Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Применение препаратов коллагеназы для лечения ран и рубцов кожи

На правах рукописи

БОНДАРЕВ Сергей Викторович

ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ КОЛЛАГЕНА ЗЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАН И РУБЦОВ КОЖИ

14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

OUJ

Санкт-Петербург 2008

003163481

Работа выполнена на кафедре термических поражений Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им С М Кирова»

Научный руководитель доктор медицинских наук профессор

Парамонов Борис Алексеевич

Официальные оппоненты доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор

Баиндурашвили Алексей Георгиевич Крылов Константин Михайлович

Ведущая организация

Институт хирургии им А В Вишневского Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

совета Д 208 089 02 при Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (191015, Санкт-Петербург, ул Кирочная, д 41)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195196, Санкт-Петербург, Заневский пр д 1/82)

Автореферат разослан «^Р» 2008 г

Защита состоится « 2008 г. в {5.06.

'час на заседании диссертационного

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук доцент

Г Н Горбунов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуапьность темы

Лечение ран относится к числу наиболее древних, но не стареющих проблем практической \ир> р! ии Несмотря на обилие препаратов для местного лечения ожогов и ран, совершенствование методов их лечения по-прежнему остается актуальной задачей [Кузин М И Костюченок Б М, 1990, Парамонов Б А и др , 2000] В настоящее время 35-49% больных хирургического профиля составляют пациенты с гнойно-воспалительными заболеваниями [Даценко Б М 1995] По данным Министерства Здравоохранения Российской Федерации, пациенты отделений гнойной хирургии составляют 5-7% от всех больных Послеоперационные осложнения у плановых больных составляют около 1% всех оперируемых случаев Количество пациентов с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами составляют до 1 5% от всего населения и 10% от числа всех больных общехирургических стационаров [Савельев В С , 1972]

К настоящему времени для терапии ран, ожогов и трофических язв предложено большое количество (более 1000) препаратов и методов лечения [Гостищев В К и др , 1996, Машковский М Д 2000 Парамонов Б А и др, 2000] Расширение знаний о закономерностях заживления ран привело к тому, что их лечение стали проводить дифференцированно в зависимости от глубины поражения, стадии раневого процесса, локализации поражения и от ряда других факторов [Камаев МФ, 1989] При этом используются медикаментозные препараты с различным механизмом действия Весьма важной задачей в лечении является активация отторжения некротических тканей, адсорбция токсического отделяемого раны, т е продуктов микробного и тканевого распада [Даценко БМ, 1995] В этих случаях целесообразно применять препараты, обладающие протеолитической активностью и сорбенты [Парамонов Б А и др , 2000] В связи с тем, что коллаген в коже и других тканях представлен широко, применение ферментов с коллагенолитической активностью в лечении длительно незаживающих ран кожи является обоснованным В настоящее время наиболее широко известен препарат «Ируксол» в состав которого входит коллагеназа, полученная из продуктов жизнедеятельности клостридий [Машковский М Д, 2000]

Другой важной сферой применения коллагеназ является лечение патологических рубцов кожи [Парамонов Б А и др , 2000] Патологические рубцы кожи возникают после ожогов и травм, а также после выполнения плановых операций [Дельвиг А А , 1995, МалыхинаТ В 2000, Ыоих Р е1 а1,1986, МопЫ Е ,1991, \VaiwickD 1, 01ск80п\\' А ,1993]

Располагаясь на открытых участках кожи, а особенно на лине, шее, груди, патологические рубцы не только обезображивают человека, но и приводят к деформациям различных органов что часто сопровождается нарушениями их функции, а также неприятными ощущениями [Вихриев Б С , Бурмистров В М , 1986, Юденич В В , Гришкевич В М. 1986] Выраженность развивающихся деформаций зависит от длительности существования ран [Boecxk W et al, 1990] У таких пациентов существенно снижается качество жизни В ряде случаев возникновение грубых рубцов приводит к инвалидизации и к развитию нервно-психических расстройств у пациентов вплоть до случаев тяжелой депрессии [Лосицкая В М, Бурьянов А А ,1987, Озерская О С ,2002, Simmons D А , 1996]

В связи с этим разработка и совершенствование методов лечения ран и патологических рубцов кожи является актуальной задачей

Цель исследования

Совершенствование методов лечения ран и патологических рубцов кожи путем применения препаратов, обладающих коллагенолитической активностью

Задачи исследования

1 В опытах т vitw провести сравнительную оценку коллагенолитической активности ряда протеаз

2 Провести комплексное исследование влияния коллагеназы на течение раневого процесса и изучить клиническую эффективность раневого сорбента «Колладиосорб» и мази «Ируксол» при лечении трофических язв и ран кожи

3 Изучить изменения водного баланса в ткани рубцов кожи в процессе лечения препаратами коллагеназы методом КВЧ-диэлектрометрии

4 Определить эффективность применения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи

Научная новизна

1 В опытах т vitro изучены биохимические особенности действия коллагеназ различного происхождения Установлено, что лекарственные препараты коллагеназы, полученные из гепатопанкреаса камчатского краба, обеспечивают более интенсивный и глубокий гидролиз коллагена, по сравнению с коллагеназами микробного происхождения Выявлена амилолитическая активность препаратов коллагеназы

2 Впервые проведена комплексная оценка влияния коллагеназ на течение раневого процесса

3 В \оде клинических исследований изучены изменения водного баланса рубцовой ткани при воздействии коллагеназ

Практическая шачимость

1 Обоснованы показания и способы применения препарата «Колпадиосорб»

2 Определены показания к применению дозировки и способы введения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи

3 Установлены физические критерии эффективности проведения противорубцовой терапии

Положения, выносимые на защит\

1 Для оценки т I иго коллагенолитической активности протеаз необходимо использовать методы характеризующие интенсивность и полноту гидролиза

2 Для лечения ран и трофических язв в 1 стадию раневого процесса целесообразно применять комплексные препараты, включающие коллагеназу («Котласорб», «Колладиосорб») обеспечивающие сорбцию раневого экссудата и очистку ран от омертвевших тканей

3 Введение в ткань патологических рубцов кожи препаратов коллагеназы приводит к разрушению избыточного коллагена и изменению соотношения в ткани белков и гликозаминогликанов что проявляется увеличением доли структурированной («связанной») воды в ткани

Личный вклад автора в проведенное исследование

Автор лично участвовал в определении основной идеи исследования, выработке единой методологии его выполнения и проведении экспериментальных и клинических исследований, статистической обработке материала и анализе результатов

Апробация работы и реализация резупьтатов исспедования

Основные результаты диссертации доложены на УТИ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по проблемам термических поражений (Нижний Новгород, 2004) и Международном хирургическом конгрессе «Новые технологии в хирургии» (Ростов-на-Дону, 2005)

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность кафедры пластической и эстетической хирургии СПб МАПО клиники «Пластической хирургии и косметологии» при МСЧ-70 г Санкт-Петербург Медицинского центра «Балтмед» г Санкт-Петербург

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста состоит из введения 4 пав, заключения выводов, практических рекомендаций списка литературы включающего 175 источников из них-85 иностранных авторов Работа иллюстрирована 25 таблицами и 29 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материяпы и методы исследования

Работа базируется на данных биохимических, гистологических цитологических исследований и опытов проведенных на 53 животных и 61 клиническом наблюдении

Исследования выполнены в клинике экспериментальных животных №2 ВМедА физиотерапевтическом отделении кафедры физиотерапии и курортологии ВМедА лаборатории кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ВМедА, биохимической лаборатории и лаборатории электронной микроскопии НИИ «Особо Чистых Биопрепаратов» (г Санкт-Петербург)

Были изучены следующие виды коллагеназ «Коллагеназа» из Clostndium hystohticum (ГУП «Иммунопрепарат», респ Башкортостан, г Уфа), «Коллализин» («Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» г Санкт-Петербург), «Коллагеназа-КК» (ТИБОХ ДВО РАН г Владивосток) «Поликоллагеназа-К» («С-Пб-Технология», г Санкт-Петербург - в настоящее время выпускается под названием «Ферменкол» ОАО НПК «Высокие технологии», г Санкт-Петербург) и «Коллагеназа очищенная для косметологии» (в настоящее время препарат не выпускается, планируемое название «Ферменкол-ультра» ОАО НПК«Высокие технологии», г Санкт-Петербург, далее по тексту- «Коллагеназа-Х») Кроме того были изучены такие препараты, как сорбент раневой дренирующий биологически активный «Колладиосорб» («Росми» Москва) и мазь «Ируксол» («ПЛИВА» Загреб, Хорватия)

В ходе биохимических исследований определены следующие виды активности фермента Для определения коллагенолитической активности выражающейся в миллиграммах интактного коллагена гидролизованного миллиграммом фермента в единицу времени, использована методика Bourn в модификации Стальной ИД (1977) Данный метод характеризует качественный аспект процесса При этом активность,

выраженная в единицах Mandl (Sigma, Cat #С0299), представляет собой количественный аспект (глубину) гидропиза коллагена

Амилопитическую активность ферментов оценивали по методу Каравея В основе метода лежит гидролиз крахмала с образованием конечных продуктов не дающих цветной реакции с йодом Об активности судят по уменьшению интенсивности окраски

Эксперименты, выполненные на животных

Общая характеристика экспериментов, выполненных на животных приведена в табл 1

Таблица 1

Общая характеристика материала

Опытные группы Количество животных

1 2 Ожог Ш-а степени Аппликация исследуемых растворов ферментов после начала отторжения струпа Ожог ГТГ-б степени Аппликация наследуемых растворов ферментов после начала отторжения струпа 8 крыс 8 крыс

3 Моделирование длительно незаживающей раны получаемой внутрикожным введением 10% раствора додецилсульфата натрия, аппликация растворов ферментов на 7-е и 10-е сутки 8 крыс

4 Лечение ран, образовавшихся после срезания дерматомом ДПЭ-30 расщепленных лоскутов кожи у крыс 15 крыс

5 Лечение ран, образовавшихся после срезания клеевым дерматомом расщепленных лоскутов кожи у собак 4 собаки

6 Аппликация растворов ферментов на полнослойные раны кожи (в виде кольца) у крыс 10 крыс

Итого крысы собаки 49 4

Моделирование длительно незаживающей раны производили внутрикожным

введением 0,3мл 10% раствора додецилсульфата натрия в б местах в области спины крысы В результате этого формировались папулы диаметром 4мм Впоследствии в местах введения образовывалась прочная корочка струпа, которая начинала отторгаться на 8-10 сутки После чего формировались длительно незаживающие раны По 2 симметричным участкам на каждой крысе одновременно испытывали действие обоих ферментов (производства «С-Пб-Технология» и «ТИБОХ») из расчета 1 мг на рану и сравнивали с контролем (0,9% раствор МаС1)

У 4 крыс аппликацию ферментов (1мг на рану) осуществляли на 7-е сутки, те до начала отторжения струпа и отмечали влияние используемых ферментов на отторжение струпа У других 4 животных на 10-е сутки растворы ферментов вводили шприцем непосредственно под струп, который уже к этому моменту начинал отторгаться

В процессе дальнейшего наблюдения за животными отмечали сроки заживления ран В другой серии экспериментов изучали влияние ферментов на заживление ран образовавшихся после срезания расщепленных лоскутов кожи

В данной серии экспериментов (4 группа) использовали взрослых беспородных крыс-самцов массой 230-280г Выбор кр\пныч взрослых самцов обусловлен тем чю кожа у них более толстая и срезать расщепленные кожные лоскуты проще Под кожу в области спины вводили 20мл 0,9% раствора КаС'К в результате чего формировалась «подушка» После депиляции кожу дважды обрабатывали раствором спирта и с помощью дерматома ДПЭ-30 срезали расщепленные кожные лоску!ы толщиной 0,2мм На спине у каждой крысы формировали рану площадью около 2см2 На раневые поверхности наносили салфетки с растворами ферментов (из расчета 1мг на рану) и 0,9% раствором ЫаС1 После этого раны закрывали многослойными марлевыми повязками, которые подшивали узловыми швами к коже Животных отсаживали в отдельные клетки для предотвращения взаимного разгрызания повязок Смачивание салфеток покрывающих раны опытных и контрольных участков, осуществляли ежедневно с помощью шприца в течение 5 дней Спустя 5 су ток ежедневно осматривали раны, определяли сроки эпителизации ран

В опыте на собаках срезание расщепленных лоскутов кожи толщиной 0,2мм осуществляли клеевым дерматомом Педжета Гемостаз осуществляли промыванием 3% раствором перекиси водорода К образовавшимся раневым поверхностям подшивали пластиковые кольца, внутрь которых закладывали марлевые салфетки, на которые наносили мазь «Ируксол» или порошок сорбента «Колладиосорб» (по 5 точкам) Поверх марлевых салфеток накладывали стериаьный марлевый шарик, который фиксировали завязыванием над ним лигатур Далее кольца прикрывали стерильными марлевыми салфетками и ватниками Первую смену повязок осуществляли на 3-е сутки после опыта и далее - через сутки

Изучение влияния ферментов на заживление полнослойных кожных ран проведены на 10 белых беспородных крысах-самцах массой 220-260г Животных фиксировали к станку и сбривали шерсть на спине Операционное поле последовательно обрабатывали 5% спиртовым раствором йода и 70% этиловым спиртом, после чего закрывали стерильными салфетками На спине моделировали 3 раны, для чего циркулярно иссекали кожу и фасцию, покрывающую мышцы, и осуществляли гемостаз Для предотвращения контракции кожи ко дну раны с захватом кожи пришивали пластиковые кольца диаметром около 2см На подготовленную таким образом рану

наносичи смоченную в растворах ферментов (1ыг на ран\) салфетку, закрывали ее парафиновой пленкой, сверху накладывали марлевый шарик, который фиксировали завязыванием над ним концов лигатур Для предотвращения загрязнения раны поверх марлевого шарика пришивали 6-8-ми слойную марлевую салфетку Для профилактики инфекционных осложнений внутримышечно один раз в неделю вводили по 50 ООО единиц «Бициллина-5» Крыс отсаживали в клетки по одной для того, чтобы предотвратить взаимное разгрызание повязок Ежедневно шприцем в течение 5 дней смачивали салфетку на ране испытуемыми растворами (ферментов и физологическим раствором КаС1) Указанная длительность применения фермента была обусловлена предполагаемой продолжительностью его применения в клинической практике

При необходимости делали перевязку В последующие дни раны вели с использованием «Синтомициновой эмульсии» Отмечали динамику краевой эпителизации и сроки заживления ран

В ходе изучения влияния коллагеназы на отторжение ожогового струпа у крыс вызывали ожоги 111-а и 111-6 степени У каждого животного в области спины моделировали по 3 раны диаметром 1см Наблюдения за животными осуществлялись в течение 14 суток После начала отторжения струпа на поверхность ран накладывали салфетки, смоченные исследуемыми растворами (на рану контрольного участка - 0,9% раствор №С1 на опытные - с ферментами, разведенными в растворе 0,9% №С1 1мг/мл) В течение 3-х суток ежедневно проводили осмотр раневой поверхности, после чего повторно смачивали марлевые салфетки растворами ферментов и 0 9% раствором ЫаС1 На каждой крысе одновременно испытывали действие обоих ферментов («С-Пб-Технология» и «ТИБОХ») из расчета 1мг на рану и проводили сравнение с контролем (О 9% раствор №С1)

Материап и методы клинических исследований

Клинические исследования базируются на данных наблюдения 34 больных с ранами различного генеза, находившихся на стационарном и амбулаторном лечении в МСЧ-122 (г Санкт-Петербург), медицинском центре «Демос» (г Санкт-Петербург) и в лечебных учреждениях медицинской службы войсковой части 19612 (г Наро-Фоминск Московской области) в течение 2000 - 2004гг

Общая характеристика больных с ранами и трофическими язвами кожи приведена в табл 2 3

Исследуемые препараты (мазь «Ируксол» и раневой сорбент «Колладиосорб») накладывали на раны для очищения их от омертвевших тканей

Таблица 2

Распределение больных с ранами и трофическими язвами коли по полу и возрасту

Характеристика ран Мужчины Женщины

до 30 лет 31-50 лет >50 лет до 30 лет 31-50 лет >50 лет

Посттравматические дефекты кожи и мягких тканей 2 5 3 1 2 -

Гранулирующие раны 3 2 1 1 2 1

Пролежни - - 2 - - -

Трофические язвы на фоне заболеваний вен - - 2 - 1

Трофические язвы на фоне травм и заболеваний артерий - 1 2 - - -

Трофические язвы на фоне диабета - - 1 - - 2

Итого 5 8 11 2 4 4

При наличии выраженного гнойного отделяемого или экссудации из раны

использовали сорбента «Колладиосорб» Мазь «Ируксол» в таких случаях не использовали Аппликацию мази «Ируксол» накладывали в соответствии с инструкцией по применению Смену повязок осуществляли через 1-2 дня в зависимости от наличия показаний

Таблица 3

Распределение больных с ранами и трофическими язвами по этиологической причине заболевания

Количество больных

Характеристика ран Колладиосорб

Ируксол

Посттравматические дефекты кожи и мягких тканей 5 8

Гранулирующие раны после вскрытия флегмон и 5 5

абсцессов

Пролежни 1 1

Трофические язвы на фоне заболеваний вен 1 2

Трофические язвы на фоне травм и заболеваний артерий 2 1

Трофические язвы на фоне диабета 1 2

Итого 15 19

Раневой сорбент «Колладиосорб» насыпали на раневую поверхность, после чего покрывали стерильными салфетками Смену повязок делали через 3-5 дней Сравнительную оценку эффективности препаратов проводили на группе из 10 больных с

гранулирующими ранами > 5 из них применяли «Колладиосорб», у 5 - мазь «Ируксол» Площадь ран у пострадавших была разная - от 50 до 70см2

В динамике изучали состояние дна и краев раны (язвы) Отмечали вид ткани раневого дна (грануляции мышца подкожно-жировая клетчатка и тп) цвет тканей раневой поверхности, наличие краевой эпителизации наличие и характер экссудата (серозный, геморрагический гнойно-воспалительный) Для оценки указанных параметров использовали полуколичественную шкалу Оценивали субъективные ощущения больного (болезненность зуд и пр ) при проведении перевязок в процессе лечения

Для оценки эффективности местного лечения длительно незаживающих ран измеряли скорость эпителизации С этой целью до начала лечения точно определяли площадь раны Для этого на рану накладывали стерильный лист полиэтиленовой пленки и переносили на нее контуры кожного дефекта Затем полученное изображение раны накладывали на лист миллиметровой бумаги после чего подсчитывали количество квадратных сантиметров и миллиметров заключенных внутри границ контура Повторное измерение площади раны осуществляли через каждые 10 - 15 дней проводимой локальной и общей терапии Процентное уменьшения площади раны (ЛБ) в процессе лечения определяли по формуле Л Н Поповой (1942)

(8 - Бп) х 100

ДБ = --------------------,

Б х г

где Б - величина площади раны при первом измерении (мм2) 8п - величина площади раны в день последующего измерения (мм2), I - число суток между измерениями [Васюков В Я , Проценко Н В , 1993]

У части больных делали посевы со дна ран (язв) для определения характера условно-патогенной и патогенной микрофлоры и ее чувствительности к антибактериальным препаратам

С раневой поверхности делали мазки-отпечатки для определения клеточного состава Изучали изменения основных клинико-лабораторных показателей (общий анализ крови и мочи биохимические показатели)

Анализ лечения больных с рубцами кожи проводили в ходе наблюдения и лечения 27 больных с гипертрофическими рубцами кожи

Распределение больных по полу, возрасту, локализации рубца, по срокам возникновения рубца, по этиологическим причинам, вызвавшим образование рубца, приведены в табл 4-7

Таблица 4

Распределение больных по этиологическим причинам, вызвавшим образование р\ бца

Всего Этиологические факторы

больных Ожоги Хирургические вмешательства Травмы Заболевания кожи

27 7 9 7 4

Таблица 5

Распределение больных по возрасту и полу

Всего больных Возраст больных (лет)

10-20 21-30 31-40 41-50 51-60 | 60

М Ж м ж М Ж М Ж м ж м ж

27 1 1 3 4 2 7 1 3 - 3 1 1

Таблица 6

Распределение больных по срокам возникновения рубца

«возраст» рубца, мес

до 2 3-6 7-9 10-12 12-24 >24

4 13 2 2 3 3

Таблица 7

Распределение больных по локализации рубца

Локализация рубца Количество больных

Лицо 4(14,8%)

Шея 3(11,1%)

Туловище 3(11,1%)

Верхние конечности 8(29 7%)

Нижние конечности 9(33 3%)

Препарат «Поликоллагеназа-К» пациентам вводили посредством электрофореза в

слабых растворах электролитов (0,9% раствор 1МаС1) в концентрации 0,01-1,0 мг/мл Для повышения стабильности фермента в раствор добавляли до 3 мМ хлорида кальция Для повышения электрофоретической подвижности молекул доводили рН раствора до 5 0-5 2 добавлением в раствор соляной кислоты Препарат вводили с анода при силе тока от 0 05 до 0,15 мА/см2 в течение 10-15 минут Лечение проводили циклами по 5-7 процедур через 1-2 дня

Для оценки клинической эффективности препарата, изучения состояния рубца в процессе лечения была применена следующая специальная шкала

1) Тип рубца нормотрофический - 0 баллов, гипертрофический гомогенный - 1 балл, гипертрофический с узелками - 2 балла, заметный келоид - 3 балла, выраженный келоид - 4 балла

2) Консистенция рубца нормальная - 0 баллов, небольшое уплотнение - 1 балл выраженная индурация - 2 балла

3) Цвет рубца здоровой кожи - 0 баллов незначительная эритема - 1 балл, выраженная эритема - 2 балла

4) Чу вствитечьность рубца напряжение - 0 баллов зуд - 1 балл жжение - 2 балла, боль - 3 балла

Анализ состояния рубцов в процессе лечения осуществляли методом КВЧ-диэлектрометрии

Для изучения параметров влагосодержания кожи использовали КВЧ-диэлектрометрию на частоте 55 ГГц с использованием лейкосапфирового волноводного зонда при температурах от 28 до 32 °С Плотность потока энергии зондирующего излучения не превышала 1 мкВтхсм2 Диэлектрические параметры кожи рассчитывали на основании измерения комплексного коэффициента отражения падающего излучения по уравнению Ж О Френеля Объемную долю воды в тканях оценивали по формуле Максвелла - Вагнера

Для изучения параметров влагосодержания отбирали участки гипертрофических рубцов с плоской поверхностью Для измерения параметров в одном и том же месте при каждом исследовании на исследуемую область накладывали прозрачную пленку, на которую наносили контуры рубцов и точку измерения При повторных исследованиях эта точка находилась путем совмещения контуров на пленке и исследуемой области Измерения проводили многократно в течение длительного времени (до 2-х лет у одной пациентки)

У пятерых пациентов рубцы до начала лечения имели схожую локализацию (бедро) «возраст» (3-4 месяца) и свойства Эти пациенты составили основную анализируемую группу У остальных больных рубцы были расположены на различных частях тела и отличались по своим параметрам

Полученные данные заносили в формализованные истории болезни Анализ проводили с помощью ПЭВМ в виде электронных таблиц Обработку данных проводили в редакторе ЕХСЕЬГ 6 0 Статистическую обработку проводили с учетом средней величины, стандартного отклонения, средней ошибки и ^критерия Стьюдента На основе статистической обработки составлялись сводные таблицы, формировались графики

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе оценки коллагенолитической эффективности препаратов коллагеназы установили, что наиболее высокой протеолитической активностью обладает препарат «Коллагеназа-Х». Так. активность данного препарата превышала таковую (р<0.05) «Поликоллагеназы-К» в 2.5 раза, «Коллагеназы-КК» - в 3.9 раза, и «Коллагеназы» в 5.3 раза. «Коллализина» - в 7,6 раза (рис. I).

В свою очередь, протеолитическая активность «Поликоллагепазы-К» выше таковой (р<0,05) «Коллагеназы-КК» в 1.5 раз. «Коллагеназы» - в 2.1 раза, «Коллализина» - в 3 раза (рис. 1).

га Коллпгеназп Ш Коллалршш

[53 Коллагенлзя-1<1< Е2Э Полшсоллагешза-К

□ Коллпгеиша-Х

Рис. 1. Уровень протеолитической активности препаратов коллагеназ Кроме того, этот фермент обладал также и более выраженной амилолитической активностью по сравнению с другими изучаемыми ферментами. Так. его активность была достоверно (р<0.05) выше активности «Поликоллагеназы-К» в 1.9 раз. «Коллагеназы-КК» - в 2.6 раза, «Коллагеназы» - в 3.0 раза, «Коллализина» - в 6,2 раза. Амило логическая активность достоверно (р<0,05) «Поликоллагеназы-К» выше «Коллагеназы-КК» - в 1.3 раза. «Коллагеназы» - в 1.5 раза. «Коллализина» в 3.1 раза.

Из вышеприведенных данных следует, что наиболее перспективным препаратом для лечения рубцов является препарат «Подиколлагеназа-Х».

Вместе с тем, было выявлено, что введение ферментного препарата в мазь приводит к снижению его активности. Так, водорастворимая основа мази достоверно (р<0.05) снижает активность фермента на 43%. жировая основа па 70% (рис. 2).

Таким образом, наиболее эффективным является сочетание фермента с сорбентом, который лишь незначительно снижает его активность (на 8%).

ЕЗ 1 То.:т к'оллпгената-К В Колла;шос^^р6

ЕЗ 11<1,ч<-'рпсч1'.< >р оеновн о На'зелиы

□ Ланолин

Рис. 2. Сравнительная оценка коллагенолитической активности препарата «Поликоллатеназа-К» в различных основах лекарственных форм

При исследовании коллагенолитической активности фермента

«Клостридиопсптидаза» в мазевой основе (мазь «Ируксол») достоверно (р<0,05) также выявили снижение ею акшвносги на 55% (рис. 3).

□ К тс I рпдноноп I и;ипп ЕЭ Иругссо.тт

Рис.3. Оценка коллагенолитической активности препарата «Клостридиопсптидаза» в мазе «Ируксол»

Анализ полученных результатов показал, что лекарственные препараты, содержащие протеолитичсскис ферменты, выполненные на жировой основе для лечения длительно незаживающих ран и рубцов кожи менее эффективны по сравнению с препаратами на водорастворимой основе и в сочетании с сорбентом.

В ходе экспериментов на животных также было установлено, что растворы препаратов коллагеназы с концентрацией 1мг/мл. при условии их аппликации в виде

марлевых салфеток, на поверхность плотного струпа относительно слабо влияют на отторжение струпа Это связано с плохой степенью проникновения ферментов через плотный струп Введение коллагеназы шприцем под струп обусловило более быстрое (на 1-2 дня) очищение ран по сравнению с ранами контрольного участка

При аппликации растворов коллагеназы на полнослойные раны и раны, образованные срезанием расщепленных лоскутов кожи не отмечено ускорения их заживления Полнослойные раны опытных и контрольных участков зажили в одни и те же сроки (спустя 21-25 суток с начала опыта) Раны, образованные срезанием расщепленных лоскутов кожи опытной и контрольной группы эпителизовались примерно в одни сроки (спустя 7-13 суток с начала опыта)

Эпителизация полнослойных ран при сохранности кольца во всех группах (опытных и контрольных) завершилась в одни и те же сроки - к исходу 4-й недели Средние сроки заживления ран при использовании ферментов «Поликоллагеназа-К» и «Коллагеназа-КК» составили соответственно 28 4+1 51 и 27,6+1,59 суток Различия статистически недостоверны Заживление ран контрольных участков завершилось приблизительно в те же сроки (26,3+1,57 суток)

В ходе сравнительных клинических исследований было установлено

- «Колладиосорб» вызывает меньшее количество болезненных ощущений при наложении на рану,

- «Колладиосорб» имеет лучшую адгезию ко дну раны по сравнению с мазью «Ируксол»,

- необходимая кратность перевязок при использовании мази «Ируксол» была выше, чем с препаратом «Колладиосорб»

- оба препарата не оказывают выраженного влияния на рост грануляционной ткани и выражено стимулируют эпителизацию ран,

- при применении препарата «Колладиосорб» побочных эффектов не отмечено,

- при использовании порошка «Колладиосорб» нет необходимости его замены при каждой перевязке,

- «Колладиосорб» обладает способностью к сорбции раневого экссудата и снижает отек в ране и в ближайшем ее окружении,

- мазь «Ируксол» несколько хуже стимулирует репаративные процессы в ране

Независимо от причины возникновения ран, суточное уменьшение то щади длительно незаживающих ран и трофических язв было более выражено при использовании «Колладиосорб», чем при применении мази «Иру кол» (табл 8)

Таблица 8

Суточное заживление площади гранулирующих ран трофических язв кожи при лечении препаратами, содержащими коллагенолитические ферменты

Характеристика ран Исследуемые препараты Суточное заживление площади ран (%)

Посттравматические дефекты кожи «Колладиосорб» (п=5) 7,26±0,44

«Ируксол» (п=8) 5,4±0 7

Гранулирующие раны «Колладиосорб» (п=5) 6,56+0 65

«Ируксол» (п=5) 3,63+0,22

Пролежни «Колладиосорб» (п=1) 4,16

«Ируксол» (п=1) 3,12

Трофические язвы на фоне заболеваний вен «Колладиосорб» (п=1) 4,76

«Ируксол» (ч=2) 3,15±0 42

Трофические язвы при патологии артерий «Колладиосорб» (п=2) 4,09±0 35

«Ируксол» (п=1) 2,63

Трофические язвы на фоне диабета «Колладиосорб» (п=1) 4 16

«Ируксол» (п=2) 3,4+0,25

В ходе анализа мазков-отпечатков было установлено, что раневой сорбент

«Колладиосорб» в значительно большей степени способствует благоприятному течению раневого процесса У каждого больного цитологическая картина в ранах имела свои индивидуальные особенности но направленность процесса была схожей

Сравнение цитограмм при лечении ран исследуемыми препаратами показало, что препарат «Колладиосорб» предотвращает инфицирование микроорганизмами и способствует регенерации тьаней (более быстро уменьшается количество нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов, появляются фибробласты и эпителиальные клетки)

Микробиологическое исследование показало, что при использовании обоих препаратов степень микробного обсеменения ран снижалась, более успешно при применении препарата «Колладиосорб» Это обусловлено наличием антибактериальных компонентов в составе обоих препаратов

Для оценки водного баланса кожи применили метод КВЧ-диэлектрометрии [Турковский И И с соавт, 2003] Установили параметры «общей» и «структурированной» воды в нормальной и рубцово-измененной коже

В ходе клинических наблюдений у всех больных спустя 3-4 недели с момента начала коллагенолитической терапии отметили наличие клинически выраженного эффекта по всем исследуемым параметрам рубца Так по используемой нами шкале состояния рубцов количество баллов отражающих клиническую картину во всей группе больных снизилось в 3 4 раза после проведения одного курса коллагенолитической терапии и в 6,3 раза после второго Побочных эффектов при лечении не отмечено

Изменение параметров гидратации тканей происходило в более ранние сроки и выражалось в увеличении содержания как общей так и свободной воды в тканях рубца (табл 9) Такая динамика влагосодержания может быть объяснена тем, что в результате действия коллагеназы происходит гидролиз коллагена внеклеточного матрикса с высвобождением воды

Таблица 9

Изменение объемной доли «обшей воды» (V,,-,) и фракции свободной воды (V,,,,) в рубцовой ткани при лечении «Поликоллагеназой-К»

Параметры гидратации (%) До начала лечения Спустя 2 недели (10 проц )

Общая вода (УоВ ) 67 6+2 7 71,1+2 6

Связанная вода ) по отношению к общей воде 60 0+2,3 65,0+2,5

Одновременно с распадом коллагена происходит нормализация микроциркуляции Снижение объемной доли внеклеточного матрикса в рубце сопровождается увеличением количества клеток эпителиальной и соединительной тканей Полученные данные свидетельствуют о повышении влагонасыщения межклеточного матрикса рубцовой ткани кожи в экспериментальной группе, что является признаком благоприятного исхода разрешения рубцового процесса Показатели гидратации ткани рубцов контрольной группы в исследуемый период не отличались от исходных Препарат «Поликоллагеназа-К» обладает высокой эффективностью при лечении рубцовых изменений кожи, о чем свидетельствуют данные, полученные при КВЧ-диэлектрометрии

ВЫВОДЫ

I Наиболее выраженной коллагенолитической и амилолитической активностью обладают коллагеназы, полученные из гепатопанкреаса камчатского краба Среди исследованных препаратов наибольшей активностью обладают «Поликоллагеназа-Х» и «Поликоллагеназа-К»

2 Применение препаратов коллагеназы способствует очищению ран от омертвевших тканей Иммобилизация фермента коллагеназы на поверхности раневого сорбента «Колладиосорб» не вызывает снижения активности фермента по сравнению с тем что происходит в мазевой основе Наличие сорбционной активности гранул поливинилового спирта обеспечивает более высокую эффективность препарата по сравнению с мазью «Ируксол»

3 Изменения водного баланса в ткани рубца (соотношения «общей» и «структурированной» воды) выявляемые методом КВЧ-диэлектрометрии, могут служить диагностическим критерием состояния рубцовой ткани

4 Введение коллагеназы в рубцы кожи приводит к разрушению избыточного коллагена и к уменьшению его доли во внеклеточном матриксе

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Применение препарата «Колладиосорб» целесообразно для лечения длительно незаживающих ран и трофических язв колеи а также подготовки раневой поверхности к кожной пластике

2 Лечение рубцовой патологии кожи коллагенолитическими протеиназами следует проводить в сроки не позднее 1-15 года после их формирования

3 Рекомендуется к применению в лечебной практике наиболее эффективный препарат «Поликоллагеназа-К» (из препаратов выпускаемых в настоящее время), превышающий по активности аналоги в 1,5 раза

4 Для введения коллагенолитических протеиназ в рубцовую ткань наиболее эффективным является метод электрофореза с анода в слабых растворах электролитов (0 9% раствор NaCl) в концентрации 0,01 - 1,0 мг/мл. при силе тока от 0 05 до 0,15 мА/см", время процедуры - 15 минут ежедневно Для повышения стабильности фермента в раствор необходимо добавить до 3 мМ хлорида кальция Для повышения электрофоретической подвижности молекул довести pH раствора до 5 0-5,2 добавлением в раствор соляной кислоты Курс лечения 10 процедур повторный - по показаниям через 2 недели

5 Для оценки эффективности лечения различной патологии ко,к и и подкожной клетчатки необходимо использовать метод неинвазивного контроля влагосодержания кожи - КВЧ-диэлектрометрия

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Бондарев С В Изучение влияния препарата «Поликоллагеназа-К» на заживление ран у экспериментальных животных / Б А Парамонов, А И Карпищенко, С В Бондарев В А Шилович // Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 50

2 Бондарев С В Сравнительная оценка коллаге почти ческой активности коллагеназ / А. И Карпищенко, Б А Парамонов, С В Бондарев, В А Шилович //Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 49

3 Бондарев С В Изучение влияния «Поликоллагеназы-К» на заживление расщепленной кожной раны / Б А Парамонов. А И Карпищенко, С В Бондарев, В А Шилович // Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 46

4 Бондарев С В Пути совершенствования лечения ожоговых ран / Б А Парамонов С Ф Малахов И Л Агапов, Д Ю Андреев, Ю Ю Суисси, А Г Карнович, А М Шляков ИВЧ>рилова С Ф Антонов, В А Шилович С В Бондарев, ИИТурковский // Сборник научных работ ОГМ Л - Омск, 2004 - С 104

5 Бондарев С В Изменение содержания РНК и ДНК в грануляционной ткани при местном воздействии различных коллагеназ / Б А Парамонов, И И Турковский А А Панферов С В Бондарев, О А Климова В А Шилович, В Ю Чеботарев // Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 37

6 Бондарев С В Обобщение опыта применения препаратов коллагеназы для лечения патологических рубцов колеи / ИИ Турковский Б А Парамонов, А А Панферов О А Климова, И Л Потокин, С В Бондарев. В А Шилович В Ю Чеботарев // Сборник нау чных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 51

7 Бондарев С В Изменение белкового обмена в грануляционной ткани при аппликации препаратов коллагеназы / А И Карпищенко Б А Парамонов, С В Бондарев В А Шилович, А А Панферов О А Климова // Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 38

8 Бондарев С В Сравнительная характеристика коллагенолитической активности протеаз / А И Карпищенко Б А Парамонов, С В Бондарев В А Шилович А А Панферов О А Климова // Сборник научных работ ОГМА - Омск, 2004 - С 47

9 Бондарев С В Применение препаратов коллагеназы для лечения патологических рубцов кожи / ИИТурковский, Б А Парамонов С В Бондарев // Нижегородский медицинский журнал Приложение кНМЖ Комбустиология -2004 -С 215-216

10 Бондарев С В Применение препаратов коллагеназы для лечения трофических язв /' С В Бондарев, Б Л Парамонов, И И Таранов Д Ю Андреев, Ю Ю Суисси А А Панферов, А Г Карнович, Я Г Свиридов // Международный хирургический конгресс «Новые технологии в хирургии» - Ростов-на-Дону 2005 - С 265

11 Бондарев С В Применение ферментов при лечении больных с гипертрофическими рубцами / Б А Парамонов, И И Турковский, С В Бондарев // Вестник хирургии имени И И Грекова - 2007 -Т 166, №4 -С 84-85

Актуальность

Лечение ран относится к числу наиболее древних, но не стареющих проблем практической хирургии. Несмотря на обилие препаратов для местного лечения ожогов и ран, совершенствование методов их лечения по-прежнему остается актуальной задачей [Кузин М.И., Коспоченок Б.М., 1990; Парамонов Б.А. и др., 2000]. В настоящее время 35-49% больных хирургического профиля составляют пациенты с гнойно-воспалительными заболеваниями [Даценко Б.М., 1995]. По данным- Министерства здравоохранения Российской Федерации, пациенты отделений гнойной хирургии составляют 5-7% от всех больных. Послеоперационные осложнения у плановых больных составляют около 1% всех оперируемых случаев. Пациенты с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами составляют до 1,5% от всего населения, 10% от числа всех больных общехирургических стационаров [Савельев B.G., 1972].

К настоящему времени для терапии ран, ожогов и трофических язв предложено большое количество (более 1000) препаратов и методов лечения [Гостищев В.К. и др., 1996; Машковский М.Д., 2000; Парамонов Б.А. и др., 2000]. Расширение познаний о закономерностях заживления ран привело к тому, что их лечение стали проводить дифференцированно в зависимости от глубины поражения, стадии раневого процесса, локализации поражения и от ряда других факторов [Камаев М.Ф., 1989]. При этом, используются медикаментозные препараты с различным механизмом действия. Весьма важной задачей в лечении является активация отторжения некротических тканей, адсорбция токсического отделяемого раны, т.е. продуктов микробного и тканевого распада [Даценко Б.М., 1995]. Для этого целесообразно применять препараты, обладающие протеолитической активностью и сорбенты [Парамонов Б.А. и др., 2000]. В связи с тем, что коллаген в коже и других тканях представлен широко, применение ферментов с коллагенолитической активностью является обоснованным. В настоящее время наиболее широко известен препарат «Ируксол», в состав которого входит коллагеназа, получаемая из продуктов жизнедеятельности клостридий [Машковский М.Д., 2000].

Другой важной сферой применения коллагеназ является лечение патологических рубцов кожи [Парамонов Б.А. и др., 2000]. Патологические рубцы кожи возникают после ожогов и травм, а также после выполнения плановых операций [Дельвиг А.А., 1995; Малыхина Т.В., 2000; Логвинов С.В. и др., 2004; Litoux P. et al., 1986; Norris J.E., 1991; Warwick D.J., Dickson W.A., 1993]. Располагаясь на открытых участках кожи, а особенно на лице, шее, груди, патологические рубцы не только обезображивают человека, но и приводят к деформациям различных органов, что часто сопровождается нарушениями их функции, а также неприятными ощущениями [Вихриев Б.С., Бурмистров В.М., 1986; Юденич В.В., Гришкевич В.М., 1986; Озерская О.С., 2002; Логвинов С.В. и др., 2004]. Выраженность развивающихся деформаций зависит от длительности существования ран [Boecxk W. et' al., 1990]. У таких пациентов существенно снижается качество жизни. В ряде случаев возникновение грубых рубцов приводит к инвалидизации и к развитию нервно-психических расстройств, вплоть до случаев тяжелой- депрессии [Лосицкая В.М., Бурьянов А.А., 1987;. Озерская 0.с.,2002; Simmons D.A., 1996].

В связи с этим разработка и совершенствование методов лечения ран и патологических рубцов кожи является актуальной задачей.

Целью исследования является совершенствование методов лечения ран и; патологических рубцов кожи применением препаратов, обладающих коллагенолитической активностью.

Для достижения поставленной цели исследования были определены следующие задачи:

1. В опытах in vitro провести сравнительную оценку коллагенолитической активности ряда протеаз.

2. Провести комплексное исследование влияния коллагеназы на течение раневого процесса и изучить клиническую эффективность раневого сорбента «Колладиосорб» и мази «Ируксол» при лечении трофических язв и ран.

3. Изучить изменения водного баланса в ткани рубцов кожи в процессе лечения препаратами коллагеназы методом КВЧ-диэлектрометрии.

4. Определить эффективность применения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи.

Научная новизна

1. В опытах in vitro изучены биохимические особенности действия коллагеназ различного происхождения.

2. Впервые проведена комплексная оценка влияния коллагеназ на течение раневого процесса.

3. В ходе клинических исследований изучены изменения водного баланса рубцовой ткани при воздействии коллагеназ.

Практическая ценность

1. Обоснованы показания к применению и способы применения препарата «Колладиосорб».

2. Определены показания к применению, дозировки и способы введения препаратов коллагеназы при лечении патологических рубцов кожи.

3. Установлены физические критерии эффективности проведения противорубцовой терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Для оценки in vitro коллагенолитической активности протеаз следует использовать методы, характеризующие интенсивность и полноту гидролиза.

2. Для лечения ран и трофических язв в I стадию раневого процесса целесообразно применять комплексные препараты, включающие коллагеназу («Колласорб», «Колладиосорб»), обеспечивающие сорбцию раневого экссудата и очистку ран от омертвевших тканей.

3. Введение в ткань патологических рубцов кожи препаратов коллагеназы приводит к разрушению избыточного коллагена и изменению соотношения в ткани бежов и гликозаминогликанов, что проявляется увеличением доли структурированной («связанной») воды в ткани.

Личное участие автора в получении результатов

Личное участие автора в исследовании выразилось в определении основной идеи исследования, выработке единой методологии его выполнения за весть период исследовательских работ, в проведении экспериментальных и клинических исследований, статистической обработке материала и анализе результатов.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на YIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по проблемам термических поражений (Нижний Новгород, 2004) и Международном хирургическом конгрессе «Новые технологии в хирургии (Ростов-на-Дону, 2005).

Реализация результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы кафедры пластической и эстетической хирургии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, клиники «Пластической хирургии и косметологии» при МСЧ-70 г. Санкт-Петербург, медицинского центра «Балтмед» г. Санкт-Петербург.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 11 статей в реферируемых журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 175 источника, из них - 85 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 29 рисунками.

108 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наибольшей коллагенолитической активностью обладает «Поликоллагеназа-К». Ее активность в 1,5 раза превышает активность «Коллагеназы-КК», «Коллагеназы» — в 2,1 раза, «Коллализина» — в 3 раза.

2. Применение препаратов коллагеназы способствует очищению ран от омертвевших тканей. Иммобилизация фермента коллагеназы на поверхности раневого сорбента «Колладиосорб», выполненного из поливинилового спирта, не вызывает снижения активности фермента по сравнению с тем, что происходит в мазевой основе. Наличие сорбционной активности гранул поливинилового спирта обеспечивает более высокую эффективность препарата по сравнению с мазью «Ируксол».

3. Изменения водного баланса в ткани рубца (соотношения «общей» и «структурированной» воды), выявляемые методом КВЧ-диэлектрометрии, могут служить диагностическим критерием состояния рубцовой ткани.

4. Введение коллагеназы в рубцы кожи приводит к разрушению избыточного коллагена и к уменьшению его доли во внеклеточном матриксе, что обнаруживается методом КВЧ-диэлектрометрии спустя 2-3 недели после начала терапии. Визуальные изменения рубца происходят позднее.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Целесообразно применение препарата «Колладиосорб» для лечения длительно незаживающих ран и трофических язв кожи, а также подготовки раневой поверхности к кожной пластике.

2. Лечение рубцовой патологии кожи коллагенолитическими протеиназами следует проводить в сроки не позднее 1 — 1,5 года после их формирования.

3. Исходя из проведенной оценки коллагенолитической активности различных протиназ, рекомендуется к применению в лечебной практике наиболее эффективный препарат «Поликоллагеназа-К», превышающий по активности аналоги в 1,5 раза.

4. Рекомендуемым методом введения коллагенолитических протёиназ в рубцовую ткань является метод электрофореза с анода в слабых растворах электролитов (0,9% раствор NaCl) в концентрации 0,01 - 1,0 мг/мл, при силе тока о от 0,05 до 0,15 мА/см , время процедуры - 15 минут ежедневно. Для повышения стабильности фермента в раствор необходимо добавить до 3 мМ хлорида кальция. Для повышения электрофоретической подвижности молекул довести рН раствора до 5,0 - 5,2 добавлением в раствор соляной кислоты. Курс лечения 10 процедур, повторный - по показаниям через 2 недели.

5. Для оценки эффективности лечения различной патологии кожи и подкожной клетчатки предложен и рекомендуется к применению метод неинвазивного контроля влагосодержания кожи - КВЧ-диэлектрометрия. г ь

110