особенно на лице, шее, груди, патологические рубцы не только обезображивают человека, но и приводят к деформациям различных органов, что часто сопровождается нарушениями их функции, а также неприятными ощущениями [Вихриев Б.С., Бурмистров В.М., 1986; Юденич В.В., Гришкевич В.М., 1986]. Выраженность развивающихся деформаций зависит от длительности существования ран [Boecxk W. et al., 1990]. У таких пациентов существенно снижается качество жизни. В ряде случаев возникновение грубых рубцов приводит к инвалидизации и к развитию нервно-психических расстройств, вплоть до случаев тяжелой депрессии [Лосицкая В М., Бурьянов A.A., 1987; Озерская ОС, 2002; Simmons D.A., 1996].

В связи с этим разработка и совершенствование методов лечения ран и патологических рубцов кожи является актуальной задачей.

Цель исследования

Совершенствование методов лечения ран и патологических рубцов кожи применением препаратов, обладающих коллагенолитической активностью.

Задачи исследования

1. В опытах in vitro провести сравнительную оценку коллагенолитической активности ряда протеаз.

2. Провести комплексное исследование влияния коллагеназы на течение раневого процесса и изучить клиническую эффективность раневого сорбента «Колладиосорб» и мази «Ируксол» при лечении трофических язв и ран.

3. Изучить изменения водного баланса в ткани рубцов кожи в процессе лечения препаратами коллагеназы методом КВЧ-диэлектрометрии.

4. Определить эффективность применения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи.

Научная новизна

1. В опытах in vitro изучены биохимические особенности действия коллагеназ различного происхождения.

2. Впервые проведена комплексная оценка влияния коллагеназ на течение раневого процесса.

3. В ходе клинических исследований изучены изменения водного баланса рубцовой ткани при воздействии коллагеназ.

Практическая значимость

1. Обоснованы показания к применению и способы применения препарата «Колладиосорб».

2. Определены показания к применению, дозировки и способы введения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи.

3. Установлены физические критерии эффективности проведения противорубцовой терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Для оценки in vitro коллагенолитической активности протеаз следует использовать методы характеризующие интенсивность и полноту гидролиза.

2. Для лечения ран и трофических язв в I стадию раневого процесса целесообразно применять комплексные препараты, включающие коллагеназу («Колласорб», «Колладиосорб»), обеспечивающие сорбцию раневого экссудата и очистку ран от омертвевших тканей.

3. Введение в ткань патологических рубцов кожи препаратов коллагеназы приводит к разрушению избыточного коллагена и изменению соотношения в ткани белков и гликозаминогликанов, что проявляется увеличением доли структурированной («связанной») воды в ткани.

Апробация работы и реализация результатов исследования

Основные результаты диссертации доложены на YIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по проблемам термических поражений (Нижний Новгород, 2004) и конференции слушателей I факультета ВМедА (2004).

Результаты исследования внедрены в практику работы кафедры физиотерапии ВМедА, кафедры пластической и эстетической хирургии СПбМАПО, медицинского центра «Демос». Полученные данные используются в преподавании на кафедре пластической и эстетической хирургии СПбМАПО.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка

литературы, включающего 175 источника, из них - 85 иностранных авторов Работа иллюстрирована 25 таблицами и 29 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы в методы лечения

Работа базируется на данных биохимических, гистологических и цитологических исследований, опытов, проведенных на 53 животных, и 61 клинических наблюдений.

Исследования выполнены в клиниках экспериментальных животных №1 и 2 ВМедА, физиотерапевтическом отделении кафедры физиотерапии и курортологии ВМедА, лаборатории кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ВМедА, биохимической лаборатории и лаборатории электронной микроскопии НИИ Особо Чистых Биопрепаратов (г. Санкт-Петербург)

Изучали следующие виды коллагеназы «Коллагеназа-КК» (ТИБОХ ДВО РАН г. Владивосток), «Коллагеназа» из Clostridium hystoliticum («Алтай-витамины» г Екатеринург), «Коллализин» ( «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» г. Санкт-Петербург), «Поликоллагеназа-К» и «Коллагеназа очищенная для косметологии» (оба -производства «С-Пб-Технология», г. Санкт-Петербург) Кроме того, изучали сорбент раневой дренирующий биологически активный «Колладиосорб» («Росми», Москва) и мазь «Ируксол» («ПЛИВА» Загреб, Хорватия)

В ходе биохимических исследований определяли следующие виды активности фермента. Для определения коллагенолитической активности, выражающейся в миллиграммах интактного коллагена, гидролизованного миллиграммом фермента в единицу времени, использовали методику Bourn в модификации Стальной ИД (1977) Данный метод характеризует качественный аспект процесса, в то же время активность, выраженная в единицах Mandl (Sigma, Cat #C0299), представляет количественный аспект (глубину) гидролиза коллагена

Амилолитическую активность ферментов оценивали по методу Каравея В основе метода лежит гидролиз крахмала с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом Об активности судят по уменьшению интенсивности окраски.

Эксперименты, выполненные на животных

Общая характеристика экспериментов, выполненных на животных приведена в

табл 1

Таблица 1

Общая характеристика материала

Опытные группы Количество животных

1 2 Ожог Ш-а степени Аппликация исследуемых растворов ферментов после начала отторжения струпа Ожог ГО-б степени Аппликация исследуемых растворов ферментов после начала отторжения струпа 8 крыс 8 крыс

3 Моделирование длительно незаживающей раны, получаемой внутрикожным введением 10% раствора додецилсульфата натрия, аппликация растворов ферментов на 7-е и 10-е сутки 8 крыс

4 Лечение ран, образовавшихся после срезания дерматомом ДПЭ-30 расщепленных лоскутов кожи у крыс 15 крыс

5 Лечение ран, образовавшихся после срезания клеевым дерматомом расщепленных лоскутов кожи у собак 4 собаки

6 Аппликация растворов ферментов на полнослойные раны кожи (в виде кольца) у крыс 10 крыс

Итого крысы собаки 49 4

Моделирование длительно незаживающей раны производили внутрикожным введением 0,3 мл 10% раствора додецилсульфата натрия в 6 местах вводили, в результате чего формировались папулы диаметром 4 мм Впоследствии в местах введения образовывалась прочная корочка струпа, которая начинала отторгаться на 810 сутки, после чего формировалась длительно незаживающая рана Таким образом, на каждой крысе одновременно испытывали действие обоих ферментов (производства «СПб - Технология» и «ТИБОХ») из расчета 1 мг на рану и проводили сравнение с контролем (0,9% раствор №С1) и учитывали результаты по 2 участкам

У 4 крыс аппликацию ферментов (1 мг на рану) осуществляли на 7-е сутки, т е до начала отторжения струпа и отмечали влияние используемых ферментов на отторжение струпа У других 4 животных на 10-е сутки растворы ферментов вводили шприцем непосредственно под струп, который уже к этому моменту начинал отторгаться

В процессе дальнейшего наблюдения за животными отмечали сроки заживления

ран

В другой серии изучали влияние ферментов на заживление ран, образовавшихся после срезания расщепленных лоскутов кожи

В данной серии экспериментов (4 группа) использовали взрослых беспородных крыс - самцов массой 230-280 г. Выбор крупных взрослых самцов обусловлен тем, что кожа у них более толстая и срезать расщепленные кожные лоскуты проще. Под кожу в области спины вводили 20 мл 0,9% раствора №С1, в результате чего формировалась «подушка». После депиляции кожу дважды обрабатывали раствором спирта и с помощью дерматома ДПЭ-30 срезали расщепленные кожные лоскуты толщиной 0,2 мм. На спине у каждой крысы формировали рану площадью около 2 см2. Отбирали биоптаты срезанной расщепленной и полнослойной кожи для последующей морфометрии. На раневые поверхности наносили салфетки с растворами ферментов (из расчета 1 мг на рану) и 0,9% раствором №С1. После этого раны закрывали многослойными марлевыми повязками, которые подшивали узловыми швами к коже. Животных отсаживали в клетки по одиночке для предотвращения взаимного разгрызания повязок. Смачивание салфеток, покрывающих раны опытных и контрольных участков, осуществляли ежедневно с помощью шприца в течение 5 дней. Спустя 5 суток ежедневно осматривали раны, определяли сроки эпителизации ран.

В опыте на собаках срезание расщепленных лоскутов кожи, толщиной 0,2 мм осуществляли клеевым дерматомом Педжета. Гемостаз осуществляли промыванием 3% раствором перекиси водорода. К образовавшимся раневым поверхностям подшивали пластиковые кольца, внутрь которых закладывали марлевые салфетки, на которые наносили мазь «Ируксол» или порошок сорбента «Колладиосорб» (по 5 точкам), поверх которых накладывали стерильный марлевый шарик, последний фиксировали завязыванием над ним лигатур. Далее кольца прикрывали стерильными марлевыми салфетками и ватниками. Первую смену повязок осуществляли на 3-е сутки после опыта и далее - через сутки.

Изучение влияния ферментов на заживление полнослойных кожных ран проведены на 10 белых беспородных крысах-самцах массой 220 - 260г. Животных фиксировали к станку и сбривали шерсть на спине. Операционное поле последовательно обрабатывали 5% спиртовым раствором йода и 70% этиловым спиртом, после чего закрывали стерильными салфетками. На спине моделировали 3 раны, для чего циркулярно иссекали кожу и фасцию, покрывающую мышцы, и осуществляли гемостаз. Для предотвращения контракции кожи к дну раны с захватом

кожи пришивали пластиковые кольца диаметром около 2 см. На подготовленную таким образом рану наносили смоченную в растворах ферментов (1 мг на рану) салфетку, закрывали ее парафиновой пленкой, сверху накладывали марлевый шарик, который фиксировали завязыванием над ним концов лигатур. Для предотвращения загрязнения раны поверх марлевого шарика пришивали 6-8-ми слойную марлевую салфетку. Для профилактики инфекционных осложнений внутримышечно один раз в неделю вводили по 50 000 единиц бициллина-5. Крыс отсаживали в клетки по одной для того, чтобы предотвратить взаимное разгрызание повязок. Ежедневно шприцем в течение 5 дней смачивали салфетку на ране испытуемыми растворами (ферментов и физологическим раствором Указанная длительность применения фермента была

обусловлена предполагаемой продолжительностью его применения в клинической практике.

При необходимости делали перевязку. В последующие дни раны вели с использованием «Синтомициновой эмульсии». Отмечали динамику краевой эпителизации и сроки заживления ран.

В ходе изучения влияния коллагеназы на отторжение ожогового струпа у крыс вызывали ожоги Ш-а и Ш-б степени. У каждого животного моделировали по 3 раны диаметром 1 см. Наблюдали за животными в течение 14 суток и после начала отторжения струпа накладывали салфетки, смоченные исследуемыми растворами (на рану контрольного участка - 0,9% раствор №0; на опытные - с ферментами, разведенными в растворе 0,9% №0 1мг/мл). В течение 3-х суток ежедневно осматривали раны и повторно смачивали марлевые салфетки растворами ферментов. На каждой крысе одновременно испытывали действие обоих ферментов (производства «С-Пб-Технология» и «ТИБОХ») из расчета 1 мг на рану и проводили сравнение с контролем (0,9% раствор №СТ).

Материал и методы клинических исследований

Клинические исследования базируются на данных наблюдения и анализа 34 больных с ранами различного генеза, находившихся на стационарном и амбулаторном лечении в МСЧ-122 (Санкт-Петербург); медицинском центре «Демос» (Санкт-Петербург) и в лечебных учреждениях медицинской службы войсковой части 19612 (г. Наро-Фоминск) в течение 2000 - 2004 гг.

Общая характеристика больных с ранами и трофическими язвами кожи приведена в табл. 2,3.

Исследуемые препараты (мазь «Ируксол» и раневой сорбент «Колладиосорб») накладывали на раны для очищения их от омертвевших тканей

Таблица 2

Распределение больных с ранами и трофическими язвами кожи по полу и возрасту

Наличие выраженного гнойного отделяемого или экссудации не служило критерием исключения использования сорбента. Мазь «Ируксол» в таких случаях не использовали. Аппликацию мази «Ируксол» накладывали в соответствии с инструкцией по применению. Смену повязок осуществляли через 1 - 2 дня в зависимости от наличия показаний.

Таблица 3

Распределение больных с ранами и трофическими язвами по этиологической причине заболевания

Раневой сорбент «Колладиосорб» насыпали на раневую поверхность, после чего покрывали стерильными салфетками Смену повязок делали через 3-5 дней Сравнительную оценку эффективности препаратов проводили на группе из 10 больных с гранулирующими ранами У 5 из них применяли «Колладиосорб», у 5 - мазь «Ируксол» Площадь ран у пострадавших была разная - от 50 до 70 см2

В динамике изучали состояние дна и краев раны (язвы) Отмечали вид ткани раневого дна (грануляции, мышца, подкожно-жировая клетчатка и т п), цвет тканей раневой поверхности, наличие краевой эпителизации, наличие и характер экссудата (серозный, геморрагический, гнойно-воспалительный) Для оценки указанных параметров использовали полуколичественную шкалу Оценивали субъективные ощущения больного (болезненность, зуд и пр) при проведении перевязок в процессе лечения

Для оценки эффективности местного лечения длительно незаживающих ран измеряли скорость эпителизации С этой целью до начала лечения точно определяли площадь раны Для этого на рану накладывали стерильный лист полиэтиленовой пленки и переносили на нее контуры кожного дефекта Затем полученное изображение раны накладывали на лист миллиметровой бумаги, после чего подсчитывали количество квадратных сантиметров и миллиметров, заключенных внутри границ контура Повторное измерение площади раны осуществляли через каждые 10-15 дней проводимой локальной и общей терапии Процентное уменьшения площади раны (Л8) в процессе лечения определяли по формуле Л Н Поповой (1942) (в - Бп) х 100

Д8 =

Б х I

где 8 - величина площади раны при первом измерении (мм ), 8п - величина площади раны в день последующего измерения (мм 2), 1 - число суток между измерениями [Васюков В Я, Проценко Н В, 1993]

У части больных делали посевы со дна ран (язв) для определения характера вегетирующей микрофлоры и ее чувствительности к антибиотикам Делали мазки-отпечатки для определения клеточного состава

Изучали изменения основных клинико-лабораторных показателей (общий анализ крови и мочи, биохимические показатели).

Анализ лечения больных с рубцами кожи проводили в ходе наблюдения и лечения 27 больных с гипертрофическими рубцами кожи. Распределение пострадавших по полу, возрасту, локализации рубца, по срокам возникновения рубца; по этиологическим причинам, вызвавшим образование рубца, приведено в табл. 4-7.

Таблица 4

Распределение больных по этиологическим причинам, вызвавшим образование

Всего Этиологические факторы

больных Ожоги Хирургические Травмы Заболевания

вмешательства кожи

27 7 9 7 4

Таблица 5

Распределение больных по возрасту и ^ полу

Всего больных Возраст больных (лет)

10-20 21- -30 31-40 41- -50 51-60 т 60

М. Ж М. Ж. М. Ж. М. Ж. М. Ж м. ж.

27 1 1 3 4 2 7 1 3 - 3 1 1

Таблица 6

Распределение больных по срокам возникновения рубца

Распределение больных по локализации рубца

Таблица 7

Локализация рубца

Количество больных

Лицо

4(14,8%)

Шея

3(11,1%)

Туловище

3(11,1%)

Верхние конечности

8(29,7%)

Нижние конечности

9(33,3%)

Пациенты получали лечение препаратом «Поликоллагеназа-К». Препарат вводили посредством электрофореза в слабых растворах электролитов (0,9% раствор №01) в концентрации 0,01-1,0 мг/мл. Для повышения стабильности фермента в раствор добавляли до 3 мМ хлорида кальция. Для повышения электрофоретической подвижности молекул доводили рН раствора до 5,0-5,2 добавлением в раствор соляной кислоты. Препарат вводили с анода при силе тока от 0,05 до 0,15 мА/см2 в течение 10-I 5 минут. Лечение проводили циклами по 5-7 процедур через 1-2 дня.

Для оценки клинической эффективности препарата, изучения состояния рубца в процессе лечения была применена следующая специальная шкала:

1) Тип рубца: нормотрофический - 0 баллов; гипертрофический гомогенный - 1 балл; гипертрофический с узелками - 2 балла; заметный келоид - 3 балла; выраженный келоид - 4 балла

2) Консистенция рубца: нормальная - 0 баллов; небольшое уплотнение - 1 балл; выраженная индурация - 2 балла.

3) Цвет рубца: здоровой кожи - 0 баллов; незначительная эритема - 1 балл; выраженная эритема - 2 балла.

4) Чувствительность рубца: напряжение - 0 баллов; зуд - 1 балл; жжение - 2 балла; боль - 3 балла.

Анализ состояния рубцов в процессе лечения осуществляли методом КВЧ-диэлектрометрии.

Дня изучения параметров влагосодержания кожи мы использовали КВЧ -диэлектрометрию на частоте 55 ГГц с использованием лейкосапфирового волноводного зонда при температурах от 28 до 32 °С. Плотность потока энергии зондирующего излучения не превышала 1 мкВтхсм'2. Диэлектрические параметры кожи рассчитывали на основании измерения комплексного коэффициента отражения падающего излучения по уравнению Ж.О. Френеля. Объемную долю воды в тканях оценивали по формуле Максвелла - Вагнера.

Для анализа отбирали участки гипертрофических рубцов с плоской поверхностью. Для измерения параметров в одном и том же месте при каждом исследовании на исследуемую область накладывали прозрачную пленку, на которую наносили контуры рубцов и точку измерения. При повторных исследованиях эта точка находилась путем совмещения контуров на пленке и исследуемой области. Измерения проводили многократно в течение длительного времени (до 2-х лет у одной пациентки).

У пятерых из пациентов рубцы до начала лечения имели схожую локализацию (бедро), «возраст» (3-4 месяца) и свойства. Эти пациенты составили основную анализируемую группу. У остальных больных рубцы были расположены на различных частях тела и отличались по своим параметрам.

Полученные данные заносили в формализованные истории болезни, анализ проводили с помощью ПЭВМ, создавали электронную таблицу, обработку данных проводили в редакторе ЕХСЕЬЬ 6.0. Статистическую обработку проводили с учетом

средней величины, стандартного отклонения, средней ошибки и ^ критерия Стьюдента На основе статистической обработки составлялись сводные таблицы, исполнялись графики

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе оценки коллагенолитической эффективности препаратов коллагеназы установили, что наиболее высокой протеолитической активностью обладает препарат «Коллагеназа-Х». Так, активность данного препарата превышала таковую «Поликоллагеназы-К» в 2,5 раза, «Коллагеназы-КК» - в 3,9 раза, и «Коллагеназы» - в 5,3 раза, «Коллализина» - в 7,6 раза (рис 1)

В свою очередь, протеолитическая активность «Поликоллагеназы-К» выше таковой (р<0,05) «Коллагеназы-КК» - в 1,5 раз, «Коллагеназы» - в 2,1 раза, «Коллализина» - в Зраза (рис. 1)

Рис 1 Уровень протеолитической активности препаратов коллагеназ

Кроме того, этот фермент обладал также и более выраженной амилолитической активностью по сравнению с другими изучаемыми нами ферментами Так, его активность была достоверно (р<0,05) выше активности «Поликоллагеназы-К» в 1,9 раз, «Коллагеназы-КК» - в 2,6 раза, «Коллагеназы» - в 3,0 раза, «Коллализина» - в 6,2 раза Амилолитическая активность достоверно (р<0,05) «Поликоллагеназы-К» выше «Коллагеназы-КК» - в 1,3 раза, «Коллагеназы» - в 1,5 раза, «Коллализина» - в 3,1 раза.

В связи с этим был сделан вывод о том, что наиболее перспективным препаратом для лечения рубцов является препарат «Поликоллагеназа-К»

Вместе с тем, введение ферментного препарата в мазь приводит к снижению его активности Так, водорастворимая основа мази достоверно (р<0,05) снижает активность фермента на 43%, жировая основа - на 70% (рис 2) Наиболее выгодным является сочетание фермента с сорбентом, который лишь незначительно снижает его активность (на 8%)

Рис 2 Сравнительная оценка коллагенолитической активности препарата «Поликоллагеназа-К» в различных основах лекарственных форм

При исследовании коллагенолитической активности фермента «Клостридиопептидаза» в мазевой основе (мазь «Ируксол») достоверно (р<0,05) также выявили снижение его активности на 55% (рис 3)

Рис 3 Оценка коллагенолитической активности препарата «Клостридиопептидаза» в мазе «Ируксол»

Анализ полученных результатов показал, что готовить лекарственные препараты, содержащие протеолитические ферменты, на жировой основе нецелесообразно

В ходе экспериментов на животных установили, что растворы препаратов коллагеназы с концентрацией 1мг/мл, при условии их аппликации в виде марлевых салфеток, на поверхность плотного струпа относительно слабо влияют на отторжение струпа. Это связано с плохой степенью проникновения ферментов через плотный струп. Введение коллагеназы шприцем под струп обусловило более быстрое (на 1-2 дня) очищение ран по сравнению с ранами контрольного участка.

При аппликации растворов коллагеназы на полнослойные раны и раны, образованные срезанием расщепленных лоскутов кожи, не отмечено ускорения заживления ран. Полнослойные раны опытных и контрольных участков зажили в одни и те же сроки (спустя 21-25 суток с начала опыта). Раны, образованные срезанием расщепленных лоскутов кожи, опытной и контрольной группы эпителизовались примерно в одни сроки (спустя 7-13 суток с начала опыта).

Полнослойные раны в раневых дефектов при сохранности кольца во всех группах (опытных и контрольных) завершилась в одни и те же сроки - к исходу 4-й недели. Средние сроки заживления ран при использовании ферментов «Поликоллагеназа-К» и «Коллагеназа-КК» составили 28,4±1,51 и 27,6± 1,59 суток, соответственно. Различия статистически недостоверны. Заживление ран контрольных участков завершилось приблизительно в те же сроки (26,3±1,57).

В ходе сравнительных клинических исследований установили следующее:

- «Колладиосорб» вызывает меньшее количество болезненных ощущений при наложении. Большинство больных болезненных ощущений не испытывали;

- «Колладиосорб» показал лучшую адгезию к дну раны по сравнению с мазью «Ируксол». Это связано с тем, что мазь выполнена на жировой основе;

- необходимая кратность перевязок при использовании «Ируксол» была выше, по сравнению с препаратом «Колладиосорб»;

- оба препарата не оказывают выраженного влияния на рост грануляционной

ткани;

- оба препарата выражено стимулируют эпителизацию ран;

- при применении препарата «Колладиосорб» побочных эффектов не отмечено;

- рана, находящаяся "под поверхностью полимеризовавшегося порошка «Колладиосорб», не высыхала, необходимость его замены при каждой перевязке отсутствовала;

- «Колладиосорб» обладает способностью к сорбции раневого экссудата. Это следует из следующих фактов: набухание сорбента и некоторое увеличение его объема за счет впитывания раневого экссудата; отмечено уменьшение степени отека в ране и в ближайшем ее окружении;

- в случае использования мази «Ируксол» в большинстве случаев не отметили ухудшения состояния раны. Вместе с тем, препарат несколько хуже стимулирует репаративные процессы в ране.

Во всех случаях применения препарата «Колладиосорб» во время перевязки отмечали стимуляцию процесса краевой эпителизации. По краям ран появлялся поясок нового неокрепшего эпителия толщиной 1-2 мм.

Выявили, что независимо от причины возникновения ран, суточное уменьшение площади длительно незаживающих ран и трофических язв было более выражено при использовании «Колладиосорб», чем при применении мази «Ирукол» (табл. 8).

Таблица 8

Суточное заживление площади гранулирующих ран, трофических язв кожи при лечении препаратами, содержащими коллагенолитические ферменты_

Характеристика ран

Исследуемые препараты

Суточное заживление площади ран (%)

Посттравматические дефекты кожи

«Колладиосорб» (п=5)

7,26±0,44

«Ируксол»

(п=8)

5,4±0,7

Гранулирующие раны

«Колладиосорб» (п=5)

6,56±0,65

«Ируксол»

(п=5)

3,63+0,22

Пролежни

«Колладиосорб» (п=1)

4,16

«Ируксол»_(п=1)

3,12

Трофические язвы на фоне заболеваний вен

«Колладиосорб» (п=1)

4,76

«Ируксол»

("=2)

3,15±0,42

Трофические язвы патологии артерий

при

«Колладиосорб» (п=2)

4,09±0,35

«Ируксол»

(п=1)

2,63

Трофические язвы на фоне диабета

«Колладиосорб» (п=1)

4,16

«Ируксол»

(п~2)

3,4±0,25

В ходе анализа мазков-отпечатков установили, что раневой сорбент «Колладиосорб» в значительно большей степени способствует благоприятному течению раневого процесса. У каждого конкретного больного цитологическая картина в ранах имела свои индивидуальные особенности, но направленность процесса была схожей. Сравнение цитограмм при лечении ран исследуемыми препаратами показало

следующее. Препарат «Колладиосорб» предотвращает инфицирование микроорганизмами, способствует регенерации тканей. Это проявляется в следующем: более быстро уменьшается количество нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов, появляются фибробласты и эпителиальные клетки.

Микробиологическое исследование показало, что при использовании обоих препаратов степень микробного обсеменения ран снижалась, более успешно при применении препарата «Колладиосорб». Это обусловлено наличием антибактериальных агентов в составе обоих препаратов.

Для оценки водного баланса кожи применили метод КВЧ- диэлектрометрии [Турквоский ИИ. с соавт., 2003] Установили параметры «общей» и «структурированной» воды в нормальной и рубцово-измененной коже.

В ходе клинических наблюдений у всех больных спустя 3-4 недели с момента начала коллагенолитической терапии отметили наличие клинически выраженного эффекта по всем исследуемым параметрам рубца. Так, по используемой нами шкале состояния рубцов количество баллов, отражающих клиническую картину, во всей группе больных снизилось в 3,4 раза после проведения одного курса коллагенолитической терапии, и в 6,3 раза после второго. Побочных эффектов при лечении не отмечено.

Изменение параметров гидратации тканей происходило в более ранние сроки и выражалось в увеличении содержания как общей, так и свободной воды в тканях рубца (табл. 9) Такая динамика влагосодержания, вероятно, может быть объяснена следующим образом. В результате действия коллагеназы происходит гидролиз коллагена внеклеточного матрикса с высвобождением воды.

Таблица 9

Изменение объемной доли «общей воды» (УОБ ) и фракции свободной воды (У.г) в рубцовой ткани при лечении «Поликоллагеназой-К»_

Параметры гидратации (%) До начала лечения Спустя 2 недели (10 проц)

Общая вода (У<&) 67,6+2,7 71,1+2,6

Связанная вода (Уя) по отношению к общей воде 60,0+2,3 65,0+2,5

Одновременно с распадом коллагена происходит нормализация микроциркуляции. Снижение объемной доли внеклеточного матрикса в рубце сопровождается увеличением количества клеток эпителиальной и соединительной тканей. Полученные данные свидетельствуют о повышении влагонасыщения

межклеточного матрикса рубцовой ткани кожи в экспериментальной группе, что является признаком благоприятного исхода разрешения рубцового процесса. Показатели гидратации ткани рубцов контрольной группы в исследуемый период не отличались от исходных. Препарат «Поликоллагеназа-К» обладает высокой эффективностью при лечении Рубцовых изменений кожи, как свидетельствуют данные, полученные при КВЧ-диэлектрометрии.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наибольшей коллагенолитической активностью обладает «Поликоллагеназа-К». Ее активность в 1,5 раза превышает активность «Коллагеназы-КК», «Коллагеназы» - в 2,1 раза, «Коллализина» - в 3 раза.

2. Применение препаратов коллагеназы способствует очищению ран от омертвевших тканей. Иммобилизация фермента коллагеназы на поверхности раневого сорбента «Колладиосорб», выполненного из поливинилового спирта, не вызывает снижения активности фермента по сравнению с тем, что происходит в мазевой основе. Наличие сорбционной активности гранул поливинилового спирта обеспечивает более высокую эффективность препарата по сравнению с мазью «Ируксол».

3. Изменения водного баланса в ткани рубца (соотношения «общей» и «структурированной» воды), выявляемые методом КВЧ-диэлектрометрии, могут служить диагностическим критерием состояния рубцовой ткани.

4. Введение коллагеназы в рубцы кожи приводит к разрушению избыточного коллагена и к уменьшению его доли во внеклеточном матриксе, что обнаруживается методом КВЧ-диэлектрометрии спустя 2-3 недели после начала терапии. Визуальные изменения рубца происходят позднее.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Целесообразно применение препарата «Колладиосорб» для лечения длительно незаживающих ран и трофических язв кожи, а также подготовки раневой поверхности к кожной пластике.

2. Лечение рубцовой патологии кожи коллагенолитическими протеиназами следует проводить в сроки не позднее 1-1,5 года после их формирования.

3. Исходя из проведенной оценки коллагенолитической активности различных протиназ, рекомендуется к применению в лечебной практике наиболее

эффективный препарат «Поликоллагеназа-К», превышающий по активности аналоги в 1,5 раза

4 Рекомендуемым методом введения коллагенолитических протеиназ в рубцовую ткань является метод электрофореза с анода в слабых растворах электролитов (0,9% раствор NaCl) в концентрации 0,01 - 1,0 мг/мл, при силе тока от 0,05 до 0,15 мА/см2, время процедуры - 15 минут ежедневно Для повышения стабильности фермента в раствор необходимо добавить до 3 мМ хлорида кальция Для повышения электрофоретической подвижности молекул довести pH раствора до 5,0 - 5,2 добавлением в раствор соляной кислоты Курс лечения 10 процедур, повторный -по показаниям через 2 недели

5 Для оценки эффективности лечения различной патологии кожи и подкожной клетчатки предложен и рекомендуется к применению метод неинвазивного контроля влагосодержания кожи - КВЧ-диэлектрометрия

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Турковский ИИ, Парамонов Б А, Бондарев С В Применение препаратов коллагеназы для лечения патологических рубцов кожи//Нижегородский медицинский журнал Приложение кНМЖ Комбустиология -2004 -С 215-216

2 Агапов И Л, Парамонов Б А, Антонов С Ф, Бондарев С В, Вербицкая Н М, Карпухина Л Г Оценка в опытах in vitro антибактериальной эффективности раневых покрытий и «Фолидерм»(после различных способов «DDB» его обработки)//Сборник научных работ врачей Ленинградского военного округа -СПб, 2003 -С 150

3 Парамонов Б А, Бондарев С В, Шилович В А, Сергеев Н А, Фокин Д В Изучение влияния УВЧ- и СВЧ-терапии на течение отморожений в эксперименте//Сборник научных работ врачей Ленинградского военного округа -СПб,2003 -С 68

4 Парамонов Б А, Карпищенко А И, Бондарев С В, Шилович В А Изучение влияния препарата «Поликоллагеназа-К» на заживление ран у экспериментальных животных//Сборник научных работОГМА -Омск,2004-С 50

5 Карпищенко АИ, Парамонов Б А, Бондарев СВ, Шилович В А Сравнительная оценка коллагенолитической активности коллагеназ//Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 49

6 Парамонов Б А, Карпищенко А И, Бондарев С В, Шилович В А Изучение влияния «Поликоллагеназы-К» на заживление расщепленной кожной раны//Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 46

7 Парамонов Б А, Малахов С Ф, Агапов И Л, Андреев Д Ю, Суисси Ю Ю, Карнович А Г, Шляков А М, Чурилова И В, Антонов С Ф, Шилович В А, Бондарев С В, Турковский ИИ Пути совершенствования лечения ожоговых ран//Сборник научных работ ОГМА -Омск, 2004 -С 104

8 Парамонов Б А, Турковский И И, Панферов А А, Бондарев С В, Климова О А, Шилович В А, Чеботарев ВЮ Изменение содержания РНК и ДНК в грануляционной ткани при местном воздействии различных коллагеназ//Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 37

9 Турковский И И, Парамонов Б А, Панферов А А, Климова О А, Потокин И Л, Бондарев С В, Шилович В А, Чеботарев В Ю Обобщение опыта применения препаратов коллагеназы для лечения патологических рубцов кожи//Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 51

10 Карпищенко А И, Парамонов Б А, Бондарев С В, Шилович В А, Панферов А А, Климова О А Изменение белкового обмена в грануляционной ткани при аппликации препаратов коллагеназы//Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 -С 38

11 Карпищенко А И, Парамонов Б А, Бондарев С В, Шилович В А, Панферов А А, Климова О А Сравнительная характеристика коллагенолитической активности протеаз//Сборник научных работ ОГМА -Омск, 2004 -С 47

Заказ № 311

Отпечатано в 000"К0ПИ-Р", ул., Колокольная, 12 Подписано к печати 14.03.2005 г. Тираж 100 экз..

\

22 ¡.:д?г:з5

2С13