Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследования по разработке методов анализа некоторых β-адреноблокаторов в биологических объектах

На правах рукописи

(/л^---

КОКОРИНА НАТАЛЬЯ ОЛЕГОВНА

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА НЕКОТОРЫХ (3—АДРЕНОБЛОКАТОРОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 4 ФЕВ 2013

Самара - 2013

005049572

Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Ханина Миниса Абдуллаевна - доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Кудашкина Наталья Владимировна - доктор фармацевтических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, заведующая кафедрой

Гурьев Артем Михайлович - доктор фармацевтических наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Центр внедрения технологий, руководитель

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «1» марта 2013 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.

Автореферат разослан «И" л АнЛй/лА 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета _/_г-

кандидат фармацевтических наук, доцент "¡^¿¿^Агетрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в практике судебной медицины и токсикологии встречаются случаи отравления ß-адреноблокаторами лиц различных возрастных групп. Наиболее часто встречаются отравления метопрололом, атенололом, пропранололом, бисопрололом, талинололом, бетаксололом (Ходасевич А.П., Вольграм E.H., 1983; Анохин В.Т. с соавторами, 1983; Belson, M.G., Geller, R.S., 2000; Кутяков В.А., 2006; Семьянов с соавторами, 2007; Кнауб В.А., 2009; Лагуткина Т.П. с соавторами, 2011).

Используемые в судебной химии и токсикологии методики не позволяют однозначно идентифицировать ß-адреноблокаторы, поскольку в литературе в основном описаны методики обнаружения отдельных ß-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) методом тонкослойной хроматографией (ТСХ), где в качестве проявляющих реагентов используются йодсодержащие реактивы. Кроме того, информация по идентификации ß-адреноблокаторов при их совместном присутствии ограничена, а проявители (йодсодержащие реагенты), используемые для их проявления, не позволяют однозначно интерпретировать полученные результаты, так как окрашивают все азотсодержащие вещества в оранжевый или коричневый цвет.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектированием позволяет идентифицировать многие лекарственные вещества, имеющие поглощение в области УФ-спектра, в том числе и ß-адреноблокаторы (Барам Г.И. с соавторами, 2002; 2003; 2005; Федорова Г.А., Кожанова Л.А., 2007). Однако применение метода ВЭЖХ ограничивается отсутствием в практике судебной химии и токсикологической химии оптимальных методик пробоподготовки биологических объектов (оптимальные условия для высокой степени излечения ß-адреноблокаторов), обеспечивающих наилучшую эффективность экстракции и характеризующиеся невысокой трудоемкостью.

В случае летальных исходов при судебно-химических исследованиях и острых отравлениях наиболее удобными объектами исследования являются кровь и моча. Поэтому разработка надежных и достоверных методик изолирования ß-адреноблокаторов из крови и мочи, их идентификации и количественного определения является актуальной проблемой.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка эффективной методики выделения ß-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических объектов (кровь и моча), их идентификации и количественного определения.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработка методик извлечения, обеспечивающих эффективную экстракцию ß-адреноблокаторов из биологических жидкостей;

- подбор чувствительных цветных реакций при анализе методом тонкослойной хроматографии для идентификации атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола;

- подбор хроматографических систем, позволяющих разделять и идентифицировать Р-адреноблокаторы методом ТСХ;

- разработка оптимальных условий метода ВЭЖХ, определение хроматографических характеристик (время удерживания, спектральные отношения) для идентификации исследуемых Р-адреноблокаторов.

- разработка методики количественного определения атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола в биологических объектах (крови и моче) методом ВЭЖХ.

- апробирование разработанных методик на образцах биологического материала, полученного для судебно-медицинского и токсикологического исследования в работе ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы».

Научная новизна. Разработаны оптимальные условия извлечения (рН среды, соотношения органических растворителей в смеси экстрагентов) р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических объектов (крови и мочи), позволяющие извлекать из них до 80-90% вещества (атенолола из крови извлекается 54%, из мочи - 63%).

Разработаны условия тонкослойной хроматографии (подобраны системы растворителей и чувствительные цветные реакции) для разделения и идентификации индивидуальных р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) и при их совместном присутствии в биологических объектах.

Определена чувствительность методик идентификации атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола методами ТСХ и ВЭЖХ.

Разработаны условия для идентификации атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола методом ВЭЖХ с многоволновым УФ-детектированием в биообъектах (крови и моче), установлены спектральные характеристики (времена удерживания и спектральные отношения) для атенолола, бетаксолола, бисопролола и талинолола.

Разработана и валидирована методика количественного определения атенолола, бетаксолола, бисопролола и талинолола методом ВЭЖХ в биологических объектах (крови, моче).

Установлено, что при очистке биологических объектов от соэкстрактивных веществ гексаном, происходит потеря р—адреноблокаторов.

Практическая значимость. Разработанные методики извлечения, качественного обнаружения и количественного определения р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических жидкостях (крови, мочи) методами ТСХ и ВЭЖХ внедрены в работу судебно-химического отделения

ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», судебно-химического отделения КГБУЗ «Алтайское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (г. Барнаул), КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы».

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе (в лекционном материале и практических занятиях) на кафедре фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, на кафедре судебной медицины ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, на кафедре судебной медицины ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет» Минздрава России, на кафедре судебной медицины ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Материалы диссертационной работы рекомендованы к использованию в работе контрольно-аналитической лаборатории ОАО «Фармация» (г. Новосибирск).

По результатам диссертационной работы разработаны Методические рекомендации «Определение некоторых р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических жидкостях» (рекомендованы к изданию советом межрегиональной общественной организации «Судебные медики Сибири», протокол № 17 от 24.06.2011 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме «Поиск, изучение, создание и внедрение новых лекарственных средств растительного и синтетического, происхождения и организация форм фармацевтической деятельности» (государственная регистрация № 01200807420).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Методика извлечения Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических жидкостей (крови, мочи) методом жидкость-жидкостной экстракции.

2. Методики идентификации р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

3. Методика количественного определения Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических объектах методом ВЭЖХ.

Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на заседаниях кафедры судебно-медицинской экспертизы ГБОУ ВПО «Новосибирский Государственный медицинский университет» Минздрава России (2006 - 2011 гг.), на заседаниях методического совета ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (2007 -

2011 гг.). Результаты исследования докладывались на научно-практических конференциях Межрегиональной общественной организации «Судебные медики Сибири» (июнь 2009 г, май 2010 г., июнь 2011 г.), на конференции, посвященной 55-летию Красноярского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы (май 2006 г.), на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири -развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств», посвященной 300-летию М.В.Ломоносова»,г. Новосибирск (6-7 октября 2011 г.).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 7 статей, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК.

Экспериментальные исследования по теме диссертационной работы выполнены в судебно-химическом отделении ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: ЗАО «Институт хроматографии «Эконова» (г. Новосибирск), контрольно-аналитической лаборатории ОАО «Фармация» (г. Новосибирск).

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором выполнены исследования по оценке параметров пригодности хроматографических систем, позволяющих разделять и идентифицировать р-адреноблокаторы методом ТСХ; автором апробированы и подобраны наиболее оптимальные хромогенные реактивы для достоверной идентификации исследуемых р-адреноблокаторов в условиях ТСХ. Автором разработаны оптимальные условия извлечения Р-адреноблокаторов из биологических объектов (крови, мочи) и установлены степени их извлечения, подобраны условия исследования методом ВЭЖХ и определены их хроматографические характеристики, построены калибровочные графики для количественного определения. Автор самостоятельно рассчитал метрологические характеристики методики количественного определения и провел ее валидацию.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методам исследований, собственных исследований, выводов, а также списка литературы, включающего 189 наименований, в т.ч. 34 источника иностранных авторов. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц, 8 рисунков и 5 приложений, включающих 2 таблицы и 9 рисунков.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту.

В первой главе (обзор литературы) приведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современным методам извлечения исследуемых р-адреноблокаторов из биологического материала и их анализа.

Во второй главе представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены системы растворителей и элюентов для исследования методами ТСХ и ВЭЖХ, условия проведения исследований методом ВЭЖХ.

В третьей главе (экспериментальная часть) приведены результаты исследования p-адреноблокаторов методом ТСХ и методом ВЭЖХ:

- описаны модельные растворы p-адреноблокаторов, используемые для этих целей;

- приведены результаты исследований по подбору систем растворителей для разделения и идентификации исследуемой группы веществ в индивидуальном виде и в смеси;

- приведены результаты исследований по подбору хромогенных реактивов для идентификации исследуемых p-адреноблокаторов;

- определены хроматографические характеристики и установлены пределы обнаружения p-адреноблокаторов при анализе методом ТСХ и ВЭЖХ;

- приведена методика количественного определения исследуемых адреноблокаторов методом ВЭЖХ, построены калибровочные графики;

- приведены результаты исследований по жидкость-жидкостной экстракции (подбор растворителей, их соотношение, рН среды, влияние разбавления и очистки биологических жидкостей) исследуемых р-адреноблокаторов из водных растворов и биологических жидкостей (кровь, моча), приведены результаты валидации методики количественного определения.

- предложены схемы определения исследуемых p-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических жидкостях (крови и моче) при судебно-химическом и токсикологическом исследованиях.

Диссертация завершается общими выводами по работе, списком литературы и приложениями. В приложениях приведены результаты применения разработанной методики извлечения, идентификации и количественного определения p-адреноблокаторов в практике судебно-химического отделения ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы».

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах и на рисунках, которые приведены в тексте диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методики исследования

Объектами исследования являлись субстанции p-адреноблокаторов, представленных компаниями «Sigma», «Ipca Laboratories Limited» ( Индия), Alcon-Couvreur n.v.» (Бельгия); «Cambrex Cork LT (Ирландия), «Ipca Laboratories Limited» (Индия), «Changzhou Yabang Pharmaceutical Co.»

(Китай), «Frzneimittwerc Drezden, GmbH» (Германия); «ASTA Medica» (Германия).

Модельные растворы индивидуальных ß-адреноблокаторов и их смесей (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола): в 0,1 н растворе кислоты хлороводородной; в спирте этиловом 95%; в биологических объектах (моча, кровь);

Для анализа ß-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) использованы методы ТСХ и ВЭЖХ.

Исследование методом ТСХ проводилось на пластинках для тонкослойной хроматографии «Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ» размером 10 х 10 см с использованием 17 систем растворителей.

Идентификация исследуемых ß-адреноблокаторов проводилась по величинам Rf, окраске пятен после проявления хромогенными реактивами.

Исследования методом ВЭЖХ проведены на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО ИХ «Эконова», г. Новосибирск) с металлической колонкой 2 х 75 мм, заполненной обратно-фазовым сорбентом ProntoSIL 120 - 5 - С 18 (BischoffAnal, Gmbh., Германия), детектор - Уф-фотометр. Уф-детектирование проведено одновременно при 8 длинах волн: 210 (опорная), 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм. Градиентное элюирование проведено смешиванием двух элюентов: элюент А - 0,1% раствор кислоты трифторуксусной в воде очищенной, элюент В -ацетонитрил. Скорость потока - 150 мкл/мин, элюирование - линейный градиент от 2 до 100% ацетонитрила за 3000 мкл, температура колонки 35°С.

Количественное определение проведено методом ВЭЖХ.

Извлечение исследуемых ß-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических жидкостей (крови, мочи) проведено методом жидкость-жидкостной экстракции органическими растворителями.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Statistica MS Excel, OriginPro 7.5.

2. Результаты исследования

2.1. Исследование ß-адреноблокаторов методом ТСХ

Исследования по идентификации исследуемых ß-адреноблокаторов методом ТСХ были проведены на модельных растворах индивидуальных веществ - атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола в 95% спирте этиловом с концентрацией веществ 10 мкг/мл.

Для подбора хромогенных реактивов для обнаружения и идентификации исследуемых ß-адреноблокаторов были исследованы 17 наиболее часто используемых хромогенных реактивов, представленных в таблице 1.

Результаты окрашивания пятен ß-адреноблокаторов после обработки хроматограмм хромогенными реактивами представлены в таблице 2.

Хромогенные реактивы для проявления (5-адреноблокаторов _при исследовании методом ТСХ_

№ п/п Хромогенный реактив

1 Реактив Драгендорфа (основной висмута нитрат в кислоте азотной концентрированной с калием йодида)

2 Реактив Драгендорфа в модификации по Мунье (основной висмута нитрат в кислоте уксусной ледяной с калием йодида)

3 0,3 М раствор меди сульфата, подкисленный кислотой серной и 0,3 М раствор калия йодида

4 0,1 н раствор йода с 10 % раствором кислоты хлороводородной

5 Реактив Манделина (аммония ванадат в кислоте серной концентрированной)

6 Реактив Либермана (натрия нитрит в кислоте серной концентрированной)

7 Реактив Фреде (аммония молибдат в кислоте серной концентрированной)

8 Реактив Марки (формалин в кислоте серной концентрированной)

9 5% раствор железа (III) хлорида

10 2% раствор калия перманганата

11 1% водный раствор ванилина и кислота серная концентрированная

12 5% раствор ртути сульфата и 0,02% раствор дифенилкарбазона в хлороформе

13 2 н раствор кислоты хлороводородной, 0,5% раствор натрия нитрита и щелочный раствор р-нафтола

14 57% раствор кислоты хлорной, содержащей 3% 0,5% раствора натрия нитрита

15 Кислота серная концентрированная и спирт этиловый (95°) в соотношении (1:1)

16 Кислота серная концентрированная

17 Кислота азотная концентрированная

Сравнительный визуальный анализ хромогенных реактивов позволил установить, что реактивом Драгендорфа (реактив № 1) все исследуемые Р-адреноблокаторы окрашиваются в оранжевый цвет, реактивом Драгендорфа в модификации по Мунье (реактив № 2), меди сульфатом, подкисленной кислотой серной и раствором калия йодида (реактив № 3), раствором йода с раствором кислоты хлороводородной (реактив № 4), все исследуемые р-адреноблокаторы окрашиваются в коричневый цвет (бетаксолол в серо-коричневый цвет), раствором калия перманганата все исследуемые р-адреноблокаторы проявляются в виде пятен желтого цвета на розовом фоне, раствором ртути сульфата и раствором дифенилкарбазона все исследуемые

Таблица 2

Окрашивание исследуемых Р-адреноблокаторов после обработки

хромогенными реагентами (визуальная оценка)_

№ Окрашивание Р-адреноблокаторов

реактива Атенолол Бетаксолол Бисопролол Метопролол Пропранолол Талинолол

1 коричневое темно-серо-коричневое коричневое коричневое коричневое коричневое

2 оранжевое оранжевое оранжевое оранжевое оранжевое оранжевое

3 коричневое темно-серо-коричневое коричневое коричневое коричневое коричневое

4 коричневое темно-серо-коричневое коричневое коричневое коричневое коричневое

5 серо-сиреневое сиреневое, переходящее в оранжевый, затем в коричневый малиновое сиреневое зеленое сиреневое

6 серо-сиреневое, переходящее в коричневое кирпично-коричневое малиновое сиреневое зеленое сиреневое

7 сиреневое бежевое коричневое, переходящее в зеленое

8 сиреневое бежевое коричневое, переходящее в зеленое

9 - - - - - -

10 желтое на желтое на желтое на желтое на желтое на желтое на

розовом фоне розовом фоне розовом фоне розовом фоне розовом фоне розовом фоне

11 - фиолетовое красное - синее -

12 синее синее синее синее синее синее

13 - - - - - малиновое

14 - - малиновое - зеленое -

15 - - - - - -

16 оранжевое с зеленым ободком

17 зеленое, переходящее в желтый желтое

Примечание: названия и состав реактивов приведен в таблице №1; знак «-» означает

отсутствие окрашивания

Р-адреноблокаторы окрашиваются в синий цвет.

Для идентификации исследуемой группы Р-адреноблокаторов следует использовать следующие хромогенные реактивы: для атенолола и метопролола - реактивы Манделина (реактив № 5) и Либермана (реактив № 6 для бетаксолола - реактивы Манделина (реактив № 5), Либермана (реактив № 6), Фреде (реактив № 7), Марки (реактив № 8), ванилин с кислотой серной концентрированной (реактив № 11); для бисопролола - реактивы Манделина (реактив № 5), Либермана (реактив № 6), Фреде (реактив № 7), Марки

(реактив № 8), ванилин с кислотой серной концентрированной (реактив № 11), кислоту хлорную, содержащую раствора натрия нитрита (реактив № 14); для пропранолола - реактивы Манделина (реактив № 5), Либермана (реактив № 6), Фреде (реактив № 7), Марки (реактив № 8), кислоту хлорную, содержащую раствора натрия нитрита (реактив № 14) и кислоту серную концентрированную (реактив № 16), кислоту азотную концентрированную (реактив № 17); для талинолола - реактивы Манделина (реактив № 5), Либермана (реактив № 6), Фреде (реактив № 7), раствор кислоты хлороводородной, раствор натрия нитрита и щелочной раствор р-нафтола (реактив № 13), кислоту азотную концентрированную (реактив № 17).

Наиболее информативными для идентификации исследуемых Р-адреноблокаторов являются реактивы Манделина (реактив № 5) и Либермана (реактив № 6), поскольку окрашивают все исследуемые Р-адреноблокаторы в разные цвета.

С целью подбора лучшей системы растворителей для разделения исследуемых р-адреноблокаторов проведен сравнительный анализ 17 систем растворителей, представленных в таблице 3.

Сравнительный анализ хроматографического поведения Р-адреноблокаторов в различных системах растворителей (по значениям Яг) показал, что универсальной системы растворителей, в которой бы все исследуемые Р-адреноблокаторы имели различные значения не найдено, но установлено, что для разделения атенолола и талинолола подходят системы растворителей № 1, 2, 5, 7, 8 и 10, для разделения атенолола, бетаксолола и талинолола -система растворителей №. 2, для разделения бисопролола и метопролола -система растворителей № 9, для разделения атенолола, бисопролола и талинолола - система растворителей № 10, для разделения метопролола и пропранолола - система растворителей № 13.

Анализ результатов сравнительного исследования хромогенных реактивов и систем растворителей позволил установить, что использование исследованных систем растворителей и хромогенных реактивов в определенной последовательности позволяет однозначно и достоверно разделять и идентифицировать исследуемые Р-адреноблокаторы.

Показано, что при детектировании исследуемых Р-адреноблокаторов йодсодержащими реагентами №№ 3 и 4 предел обнаружения всех Р-адреноблокаторов составляет 1 мкг, при детектировании йодсодержащим реагентом № 1 предел обнаружения атенолола, бетаксолола, пропранолола и талинолола составляет 1 мкг, бисопролола и метопролола - 3 мкг, при детектировании реактивом Манделина (реактив № 5) предел обнаружения атенолола, бисопролола, метопролола и пропранолола составляет 1 мкг, бетаксолола и талинолола - 3 мкг, при детектировании реактивом Либермана (реактив № 6) предел обнаружения пропранолола составляет 1 мкг, бисопролола метопролола - 3 мкг, атенолола и талинолола - 5 мкг, бетаксолола - 10 мкг (табл. 4).

Значения Кг р-адреноблокаторов в зависимости от используемых систем растворителей

№ п/п Системы растворителей Р-адрсноблокаторов

Атенолол Бетаксолол Бисопролол Метопролол Пропранолол Талинолол

1 Эфир диэтиловый-ацетон-25% раствор аммиака (40:20:1) 0,12±0,02 0,67±0,02 0,67±0,02 0,70±0,02 0,73±0,03 0,35±0,02

2 Толуол-спирт изопропиловый-25% раствор аммиака (5:4:1) 0,44±0,02 0,83±0,03 0,72±0,02 0,72±0,02 0,78±0,03 0,63±0,02

3 Толуол-спирт этиловый- 25% раствор аммиака (40:20:1) 0,69±0,02 0,71 ±0,02 0,69±0,02 0,69±0,02 0,69±0,02 0,34±0,02

4 Хлороформ-ацетон (9:1) 0 0 0 0 0 0

5 Хлороформ-спирт метиловый (85:15) 0,06±0,02 0,45±0,02 0,44 ±0,02 0,44 ±0,01 0,44±0,02 0,15±0,01

6 Спирт н-бутиловый-спирт этиловый-диэтиламин (5:1:1) 0,65±0,03 0,76±0,02 0,59±0,02 0,52±0,02 0,75±0,02 0,35±0,02

7 Этилацетат-ацетон-25% раствор аммиака (50:45:5) 0,12±0,02 0,59±0,02 0,53±0,02 0,51 ±0,02 0,56±0,02 0,35±0,02

8 Бензол-диоксан-25% раствор аммиака (60:35:5) 0,33±0,02 0,83±0,03 0,60±0,02 0,61 ±0,02 0,83±0,02 0,39±0,02

9 Спирт н-бутиловый-кислота уксусная-25% раствор аммиака (5:1:1) 0,35±0,02 0,55±0,02 0,41±0,02 0,06±0,02 0,53±0,02 0,35±0,02

10 Хлороформ-ацетон-спирт этиловый-25% раствор аммиака (45:45:7:1) 0,19±0,01 0,62±0,02 0,56±0,02 0,62±0,02 0,62±0,02 0,31 ±0,02

11 Хлороформ-спирт этиловый-25% раствор аммиака (20:5:1) 0,41 ±0,03 0,66±0,02 0,53±0,02 0,65±0,02 0,66±0,02 0,53±0,02

12 Хлороформ-ацетон-25% раствор аммиака (45:45:5) 0,11 ±0,02 0,41 ±0,02 0,37±0,02 0,41 ±0,02 0,41 ±0,02 0,18±0,01

13 Спирт этиловый 0,39±0,02 0,33±0,02 0,33±0,01 0,24±0,01 0,68±0,03 0,39±0,02

14 Ацетон 0 0 0 0 0 0

15 Этилацетат 0 0 0 0 0 0

16 Толуол-ацетон-спирт этиловый-25 % раствор аммиака (45:45:7,5:2,5) 0,10±0,02 0,35±0,02 0,20±0,02 0,24±0,01 0,ЗШ=0,02 0,22±0,02

17 Диоксан-хлороформ-ацетон-25 % раствор аммиака (47,5:45:5:2,5) 0,10±0,02 0,33±0,02 0,24±0,02 0,23±0,01 0,30±0,02 0,20±0,02

Примечание: * - приведены данные для трех измерений

Пределы обнаружения р-адреноблокаторов хромогенными реактивами _ при исследовании методом ТСХ_

Р-адреноблокаторы Количество обнаруженного вещества в пятне, мкг

Реактивы обнаружения

№ 1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8

Атенолол 1 5 1 1 1 5 - -

Бетаксолол 1 5 1 1 3 10 >10

Бисопролол 3 10 1 1 1 3 7 5

Метопролол 3 7 1 1 1 3 - -

Пропранолол 1 5 1 1 1 1 1 5

Талинолол 1 1 1 1 3 5 - -

Примечание: Названия и состав хромогенных реактивов приведены в таблице №1

Йодсодержащие реагенты (реагенты №№ 1, 3, 4) наиболее чувствиительны, но не селективны, они проявляют все исследуемые адреноблокаторы и многие другие лекарственные вещества в виде пятен коричневого цвета. Реактив Манделина (реагент № 5) имеет меньшую чувствительность по бетаксололу и талинололу, реактив Либермана (реагент № 6) имеет меньшую чувствительность по атенололу, бетаксололу, бисопрололу и метопрололу, но эти реактивы имеют преимущество: они позволяют проводить идентификацию за счет разных цветов окрашивания исследуемых веществ.

2.2. Исследование Р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ

Для качественного обнаружения и количественного определения исследуемых Р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ определены их хроматографические характеристики (время удерживания и спектральные отношения) на модельных растворах с концентрацией веществ по 10 мкг/мл в 0,1 н растворе кислоты хлороводородной (табл. 5).

Таблица 5

Хроматографические характеристики Р-адреноблокаторов

Р- адрено-блокатор Время удерживания, мин Спектральные отношения

220/ 210 230/ 210 240/ 210 250/ 210 260/ 210 280/ 210 300/ 210

Атенолол 5,86 1,251 1,131 0,227 0,046 0,090 0,159 0,001

Бетаксолол 10,05 1,442 0,922 0,039 0,033 0,092 0,191 0,001

Бисопролол 9,24 1,629 1,463 0,100 0,038 0,096 0,140 0,000

Метопролол 8,12 1,419 0,867 0,034 0,027 0,085 0,174 0,002

Пропранолол 9,84 0,960 0,768 0,211 0,023 0,048 0,132 0,111

Талинолол 9,56 0,476 0,950 1,475 1,216 0,319 0,115 0,080

Бисопролол, талинолол, пропранолол и бетаксолол имеют близкие времена удерживания. Однако анализ модельного раствора смеси исследуемых Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) с концентрациями по 10 мкг/мл

показал, что в предлагаемых условиях хроматографирования пики исследуемых р-адреиоблокаторов на хроматограмме хорошо делятся и однозначно идентифицируются по временам удерживания и спектральным отношениям (рис. 1, табл. 5).

Рис. 1. Хроматограмма раствора смеси р-адреиоблокаторов с концентрацией веществ по 10 мкг/мл в 0,1 н растворе кислоты хлороводородной

Обозначения", пики со временем удерживания 5,86 мин. - атенолол; 8,12 мин. - метопролол; 9,24 мин. - бисопролол; 9,56 мин. - талинолол; 9,84 мин. -пропранолол; 10,05 мин. - бетаксолол.

Пригодность выбранных условий для анализа исследуемых Р-адреноблокаторов оценивалась по коэффициенту емкости, коэффициенту разделения пиков Ыв, по симметричности пиков и эффективности колонки (табл. 6).

Пределы обнаружения Р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ оценивали расчетным методом и в эксперименте по возможности их идентификации по временам удерживания и спектральным отношениям. Полученные результаты представлены в таблице 7.

2.3. Исследования по разработке условий для количественное определения р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ

Для количественного определения исследуемых Р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ необходимо провести калибровку прибора и построить калибровочные графики.

Калибровочные графики для определения концентраций р-адреноблокаторов строили в зависимости площадь пика вещества от его концентрации с использованием программы «МультиХром - Спектр».

Для всех исследуемых веществ установлена линейная зависимость между площадью хроматографического пика и концентрацией вещества в пробе в интервале концентраций 0,5 - 10 мкг/мл (рисунок 2).

2 3 4 5 6 7

8

9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 мни

Пригодность хроматографической системы для анализа исследуемых __Р-адреноблокаторов_

р- адреноблокатор Время удержива ния, мин Коэффициент емкости Коэффициент разделения пиков, Яв Коэффициент ассиметрии, As Эффективность колонки, TT

Атенолол 5,86 4,33 13,07 1,33 11881

Бетаксолол 10,05 6,39 5,33 1,42 27510

Бисопролол 9,24 7,38 2,84 1,49 30006

Метопролол 8,12 7,69 2,47 1,11 58571

Пропранолол 9,84 7,95 2,16 0,96 33580

Талинолол 9,56 8,14 2,07 1,22 48540

Критерий пригодности (2-10) Критерий пригодности не менее 2 Критерий пригодности (0,8-1,5) Критерий пригодности Более 2000

Таблица 7

Пределы обнаружения исследуемых Р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ

Атенолол Бетаксолол Бисопролол Метопролол Пропрано лол Талинолол

Предел обнаружения, г в пробе 1,1 х 10"9 2,0 х 10"9 1,9x10'' 0,5 х 10"9 0,9 х 10"9 2,3 х 10-9

Калибровочные графики исследуемых Р-адреноблокаторов описываются линейными уравнениями:

для атенолола С = 9,209 х Б, коэффициент корреляции 0,9998, для бетаксолола С = 59,273 х Б, коэффициент корреляции 0,9998, для бисопролола С = 74,171 * Б, коэффициент корреляции 0,9998, для метопролола С = 10,533x8, коэффициент корреляции 0,9999, для пропранолола С = 8,672x8, коэффициент корреляции 0,9999, для талинолола С = 35,529 х 8, коэффициент корреляции 0,9998, где С - концентрация вещества в пробе, мкг/мл

Б - площадь хроматографического пика вещества, Аи х мкл

Я "

ж о

tu

1-бисопролол

2-атенолол

3- метопролол

4- нропранолол

5- талинолол,

Площадь 6- бетаксолол

Рис. 2. Калибровочные графики исследуемых Р-адреноблокаторов

2.4.Извлечение исследуемых растворов Р-адреноблокаторов из биологических жидкостей

Для количественного определения исследуемых Р-адреноблокаторов в биологических жидкостях (кровь, моча) методом ВЭЖХ необходимо их извлечь из этих жидкостей.

Для разработки оптимальных условий жидкость-жидкостной экстракции исследуемых Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических жидкостей (крови, мочи) были проведены исследования по подбору органических растворителей (хлороформ и смеси хлороформа с добавлением полярного растворителя: хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (9:1), хлороформ-ацетон в соотношении (9:1), хлороформ-ацетонитрил в соотношении (9:1) и рН среды.

Проведенные исследования на водных растворах исследуемых Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) с концентрациями веществ в диапазоне 0,5 - 10 мкг/мл показали, что оптимальными условиями для экстрагирования является смесь растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (9:1) при рН среды 11 - 12. Атенолол в этих условиях экстрагируется 60 - 70 %, бетаксолол - 82 - 98 %, бисопролол - 89 - 99 %, метопролол - 65 - 99 %, пропранолол - 95 - 98 %, талинолол - 84 - 97 %.

Результаты исследования по проценту извлечению исследуемых Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из модельных растворов биологических жидкостей (крови, мочи) с содержанием веществ 1 мкг/мл представлены в таблице 8.

Исследования по влиянию разбавления биологических жидкостей (крови, мочи) перед извлечением исследуемых Р-адреноблокаторов показали, что разбавление биологических жидкостей (крови, мочи) водой очищенной в соотношении (1:1) перед экстрагированием увеличивает процент извлечения исследуемых веществ из крови на 8,5 - 12,5 %, из мочи - на 14 - 20 %, дальнейшее разбавление биологических жидкостей водой очищенной в соотношении (1:2) не приводит к увеличению извлечения веществ (табл. 8).

Для максимального извлечения атенолола из биологических жидкостей (крови, мочи) рекомендовано использовать смесь растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (3:2) при рН 11 - 12, при этом извлечение атенолола из крови увеличивается до 55 %, из мочи - до 64 %.

Исследования по очистке биологических жидкостей (крови, мочи) гексаном от сопутствующих веществ показали, что происходят потери отдельных веществ: при очистке мочи бетаксолола теряется до 16%, метопролола - до 2% и пропранолола - до 35,8%, при очистке крови теряется бетаксолола до 5,2%, метопролола - до 1% и пропранолола - до 1,4%. Атенолол, бисопролол и талинолол гексаном не извлекаются.

Извлечение р-адреноблокаторов из модельных растворов крови и мочи _(в % от внесенного количества вещества)_

Биологическая жидкость Процент извлечения Р-адреноблокаторов

Атенолол Бетаксолол Бисопролол Метопролол Пропранолол Талинолол

Кровь 30,1±1,0 71,4±2,2 71,8±2,3 76,2±2,1 72,0±2,1 72,4±2,4

Моча 38,4±0,8 79,4±1,9 80,3±2,0 82,4±1,8 80,5±1,7 85,3±1,9

Разбавление водой очищенной в соотношении (1:1)

Кровь 42,7±1,0 81,9±1,9 80,3±1,8 87,1±2,1 84,5±1,6 84,1 ±2,0

Моча 43,0±1,6 83,3±1,9 82,4±2,0 88,2±2,0 84,9±1,6 84,9±1,9

Разбавление водой очищенной в соотношении (1:2)

Кровь 46,8±1,4 88,1±1,3 88,7±1,4 90,1±1,8 89,3±1,7 92,5±1,5

Моча 45,4±1,9 89,2±1,8 90,3±2,1 90,8±1,9 90,4±1,7 93,3±1,6

3. Методики количественного определения Р-адреноблокаторов

По результатам проведенных исследований разработаны методики количественного определения исследуемых Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических жидкостях (крови и мочи) и включают следующие этапы:

Этап 1. Извлечение бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола из биологической жидкости

10 мл образца биологической жидкости (крови, мочи) помещают в делительную воронку на 50 мл, добавляют 10 мл воды очищенной, перемешивают и выдерживают в течение 20 мин. Затем к полученному раствору добавляют по каплям (около 1 мл) 50% раствор натрия гидроксида до рН среды 11-12 (контроль по рН-метру или универсальной индикаторной бумаге), приливают 10 мл смеси растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (9:1) и экстрагируют при перемешивании в течение 10 мин. После разделения фаз нижний слой фильтруют через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом в фарфоровую чашку. Экстракцию проводят дважды. Фильтр промывают 1 - 2 мл смеси растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (9:1). Извлечения объединяют, упаривают до сухого остатка, который количественно переносят в градуированную пробирку смесью растворителей хлороформ-спирт изопропиловый (9:1) общим объемом 10 мл (Раствор А). Извлечение атенолола из биологической жидкости 10 мл образца биологической жидкости (крови, мочи) помещают в делительную воронку на 50 мл, добавляют 10 мл воды очищенной, перемешивают и выдерживают в течение 20 мин. Затем к полученному раствору добавляют по каплям (около 1 мл) 50% раствор натрия гидроксида до рН среды 11-12 (контроль по рН-метру или универсальной индикаторной бумаге), приливают 10 мл смеси растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (3:2) и экстрагируют при перемешивании в течение 10 мин. После разделения фаз нижний слой фильтруют через бумажный фильтр с безводным натрием сульфатом в фарфоровую чашку.

Экстракцию проводят дважды. Фильтр промывают 1 - 2 мл смеси растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (3:2). Извлечения объединяют, упаривают до сухого остатка, который количественно переносят в градуированную пробирку смесью растворителей: хлороформ-спирт изопропиловый (3:2) общим объемом 10 мл (Раствор А).

Этап 2. Исследование методом ТСХ

По 2 мл раствора А переносят в две фарфоровые чашки и упаривают до небольших объемов, затем капилляром наносят на линии старта 2 хроматографических пластинок «Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ» размером 10x10 см в виде пятен диаметром не более 0,5 см. В качестве веществ сравнения на линию старта тех же пластин наносят спиртовые растворы PCO ß— адреноблокаторов с концентрациями 1 мкг/мл (наносят по 3 - 5 мкг вещества в пятно). Обе пластинки хроматографируют в любых разных системах растворителей (табл. 3, за исключением систем №№ 4, 14, 15). После прохождения фронта растворителей не менее 9 см, хроматограммы вынимают из камеры и просушивают на воздухе. Затем обе пластинки обрабатывают любыми разными двумя хромогенными реактивами (табл. 1, за исключением реактивов №№ 9, 15). Идентификацию ß-адреноблокаторов проводят по значениям Rf и окраске пятен в сравнении с известными ß— адреноблокаторами.

При обнаружении на хроматограммах пятен веществ по окраске и значениям Rf соответствующих известным ß-адреноблокаторам, проводят дальнейшее исследование методом ВЭЖХ.

Этап 3. Исследование методом ВЭЖХ

0,6 мл раствора А переносят в пробирку «Эппендорф», удаляют растворитель при комнатной температуре до сухого остатка, сухой остаток растворяют в 0,2 мл 0,1 н раствора кислоты хлороводородной и центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 3-5 мин. 10 мкл надосадочной жидкости исследуют на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с УФ-детектором, с хроматографической колонкой размером 75 х 2 мм, заполненной обращено-фазовым сорбентом ProntoSIL 120-5С-18,с размером частиц сорбента 5 мкм. Детектирование проводят при длинах волн 210 (опорная), 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм. В качестве подвижной фазы используют: элюент А - 0,1 % раствор кислоты трифторуксусной, элюент В - ацетонитрил (класс 0 или 1). Режим анализа: регенерация колонки 700 мкл 2 % элюентом В, градиентный режим: элюент В от 2 % до 100 % за 3000 мкл, скорость элюирования 150 мкл/мин, частота детектирования 0,18 с, температура термостата колонки 35°С.

Идентификацию ß-адреноблокаторов проводят путем сравнения времен удерживания и спектральных отношений со стандартными веществами.

Количественное содержание вещества рассчитывают по формуле: С = Q х S xv, хро/0 / умкл х К х V2, где Q - калибровочный коэффициент вещества S - площадь пика вещества, Аи*мкл Vi - объем, полученного извлечения, мл,

^^мкл - объем пробы, вводимый в хроматограф, мкл К - концентрирование пробы перед исследованием методом ВЭЖХ У2 - объем крови (мочи), взятой на анализ, мл Р % - процент извлечения вещества из биологической жидкости

4. Схемы судебно-химического (токсикологического) исследования биологических жидкостей (крови, мочи) по определению Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола)

На основании проведенных исследований по разработке оптимальных условий извлечения (рН среды, органические растворители) Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических жидкостей (крови, мочи), качественного и количественного их определения методами ТСХ и ВЭЖХ предложены схемы судебно-химического (токсикологического) исследования (рис. 3, 4).

По разработанной методике проведено судебно-химическое исследование 20 образцов крови и 12 образцов мочи, в которых определены метопролол и пропранолол: пропранолол определен в 10 образцах крови в концентрациях 0,6 - 52,54 мкг/мл, в 5 образцах мочи в концентрациях 0,85 -14,33 мкг/мл, метопролол определен в 10 образцах крови в концентрациях 0,56 - 7,73 мкг/мл, в 7 образцах мочи в концентрациях 5,89 - 176,58 мкг/мл.

По результатам 6 параллельных извлечений исследуемых Р-адреноблокаторов из модельных растворов крови и мочи с концентрациями каждого вещества по 1 мкг/мл рассчитаны метрологические характеристики. Степень извлечения, исследуемых р-адреноблокаторов, дисперсия, при доверительном интервале 95%, и относительные погрешности отдельных результатов представлены в таблице 9.

Для оценки пригодности предлагаемой методики определения Р-адреноблокаторов в биологических жидкостях (крови, моче), проведена валидация по таким показателям: линейность результатов, правильность, повторяемость и воспроизводимость.

Метрологические характеристики методики количественного определения р-адреноблокаторов в биологических жидкостях (крови и __моче) __

Р-адреноблокатор Процент извлечения, Хер, % ДХ,% X ср± ДХ, % Еср, %

1 .Извлечение из мочи смесью растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в

соотношении 9:1

Атенолол 46,97 1,36 46,97 ± 1,36 2,89

Бетаксолол 86,98 1,35 86,98 ±1,35 1,55

Бисопролол 88,80 1,40 88,80 ± 1,40 1,58

Метопролол 89,74 1,83 89,74 ± 1,83 2,06

Пропранолол 86,40 1,70 86,40 ±1,70 1,95

Талинолол 92,61 1,48 92,61 ± 1,48 1,62

2.Извлечение из крови смесью растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в

соотношении 9:1

Атенолол 42,47 7,01 42,47 ±7,01 4,95

Бетаксолол 82,33 1,87 82,33 ± 1,87 2,22

Бисопролол 80,30 1,80 80,30 ± 1,80 2,47

Метопролол 79,14 2,16 79,14 ±2,16 2,73

Пропранолол 84,40 1,65 84,40 ±1,65 1,96

Талинолол 83,70 1,97 83,70 ±1,97 2,48

3.Извлечение атенолола из мочи смесью растворителей хлороформ-

спирт изопропиловый в соотношении 3:2

Атенолол 63,80 2,12 63,80 ±2,12 3,35

4.Извлечение атенолола из крови смесью растворителей хлороформ-

спирт изопропиловый в соотношении 3:2

Атенолол 54,61 1,27 54,61 ± 1,27 2,33

Биологическая жидкость (кровь, моча)

разбавление 10 мл воды очищенной (1:1), выдержка 20 мин, добавление около 1 мл 50 % раствора натрия гидроксида

Водный раствор биологической жидкости (крови, мочи) рН 11 - 12

двукратная экстракция смесью астворителей хлороформ-спирт изопропиловый (9:1), фильтрование через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом

Хлороформно - изопропанольное извлечение из биологической жидкости (крови, мочи)

упаривание

Сухой остаток

растворение в 10 мл смеси растворителей хлороформ-спирт изопропиловый (9:1)

Раствор А

хлороформно - изопропанольное извлечение из биологической жидкости (кровь, моча)

по 2 мл раствора А упарить в двух фарфоровых чашках

тех - анализ_

положительный результат - 0,6 мл раствора А (точный объем) высушить и растворить в 0,2 мл 0,1 н растворе кислоты хлороводородной

ВЭЖХ - анализ, количественное определение

Рис. 3. Схема судебно-химического (токсикологического) исследо-вания биологических жидкостей (крови, мочи) по определению бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола

Биологическая жидкость (кровь, моча)

разбавление 10 мл воды очищенной (1:1), выдержка 20 мин, добавление около 1 мл 50 % раствора натрия гидроксида

Водный раствор биологической жидкости (крови, мочи) рН 11-12

двукратная экстракция смесью растворителей хлороформ-спирт изопропиловый (3:2), фильтрование через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом

Хлороформно - изопропанольное извлечение из биологической жидкости (крови, мочи)

упаривание

Сухой остаток

растворение в 10 мл смеси растворителей хлороформ-спирт изопропиловый (3:2)

Раствор А

хлороформно - изопропанольное извлечение из биологической жидкости (кровь, моча)

по 2 мл раствора А упарить в двух фарфоровых чашках

тех - анализ_

положительный результат - 0,6 мл раствора А (точный объем) высушить и растворить в 0,2 мл 0,1 н раствора кислоты хлороводородной

ВЭЖХ - анализ, количественное определение

Рис. 4. Схема судебно-химического (токсикологического) исследования биологических жидкостей (крови, мочи) по определению атенолола

ВЫВОДЫ

1. Оптимальные условия извлечения методом жидкость-жидкостной экстракции из биологических жидкостей (крови, мочи) бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола - смесь растворителей хлороформ-спирт изопропиловый в соотношении (9:1) при рН среды 11 — 12, атенолола - смесь растворителей хлороформ — спирт изопропиловый в соотношении (3:2) при рН среды 11-12.

2. Установлено, что разбавление биологических жидкостей (крови, мочи) водой очищенной в соотношении (1:1) перед экстрагированием увеличивает процент извлечения исследуемых веществ из крови на 8,5 - 12,5 %, из мочи - на 14 - 20 %.

3. В предложенных условиях жидкость-жидкостной экстракции р-адреноблокаторов из мочи извлекается бетаксолола 83,3±1,9%, бисопролола 82,4±2,0%, метопролола 88,2±2,0%, пропранолола 84,9±1,6%, талинолола 84,9±1,9%, из крови бетаксолола 81,9±1,9%, бисопролола 80,3±1,8%, метопролола 87,1±2,1%, пропранолола 84,5±1,6%, талинолола 84,1±2,0%, атенолола извлекается из мочи до 64%, из крови до 55%.

4. Установлено, что при очистке биологических жидкостей (крови, мочи) гексаном от сопутствующих веществ из мочи перед извлечением р-адреноблокаторов теряется бетаксолола до 16%, метопролола до 2% и пропранолола до 35,8%, из крови - бетаксолола до 5,2%, метопролола - до 1% и пропранолола - до 1,4%,. Атенолол, бисопролол и талинолол гексаном не извлекаются.

5. Разработана методика ТСХ для разделения и идентификации р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в индивидуальном виде и в смеси. Подобраны системы растворителей и хромогенные проявители, определены значения Яг для каждого вещества.

6. Подобраны условия для качественного и количественного анализа Р-адреноблокаторов в биологических жидкостях (крови, мочи) методом ВЭЖХ: элюент А 0,1% раствор кислоты трифторуксусной, элюент В -ацетонитрил (класс 0 или 1), многоволновое фотометрирование в УФ-области спектра при длинах волн 210 (базовая), 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 им, градиентный режим анализа: градиент ацетонитрила (элюента В) от 2 до 100% за 3000 мкл.

7. Определены хроматографические характеристики (времена удерживания и спектральные отношения) для идентификации Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола,) методом ВЭЖХ.

8. Установлены пределы обнаружения исследуемых р-адреноблокаторов методом ВЭЖХ (г. в пробе): для атенолола 1,1 х 10"9, для бетаксолола 2,0 х 10"9, для бисопролола 1,9 х 10"', для метопролола 0,5 х 10~9, для пропранолола 0,9 х 10"9, для талинолола 1,1 х 10"9.

9. Разработаны методики количественного определения р-адренобло-каторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и

талинолола) в биологических жидкостях (крови, моче) методом ВЭЖХ при концентрации вещества в пробе в интервале 0,5-10 мкг/мл.

10. Проведена валидация разработанной методика по показателям: линейность результатов, правильность, повторяемость и воспроизводимость.

11. Разработаны алгоритмы судебно-химического (токсикологического) исследования биологических жидкостей (крови и мочи) для качественного и количественного анализа Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола).

12. Разработанная методика качественного и количественного определения Р-адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) используется в работе судебно-химического отделения ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кокорина, Н. О. Определение лекарственных препаратов в биожидкостях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Н. О. Кокорина, В. П. Новоселов, М. А. Ханина // Сибирский медицинский журнал - 2008. - Т. 23. -№4.-С.51 -53.

2. Кокорина, Н. О. Идентификация Р-адреноблокаторов хроматографи-ческим методом / Н. О. Кокорина, В. П. Новоселов, М. А. Ханина // Фармация. -2009.-№ 7.-С. 23 -30.

3. Кокорина, Н. О. Определение некоторых Р-адреноблокаторов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ / Н. О. Кокорина, В. П. Новоселов, М. А. Ханина // Медицина и образование в Сибири. - 2012. - № 3. - Режим доступа: http://www.ngmu.ru (10 янв. 2000 г.).

4. Кокорина, Н.О. Скрининг лекарственных препаратов в биожидкостях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Н. О. Кокорина // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. - Новосибирск, 2005. - Вып. 10.-С. 221 -225.

5. Кокорина, Н.О. Скрининг лекарственных препаратов в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Н. О. Кокорина // Перспективы развития и совершенствования судебно- медицинской науки и практики: материалы VI Всерос. съезда судебных медиков, посвященного 30-летию Всерос. общества судебных медиков. - Москва - Тюмень, 2005. - С. 146 - 147.

6. Кокорина, Н. О. Анализ отравлений лекарственными веществами по региону Сибири и Дальнего востока за период 2001 - 2005 гг. / Н. О. Кокорина, В. П. Новоселов, М. А. Ханина // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. - Новосибирск - Красноярск, 2007. - Вып. 12. - Ч. 2. - С. 65 - 67.

7. Кокорина, Н.О. Химико-токсикологическое исследование р-адреноблокаторов / Н. О. Кокорина // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. - Новосибирск. - 2009. - Вып. 15.-С. 251 -255.

КОКОРИНА НАТАЛЬЯ ОЛЕГОВНА

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА НЕКОТОРЫХ р-АДРЕНОБЛОКАТОРОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Отпечатано в типографии Новосибирского Государственного технического университета 630092, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 1,75 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 572. Подписано в печать 28.01.2013 г.