Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Применение холодового концентрирования в анализе мочи, содержащей некоторые токсикологически значимые вещества

На правах рукописи

т4

Тяжельников Станислав Федорович

ПРИМЕНЕНИЕ ХОЛОДОВОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ В АНАЛИЗЕ МОЧИ, СОДЕРЖАЩЕЙ НЕКОТОРЫЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ

ВЕЩЕСТВА

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 ь йпв т

Пермь-2012

005048078

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент

Малкова Тамара Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Коркодинова Любовь Михайловна ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор, заведующий кафедрой

фармацевтической химии очного факультета

доктор фармацевтических наук, профессор Куклин Владимир Николаевич ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармацевтической химии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «15» января 2013 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства

образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru «__» декабря

2012 г. и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru «гЯ » декабря 2012 г.

Автореферат разослан «8» декабря 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, р

кандидат фармацевтических наук, доцент 'и И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Специалистам, занимающимся химическим анализом, судебным химикам, токсикологам часто приходится сталкиваться с задачами по определению достаточно низких концентраций веществ. Для работы большинства высокочувствительных приборов необходима достаточно сложная и глубокая очистка первичной пробы.

В настоящее время увеличивается распространение так называемых «дизайнерских» наркотиков. Эту группу отличает фактическая легальность, широкая номенклатура, разнообразие физико-химических свойств и большой потенциал действия - рекреационная доза от 1 до 20 мг.

Еще одной важной проблемой современной токсикологической химии является определение алкалоидов галлюциногенных грибов рода РэПосуЬе. Растет количество случаев их употребления на территории России, особенно в Пермском крае и в Ленинградской области. На данный момент не существует эффективной методики определения алкалоидов в биоматериале (прежде всего в моче).

Общим для двух рассмотренных групп проблем является необходимость определения достаточно низкой концентрации веществ в моче. В случае галлюциногенных грибов добавляется высокая термолабильность и низкая устойчивость к действию кислорода воздуха алкалоидов группы псилоцина.

Современная практика предлагает несколько решений. В западных странах наиболее распространена твердофазная экстракция. В России применяются различные подходы, включающие жидкость-жидкостную экстракцию, выпаривание, вакуумную отгонку, применение осадительных реактивов и т.д. Часто эти приемы ведут к частичному или полному разрушению искомых веществ, либо не обеспечивают необходимой степени концентрирования и очистки пробы для последующего исследования с применением инструментальных методов.

Данная работа посвящена модернизации пробоподготовки и очистки первичных проб мочи с целью снижения потерь искомых веществ и повышения степени концентрирования.

Целью работы является оптимизация и усовершенствование методик пробоподготовки биоматериала, применение холодового концентрирования в анализе мочи, содержащей некоторые токсикологически значимые вещества.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• Изучить характеристики метода холодового концентрирования на примере водных растворов неорганических и органических веществ

• Изучить характеристики холодового концентрирования модельных образцов мочи, в том числе содержащих токсикологически значимые вещества

• Разработать частные методики определения в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в низких дозировках (менее 10 мг) на примере 2,5-диметокси-4-этил-фенилэтиламина (2С-Е), 2-(2,6-Дихлорфениламино)-имидазолина гидрохлорида (клонидин), 1-(бензо[<1][1,3]диоксол-5-ил)-2-(пирролидин-1 -ил)пентан-1 -она (МДПВ, метилендиоксипировалерон) и (Нафталин-1 -ил)( 1 -пентил-1 Н-индол-3-ил)метанона

• Разработать частные методики определения в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в достаточно высоких дозах (более 10 мг) на примере 1-фенилпропан-2-амина (амфетамин) и 1-(бензо[с1][1,3]диоксол-5-ил)-М-метилпропан-2-амина (метилендиоксиметамфетамин)

• Усовершенствовать методики определения алкалоидов группы псилоцина в нативном материале грибов вида РвПосуЬе зегт1апсеа1а

• Усовершенствовать методики определения алкалоидов группы псилоцина в моче.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведены исследования по изучению и внедрению метода холодового концентрирования в судебно-химический и фармацевтический анализ различных соединений. Автором были разработаны эффективные методики, позволяющие значительно повысить чувствительность, надежность и воспроизводимость анализа веществ, содержащихся в низких концентрациях, как в водных растворах, так и в

биологических матрицах. Самостоятельно проведены исследования в качестве оператора аналитического оборудования, используемого в работе.

Научная новизна. Усовершенствованы методики определения сложных для идентификации токсикологически значимых веществ, обычно содержащихся в биожидкостях в относительно низкой концентрации из-за малой употребляемой дозы; позднего забора пробы, когда большая часть аналитов выведена; низкой стабильности при проведении пробоподготовки.

Изучение характеристик метода холодового концентрирования проводилось на водных растворах неорганических (КМ11О4, AgNOj) и органических (нитрофурантоин, МДПВ, дицикловерин) веществ, а так же на модельных образцах мочи, в том числе содержащих кеторолака трометамин и тропикамид.

Вещества, для которых были разработаны методики, относятся к лекарственным средствам (клонидин), «классическим» наркотическим веществам (амфетамин, MDMA), «дизайнерским» наркотикам (2С-Е, МДПВ, JWH 018). Кроме того, была разработана методика определения алкалоидов группы псилоцина, являющихся «классическими» наркотиками, в нативном материале и биологических матрицах.

В усовершенствованных методиках на стадии пробоподготовки применяли холодовое концентрирование, как основной прием, позволяющий одновременно очищать и концентрировать пробу. Установлены основные температурные режимы, при которых происходит холодовое концентрирование с минимальными потерями аналитов и максимальной степенью очистки от высокомолекулярных балластных веществ.

Практическая значимость. На основе полученных данных был усовершенствован ряд методик для определения широкого спектра токсикологически значимых веществ при наличии усложняющих анализ факторов, таких как большое количество примесей, малая концентрация искомых веществ, низкая устойчивость искомых веществ к действию температуры и химических реагентов.

Выполненная работа позволяет принимать обоснованные решения при выборе метода пробоподготовки и определения при проведении судебно-химических исследований, которые способствуют повышению качества, надежности, точности и воспроизводимости результатов.

Усовершенствованные методики пробоподготовки с применением холодового концентрирования внедрены в практику химико-токсикологической лаборатории Санкт-Петербургского государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Межрайонный наркологический диспансер №1» (акт внедрения от 12 сентября 2012 г.), лаборатории токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» (акт внедрения от 12 сентября 2012 г.), в учебный процесс кафедры биологической химии с курсом токсикологической химии Оренбургской государственной медицинской академии (акт внедрения от 30 мая 2012 года), кафедры охраны окружающей среды Пермского национального исследовательского политехнического университета (акт внедрения от 03 сентября 2012 года).

Объем и структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы, включающего 179 наименований, в том числе 137 источников литературы на иностранном языке. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 20 таблиц, 30 рисунков и приложение, включающее акты внедрения.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК, 1 монография.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических

наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.50 007417).

На защиту диссертации выносятся следующие положения:

• Общие характеристики холодового концентрирования ряда неорганических и органических веществ

• Частные методики пробоподготовки мочи при определении лекарственных и наркотических средств, обычно употребляемых в низкой дозировке

• Частные методики пробоподготовки мочи при определении лекарственных и наркотических средств, в случаях, когда забор пробы происходил после окончания периода полувыведения

• Методики пробоподготовки нативного материала при анализе грибов вида РзПосуЬе зегш1апсеа1а

• Методики пробоподготовки мочи при определении алкалоидов грибов РхПосуЬе зетПапсеа1а

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Обобщены данные литературных источников о существующих вариантах пробоподготовки с использованием жидкость-жидкостной экстракции, твердофазной экстракции, различных способах деструкции конъюгатов с эндогенными веществами. Так же, в литературном обзоре приведены данные об имеющихся вариантах применения холодового концентрирования в химической промышленности и анализе.

Материалы и методы

В эксперименте были использованы фармацевтические препараты, соответствующие требованиям нормативной документации. Для приготовления модельных образцов мочи без примесей производили забор мочи от здоровых добровольцев без дополнительной водной нагрузки, не принимавших лекарственные препараты в течение месяца до отбора проб. Для приготовления модельных образцов мочи, содержащих токсикологически значимые вещества, в модельные образцы мочи без примесей добавляли 0,1 % водных растворов субстанций исследуемых веществ или растворов, представляющих собой готовые

лекарственные средства. Приготовленные модельные смеси выдерживали в течение 24 часов при комнатной температуре и исследовали в соответствии с планом эксперимента. Забор реальных образцов мочи производили у добровольцев, употреблявших токсикологически значимые вещества, либо у пациентов отделения токсикологии ГБУЗ ПК «МСЧ № 9 им. М.А. Тверье» после отравления.

В качестве исследуемых веществ использовали:

Нитрофурантоин — таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой по 50 мг. Производитель: Ирбитский ХФЗ, серия С-14-022, НД 42-8251-05

Дицикловерин - Триган, раствор для внутримышечного введения, 10 мг/мл, 2 мл амп. Серия Е2027. Производитель Кадила Фармасьютикалз Лимитед -Индия, НД 42-8317-98

Кеторолака трометамин - раствор для внутримышечного введения, 30 мг/мл, 1 мл амп. Серия В000035 - 174230. Производитель Люпин Лабораторис -Индия, НД 42-8805-05

Тропикамид — Мидриацил, глазные капли, раствор 0,5%. Серия 1518-27338. Производитель «Алкон-Куврер», Бельгия. НД 42-10313-99

Метилендиоксипировалерон — порошок, реализуемый вод видом «сыпучего Фен-шуй». Подлинность была установлена с помощью ГХ МС, идентификация спектра по базе NIST. Чистота устанавливалась с помощью метода ВЭЖХ.

Исследования методом ПЖХ были выполнены на аппаратно-программных комплексах на базе хроматографов «Кристалл 2000М» и «Agilent 7890А». Хроматограф «Кристалл 2000М» снабжен сменным аналитическим модулем с пламенно-ионизационным (ПИД), электронозахватным (ЭЗД) и термоионным (ГИД) детекторами. Хроматограф «Agilent 7890А» снабжен пламенно-ионизационным (ПИД) и масс-спектрометрическим детекторами.

Исследование метода холодового концентрирования на примере водных растворов веществ

Были изучены эффективность холодового концентрирования в целом, подобраны оптимальные посуда, температуры, объемы пробы. Установлено, что оптимальной температурой холодового концентрирования водных растворов

является - 27 °С. Использование более низкой температуры (изучали режимы - 30, - 35, - 40 °С) приводит к значительному росту потерь. Использование более высокой температуры (изучали режимы - 25, -20, -15,- 10,- 5 °С) приводило к увеличению времени процесса без снижения количества потерь.

Для изучения холодового концентрирования водных растворов неорганических веществ были выбраны растворы калия перманганата и серебра нитрата в связи с доступностью, простотой количественного определения и широким распространением в Пермском крае (используются при кустарном производстве наркотических веществ или содержатся в окружающей среде). Результаты представлены на рисунках 1 и 2.

Установлено, что в случае разбавленных растворов (калия перманганат 6,1 мг/л) потери значительно ниже, чем в случае более концентрированных растворов (серебра нитрат, ОД М).

•Ю 50 60

Степень замер-зпкпя, %

Рисунок 1. Результаты холодового концентрирования водных растворов калия перманганата с концентрацией 6,1 мг/л в стаканах, емкостью 100 мл

Примечание:

* степень замерзания - отношение доли жидкости, полученной после растапливания льда к общему объему пробы

потери-доля аналита в процентах, перешедшего в твердую фазу

......................................... ..................................... 16,49

^ 8.83 '

' 529

|

30 40 50 60 70

Степень -замерзания. %

Рисунок 2. Результаты холодового концентрирования водных растворов серебра нитрата с концентрацией 0,1 М в стаканах, емкостью 100 мл

Для изучения холодового концентрирования водных растворов органических веществ были выбраны растворы нитрофурантоина, МДПВ и дицикловерина. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Результаты холодового концентрирования водных растворов нитрофурантоина с концентрацией 1 г/л

Номер Степень Оптическая плотность Степень Потери,

пробы замерзания, % жидкой фазы концентрирования %

1 20 0,091 1Д4 8,52

2 30 0,100 1,25 12,46

3 40 0,110 1,38 17,49

4 50 0,117 1,46 26,84

5 60 0,142 1,78 28,97

Примечание:

степень концентрирования - это кратность увеличения концентрации в пробе после холодового концентрирования

Таблица 2. Результаты холодового концентрирования водных растворов МДПВ с концентрацией 40 мг/л и дицигсловерина с концентрацией 80 мг/л

Номер Степень Площадь пика в Степень концентри- Потери,

пробы замерзания, % жидкой фазе рования %

МДПВ

1 30 142,046 1,38 3,18

2 40 161,167 1,57 5,84

3 50 190,546 1,86 7,23%

4 60 233,253 2,27 9,15%

5 70 298,577 2,91 12,78%

Дицикловерин

1 30 109,916 1,35 5,28

2 40 126,380 1,56 6,65

3 50 153,703 1,89 5,39

4 60 187,783 2,31 7,53

5 70 240,549 2,96 11,16

Холодовое концентрирование более концентрированного раствора нитрофурантоина показывает большие потери даже при степени замерзания 60 %. Более разбавленные растворы МДПВ и дицикловерина показывают потери до 13 % даже при замерзании на 70 %, что является удовлетворительным результатом.

На основе изучения водных растворов было установлено, что быстрое, а значит низкотемпературное, холодовое концентрирование позволяет эффективно концентрировать только относительно разбавленные растворы как органических, так и неорганических веществ. При работе с более концентрированными растворами возникают большие потери, которые вызваны в основном остатками концентрированного раствора на поверхности льда, а так же включением капель концентрата в структуру растущего льда.

Изучали холодовое коцентрирование модельных образцов мочи без примесей - определяли распределение ионов К+ и Иа+, а так же пигмента урохрома между твердой и жидкой фазами при различных температурных режимах и степенях замерзания.

Изучение поведения ионов К+ и в образцах мочи показало, что при температурах - 27 °С и степени заморозки 60 - 70 % потеря катионов составляет 15 - 24 % в случае Ыа+ и 10 - 14 % в случае К+.

Для оптимизации потерь были проведены исследования в диапазонах температур от - 25 до — 5 °С. Было установлено, что оптимальной температурой холодового концентрирования мочи является диапазон от - 12 до - 15 °С. Результаты представлены на рисунках 3, 4 и 5.

30 -.....-

° 30 i 40 SO 60 I 70

—«—Nat; 1,23 f 4,12 7,96 15,49 [ 23,87

-Ш-К» f 0,33 2,59 ' 5,84 10,23 13,85

Степень кокцентрнровання, %

Рисунок 3. Результаты холодового концентрирования ионов N8+ и К+ в модельной моче при температуре — 27 °С

Рисунок 4. Результаты холодового концентрнрования ионов N3+ и К+ в модельной моче при температуре — 15 °С

Рисунок 5. Результаты холодового концентрирования урохрома в модельной моче при температуре -15 °С

Потери ионов Ыа+ и К+ при холодовом коцентрировании в температурном режиме - 15 °С существенно ниже, чем в случае - 27 °С. В то же время, повышение температуры приводит к сохранению высокого уровня потерь урохрома - порядка 30 %. Переход растворенных в моче высокомолекулярных балластных веществ в твердую фазу является положительным моментом, так как обеспечивает дополнительную очистку пробы.

Для изучения холодового концентрирования модельной мочи, содержащей органические вещества, были выбраны кеторолака трометамин и тропикамид в связи с токсичностью или применением этих веществ с целями одурманивания.

Результаты представлены в таблице 3.

Проведенная серия опытов показала, что холодовое концентрирование при температуре - 12 °С позволяет эффективно очищать от высокомолекулярных балластных веществ и концентрировать пробу при незначительных потерях аналита.

Проведенная серия опытов показала, что холодовое концентрирование при температуре - 12 °С позволяет эффективно очищать и концентрировать пробу при незначительных потерях аналита- 8 -11%.

После разностороннего изучения холодового концентрирования и подбора оптимальных условий, которые обеспечивали низкий уровень потерь аналитов и умеренные временные затраты на пробоподготовку, были усовершенствованы частные методики определения токсикологически значимых веществ.

Таблица 3. Результаты холодового концентрирования кеторолака трометамина и тропикамида с концентрацией 40 мг/л в модельной моче при температуре - 12 °С

Номер пробы Степень замерзания, % Площадь пика в жидкой фазе Степень концентрирования Потери, %

Кеторолака трометамин

1 30 538,451 1,42 0,52

2 40 625,541 1,65 0,94

3 50 741,480 1,96 2,15

4 60 887,067 2,34 6,35

5 70 1139,058 3,01 9,81

Тропикамид

1 30 747139 1,42 0,73

2 40 861827 1,64 1,85

3 50 1020495 1,94 3,15

4 60 1223329 2,32 7,12

5 70 1576490 2,99 10,23

Разработка частных методик применения холодового концентрирования в судебно-химическом анализе

Изучали возможность использования холодового концентрирования при разработке методик определения токсикологически значимых веществ. При этом были устранены проблемы, возникающие при решении задач обнаружения и количественного определения веществ в биожидкостях. Чаще всего такие сложности возникают либо при анализе веществ, употребляемых в низких концентрациях (менее 5 мг в качестве однократной дозы) либо при позднем заборе пробы (после окончания периода полувыведения вещества).

Применение холодового концентрирования при анализе веществ, употребляемых в низких дозах

Для разработки частных методик были выбраны наиболее актуальные токсикологически значимые вещества, основной путь выделения которых через почки. Для исследования брали реальные образцы мочи, содержащие «дизайнерские» наркотики 2С-Е (средняя дозировка вещества составляет 6 - 10 мг интраназально), МДПВ (средняя дозировка вещества составляет 10 - 15 мг интраназально), JWH 018 (средняя дозировка вещества при выкуривании порции курительной смеси составляет 1-1,5 мг), а так же клонидин (средняя дозировка при криминальном отравлении в сочетании с алкоголем составляет 0,8 - 1,5 мг).

Со всеми пробами проводили однократное холодовое концентрирование со степенью замерзания 70 %, с последующей экстракцией в слой хлороформа. По результатам серии опытов установили, что степень концентрирования, обеспечиваемая однократным Холодовым концентрированием, не обеспечивает должной чувствительности анализа.

В серии анализов опробовали методику двукратного холодового концентрирования со степенью замерзания 70 %. Для этого 3 образца мочи сконцентрировали, после чего концентраты объединили и сконцентрировали еще раз. Полученный концентрат исследовали с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Было установлено, что большие значения аналитического сигнала во втором случае говорят о высокой надежности данного подхода.

Применение холодового концентрирования при анализе проб, забор которых осуществлялся после окончания периода полувыведения

Был выработан подход для определения веществ, которые употребляют в относительно больших дозировках - более 10 мг, в случаях, когда забор пробы производили после окончания периода полувыведения.

Для разработки частных методик брали реальные образцы мочи, содержащие амфетамин (1-фенилпропан-2-амин, средняя дозировка вещества составляет 100- 150 мг интраназально) и МДМА (метилендиоксиметамфетамина, средняя дозировка вещества составляет 100 - 500 мг интраназально).

После подтверждения употребления амфетамина и МДМА, исследовали серию проб, которые забирались через 56 часов после употребления. Использование классических методик не выявило в пробе психотропных веществ и их метаболитов.

Было установлено, что, при заборе проб через 56 часов после употребления, в случае амфетамина при щелочном значении рН достаточно проведение однократного холодового концентрирования для надежного определения с помощью ГХ МС. В случае МДМА необходимо двукратное холодовое концентрирование при любом значении рН мочи.

Разработка методики пробоподготовки материалов, содержащих алкалоиды грибов рода РяПосуЬе

Установлено, что в пуле методик, используемых в анализе, направленном на определение алкалоидов группы псилоцина существует определенный дефицит. Это зачастую приводит к ложно-отрицательным результатам определения.

Исследование нашивного материала грибов вида РзПосуЬе ¡етИапсеа1а

Изучали свежие и сушеные плодовые тела грибов вида РзПосуЬе БетНапсеаГа, собранные на территории Пермского края.

Исследовали процессы экстракции суммы алкалоидов из нативного материала различными растворителями — водой; водой, подкисленной уксусной кислотой (1:100); водой, подкисленной хлороводородной кислотой (1:100); метанолом и этанолом. Изучали полноту извлечения алкалоидов, а так же количество совместно извлекаемых балластных веществ. Установили, что оптимальными растворителями для извлечения суммы алкалоидов из нативного материала являются вода, подкисленная уксусной кислотой и метанол. Метанол показал лучшие результаты извлечения, но вместе с искомыми алкалоидами извлекал и большее количество балластных веществ, чем вода, подкисленная уксусной кислотой. В качестве скрининговой методики использовали обычную и обращено-фазную тонкослойную хроматогарафию, в качестве подтверждающих методов применяли газовую хроматографию с масс-селективным детектированием.

Исследование биожидкостей, содержащих алкалоиды группы псилоцина с использованием классических схем дериватизации

Установили, что использование классических схем пробоподготовки, таких как кислотный гидролиз конъюгатов и жидкость-жидкостная экстракция, не позволяет достоверно определять алкалоиды группы псилоцина в образцах мочи, так как приводит к практически полному их разрушению.

Изучали воздействие различных факторов на степень разрушения алкалоидов группы псилоцина. По результатам испытаний установили, что основными причинами разрушения являются: воздействие кислорода воздуха и температуры.

В серии опытов термостатировали при различных температурах экстракты из грибов вида РяЛосуЬе зетПапсе.-Па, содержащие псилоцин и псилоцибин (рис. 6).

Температура, С0

Рисунок 6. Зависимость степени разрушения алкалоидов псилоцина и псилоцибина от температуры термостатнрования

В связи с отсутствием стандартов, брали объединенный экстракт, концентрацию суммы псилоцина и псилоцибина в котором брали за единицу. После термостатирования проводили исследование с помощью ГХ МС. В каждом температурном режиме количества псилоцина и псилоцибина после термостатирования варьировались, но сумма алкалоидов была постоянной величиной. Диапазон температур, при котором происходит преимущественное разложение алкалоидов, составляет 75 - 78 °С.

Исследование биожидкостей, содержащих алкалоиды группы псилоцина с использованием видоизмененных методов пробоподготовки, включающих холодовое концентрирование

При работе с образцами мочи, содержащими алкалоиды псилоцин и псилоцибин, для предотвращения воздействия кислорода воздуха, применяли натрия гидросульфит, который добавляли в смесь для гидролиза конъюгатов. Для снижения температуры смеси изучали влияние добавления этанола, метанола, ацетона и ацетонитрила на температуру термостатирования на водяной бане. Было установлено, что оптимальными добавками являются ацетон (1К1Ш = 51,6 °С) и метанол (1кип = 64,7 °С). Изучали оптимальное соотношение насыщенного раствора натрия гидросульфита, легкокипящей жидкости и концентрата пробы. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Зависимость соотношения реагентов, добавляемых к биожидкости и степени устойчивости псилоцина при термостатировании

Номер пробы Частей органической жидкости* Частей раствора КаШО., (нас.)* Площадь пика псилоцина

Метанол Ацетон

1 20 2 56284

2 18 2,7 56824

3 15 3,3 61458

4 13 4 57243

5 10 4,7 43815

6 20 5 38491

7 18 5 42157

8 15 5 62849

9 13 5 71743

10 1 10 5 52493

*на 100 частей пробы

Была разработана методика пробоподготовки мочи, содержащей алкалоиды группы псилоцина. Проба подвергается однократному холодовому концентрированию при температуре - 12 °С со степенью замерзания 70 %. Готовится смесь для кислотного гидролиза коньюгатов.

Установлены 2 состава смеси:

1. Концентрат, подкисленный хлороводородной кислотой 10 % (9 частей к 100 частям пробы), метанол, насыщенный раствор натрия гидросульфита в соотношении 100:15:3,5 соответственно.

2. Концентрат, подкисленный хлороводородной кислотой 10 % (9 частей к 100 частям пробы), ацетон, насыщенный раствор натрия гидросульфита в соотношении 100:13:5 соответственно.

Смесь термостатируется при медленном нагревании в течение 30 минут, после чего рН доводится до 10 раствором гидроксида аммония, после чего проводится трехкратная экстракция алкалоидов в хлороформ.

ВЫВОДЫ

1. Изучены характеристики холодового концентрирования водных растворов неорганических, полярных и неполярных органических веществ. Для изученных соединений оптимальными условиями при концентрациях ниже 100 мг/л являются температура замораживания - 27 °С, степень замораживания 70 %, объем пробы - 100 мл, стеклянная лабораторная посуда. В случае более насыщенных растворов, а также образцов мочи, для снижения потерь аналитов необходимо повышение температуры замораживания до - 12 - 15 °С.

2. Изучены характеристики холодового концентрирования модельных образцов мочи без примесей и содержащих токсикологически значимые вещества. Установлено, что оптимальными условиями холодового концентрирования являются температура — 12 — 15 °С, степень заморозки - 70 %.

3. Разработаны частные методики определения в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в относительно низких дозировках (менее 10 мг) на примере 2С-Е, клонидина, МДПВ и ^Н-018.

4. Разработаны частные методики идентификации в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в достаточно высоких дозах (более 10 мг) после окончания периода полувыведения аналитов, на примере амфетамина и метилендиоксиметамфетамина. Установлена роль кратности холодового концентрирования, как фактора эффективности проведения скринингового анализа токсикологически значимых веществ.

5. Усовершенствованы методики надежного определения алкалоидов группы псилоцина в нативном материале грибов вида РвПосуЬе зегш1апсеа1а. Установлено, что оптимальными экстрагентами алкалоидов являются метанол и вода, подкисленная уксусной кислотой. Метанол обеспечивает более полное извлечение алкалоидов, площадь пиков на 34 % больше, чем в случае воды, подкисленной уксусной кислотой. В то же время, метанол извлекает существенно больше балластных веществ, чем вода, подкисленная уксусной кислотой. Оценку эффективности извлечения алкалоидов проводили методом ТСХ по площади пятен.

6. Усовершенствованы методики определения алкалоидов группы псилоцибина в моче. Оптимальными условиями пробоподготовки являются однократное холодовое концентрирование с последующим добавлением в смесь для гидролиза конъюгатов восстановителей, например натрия гидросульфита, а так же жидкостей, снижающих температуру смести при выдерживании на водяной бане, таких как ацетон и метанол.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

¡.Тяжельников, С.Ф. Психоделики. Общая информация и методики анализа. Монография /С.Ф. Тяжельников. - ПГФА, Пермь, 2012. - 176 с.

2.Тяжельников, С.Ф. Механизмы действия активных веществ, содержащихся в грибах рода Psilocybe // Современное состояние и пути оптимизации лекарственного снабжения населения, материалы Российской научно-практической конференции. - ПГФА, Пермь, 2008. - С. 371-374.

3.Тяжельников, С.Ф. Определение содержания псилоцина и псилоцибина в грибах вида Psilocybe semilanceata, произрастающих на территории Пермского края /У Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа, материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. - Пермь, 2009. — С. 73-76.

4.Тяжельников, С.Ф. Токсикологическое значение грибов рода Psilocybe / О.Н. Симонова, С.Ф. Тяжельников // Вестник ПГФА. - 2009. - №5. - С. 152-154.

5.Тяжельников, С.Ф. Ключевые проблемы профилактики злоупотребления молодежью психоактивными веществами / T.JI. Малкова, П.С. Мащенко, С.Ф. Тяжельников // Вестник пермского научного центра. - 2010. - №1. — С. 43-50.

6.Тяжельников, С.Ф. Пробоподготовка биологического материала, содержащего термолабильные алкалоиды грибов рода Psilocybe // Сборник материалов 74 студенческой научно-практической конференции с международным участием поев 100-летию со дня рождения профессора Дыхно, Красноярский государственный медицинский университет. - 2010. - С. 885-886.

7. Тяжельников, С.Ф. Модернизация процедуры пробоподготовки и

скрининга биологического материала содержащего алкалоиды грибов рода Psilocybe Н Наркология. - 20! 1. - № 2. - С. 85-87.

8.Тяжельников, С.Ф. Определение оптимальных условий метода холодового концентрирования в судебно-химическом анализе / H.A. Исаева, С.Ф. Тяжельников // Вестник ПГФА. - 2011. - №8. - С. 114-116.

9.Тяжельников, С.Ф. Разработка условий пробоподготовки биоматериала с использованием метода холодового концентрирования в судебно-химическом анализе // Актуальные вопросы судебно-химических и химико-токсикологических исследований, материалы межрегиональной научно-практической конференции 6-7 октября 2011. - г. Екатеринбург. - 2011. — С. 39-41.

10. Тяжельников, С.Ф. Пробоподготовка биологического материала, содержащего термолабильные алкалоиды грибов рода Psilocybe // Морфология критических и терминальных состояний, материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РФ, профессора В.И. Алисиевича. - г. Москва,- 2011.-С. 189-193.

11. Тяжельников, С.Ф. Исследование метаболизма и разработка методик идентификации МДПВ / Е.Ю. Кузьменко, Г.Д. Назипова, С.Ф. Тяжельников // Российская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых «Современные проблемы фармацевтической науки», посвященная 75-летию ПГФА. - Пермь. - 2012. - С. 142-143.

12. Тяжельников С.Ф. Применение холодового концентрирования при анализе биожидкостей забор которых осуществлялся после окончания периода полувыведения, на предмет наличия метилендиоксиметамфетамина // Современные проблемы науки и образования. - 2012. — № 5; URL: http://www.science-education.ru/105-6960 (дата обращения: 10.09.2012)

13. Тяжельников, С.Ф. Психоделики и дизайнерские наркотики / С.Ф. Тяжельников. - Берлин: Lambert Academic Publushing, 2012. - 176 с.

Тяжельников Станислав Федорович (Россия)

Применение холодового концентрирования в анализе мочи, содержащей некоторые токсикологически значимые вещества

В работе представлены результаты исследований по применению холодового концентрирования в пробоподготовке при анализе различных проб -водных растворов органических и неорганических веществ, модельных образцов мочи, а также реальных образцов мочи, содержащих токсикологически значимые вещества.

Холодовое концентрирование мочи при температуре - 12 - 15 °С позволяет повысить чувствительность широко распространенных методов идентификации веществ.

При холодовом концентрировании происходит очистка пробы от балластных и интерферирующих веществ, а также повышение концентрации аналитов без применения нагревания, что важно при анализе термолабильных веществ.

Холодовое концентрирование может быть внедрено в практику химико-токсикологических лабораторий, а так же может послужить основой для дальнейшей разработки новых приемов и методов пробоподготовки.

Tyazhelnikov Stanislav (Russia)

The use of cold concentration in the analysis of urine which contains some toxicologically important substances

A work presents the results of studies on the use of cold concentration in sample preparation for analysis of different samples - aqueous solutions of organic and inorganic substances, model samples of urine, as well as real urine samples that contain toxicologically relevant substances.

Cold concentration of urine at a temperature of - 12 - 15 °C can increase the sensitivity of common methods of identifying substances.

Cold concentration cleans samples from ballast and interfering substances, as well as increasing the concentration of analytes without heat, which is important in the analysis of heat-sensitive substances.

Cold concentration may be incorporated into routine practice of analytical laboratories, as well as can be the basis for further development of new techniques and methods of sample preparation.

Подписано в печать 07.12.2012г. Формат60*84/16 Усл. печ. л. 1,39. Тираж 100 экз. Заказ 372

Типография Пермского государственного национального исследовательского университета. 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15

Актуальность проблемы. В современном мире специалистам, занимающимся химическим анализом, судебным химикам, токсикологам часто приходится сталкиваться с задачами по определению достаточно низких концентраций веществ. В арсенале современной лаборатории имеются высокочувствительные приборы - газовые и жидкостные хроматографы с масс спектрометрическими детекторами, позволяющие обнаружить такие концентрации, однако для проведения анализа пробы должны быть достаточно чистыми. Для достижения этого необходима достаточно сложная и глубокая очистка первичной пробы. В противном случае либо происходит нарушение работы прибора за счет накопления высокомолекулярных балластных веществ в колонках и детекторах, либо полученные хроматограммы содержат такое количество пиков, по размеру превосходящих пики искомых веществ, что качественное и, тем более, количественное определение не представляется возможным.

В последние годы в России наблюдается значительно увеличение случаев продажи, хранения и употребления так называемых «дизайнерских» наркотиков - веществ, которые являются структурными или функциональными аналогами наркотических веществ, но, зачастую, не криминализированы (делегализованы). Юридическая легальность этих веществ приводит к тому, что они свободно продаются через Интернет или просто в ларьках под видом «солей для ванн», «сыпучих Фен-шуй», чая Пу-эр и т.д. При обнаружении нового действующего вещества, не внесенного в список запрещенных к обороту веществ, либо в список аналогов [155-166] проводятся комплексные исследования фармакологической активности и подтверждение структуры, после чего вещество криминализируется и изымается из продажи. Обычно, сразу после этого, на рынке появляется новый незапрещенный наркотик. Этот цикл занимает в среднем от 3 до 5 месяцев, но, с активизацией работы ФСКН (активная работа с таможней, налаживание процедуры доказательства психотропного действия), среднее время цикла сокращается.

В случае вещественных доказательств (материалов с высоким содержанием искомых веществ) существует достаточное количество надежных и проверенных рекомендаций. В случае анализа биожидкостей этих методик недостаточно, они разработаны для узкого спектра веществ. Из-за большого ассортимента и постоянного появления новых веществ, аналитические лаборатории не успевают разрабатывать и аттестовывать соответствующие методики. Высококачественная пробоподготовка позволит значительно упростить проведение анализа и позволит разработать несколько универсальных методик, которые подойдут для ненаправленного поиска большинства групп лекарственных, наркотических веществ и их аналогов. Данные методики должны быть простыми, надежными, воспроизводимыми и обеспечивать высокую чувствительность анализа.

Лабораториям, работающим в области химико-токсикологического анализа биожидкостей, зачастую приходится проводить определение веществ, для которых не существует аттестованных методик идентификации. К тому же, чаще всего, данные вещества обладают большим потенциалом действия и применяются в низких дозировках. В случае порошков рекреационная доза составляет 5-20 мг, в случае синтетических аналогов каннабиноидов (.Г\\ГН) - 1 - 3 мг. В ходе метаболизма, который для большинства веществ не изучен, часто образуются метаболиты -структурные «осколки» исходных веществ и конъюгаты, что дополнительно усложняет анализ. Зачастую искомые вещества выводятся исключительно в виде метаболитов.

Еще одной важной проблемой современной судебной химии является определение алкалоидов галлюциногенных грибов вида РзПосуЬе зегш1апсеа1а. В настоящее время растет количество случаев их употребления на территории России, особенно в Пермском крае и в Ленинградской области. Официальная статистика показывает лишь незначительное количество случаев употребления. Это связано, прежде всего, с тем, что отравления галлюциногенными грибами, которые приводят к госпитализации, происходят крайне редко, в связи тем, что токсическая доза грибов достаточно велика. Основные алкалоиды грибов вида РзПосуЬе 8етПапсеа1а - псилоцибин и псилоцин, выводятся преимущественно в виде конъюгатов с глюкуроновой кислотой. Термический кислотный гидролиз, который обычно применяют для деструкции конъюгатов, приводит к практически полному расщеплению искомых веществ. На данный момент не существует эффективной методики определения алкалоидов в биологических матрицах (чаще всего в моче).

Общим для двух рассмотренных групп проблем является необходимость определения достаточно низких концентраций веществ в биологических матрицах. В случае галлюциногенных грибов добавляется высокая термолабильность и низкая устойчивость к действию кислорода воздуха и концентрированных кислот алкалоидов группы псилоцина.

Определение в биожидкостях, веществ, концентрация которых ниже порога определения современных приборов является достаточно сложной задачей. Современная практика предлагает в данном случае несколько решений. В западных странах наиболее распространена твердофазная экстракция. В России этот метод не имеет широкого распространения в связи с высокой стоимостью расходных материалов. Другим возможным вариантом повышения чувствительности при анализе сильно разбавленных растворов является увеличение объема пробы взятой для жидкость-жидкостной экстракции. В данном случае возникает проблема большого количества балластных веществ, экстрагируемых в слой органического растворителя, что приводит к значительным сложностям в ходе качественного и количественного определения. Метод выпаривания, позволяет проводить концентрирование, но в данном случае возникает риск улетучивания, разрушения веществ в процессе нагревания. Метод вакуумной отгонки требует специализированного оборудования, занимает длительное время и так же существует риск улетучивания искомых веществ с парами воды.

Помимо пробоподготовки проб, содержащих органические токсикологически значимые вещества, в работе так же затронуты вопросы идентификации тяжелых металлов - марганца и серебра, в связи с их широким распространением в окружающей среде или использованием при кустарном производстве наркотических веществ.

Данная научная работа посвящена модернизации пробоподготовки и очистки первичных проб, снижения потерь искомых веществ и повышения степени концентрирования.

Цели и задачи работы

Целью работы является оптимизация и усовершенствование методик пробоподготовки биоматериала, применение холодового концентрирования в анализе мочи, содержащей некоторые токсикологически значимые вещества.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

• Изучить характеристики метода холодового концентрирования на примере водных растворов неорганических и органических веществ

• Изучить характеристики холодового концентрирования модельных образцов мочи, в том числе содержащих токсикологически значимые вещества

• Разработать частные методики определения в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в низких дозировках (менее 10 мг) на примере 2,5-диметокси-4-этил-фенилэтиламина (2С-Е), 2-(2,6-Дихлорфениламино)-имидазолина гидрохлорида (клонидин), 1-(бензо[ё] [ 1,3]диоксол-5-ил)-2-(пирролидин-1 -ил)пентан-1 -она (МДПВ, метилендиоксипировал ерон) и (Нафталин-1 -и л)( 1 -пенти л-1 Н-индо л-3 -ил)метанона (I\VH-018)

• Разработать частные методики определения в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в достаточно высоких дозах (более 10 мг) на примере 1-фенилпропан-2-амина (амфетамин) и 1-(бензо [d] [ 1,3 ] диоксол-5 -ил)-1чГ-метилпропан-2-амина (метилендиоксиметамфетамин)

• Усовершенствовать методики определения алкалоидов группы псилоцина в нативном материале грибов вида Psilocybe semilanceata

• Усовершенствовать методики определения алкалоидов группы псилоцина в моче.

Научная новизна

Разработаны методики определения сложных для идентификации токсикологически значимых веществ, обычно содержащихся в биожидкостях в относительно низкой концентрации из-за низкой употребляемой дозы; позднего забора пробы, когда большая часть аналитов выведена; низкой стабильности при проведении пробоподготовки.

Вещества, для которых были разработаны методики, относятся к лекарственным средствам (клонидин), «классическим» наркотическим веществам (амфетамин, MDMA), «дизайнерским» наркотикам (2С-Е, МДПВ, JWH 018). Кроме того, была разработана методика определения алкалоидов группы псилоцина, являющихся «классическими» наркотиками, в нативном материале и биологических матрицах.

В разработанных методиках на стадии пробоподготовки применяли холодовое концентрирование, как основной прием, позволяющий одновременно очищать и концентрировать пробы. Установлены основные температурные режимы, при которых происходит холодовое концентрирование с минимальными потерями аналитов и максимальной степенью очистки от высокомолекулярных балластных веществ.

Методология работы

Водные растворы органических и * неорганических вещее гв да Г Йодельные образцы м , так и содержЬптни 4uriiiifMi.ii* Очи, как без примесей, ток|иколоЕЙчески'' -І ТІЄТТТЄГТТЇЯ і

Реальные образцы мочи, . содержащие токсикологически значимые вещества, употребляемы с в низкой дозировке А&і

Изолирование алкалоидов грибоввида "I. «ІЛ-^ЛЯЬ«.,

Р б і 1 о суЬе^еті Іапееа: натйвного материала

Пробы реальных о< .сощщсащие токср значщь^Ьещества, з выведения большей пЛлжшгг УЧО •^

РеалЁ'Ны^образЩ! мс содержащие алкали псилоцибин и псилої

-«кг.*^, 5, , , . . - , .дай™. . ,€ ■

Разработка частных метолик идентификации токсикологически знач

Для достижения целей, поставленных в рамках диссерационной задачи, исследование было разделено не несколько этапов.

Изучали общие параметры и характеристики холодового концентрирования водных растворов органических и неорганических веществ с различными физико-химическими свойствами, концентрацями и температурами.

На основе полученных результатов изучали параметры и характеристики холодового концентрирования модельных образцов мочи, как без примесей, так и содержащих токсикологических значимые вещества. Подбирали оптимальные условия, которые обеспечивают наименьшее количество потерь и временных затрат на пробоподготовку, включающую стадию холодового концентрирования.

После изучения основных характеристик холодового концентрирования биоматериала разработали частные методики определения токсикологически значимых веществ, употребляемых в низкой дозировке, а так же проб, забранных после выведения большей части аналитов.

Разработали методики изолирования алкалоидов грибов вида РБІІосуЬе зетіїапсеаіа из нативного материала. Разработали методики идентификации алкалоидов группы псилоцина в биожидкостях, после употребления галлюциногенных грибов, содержащих данные алкалоиды.

Практическая значимость

Разработан ряд методик для рутинного определения широкого спектра психотропных веществ при наличии усложняющих анализ факторов, таких как большое количество примесей, низкая концентрация аналитов, низкая устойчивость искомых веществ к действию температуры и химических реагентов.

Разработан алгоритм принятия решений для выбора метода пробоподготовки и определения при проведении судебно-химических исследований, которые способствуют повышению качества, надежности, точности и воспроизводимости результатов.

Разработанные методики пробоподготовки с применением холодового концентрирования внедрены в практику химико-токсикологической лаборатории Санкт-Петербургского государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Межрайонный наркологический диспансер №1» (акт внедрения от 12 сентября 2012 г.), лаборатории токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» (акт внедрения от 12 сентября 2012 г.), в учебный процесс кафедры биологической химии с курсом токсикологической химии Оренбургской государственной медицинской академии (акт внедрения от 30 мая 2012 года), кафедры охраны окружающей среды Пермского национального исследовательского политехнического универститета (акт внедрения от 03 сентября 2012 года).

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы, включающего 179 наименований, в том числе 137 источников литературы на иностранном языке. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 20 таблиц, 30 рисунков и приложение, включающее акты внедрения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучены характеристики холодового концентрирования водных растворов неорганических, полярных и неполярных органических веществ. Оптимальными условиями при концентрациях ниже 100 мг/л являются температура замораживания - 27 °С, степень замораживания 70 %, объем пробы - 100 мл, стеклянная лабораторная посуда. В случае более насыщенных растворов, а также образцов мочи, для снижения потерь аналитов необходимо повышение температуры замораживания до -12-15 °С.

2. Изучены характеристики холодового концентрирования модельных образцов мочи без примесей и содержащих токсикологически значимые вещества. Установлено, что оптимальными условиями холодового концентрирования являются температура - 12 - 15 °С, степень заморозки -70 %.

3. Разработаны частные методики определения в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в относительно низких дозировках (менее 10 мг) на примере 2С-Е, клонидина, МДПВ и 1\Ш-018.

4. Разработаны частные методики идентификации в моче токсикологически значимых веществ, употребляемых обычно в достаточно высоких дозах (более 10 мг) после окончания периода полувыведения аналитов, на примере амфетамина и метилендиоксиметамфетамина. Установлена роль кратности холодового концентрирования, как фактора эффективности проведения скринингового анализа токсикологически значимых веществ.

5. Усовершенствованы методики надежного определения алкалоидов группы псилоцина в нативном материале грибов вида РБПосуЬе 8етПапсеа1а. Установлено, что оптимальными экстрагентами алкалоидов являются метанол и вода, подкисленная уксусной кислотой. Метанол обеспечивает более полное извлечение алкалоидов, площадь пиков на 34 % больше, чем в случае воды, подкисленной уксусной кислотой. В то же время, метанол извлекает существенно больше балластных веществ, чем вода, подкисленная уксусной кислотой. Оценку эффективности извлечения алкалоидов проводили методом ТСХ по площади пятен.

6. Усовершенствованы методики определения алкалоидов группы псилоцина в моче. Оптимальными условиями пробоподготовки являются однократное холодовое концентрирование с последующим добавлением в смесь для гидролиза конъюгатов восстановителей, например натрия гидросульфита, а так же жидкостей, снижающих температуру смести при выдерживании на водяной бане, таких как ацетон и метанол.

Заключение

Холодовое концентрирование мочи при температуре - 12 — 15 °С позволяет повысить чувствительность широко распространенных методов идентификации токсикологически значимых веществ, таких как «дизайнерские» и «классические» наркотики, а так же лекарственные вещества и может быть внедрено в типовую схему пробоподготовки.

При холодовом концентрировании происходит очистка пробы от балластных и интерферирующих веществ, а так же повышение концентрации аналитов без применения нагревания, что важно при анализе термолабильных веществ.

Холодовое концентрирование может быть внедрено в рутинную практику химико-токсикологических лабораторий, а так же может послужить основой для дальнейшей разработки новых приемов и методов пробоподготовки.