Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Применение биокомпозиционного материала "Алломатрикс-имплант" в сочетании со стромальными стеогенными клетками-предшественниками при реконструктивных операциях на альвеолярных отростках челюстей

На правахрукописи

УДК: 616.716.-007.62-089.843

КУЗНЕЦОВ ГЛЕБ ВИКТОРОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ БИОКОМПОЗИЦИОННОГО МАТЕРИАЛА «АЛЛОМАТРИКС-ИМПЛАНТ» В СОЧЕТАНИИ СО СТРОМАЛЬНЫМИ ОСТЕОГЕННЫМИ КЛЕТКАМИ-ПРЕДШЕСТВЕННИКАМИ ПРИ РЕКОНСТРУКТИВНЫХ ОПЕРАЦИЯХ НА АЛЬВЕОЛЯРНЫХ ОТРОСТКАХ ЧЕЛЮСТЕЙ

14.00.21 - «Стоматология» 14.00.16 - «Патологическая физиология»

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОСУДАРСТВЕННОМ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ УЧРЕЖДЕНИИ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ГОУ ВПО МГМСУ МЗ РФ)

Лауреат государственной премии России по науке и технике, заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Воложин Александр Ильич

Доктор медицинских наук, профессор Кулаков Анатолий Алексеевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт повышения квалификации Федерального Управления Делами Президента «Медбиоэкстрем».

Защита состоится 2004 года в « часов

На заседании диссертационного совета Д 208.041.03 при Московском государственном медико - стоматологическом университете МЗ РФ (127006, Москва, ул. Долгоруковская, 4 а.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГМСУ (ул. Вучетича, д. 10а).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор медицинских наук, профессор Иванов Сергей Юрьевич Доктор биологических наук, Панасюк Андрей Фёдорович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

2004г

Учёный секретарь диссертационного совета к.м.н., доцент

Н. В. Шарагин

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Атрофия альвеолярных отростков является основным препятствием к рациональному протезированию. Средняя убыль высоты альвеолярного отростка к 6 месяцу после удаления зубов составляет в среднем 2,3 мм для нижней челюсти и 4,4 мм для верхней [Шашмурина В. Р. 1997]. Особенности данной анатомической зоны не позволяют сохранять исходный размер костной ткани после экстракции зубов, следовательно, утраченный объём можно возместить только хирургическим путём, подсаживая биоматериалы, способные либо механически выполнять функции кости, либо оказывать индуцирующее влияние на процессы её регенерации.

В настоящее время досконально изучен минеральный состав костной ткани челюстей, особенности её регенерации и ремоделирования. На основании этих данных создано большое количество биокомпозиционных материалов. Основу этих препаратов составляет ГАП, коллаген различных типов, а также добавки в виде антисептиков или антибиотиков [Безруков В.М и соавт.,1998, Воложин А.И. и соавт.,1996, Копецкий И.С., 2000].

Как показывает хирургический опыт, существующие материалы полностью не удовлетворяют требованиям хирургов из-за отсутствия строго прогнозируемой эффективности их применения, что на наш взгляд, связано с наличием только остеокондуктивных свойств этих материалов.

С целью улучшения качеств биокомпозиционных материалов фирмой «Коннектбиофарм» разработаны и внедрены в практику новое поколение биокомпозиционных остеопластических материалов с остеоиндуктивными свойствами. [Панин А. М., 2004]

Работа в этом направлении активно продолжается в настоящее время, и одним из перспективных направлений является использование биокомпозиционных материалов, содержащих живые клетки.

В конце 60-х годов прошлого столетия в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи была выявлена новая популяция клеток костного мозга, относящаяся к мезенхимальному ростку - остеогенные стромальные клетки-

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ | БИБЛИОТЕКА {

предшественники [Фриденштейн А.Я. и соавт., 1968]. При эксплантации клеток костного мозга в монослойные культуры, через 10-14 дней в них образуются видимые невооруженным глазом дискретные колонии, состоящие из нескольких тысяч фибробластов. Стромальные фибробласты образующие колонии, после обработки трипсином легко снимаются с пластика и поддаются многократному пассированию, образуя диплоидные штаммы стромальных клеток. Уже после 1-го пассажа количество выросших фибробластов в 3-7 тысяч раз больше, чем число стромальных предшественников в экплантированной взеси, а к XVIII пассажу численность фибробластов в штамммах составляла 9-13 триллионов. Это означало, что за 2-3 месяца культивирования клетки проходили 37-39 удвоений, что свидетельствует об огромном пролиферативном потенциале этих клеток. При трансплантации диплоидных штаммов костномозговых фибробластов в диффузионные камеры, системы непроницаемые для клеток, в них образуется костная ткань. Это значит, что эти клетки обладают остеогенными потенциями и они сохраняются при культивировании. Результаты последующих исследований показали, что в процессе культивирования остеогенные клетки не только сохраняются, но размножаются в культурах, т.е. они самоподдерживаются в составе диплоидных штаммов. Способность штаммов образовывать костную ткань проявлялась не только при трансплантации клеток в диффузионные камеры, но и при трансплантации в открытой для клеток системе - под капсулу почки [Фриденштейн А.Я., 1973, Герасимов Ю. В. и соавт. 1986].

Теоретические разработки проблемы остеогенных клеток-предшественников, разработка экспериментальной модели восстановления дефектов костной ткани позволили авторам, открывшим стромальные клетки-предшественники, создать и внедрить в клинику метод замещения костных дефектов путем аутотрансплантации в эту область остеогенных клеток-предшественников костного мозга, выращенных в культуре ткани вне организма [Осипьян И. А., Чайлахян Р. К., 1987]. Костный мозг получали

путем трепанации гребня тазовой кости. Время культивирования, т.е. получения необходимого числа остеогенных клеток, зависит от величины дефекта, который необходимо восполнить. В среднем этот срок равен 1-1,5 месяцам.

Так, до настоящего момента существует проблема носителя этих клеток при трансплантации, так как простое введение клеточной суспензии в ткани не приводит к формированию кости, нет четких показаний к использованию этого биотехнологического метода, не указан достаточно четко способ насыщения трансплантата клеточной суспензией.

Все это определило выбор цели исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. В экспериментальных и клинических условиях изучить эффективность применения композиции «алломатрикс-имплант» (коммерческое название аллоколлагена с сульфатированными гликозоаминогликанами) и остеогенных клеток предшественников в комплексном лечении больных с атрофией альвеолярных отростков челюстей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Разработать параметры системы: межклеточный матрикс -предшественники остеобластов.

2. Изучить ряд свойств разработанного нового биокомпозиционного материала в эксперименте на животных.

3. Отработать метод забора костного мозга и получения из него культуры остеогенных клеток-предшественников в условиях in vitro.

4. Опробовать разработанную систему у больных с полной и частичной вторичной адентией при реконструктивных операциях на альвеолярных отростках челюстей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые в экспериментальных и клинических условиях изучены остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства новой

биосистемы, содержащей, компоненты межклеточного костного матрикса и аутологичные остеогенные клетки-предшественники. Предложен и внедрён в практику новый метод реконструктивных операций на альвеолярном отростке верхней челюсти с использованием этого биоматериала. Вся работа выполнена с использованием аллогенных материалов. На основании анализа ближайших результатов лечения оценена клиническая эффективность применения этого костно-пластического материала.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые для медицинского применения разработан и внедрен биокомпозиционный материал нового поколения, остеиндуктивные свойства которого основаны на включении в его состав остеогенных клеток-предшественников и сульфатированных ГАГ. Применение данной композиции позволяет использовать для лечения больных с дефектами альвеолярных отростков челюстей прогрессивные оперативные технологии. Уточнены показания и противопоказания использования данной методики.

ФОРМА ВНЕДРЕНИЯ. Материал «Алломатрикс-имплант» с остеогенными клетками-предшественниками внедрен в работу клиники кафедры факультетской хирургической стоматологии МГМСУ для лечения больных с дефектами альвеолярных отростков.

ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Биосистема, состоящая из костного аллоколлагена с сульфатированными гликозоаминогликанами и стромальных остеогенных клеток-предшественников костного мозга, имеет хорошие перспективы для восстановления обширных костных дефектов, т.к. обладает выраженными остеоиндуктивными свойствами.

2. При монослойном культивировании клеток костного мозга происходит накопление популяции клеток, имеющих четкие характеристики

единого клона, не имеющего примеси других клеточных предшественников (кроветворных и нейрональных) и экспрессирующих на своей поверхности маркеры костной ткани.

3. Применение разработанного лечебного подхода позволяет эффективно устранять костные дефекты и деформации альвеолярных отростков в амбулаторных условиях.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации опубликованы в научных статьях, диссертация апробирована на заседании кафедры факультетской хирургической стоматологии и имплантологии МГМСУ.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Текст диссертации изложен на 125 страницах машинописного текста, работа иллюстрирована 48 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 122 источника, из них 60 на русском языке и 62 на иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ

В эксперименте использованы биопластические материалы производства фирмы «Коннектбиофарм» «Биоматрикс» и «Алломатрикс-имплант». Они представляют собой пористую коллагеновую губку, состоящую из высокоочищенного костного коллагена насыщенного сульфатированными гликозоаминогликанами. Между собой они отличаются источником получения костного коллагена: при изготовлении «Алломатрикса» используются ткани человека, а для «Биоматрикса» ткани крупного рогатого скота. В работе смоделирован процесс эктопического остеогенеза при пересадке комбинированного трансплантата (костный коллаген с ГАГ и аутологичные

остеогенные клетки-предшественники) в различные виды тканей кролика. Для контроля имплантировали блоки коллагена без остеогенных клеток-предшественников той же локализации. Исследование проведено на 10 кроликах породы «Шиншилла» весом 2-2,5 кг. Все животные перенесли две операции - резекцию крыла подвздошной кости (с целью забора костного мозга) и имплантацию костного коллагена с ГАГ и аутологичными остеогенными клетками-предшественниками.

Забор костного мозга у животных осуществляли под местной анестезией 0,5% раствором новокаина. После бритья и обработки операционного поля рассекали' кожу над крылом подвздошной кости длиною 5,0 см. Далее скелетировали крыло подвздошной кости, участок которого размером 1,5x2,0 см резецировали с помощью костных кусачек. Проводили гемостаз и рану послойно ушивали наглухо.

Резецированный фрагмент подвздошной кости в стерильной чашке Петри переносили в бокс, где и производили с ним все дальнейшие операции. Кость освобождали от остатков мягких тканей и надкостницы. Во избежания высыхания кости её поверхность смачивали средой а-МЕМ. Очищенный участок крыла подвздошной кости рассекали на две части вдоль кортикальных пластин и скальпелем соскабливали губчатую кость с костным мозгом, которую затем измельчали до размера частиц 1,0-1,5 мм3. Полученный объём костного мозга в количестве 0,5 см3 переносили во флакон с 3,0 мл 0,25% раствора трипсина. Трипсинизацию проводили при комнатной температуре в течение 20 минут на магнитной мешалке со скоростью 60-90 оборотов в минуту. Затем фрагментам костного мозга давали осесть в течение 1 минуты, а надосадочную жидкость переносили в следующий флакон, содержащий для инактивации трипсина 2,0 мл сыворотки эмбрионов коров. Трипсинизацию в первом флаконе повторяли 3 раза, добавляя в него свежую порцию фермента в том же объёме.

Обработанные трипсином клетки центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 10-12 минут при Г = 4°С. Надосадочную жидкость декантировали.

Клетки ресуспензировали в новой порции среды а-МЕМ, фильтровали через четырёхслойный капроновый фильтр и подсчитывали их количество в камере Горяева.. Затем клетки помещали во флаконы для выращивания культур из расчета 10*4-10*5 клеток на 1 см2 площади дна флакона. Каждый флакон содержал полную питательную смесь, состоящую из 80% среды а-МЕМ, 20% сыворотки плодов коров, 100 ЕД пенициллина, и 50 мг стрептомицина на 1 мл раствора. Культивирование проводили в термостате при 37°С после продувки флаконов СО2 до 5% в воздушной среде.

На 10-12 сутки после эксплантации клеток во флаконах формировались видимые невооружённым глазом дискретные колонии стромальных фибробластов. В дальнейшем, когда растущие клетки формировали на дне флакона плотный монослой, проводили ряд последовательных пассажей для получения достаточного числа клеток для заполнения объёма трансплантата.

Для этого из флаконов, с монослоем стромальных фибробластов, отсасывали питательную среду и промывали его 20-25 мл среды 199 для удаления сыворотки. После этого промывочную среду отсасывали и во флаконы заливали 5,0-6,0 мл 0,25% раствора трипсина, которым в течение 1-3 минут обрабатывали клетки. Затем трипсин сливали, а культуральные флаконы помещали в термостат на 15-20 минут при температуре 37°С. По истечении этого времени во флаконы добавляли 5,0-7,0 мл свежей среды

Далее, лёгким покачиванием большую часть клеток отделяли от поверхности флакона. Клетки, не открепившиеся от поверхности, смывали средой находящейся во флаконе с помощью шприца с длинной иглой, изогнутой на конце под углом 75 градусов. Полученную со всех культуральных флаконов клеточную суспензию объединяли, подсчитывали в ней концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и переносили в новые флаконы в количестве 5-7x10*3 клеток / см2 площади дна флакона.

Перед последним пассажем проводили бактериологический контроль. Для этого из флакона с клеточной суспензией, полученной со всех культуральных флаконов, отсасывали 0,5 мл надосадочной жидкости и

переносили в пробирку с мясопептонным бульоном. Пробирку помещали в термостат при 37 °С.

Перед трансплантацией все выращенные стромальные фибробласты описанным выше способом были сняты с культуральных флаконов. Затем была приготовлена клеточная суспензия и клетки в количестве 2,0-2,5x10*6 были нанесены на блоки костного коллагена объёмом 0,125 см3. В опыте исследовали 2 материала - «Биоматрикс» и «Алломатрикс-имплант», отличающиеся источником происхождения коллагена - соответственно из тканей крупного рогатого скота или человека. После заполнения остеогенными клетками-предшественниками блоки этих материалов трансплантировали тем же животным, от которых ранее выделяли костный мозг. Таким образом, каждому кролику вводили популяцию собственных остеогенных клеток, выделенных и размноженных in vitro.

По месту трансплантации: блоков с клетками-предшественниками кролики были разбиты на три группы - под капсулу почки, в мышцы и под надкостницу свода черепа. Контролем служили блоки исследуемых материалов той же локализации, но без клеток-предшественников. Всего было подсажено 42 трансплантата: 11- под капсулу почки; 12- под надкостницу теменной кости; 9- в поперечно-полосатые мышцы живота и 10 - контрольных.

Через 1,5 месяца после операции животных выводили из эксперимента, производили забор трансплантатов с прилежащими тканями. Кусочки фиксировали в 10% растворе формалина, деминерализовали в 12% азотной кислоте, проводили по восходящему ряду спиртов и заливали в парафин. Из парафиновых блоков делали срезы и готовили гистологические препараты, которые затем окрашивали гематоксилином - эозином.

КЛИНИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ. На втором этапе работы нам предстояло апробировать разработанную методику в клинических условиях. В клинической практике мы использовали «Алломатрикс-имплант». Всего проведено обследование и лечение 12 пациентов.

Таблица 1. Распределение больных по полу и возрасту

25-35 36-45 46 И СТАРШЕ

МУЖЧИНЫ - 2 2

ЖЕНЩИНЫ 1. 3 4

Упомянутый выше биотехнологический метод восстановления дефектов костной ткани состоит из следующих этапов: 1. Предоперационное клинико-лабораторное и рентгенологическое обследование 2. Получение костного мозга больного 3. Выделение и размножение в культурах стромальных клеток-предшественников костного мозга и подготовка трансплантата 4. Проведение реконструктивных операций 5. Имплантация.

Для проведения предоперационного обследования часть пациентов (на период освоения методик) госпитализировалось в отделение челюстко-лицевой хирургии и стоматологии Главного клинического госпиталя МВД России, вторая проходила обследование амбулаторно.

Предоперационное обследование больных включало в себя: клинический анализ крови, время кровотечения, время свёртываемости, общий анализ мочи, биохимический анализ крови: общий, прямой билирубин, общий белок и фракции, сахар крови, креатинин, мочевина, трансаминазы, группа крови, резус-фактор, маркёры вирусных гепатитов В, С, антитела к бледной трепонеме, вирусу иммунодефицита человека. Нами.введены в обязательную схему обследования анализы на носительство микоплазмы, выявление которой, в большинстве случаев, служило противопоказанием к использованию клеток-предшественников в лечении.

После выполнения лабораторных анализов, пациентов в обязательном порядке осматривал терапевт, при выявлении сопутствующих заболеваний проводилось необходимое обследование и коррекция терапевтической патологии.

В комплексе предоперационного обследования для уточнения размеров восполняемого дефекта, нами проводилась серия параллельных

рентгенологических исследований на ортопатомографе «Gendex» и компьютерном томографе «Picker PQ 2000» с последующим анализом изображений на графической станции «Voxel Q» по дентальной программе. При клиническом обследовании 12 пациентов у всех были выявлены одно- или двухсторонние дефекты зубных рядов верхней и нижней челюстей в виде концевых или включенных дефектов от одного до трех зубов в сочетании с атрофией альвеолярных отростков в области отсутствующих зубов. При рентгенологическом обследовании пациентов диагностировано низкое расположение дна.верхнечелюстного синуса, с толщиной нижней стенки в области моляров от 1,3 до 3,5 мм.

Забор костного мозга из гребня тазовой кости больного осуществлялся с помощью троакара конструкции В. А. Семкина. Забор проводили как в условиях клиники, так и в условиях однодневного стационара кафедры факультетской хирургической стоматологии и имплантологии. При отработке этого метода данная манипуляция занимала около 15 минут. Интенсивность болевого синдрома в послеоперационном периоде варьировалась от незначительной до умеренной.

Операция проводилась под местной инфильтрационной анестезией Sol. Ultracaini DS forte - 5,0 мл. Для этого в правой подвздошной области, отступя на 3,0 см книзу от гребня, производили разрез кожи и подкожно-жировой клетчатки длиной 1,0 см. Далее, троакаром со вставленным стилетом, тупо раздвигая ткани, доходили до наружной кортикальной пластинки подвздошной кости. Используя шнековидное сверло с установленным ограничителем глубины на 10-15,0 мм выбирали необходимое количество губчатой кости. После извлечения сверла из ручки троакара, полученную костную крошку с костным мозгом немедленно переносили в питательную среду

Полученный костный мозг передавали в лабораторию Стромальной регуляции иммунитета НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН*, где в монослойных

* выражаю глубокую признательность и благодарность за помощь в написании диссертации заведующему лабораторией д.м.н. Чайлахяну Рубену Карповичу

культурах из него выделяли и культивировали до необходимого количества стромальные клетки-предшественники. Методика наращивания стромальных остеогенных клеток-предшественников у людей отличалась только более строгим соблюдением правил асептики.

Для проверки гомогенности полученной культуры на 4м пассаже отбирали культуру клеток и направляли в лабораторию Молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН. Выявление мембранных антигенов остеогенных клеток предшественников из костного мозга проводили с помощью моноклональных антител методом непрямой иммунофлюоресценции (модификация метода Coons et al., 1955).

По завершении культивирования, клетки с помощью трипсина снимали с культуральных флаконов. Готовили суспензию, равную по объему трансплантационному блоку. Суспензию остеогенных клеток капельно наносили на предварительно смоченный средой а-МЕМ блоки «Алломатрикс-импланта» объёмом. 1,5 см3 из расчета. 8-10x106 клеток/см3 губки. После заполнения губок, их в течение 1,5-2 часов выдерживали во влажной камере при температуре 37°С, давая клеткам адгезироваться на стенках пор губки.

После этого выполняли операцию синуслифтинг по традиционной методике. Для заполнения костного дефекта использовали блоки «Апломатрикс-имплант», насыщенные собственными клетками, пациента, размноженными in vitro.

После операции, для анализа полученных результатов, больным проводили серию параллельных рентгенологических исследований. на ортопантомографе и компьютерном томографе.

Через 6 месяцев, после подтвержденного рентгенологическими методами формирования костной ткани, пациентам выполняли установку имплантатов «ЛИКО» по стандартной методике. Во время установки имплантатов из области подсадки «Алломатрикс-импланта» с остеогенными клетками

" выражаю глубокую признательность и благодарность за проведённые исследования заведующему лабораторией д.б.н. Киселёву Сергею Львовичу

предшественниками производили биопсию костной ткани для гистологического исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ.

В данном разделе работы нами был смоделирован процесс эктопического остеогенеза при имплантации в различные типы тканей (под надкостницу теменной кости, под капсулу почки и в поперечно-полосатые мышцы) кролика биокомпозиционных материалов, содержащих костный коллаген и сульфатированные гликозаминогликаны в сочетании с аутологичными стромальными клетками-предшественниками.

Как показали наблюдения уже через 1,5 месяца после операции в местах трансплантации биопластических материалов "Биоматрикс" или "Алломатрикс-Имплант", предварительно насыщенных стромальными клетками-предшественниками, выявлялись свободно лежащие тканевые образования, которые, как правило, имели твердую структуру. В некоторых случаях при их извлечении из организма реципиента в конце опыта в них визуально определялась кость с красным костным мозгом.

Всего в настоящей работе нами было изучено 42 образца, которые были представлены следующими экспериментальными сериями:

1. 12 имплантатов, помещенных под надкостницу черепа кролика.

2. 11 имплантатов, помещенных под почечную капсулу кролика.

3. 9 имплантатов, введенных кроликам внутримышечно.

4. 10 контрольных образцов.

Анализ гистологических препаратов, полученных из данных образцов, показал, что во всех исследованных препаратах, был выявлен эктопический остеогенез, но степень его выраженности отличалась в зависимости от места имплантации. Наиболее интенсивно костеобразование происходило в почке и в мышцах, тогда как на черепе этот процесс был выражен слабее. Причиной данного явления могут быть тканевые условия и в первую очередь

кровоснабжение данной ткани. Кроме того, определенную роль может играть степень перераспределения, сохранности и последующей дифференцировки клеток-предшественников в зоне их трансплантации. В то же время формирующаяся при этом эктопическая костная ткань имеет вполне зрелый вид, содержит небольшое количество остеоцитов и по периферии окружена слоем остеобластов, образующих структуру, аналогичную периосту. На месте трансплантата формируется эктопическая кость, о чем свидетельствует малое число замурованных в ее основное вещество остеоцитов и наличие линий склеивания, что характерно для зрелой костной ткани с явлениями ремоделирования. Свободный ксеноколлаген на большинстве препаратов практически отсутствует. Фиброзных изменений и воспалительных явлений на препаратах к моменту наблюдения не выявляется.

Формирование эктопической кости при трансплантации клеток-предшественников на материале «Алломатрикс-Имплант», в мышечную ткань и под почечную капсулу кролика характеризуется очень близкими показателями по сравнению с «Биоматриксом». Новообразованная кость окружена мелкими клетками кроветворного ряда и недостаточно оформлена, что указывает на ее незрелость (остеоид грубо-пучкового типа). Часто рядом с костью обнаруживаются бесклеточные фрагменты трансплантированного коллагена. В некоторых местах мышечная, ткань инфильтрирована кроветворными клетками, что указывает на индукцию гемопоэза в зоне трансплантации. Скопление этих же клеток отмечается и в непосредственной близи от сохранившейся коллагеновой части трансплантата. Ни воспалительных явлений,. ни формирования фиброзной капсулы не наблюдается. При трансплантации данного материала в подпочечную капсулу, как и в варианте с ксеноколлагеном образуется зрелая эктопическая кость с участками костномозгового кроветворения. Малое количество остеоцитов в лакунах и многочисленные линии склеивания свидетельствуют о неоднократных перестройках в костной ткани и о формировании зрелой кости пластинчатого типа.

Трансплантация материалов под надкостницу на черепе приводила к формированию незрелой фрагментарной эктопической кости, со слабой редукцией коллагеновых волокон, отмечается формирование участков остеоида и неразрушенные коллагеновые волокна.

Представленные результаты однозначно демонстрируют, что при обратном переносе в организм на материалах из костного коллагена, содержащих костные сГАГ, аутологичных стромальных клеток-предшественников, выращенных в монослойной культуре, происходит формирование эктопической кости в зонах трансплантации. При этом достоверных различий в результатах при использовании в качестве носителей клеток-предшественников композиционных биопластических материалов «Биоматрикс» или «Алломатрикс-Имплант» нами выявлено не было.

Для проведения клинического этапа исследования нами был отобран препарат «Алломатрикс-имплант». В принятии решения мы руководствовались в первую очередь происхождения данного материала - губчатая кость человека, которая, естественно, является наименее аллергенным материалом, чем ксенокость.

КЛИНИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ.

Для стромальных клеток-предшественников, которые в процессе своего развития и дифференцировки способны давать начало хрящевой и костной тканям, такими маркерами являются vimentin, osteopontin, osteonectin, повышение уровня bone sialoproteinll, эндогенной щелочной фосфатазы. Проведенный нами анализ данных маркеров показал (табл №2), что маркер vimentin, osteopontin,- osteonectin, повышение уровня bone sialoproteinll, эндогенной щелочной фосфатазы встречались у 90% клеток. В тоже время маркеры предшественников гемопоэтических клеток (CD34), плазматических клеток и лейкоцитов (CD 38, CD45), не были выявлены нами ни в одной из серий обследованных нами клеточных популяций и т.д.

Таблица № 2. Определение иммунофенотипа, используемых в клинике

Антитело Реактивность Антитело Реактивность

CD105 ++ nestin -

Anti-fibroblast (proIyl-4- hydroxylase) +++ CD45 -

vimentin +++ wWF -

CD 133 - Cytokeratin 19 -

CD34 - CD41a -

CD31 - Osteopontin ++

CD38 - Osteonectin +

SSEA-1 - Bone sialoproteinll

SSEA-4 - Эндогенная щелочная фосфатаза

CDllb - CD 142 -

Collagen IV ++

Таким образом, стромальные предшественники из костного мозга сохраняют гомогенность при культивировании in vitro, содержат остеогенные предшественники, не содержат кроветворных и нейрональных предшественников. Иммуноцитохимический анализ стромальных предшественников из костного мозга, по более чем 20 маркерам, указывает на гомогенность популяции.

Проведено лечение 12 пациентов с адентиями по разработанной методике. Всем больным проводилось три инвазивных вмешательства - забор костного мозга, операция синуслифтинг и установка двухэтапных остеоинтегрируемых имплантатов «ЛИКо».

Первая операция по забору костного мозга из гребня подвздошной кости выполнена под общим обезболиванием, вторая под комбинированной

анестезией, для последующих вмешательств использовали местную инфильтрационную анестезиею в сочетании с внутривенной премедикацией.

Все больные начинали ходить в день оперативного вмешательства, выраженность болевого синдрома была незначительной. Большинство пациентов не пользовались обезболивающими препаратами более 1-2 раз в сутки в течение 2-Зх дней после операции. Как правило, отмечался незначительно выраженный отёк в зоне операции на 2-3 сутки. Раны у всех пациентов зажили первичным натяжением. Швы снимали на 7-8е сутки после операции.

В среднем через 3-4 недели культивации. клеток, необходимых для получения необходимого количества предшественников остеобластов, их снимали с культуральных флаконов и насыщали блоки «Алломатрикс-имплант» размером 0,8x0,8x2,0 см в концентрации 8* 10б клеток на 1 см3.

В этот же день под комбинированной анестезией всем пациентам выполняли операцию синуслифтинг с одной или с двух сторон с имплантацией биопластической композиции, состоящей из костного коллагена, сульфатированных гликозоаминогликанов и аутологичных клеток-предшественников.

Как правило, у всех больных отмечался незначительный отёк щёчных областей, достигающий своего максимума ко вторым - третьим суткам после операции. Болевой синдром был выражен незначительно, пациенты не пользовались обезболивающими препаратами чаще 1-2 раз в сутки в течение нескольких дней. У всех пациентов раны зажили первичным натяжением. Швы в полости рта снимали на 7-10е сутки.

Через 1,5, 3 и 6 месяцев после операции проводили параллельные исследования на ортопантомографе «Gendex» и компьютерном томографе «Picker PQ 2000» с последующим анализом изображений на графической станции «Voxel Q». Плотность тканей в зоне операции оценивали по шкале Хаунсфилда.

Получены следующие результаты:.

Как правило, через 1,5 месяца после операции на ортопантомограммах и рентгеновских компьютерных томограммах у всех пациентов определялась только зона операции - очаг просветления в области дна верхнечелюстной пазухи полуовальной или прямоугольной формы с очагом уплотнения по верхнему краю - дефект передней стенки гайморовой пазухи и расположенное параллельно ходу рентгеновских лучей новообразованное дно гайморовой пазухи. При определении плотности тканей в области имплантации «Алломатрикс-импланта» с остеогенными клетками-предшественниками по шкале Хаунсфилда, она составляла 78-83 ЕД.

Через 3 месяца у всех пациентов на ортопантомограмме в области операции видна тень формирующейся остеоидной ткани, располагающаяся в зоне операции - между старым и новым дном верхнечелюстной пазухи. В тоже время при компьютерной томографии плотность подсаженных тканей возросла незначительно - в среднем она достигала 120-150 ЕД, появлялись признаки резорбции подвернутого фрагмента передней стенки верхнечелюстного синуса.

Через 6 месяцев у всех пациентов на ортопантомограмме в зоне операции в заданном объёме определялась новообразованная костная ткань, рентгенологически имеющая сходное строение и плотность с окружающей, губчатой костью и отделённая от неё тонкой кортикальной прослойкой. Подвёрнутая кортикальная пластинка передней стенки, формирующая новое дно гайморовой пазухи достоверно не определяется. Новообразованная костная ткань имеет строение губчатой кости, с уменьшением рентгенконтрастности от периферии к центру, что, по-видимому, объясняется ходом минерализации от периферии к центру коллагенового имплантата. На компьютерных томограммах отмечается возрастание плотности в зоне операции до 450-500 ЕД по шкале Хаунсфилда, резорбция подвернутой кортикальной пластинки.

Через 6 месяцев после рентгенологического подтверждения формирования костной ткани зоне операции пациентам выполнялась установка остеоинтегрируемых имплантатов «ЛИКо» и биопсия костной ткани из области

постановки блоков «Алломатрикс-имплант» с остеогенными клеткам-предшественниками.

При гистологическом анализе биоптатов во всех образцах получена однотипная картина формирования молодой костной ткани с участками перестройки и ремоделирования.

Полученные результаты свидетельствуют, что в сроки до 6 месяцев на месте трансплантации биокомпозиционного материала «Алломатрикс-имплант», заполненного аутологичными остеогенными клетками-предшественниками костного мозга, происходит формирование костной ткани.

ВЫВОДЫ.

1. Биокомпозиционный материал «Алломатрикс-имплант» в сочетании со стромальными остеогенными клетками-предшественниками дает строго прогнозируемый эффект при реконструктивных операциях на альвеолярных отростках челюстей в виде формирования костной ткани в месте имплантации.

2. Культивирование аутологичных стромальных клеток-предшественников костного мозга позволяет получать гомогенную популяцию остеогенных клеток, способных формировать кость при их обратной трансплантации на материале «Алломатрикс-имплант».

3. Получаемые культуры клеток-предшественников являются чистой популяцией, не содержащих клеток других гистофункциональных линий.

4. Применение нового способа забора костного мозга с костной стружкой свело к минимуму травму донорского участка кости при получении необходимого количества пластического материала и позволило проводить его амбулаторно.

5. Применение разработанного подхода позволяет эффективно устранять дефекты альвеолярных отростков челюстей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Показанием для использования в качестве костно-пластического материала «Алломатрикс-импланта» в сочетании с аутологичными клетками-предшественниками костного мозга следует считать обширные костные дефекты альвеолярных отростков с одной или двух сторон.

2. В комплексе предоперационного обследования использование компьютерной томографии и с анализом изображений по дентальной программе и оценкой плотности кости являются необходимыми.

3. Противопоказанием к лечению с использованием «Алломатрикс-импланта» и аутологичных клеток костного мозга является носительство микоплазмы, наличие местного гнойно-воспалительного процесса.

4. Насыщение блоков «алломатрикс-имплант» остеогенными клетками-предшественниками проводится ex tempore за 1-2 часа до операции.

5. Рентгенологический контроль проводится через 3 и 6 месяцев после операции - ортопантомография и компьютерная томография.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ:

1.. СЮ. Иванов, Г.В. Кузнецов, Р.К. Чайлахян, А.Ф. Панасюк, Е.В. Ларионов, A.M. Панин Перспективы применения в стоматологии материалов "Биоматрикс", Алломатрикс-имплант" в сочетании с остеогенными клетками-предшественниками костного мозга // Клиническая имплантология и стоматология, 2001 № 3-4(17-18), стр.37-40

2. Иванов С. Ю., Кузнецов Г.В., Панасюк А.Ф. Результаты использования в эксперименте материалов «Биоматрикс» и «Алломатрикс-имплантат» в сочетании с остеогенными клетками - предшественниками костного мозга. // Актуальные вопросы клинической медицины. Материалы научно-практической конференции, посвященной 60-летию Главного клинического госпиталя МВД России. М., 2002, с 139-140.

3. Иванов С. Ю., Кузнецов Г.В. Исследование применения материалов «Биоматрица» и «Алломатрица-имплант» вместе с зачаточными клетками костного мозга. // Матер 1али «Першо! схщно-европейсько1 конференци з проблем стоматолопчжн 1мплантаиП» Льв1в, Украша 2002, стр. 16-17

4. Иванов С. Ю., Кузнецов Г.В. Микоплазменная инфекция в стоматологии. Новый подход к обследованию больных. // Сб. трудов Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы стоматологии" посвященный 120-летию со дня рождения А. И. Евдокимова. М., 2003 г с.74-75

Заказ №784. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06

Ш-7781

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Дефекты зубных рядов, и особенно полное отсутствие зубов, довольно часто обуславливают проблемы полноценной фиксации и функционирования протезов. Атрофия альвеолярных отростков является основным препятствием к рациональному протезированию. Средняя убыль высоты альвеолярного отростка к 6 месяцу после удаления зубов составляет в среднем 2,3 мм для нижней челюсти и 4,4 мм для верхней [53]. Особенности данной анатомической зоны не позволяют сохранять исходный размер костной ткани после экстракции зубов, следовательно, утраченный объём можно возместить только хирургическим путём, подсаживая биоматериалы, способные либо механически выполнять функции кости, либо оказывать индуцирующее влияние на процессы её регенерации.

Для создания оптимальных условий ортопедического лечения с использованием имплантатов существует отдельный класс оперативных вмешательств. Основную группу этих вмешательств составляют реконструктивные костно-пластические операции, направленные на увеличение объёма костной ткани в месте установки имплантата [72,82,117].

В настоящее время досконально изучен минеральный состав костной ткани челюстей, особенности её регенерации и ремоделирования [3]. На основании этих данных создано большое количество биокомпозиционных материалов. Применяемые костно-пластические материалы, кроме простого заполнения объёма костного дефекта, теперь выполняют сложную функцию по индукции остеогенеза, воздействию на прогениторные клетки, доставки лекарственных веществ в очаг. Для этих целей используется широкий спектр материалов: коллаген, гидроксиапатит и различные их комбинации, консервированная алло-, ксено-, брефокость, аутокость [4,5,9,16,27,46]. Одним из наиболее часто применяемых аутологичных материалов остаётся трансплантат из гребня подвздошной кости, содержащий жизнеспособные остеобласты и костные стволовые клетки, обладающие потенцией к остеогенезу [16].

Как показывает хирургический опыт, существующие материалы полностью не удовлетворяют требованиям хирургов из-за отсутствия строго прогнозируемой эффективности их применения, что на наш взгляд, связано с наличием только остеокондуктивных свойств этих материалов. В случае применения аутологичных материалов основным недостатком является нанесение дополнительной травмы, пропорциональной возмещаемому дефекту и длительный болевой синдром в области протезного ложа.

С целью улучшения качеств биокомпозиционных материалов фирмой «Коннектбиофарм» разработаны и внедрены в практику новое поколение биокомпозиционных остеопластических материалов с остеоиндуктивными свойствами. [19,30].

Работа в этом направлении активно продолжается в настоящее время, и одним из перспективных направлений является использование биокомпозиционных материалов, содержащих живые клетки.

В конце 60-х годов прошлого столетия в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи была выявлена новая популяция клеток костного мозга, относящаяся к мезенхимальному ростку - остеогенные стромальные клетки-предшественники [84]. При эксплантации клеток костного мозга в монослойные культуры, через 10-14 дней в них образуются видимые невооруженным глазом дискретные колонии, состоящие из нескольких тысяч фибробластов. Стромальные фибробласты за 2-3 месяца культивирования клетки проходили 37-39 удвоений. Результаты последующих исследований показали, что в процессе культивирования остеогенные клетки не только сохраняются, но размножаются в культурах, т.е. они самоподдерживаются в составе диплоидных штаммов. Способность штаммов образовывать костную ткань проявлялась не только при трансплантации клеток в диффузионные камеры, но и при трансплантации в открытой для клеток системе - под капсулу почки [49,50].

Так, до настоящего момента существует проблема носителя этих клеток при трансплантации, так как простое введение клеточной суспензии в ткани не приводит к формированию кости, не указан достаточно четко способ насыщения трансплантата клеточной суспензией. Перспективным, на наш взгляд, является и разработка биоматериала на основе костного коллагена, как основного структурного белка кости, в качестве носителя остеогенных клеток предшественников для возмещения костных дефектов.

Все выше перечисленное и определило выбор цели исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

В экспериментальных и клинических условиях изучить эффективность применения композиции «алломатрикс-имплант» (коммерческое название аллоколлагена с сульфатированными гликозоаминогликанами) с остеогенными клетками предшественниками в комплексном лечении больных с атрофией альвеолярных отростков челюстей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Разработать параметры системы: межклеточный матрикс -предшественники остеобластов.

2. В эксперименте изучить свойства нового биокомпозиционного материала.

3. Отработать метод забора костного мозга и получения из него культуры остеогенных клеток-предшественников в условиях in vitro.

4. Опробовать разработанную систему у больных с полной и частичной вторичной адентией при реконструктивных операциях на альвеолярных отростках челюстей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Впервые в экспериментальных и клинических условиях произведено комплексное исследование остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств новой биосистемы, содержащей, как компоненты межклеточного костного матрикса, так и остеогенные клетки-предшественники. Предложен и внедрён в практику новый метод реконструктивных операций на альвеолярном отростке верхней челюсти с использовании данного биоматериала в различных клинических ситуациях. На основании анализа ближайших и отдаленных результатов лечения оценена клиническая эффективность применения этого костно-пластического материала.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Проведённые исследования позволили применить для медицинской приктики биокомпозиционный материал нового поколения, остеиндуктивные свойства которого основаны на включении в его состав остеогенных клеток-предшественников и сульфатированных гликозоаминогликанов. Применение данной композиции для лечения больных с дефектами альвеолярных отростков челюстей позволило использовать прогрессивные оперативные технологии, улучшающие результаты лечения, снизило количество осложнений, уменьшило число рецидивов.

ФОРМА ВНЕДРЕНИЯ.

Материал «Алломатрикс-имплант» с остеогенными клетками-предшественниками внедрен в работу клиники кафедры факультетской хирургической стоматологии МГМСУ для лечения больных с дефектами альвеолярных отростков.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации опубликованы в четырёх научных статьях, доложены на заседании кафедры факультетской хирургической стоматологии и имплантологии МГМСУ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Биосистема, состоящая из костного аллоколлагена с сульфатированными гликозоаминогликанами и стромальных остеогенных клеток-предшественников костного мозга, имеет хорошие перспективы для восстановления обширных костных дефектов, т.к. обладает выраженными остеоиндуктивными свойствами.

2. При монослойном культивировании клеток костного мозга происходит накопление популяции клеток, имеющих четкие характеристики единого клона, не имеющего примеси других клеточных предшественников (кроветворных и нейрональных) и экспрессирующих на своей поверхности маркеры костной ткани.

3. Применение разработанного лечебного подхода позволяет эффективно устранять костные дефекты и деформации альвеолярных отростков в амбулаторных условиях. 9

ВЫВОДЫ.

1. Биокомпозиционный материал «Алломатрикс-имплант» в сочетании со стромальными остеогенными клетками-предшественниками дает строго прогнозируемый эффект при реконструктивных операциях на альвеолярных отростках челюстей в виде формирования костной ткани в месте имплантации.

2. Культивирование аутологичных стромальных клеток-предшественников костного мозга позволяет получать гомогенную популяцию остеогенных клеток, способных формировать кость при их обратной трансплантации на материале «Алломатрикс-имплант».

3. Получаемые культуры клеток-предшественников являются чистой популяцией, не содержащих клеток других гистофункциональных линий

4. Применение нового способа забора костного мозга с костной стружкой свело к минимуму травму донорского участка кости при получении необходимого количества пластического материала и позволило проводить его амбулаторно.

5. Применение разработанного подхода позволяет эффективно устранять дефекты альвеолярных отростков челюстей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Показанием для использования в качестве костно-пластического материала «алломатрикс-импланта» в сочетании с аутологичными клетками-предшественниками костного мозга следует считать обширные костные дефекты альвеолярных отростков с одной или двух сторон.

2. В комплексе предоперационного обследования использование компьютерной томографии и с анализом изображений по дентальной программе и оценкой плотности кости являются необходимыми.

3. Противопоказанием к лечению с использованием «алломатрикс-импланта» и аутологичных клеток костного мозга является носительство микоплазмы, наличие местного гнойно-воспалительного процесса.

4. Насыщение блоков «алломатрикс-имплант» остеогенными клетками-предшественниками проводится ex tempore за 1-2 часа до операции

5. Рентгенологический контроль проводится через 3 и 6 месяцев после операции - ортопантомография и компьютерная томография.