Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Энзимохимическая характеристика нейромышечного синапса икроножной мышцы деафферентированной белой крысы

Запросы практической и теоретической медицины ставят перед исследователями задачу изучения реакции двигательного окончания скелетных мышц на различные виды ее денервации - смешанной, эфферентной, чувствительной, симпатической. К настоящему времени накоплен значительный материал по изменению аксона и его ветвлений после смешанной и эфферентной соматической денервации (Л.И.Фалин, 1954; Б.С.Дойников, 1955; Р.П.Женевская, 1974; О.М.Поздняков, 1972, 1980, Г.Н.Кры-жановский с соавт., 1974; К.Е.Сисабеков, 1989; Воеске, 1912; Stohr, 1928; Reger, 1957; 1959; Csillik a. Knyihar, 1968; Miledi a. Slater, 1970), характеристике ферментоактивной зоны HMC денервированной мышцы (Г.М.Николаев, 1976; В.И.Филимонов, 1992, 1998; Coers, 1953, 1967; Savay a. Csillik, 1954, 1955; Yoshihara et al., 1991), что позволило, наряду с исследованиями нейроцитов и чувствительных окончаний в эксперименте и при различной патологии человека, определить признаки возрастных, неспецифических, обратимых и необратимых изменений в структурах периферической нервной системы.

В меньшей степени исследованы изменения нейромышечного синапса после хирургической десимпатизации и деафферентации, хотя широко известно адаптационно-трофическое влияние нервной системы на ткани и органы, включая скелетные мышцы (И.П.Павлов, 1922; А.Г.Гинецинский, 1923; Л.А.Орбели, 1923; Т.А.Григорьева, 1958; О.В.Волкова, 1970; В.А.Говырин, 1965, 1967, 1982; А.Ф.Никифоров, 1973; Н.П. Резвяков, 1973).

Положение не изменилось даже с внедрением в научные исследования новых приемов, обеспечивающих элективное выключение влияния симпатоцитов (химическая десимпатизация с помощью изобарина или других реагентов) и нейроцитов чувствительных узлов (химическая деаф-ферентация с помощью капсаицина), хотя появившиеся в последние годы единичные исследования о влиянии десимпатизации на миелинизирован-ные нервные волокна различных нервов (В.М.Чучков, 1989, 1991; И.А.Исаева, 1991; С.Л.Гомоюнова, 1994; С.П.Селякин, 1994; О.Л.Полякова, 1996), на ферментоактивную зону НМС скелетных мышц взрослой (В.В.Шилкин и В.И.Филимонов, 1996, 1997; В.И.Филимонов, 1998) и растущей белой крысы (Н.Е.Сабельников, 2000) свидетельствуют о перспективности расширения исследований нейромышечного синапса при элективной денервации мышцы.

Вероятно, отсутствие современных исследований влияния деаффе-рентации на нейромышечный синапс скелетной мышцы объясняется с одной стороны широко известными данными о незначительности изменений структур двигательного окончания после хирургической деафферентации (В.Б.Потапова, 1965; Р.П.Женевская и Б.В.Потапова, 1965; Р.П.Женевская, 1974; S.S.Tower, 1932), с другой - сложившимся у исследователей мнением о влиянии капсаицина, используемого для химической деафферентации, на мелкие нейроциты чувствительных ганглиев.

Целью настоящего исследования явилось установление влияния химической деафферентации на преобразования ферментоактивной зоны нейромышечного синапса скелетной мышцы белой крысы на протяжении первого полугодия постнатальной жизни.

Конкретными задачами исследования явились:

1. Сравнительный анализ качественной и морфометрической характеристики нейроцитов чувствительных узлов крестцовых спинномозговых нервов у интактных и подопытных животных после разового неонатального подкожного введения капсаицина или «наполнителя».

2. Установление нормативной характеристики ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса икроножной мышцы в различные периоды постнатальной жизни белой крысы.

3. Изучение качественной и морфометрической характеристики ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса икроножной мышцы в различные периоды постнатальной жизни белой крысы после разового подкожного неонатального введения капсаицина.

4. Изучение качественной и морфометрической характеристики ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса икроножной мышцы в различные периоды постнатальной жизни белой крысы после разового подкожного введения «наполнителя».

5. Сравнительный анализ развития ХЭ-позитивной зоны НМС икроножной мышцы и ее состояния в различные периоды постнатальной жизни интактных и подопытных животных в целях обоснования влияния химической деафферентации на морфо-функциональную характеристику НМС.

Для достижения деафферентации животным на вторые сутки после рождения подкожно вводили смесь, состоящую из 8 частей физиологического раствора, 1 части спирта и 1 части Твин-80. В подготовленной смеси «наполнителя» растворяли необходимое для достижения 10% концентрации количество капсаицина. Каждому крысенку вводился определенный объем конечной смеси, обеспечивающий получение 100 мг капсаицина на 1 кг массы. Это соответствовало наиболее часто употребляемой в других исследованиях дозе (Levine et al., 1990; Mi one et al., 1992).

Объектом исследования явилась икроножная мышца 103 белых крыс, которая с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минвуза СССР от 13. 11. 1984 г. №724), забиралась в конкретном возрасте животного в каждом из следующих периодов: ранний молочный период (4, 5 суток после рождения); средний молочный период (10, 14 суток после рождения), поздний молочный период (30 суток после рождения); предпубертатный период (60 суток после рождения); пубертатный период (90 суток после рождения); репродуктивный период (180 суток после рождения) у интактных животных (39 крыс), после неонатального разового подкожного введения капсаицина (34 крыс) и после неонатального разового подкожного введения «наполнителя» (24 крыс). Кроме того, исследовался материал, взятый у шести 1 и 3-суточных интактных крысят.

Выбор объекта исследования связан с возможностями сравнения результатов проводимого исследования с результатами работ сотрудников кафедры анатомии человека Ярославской государственной медицинской академии по исследованию влияния на нейромышечный синапс икроножной мышцы различных воздействий (В.И.Филимонов, 1992, 1998). Для обоснования достигнутой деафферентации потребовалось исследование нейроцитов чувствительных ганглиев 1 - 3 крестцовых спинномозговых нервов, принимающих участие в формировании седалищного нерва крысы, в указанные выше периоды постнатальной жизни у интактных животных, после введения капсаицина и «наполнителя».

На свободноплавающих срезах ганглия и мышцы методом с тиоук-сусной кислотой в модификации (Г.М.Николаев, В.В.Шилкин, 1983) определяли активность холинэстеразы. Оценку результатов гистохимической реакции проводили по характеристике топографии, выраженности ферментативной активности, а также по мерным параметрам, полученным на основе прямого и непрямого морфометрического исследования.

Статистическая обработка цифрового материала включала нахождение средних значений мерных параметров (X), коэффициента репрезентативности (Sx), t - критерия Стыодента для суждения о достоверности средних значений и разницы между средними. Статистический анализ проведен с использованием стандартных программ «Эксель-98».

Сопоставление результатов исследования нейроцитов ганглиев крестцовых спинномозговых нервов выявило характерные черты возрастных преобразований чувствительных клеток

- у интактных животных,

- у подопытных животных, перенесших в 2-суточном возрасте инъекцию раствора капсаицина с наполнителем,

- у подопытных животных, перенесших в 2-суточном возрасте инъекцию раствора наполнителя без капсаицина, что позволило решить вопрос о специфичности токсического действия капсаицина на чувствительные нейроциты в проводимых экспериментах и степени, при наличии таковой, деафферентации.

На основе анализа качественных и морфометрических характеристик доказано, что введение капсаицина приводит к выраженным изменениям нейроцитов ганглиев крестцовых спинномозговых нервов.

Развертывание дистрофического процесса в различных по размерам нейроцитах, значительное число нейроцитов различных размерных классов с явлениями деструкции, изменение количественного состава семи размерных классов доказывают гибель части нейроцитов спинномозговых ганглиев после введения капсаицина и формирование деафферентации мышц задней конечности белой крысы.

Исследование ХЭ-позитивной зоны НМС икроножной мышцы интактных и подопытных животных позволило выявить этапность развития ферментоактивной зоны нейромышечного синапса икроножной мышцы в каждой исследуемой группе и установить существенные признаки, характеризующие нарушение постнатального развития ферментоактивной зоны у деафферентированных животных.

Доказано, что деафферентация приводит к задержке роста диаметра мышечных волокон, но ускоренному развитию ХЭ-позитивной зоны, претерпевающей выраженные дистрофические изменения в двухмесячном возрасте и последующее восстановление морфометрических параметров ферментоакгивной зоны к шестимесячному возрасту. Качественные особенности ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса в этом возрасте, наличие необычных конструкций ферментоактивной зоны свидетельствуют о формировании новой по гистохимической характеристике совокупности нейромышечных синапсов в деафферентированной икроножной мышце.

Результаты исследования являются оригинальными в части, касающейся характеристики нейроцитов чувствительных узлов крестцовых спинномозговых нервов, и, в особенности, в части, доказывающей влияние деафферентации на развитие ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса икроножной мышцы. Принципиально новой является характеристика ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса с 1 по 14 сутки постна-тальной жизни, обоснование сроков достижения ХЭ-позитивной зоной дефинитивного состояния у интактных животных.

Учитывая доказанность трофического влияния афферентного нейрона на мышцу (Т.А.Григорьева и В.П.Потапова, 1962; Р.П.Женевская, 1962, 1963, 1974; В.П.Потапова, 1966), выявление закономерностей реакции нейромышечного синапса на деафферентацию мышцы представляет интерес с позиций нейро-нейрональных и нейро-тканевых отношений и восполняет существенный пробел в современной нейроморфологии, физиологии и неврологии.

Результаты проведенной работы рекомендуются к внедрению в учебный процесс на кафедрах анатомии и физиологии высших учебных заведений.

11

Положения, выносимые на защиту:

1. Неонатальное разовое подкожное введение капсаицина приводит к гибели нейроцитов различных размерных классов в чувствительных узлах крестцовых спинномозговых нервов.

2. Деафферентация икроножной мышцы белой крысы приводит к нарушению развития в ней ХЭ-позитивной зоны нейромышечно-го синапса.

3. Деафферентация икроножной мышцы белой крысы вызывает временную задержку роста диаметра мышечных волокон и ускоренное развитие в ней ХЭ-позитивной зоны нейромышечных синапсов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Одним из революционных событий в биологии и медицине 20 века явились обоснование и победа нейронной теории, установление основных механизмов передачи нервного импульса на исполнительный орган, положений об адаптационно-трофической функции нервной системы.

Сопоставление выявленных в условиях эксперимента и патологии изменений в нервной клетке, ее отростках, рецепторных и эффекторных аппаратах позволило создать классификацию морфологических и морфо-функциональных проявлений реакции структур периферической нервной системы на действие различных факторов (А.И.Струков, С.К.Лапин, 1956; Н.Е.Ярыгин, 1957; А.И.Струков, Н.Е.Ярыгин, С.К.Лапин, 1960; В.В.Куприянов, 1962; Е.К.Плечкова, 1963; Н.Е.Ярыгин, Г.М. Николаев, 1963; 1967; Н.Е.Ярыгин, В.Н.Ярыгин, 1973, В.В.Шилкин, В.И.Филимонов, 1997).

В связи с запросами практической и теоретической медицины, определенное внимание исследователей было направлено на изучение реакции двигательного окончания скелетной мускулатуры при различных видах денервации - смешанной, чувствительной, симпатической.

Анализ результатов, полученных импрегнационными методиками, показал, что после смешанной денервации мышцы изменения аксонов мотонейронов, их ветвлений и терминалей однотипны и характеризуются в начальной фазе нарушением аргентофилии, неравномерностью диаметра, узурацией, а в последующем - зернисто-глыбчатым распадом аксона, формированием на месте нервного волокна бюнгеровских лент.

Световая микроскопия констатирует после денервации мышцы полное исчезновение терминалей, увеличение ядер подошвы, их пикноз и краевое стояние (Г.Н.Орлова, 1953; Л.И.Фалин, 1954; Б.С.Дойников, 1955;

З.А.Скударнова, 1964, Р.П.Женевская, 1974, О.М.Поздняков, 1980; К.Е.Си-сабеков,1989; Воеске, 1912; Stohr, 1928; Miledi, Slater, 1970).

Электронно-микроскопические исследования О.М.Позднякова (1972), Г.Н.Крыжановского с соавт. (1974), Reger (1957, 1959), Csillik and Knyihar (1968) показали, что после пересечения нерва изменения, прежде всего, развиваются в пресинаптическом аппарате нейромышечного синапса и в меньшей степени - в его постсинаптической части.

Биохимические исследования установили уменьшение ацетилхоли-нэстеразной активности в области нейромышечного синапса денервиро-ванной мышцы (Brzin and Majcen-Tkacev, 1963; Guth et al.,1966), что, вероятно, и объясняет развитие гиперчувствительности денервированной мышцы к ацетилхолину и другим химическим веществам, отмеченной А.Г.Гинецинским (1923), А.Г.Гинецинским, Н.М.Шамариной (1942), Cannon, Rosenblueth (1951).

Гистохимически выявляемая ХЭ-позитивная зона нейромышечного синапса скелетных мышц после их смешенной денервации у различных авторов описывается неодинаково.

В первые дни денервационного процесса большинство авторов не отмечают выраженных изменений ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса денервированной мышцы (Г.М.Николаев, 1976; В.И.Филимонов, 1992; Coers, 1953, 1967; Savay a. Csillik, 1954, 1955), что подтверждается и электронно-микроскопической гистохимией (О.М.Поздняков, 1972; Csillik a. Knyihar, 1968).

В последующем ХЭ-позитивная зона нейромышечного синапса денервированной мышцы претерпевает существенные изменения: снижается выявляемая ферментативная активность, отмечается фрагментация зоны (Savay a. Csillik, 1955), уменьшается ее площадь (Kupfer, 1951).

В.В.Шилкин с соавт. (1990), В.И.Филимонов (1992, 1998) считают, что в первой фазе денервационного периода преобразования ферментоактивной зоны нейромышечного синапса денервированной мышцы характеризуются неспецифическими изменениями, проявляющимися неравномерным утолщением и слиянием трабекул ХЭ-позитивной зоны НМС, редукцией ферментонегативной зоны, увеличением доли ФАЗ на площади НМС, округлением площади сечения двигательного окончания. Позднее в области нейромышечного синапса снижается активность ХЭ, наблюдается истончение, фрагментация и редукция трабекул. В области нейромышечного синапса и в самой мышце меняются тинкториальные свойства, вследствие чего конечный продукт реакции выявления активности холинэстеразы с тиоуксусной кислотой в области НМС имеет гранулярный характер, а поблизости от области нейромышечного синапса обнаруживается внесинаптическая активность фермента.

Последняя обнаруживается во внутриутробном периоде (Т.В.Мжаванадзе, 1969, 1970; Zelena and Szentagothai, 1957), в ранние сроки постнатального онтогенеза (С.Х.Епхиева, 1973; Н.П.Резвяков, 1982; Gautron, 1982), при возрастной инволюции ферментоактивной зоны НМС (В.И.Филимонов, 1992; Н.Е.Сабельников, 2000), при деструктивных процессах в периферической нервной системе, влекущих дефицит соматической и автономной иннервации мышцы (В.И.Филимонов, 1992, 1998; В.В.Шилкин, В.И.Филимонов, 1994, 1997; Н.Е.Сабельников, 2000).

Уменьшение числа выявляемых ферментоактивных зон, уменьшение совокупной площади ФАЗ, приходящихся на одно мышечное волокно, свидетельствуют, по мнению исследователей, о деструкции и элиминации части НМС зоны после смешанной денервации. В.И.Филимонов (1992), считает, что полного исчезновения активности холинэстеразы в области НМС денервированной мышцы на протяжении пятимесячного постденер-вационного периода не отмечается. Это совпадает с гистохимическими данными Savay, Csillik (1954, 1955) и результатами электронной гистохимии (Yoshihara et al., 1991).

Как видно, изменения нейромышечного синапса после смешанной денервации мышцы описаны с достаточной полнотой.

Сравнение исходов смешанной денервации путем пересечения или иссечения нерва с результатами пересечения вентральных корешков спинномозговых нервов позволяет придти к заключению, что существенным следствием деэфферентации является атрофия мышечных волокон, увеличение соединительнотканных прослоек и отсутствие воспалительных изменений (К.И.Кунстман и Л.А.Шендеров, 1932; П.С.Канашенок, 1954; Л.В.Сложеникина, 1957; С.Е.Северин, 1957; Р.П.Женевская, 1960, Н.Н.Зайко с соавт., 1988, В.И.Филимонов, 1998).

Сопоставление выраженности атрофии мышечных волокон денерви-рованной мышцы и мерных параметров области их НМС позволило В.В.Шилкину и В.И.Филимонову (1996) сформулировать положение о прямой корреляционной связи формы НМС и диаметра мышечного волокна при нарушении нервных связей мышцы с мотонейроном.

В меньшей степени изучено состояние нейромышечного синапса при элективном нарушении симпатической или афферентной иннервации.

История учения о влиянии симпатической нервной системы на скелетную мышцу с достаточной полнотой представлена в лекциях JI.A. Ор-бели (1935, издание второе), в которых он отдает должное И.П.Павлову, понимающего под иннервацией не только регуляцию деятельности сердца, но и «повышение жизненных свойств сердечной мышцы» (1886), а позднее (1920) обосновавшему термин «трофическая иннервация», под которой понимал «регуляцию интимных химических превращений и обмена материала между тканью и окружающей средой» (цитируется по Л.А.Орбели, 1935). Здесь же автор лекций приводит обоснование учения об адаптационной и трофической функции вегетативной нервной системы в целом и симпатической нервной системы -в частности. Подтверждение своих взглядов Л.А.Орбели находит в данных о прямой иннервации скелетной мускулатуры симпатическими нервами.

Мнение сторонников двойной иннервации мышцы, т.е. о прямой ее иннервации симпатическими нервами, базируется на обнаружении морфологами добавочного (акцессорного) безмиелинового волокна, окончание которого находилось вблизи основного двигательного окончания (Воеске, 1912). В последующем наличие такого волокна неоднократно подтверждалось, и часть исследователей до недавнего времени допускали возможность симпатической иннервации скелетной мышцы (Т.Н.Радостина, 1949, И.Ф.Иванов, 1958; А.К.Ковешникова, 1954; Ю.М.Жаботинский, 1965;

A.Г.Кнорре и И.Д.Лев, 1977).

В опытах других авторов указывается на отсутствие акцессорных волокон (А.А.Клишов, 1960; В.А.Говорын, 1965, 1967, 1982; Н.П.Резвяков, 1973), что не исключает множественности иннервации мышечного волокна за счет разрастания нервных терминалей и формирования полинейрональ-ной и полиаксональной его иннервации. Разрастание терминалей, описываемое в работах 50-60 годов настоящего столетия как феномен раздражения, избыточного роста, в современной литературе именуется спраутин-гом, наличие которого отмечается в процессе постнатальной жизни и в патологии (О.П.Балезина, 1989; В.И.Филимонов, 1998; J.Tomasi et.al., 1990;

B.Pachter, A.Eberstein,1992; M.Kawabuchi, T.Kosaka, 1993; A.Connold, G.Vrbova, 1994), как проявление пластичности аксона и двигательного нервного окончания (A.Herrera, M.Werle, 1990; S.Hiruma et.al., 1990; G.Bewick, D.Tonge, 1991).

Парадоксально, но факт, что стремление Л.А. Орбели обосновать адаптационно-трофическое влияние симпатической нервной системы обязательным присутствием симпатического волокна, не оправдалось на примере инкапсулированных нервных окончаний языка, где добавочное чувствительное Тимофеевское волокно ошибочно принималось за акцессорное симпатическое, но в полной мере было подтверждено современными исследованиями влияния вегетативной нервной системы на чувствительные окончания сосудистых рефлексогенных зон (А.О.Навакатикян, 1951, 1955, 1956; П.К.Анохин, 1952; Е.П.Анюховский, Ф.П.Ясиновская, 1977; Liljestrand, 1953; Diamond, 1955; Ellison, 1971; Myers, 1977), где постганг-лионарные вегетативные проводники являются постоянным атрибутом (Е.Б.Хайсман, Н.Б.Лаврентьева, 1964; Е.К.Плечкова, А.В.Бородуля, 1971, 1973; Е.Б.Хайсман, 1974; В.В.Шилкин, 1981; Knoche a. Kienecker, 1977).

Отсутствие самостоятельных симпатических нервных окончаний на мышечных волокнах не исключает влияние симпатической нервной системы на мышцу за счет диффузии медиатора, выделяемого симпатическими нервами кровеносных сосудов, что и объясняет длительный латентный период эффекта Орбели-Гинецинского, подтверждаемый другими исследователями (А.В.Лебединский, Н.И Михельсон, 1947; А.В.Лебединский, Н.Г.Саввин, 1947; Я.Б.Лехман, 1956). Эта точка зрения близка к высказанному еще в двадцатые годы Л.А.Орбели (1935) мнению, что адапатацион-но-трофическое влияние симпатикуса на мышцу осуществляется через изменение обменных процессов в ней и через действие на нейромоторный аппарат, что получило развитие в современных представлениях о "неме-диаторном" эффекте ацетилхолина и катехоламинов (Н.Н.Демин, 1961, 1966; Н.И.Гращенков, 1963; С.Е.Северин, 1963; А.В.Тонких, 1968; М.Я.Михельсон, Э.В.Зеймаль, 1970; В.Н.Швалев, 1971; Г.Н.Крыжа-новский, 1973; О.В.Волкова, 1978; Н.Н.Зайко, 1978).

О.М.Виноградов (1969) полагает, что сущность влияния симпатического нерва на скелетную мышцу состоит в изменении мембранного потенциала концевой пластинки и мышечного волокна, Е.М.Волков и Г.И.Полетаев (1982) объясняют нейротрофическое влияние симпатических нервов на мышечное волокно их действием на соматические нервы, которые, по мнению ряда исследователей (Я.Б.Лехман, 1956; Р.П.Женевская,

1961, И.Ф.Иванов, 1961; Ю.М.Жаботинский, 1965, И.А.Аршавский, 1970; О.В.Волкова, 1978) обеспечивают в свою очередь нейротрофический контроль мышечной мембраны.

Интересно, что установленное физиологическими методами влияние симпатической нервной системы на мышцу не удается в полной мере подтвердить другими методами. Так, исследования гомогенатов мышц после симпатэктомии показало отсутствие биохимических изменений мышечных белков (Н.А.Куценко, Г.А.Нечаева, 1953; Л.В.Сложеникина, 1957; И.И. Иванов, В.А.Юрьев, 1961; В.А.Говырин, 1967), а гистологические исследования не обнаруживают выраженных изменений мышечных волокон (В.Б.Потапова, 1965; Р.П.Женевская, 1974; S.S.Tower, 1932).

Данные, свидетельствующие о структурных изменениях нейромышечного синапса вследствие десимпатизации, в литературе отсутствуют. В то же время, в настоящее время появились публикации о структурных изменениях после химической десимпатизации в миелинизированных волокнах различных нервов (В.М.Чучков, 1989, 1991; И.А.Исаева, 1991; С.Л.Гомоюнова, 1994; С.П.Селякин, 1994; О.Л.Полякова, 1996), а гистохимические исследования ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса (В.В.Шилкин, В.И.Филимонов, 1996, 1997; В.И.Филимонов, 1998) доказывают, что после десимпатизации наблюдается формирование окончаний гроздьевидной формы, гипертрофия и гиперплазия двигательных окончаний без изменения размеров мышечного волокна.

Существенным образом химическая десимпатизация сказывается на процессах деструкции и регенерации нервных волокон (С.П.Селякин, 1992, 1994), гистохимической характеристике нейромышечного синапса после повреждения нерва и его регенерации (В.В.Шилкин, В.И. Филимонов, 1996), после чрезмерной физической нагрузки (Н.Е.Сабельников, 2000).

Вероятно, только с внедрением химических методов десимпатизации, с использованием возможностей гистохимических и электронномикроскопических методов исследования, с привлечением моделирования необычных ситуаций, будет реальным решение вопроса о влиянии симпатической нервной системы на структурную характеристику не только нервных проводников и нейромышечного синапса. При этом, очевидно, следует учитывать, что полная несостоятельность компенсаторных реакций десимпатизированных животных проявляется в критических ситуациях, а не в обычных условиях научной лаборатории (Cannon et al.,1929).

Не может не привлекать внимания исследователей и реакция нейромышечного синапса на выключение чувствительной иннервации мышцы.

Важность чувствительного нейрона состоит не только в том, что афферентная часть рефлекторной дуги обеспечивает передачу в центры информации о состоянии опорно-двигательного аппарата. Чувствительный нейрон играет свою роль в установлении единства животного организма с окружающей средой, а также в интегрировании его частей в целостную живую систему, в сохранении структуры тканей и в достижении определенной высоты их дифференцированное™ в процессе регенерации (И.Д.Хлопина, 1957). Разнообразие функционального предназначения чувствительного нейроцита предопределяется и тем его свойством, которое издавна определяется в литературе как трофическая функция, реализуемая через влияние нервной системы на обменные процессы иннервируемого органа (И.П.Павлов, 1922; А.Г.Гинецинский, 1923; Л.А.Орбели, 1923). Исследования последних лет позволяют считать, что афферентные нейроци-ты участвуют и в трофическом контроле нервных структур: Н.Г.Колосов (1974), А.А.Милохин (1967) доказали чувствительную иннервацию нервных ганглиев, а Г.Н.Акоев и Н.И.Чалисова (1997) при культивировании спинномозговых узлов выделили низкомолекулярный белок, оказывающий нейростимулирующее влияние.

Обычно, влияние чувствительного нейроцита на структурные изменения в тканях и органах изучалось на различных моделях их денервации, иногда без учета системной принадлежности повреждаемых нервных волокон. Так при пересечении соматических нервов повреждались соматические двигательные, симпатические постганглионарные и чувствительные проводники; при пересечении блуждающего нерва набор пересекаемых нервных проводников зависел от уровня невротомии, но в чистом виде проведение вагальной деафферентации практически невозможно; после экстирпации чувствительных узлов спинномозговых нервов не исключалось, особенно у мелких животных, повреждение двигательных проводников вентрального корешка; пересечение дорсального корешка спинномозгового нерва моделирует уникальную ситуацию деафферентации с сохранением трофических центров рецепторов.

Независимо от этого, анализ экспериментального материала позволил установить, что нарушение чувствительного звена рефлекторной дуги (экстирпация чувствительных узлов спинномозговых и черепных нервов, дорсальная ризотомия) вызывает в денервированных тканях типичный комплекс изменений, сходных с воспалительным процессом - гиперемия и отек, лейкоцитарная инфильтрация, повышение фагоцитарной активности и неспецифических функций клеток, потеря тканью типичной структуры, деструкция тканевых элементов - но отсутствующий при других видах денервации. Эти изменения описаны как следствие деафферентации во многих органах как проявление нейродистрофического процесса: в органах пищеварения (Е.А.Корытный, 1953, 1958, 1964; Е.С.Святенко, 1954; В.А.Титкова, 1962; Т.А.Григорьева, В.Б.Потапова, 1962; М.Д.Зайденберг, 1963; С.М.Павленко, 1971; А.Ю.Цибулевский, 1975) в органах дыхания (М.С.Грачева, 1953; Ю.К.Елецкий, 1960; А.Ф.Никифоров, 1973) в железах (А.М.Грацианская, 1954; А.В.Зеленин, 1957; И.Г.Акмаев, 1959, 1962; В.Б.Потапова, 1966; A.M.Астахова, 1967; Н.С.Миловидова, 1971, 1974; О.В.Волкова, 1973; О.К.Милостов, 1974), в селезенке

Э.М.Коган, 1954), в сердце (М.Г.Заикина, 1961, 1963; И.А.Червова, 1960, 1966; З.И.Собиева, 1970).

Оценивая изменения, обнаруживаемые в деафферентированных тканях, Т.А.Григорьева (1958) описывает «денервационный феномен», существенным проявлением которого является наличие признаков хронического асептического воспаления в его первой деструктивной фазе и длительно текущий репаративный период. Исследования О .Я Острого, З.И.Со-биевой (1961, 1963), А.Ф.Никифорова (1963,1973) доказывают, что нарушение афферентной иннервации сопровождается антигенными нарушениями, приводящими к повышению содержания в крови аутоантител де-афферентированного органа.

Исследованию деафферентированной скелетной мышцы уделялось меньшее внимание.

Начальная реакция мышцы на деафферентацию, наблюдаемая уже в первые часы после операции, впервые описана, очевидно, Я.А.Дедюлиным (1865), который отмечал в деафферентированной мышце расширение мелких сосудов и капилляров, пристеночное стояние нейтро-фильных лейкоцитов.

В скелетных мышцах деафферентированной конечности кошки после перерезки чувствительных проводников, по данным В.А.Титковой (1962), возникает дегенерация мышечного волокна на фоне лейкоцитарной инфильтрации с последующим образованием миобластов и мышечных почек. Появление молодых форм - миобластов и миосимпластов - отмечали после деафферентации мышц Р.П.Женевская (1962), Т.А.Григорьева и В.Б.Потапова (1962), В.Б.Потапова (1965).

В некоторых исследованиях деафферентация достигалась пересечением дорсальных корешков спинномозговых нервов у белой крысы, кошки, собаки. Такая деафферентация вызывает в мышце очаговый воспалительный процесс, атрофию и дегенерацию участков мышечных волокон

В.В.Александрович, П.А.Вербалович, 1950; И.А.Разумова. 1955; И.В.Скородумова, 1958; Л.Я.Данилова, Н.К.Симеонова, 1978).

Подробно последствия деафферентации задней конечности белой крысы представлены в работах Р.П.Женевской (1961, 1962, 1963) По ее данным, операция иссечения чувствительных корешков спинномозговых нервов не влечет нарушения сократительной функции икроножной мышцы, но вызывает в ней гиперемию, выраженный отек, нарастание воспалительной реакции с лейкоцитарной инфильтрацией, появление признаков возбуждения мышечного волокна (увеличение числа ядер и ядрышек, изменение формы ядер на округлую). В то же время, после удаления спинномозговых ганглиев у крысы наблюдалось ограничение движений деаф-ферентированной конечности, снижение массы икроножной мышцы, ее жировое перерождение, повышение порога раздражения нерва и прямого раздражения мышцы (Р.П.Женевская, 1974). Возможно, отмеченное автором нарушение двигательной активности после ганглиоэктомии у крыс свидетельствует о повреждении и вентрального корешка, содержащего аксоны мотонейронов вентральных рогов серого вещества спинного мозга. На возможность такого повреждения указывает В.И.Филимонов (1998).

Как видно, вследствие различных видов деафферентации, в мышце развивается в принципе однотипный процесс, сходный со структурными изменениями в других деафферентированных органах. Вместе с тем, в деафферентированной скелетной мышце установлено снижение активности ферментов тканевого дыхания, содержания адениннуклеотидов, в основном за счет АТФ, а также нарушение адаптации деафферентированной мышцы к стрессовым ситуациям, например - к общему охлаждению организма (Л.Я.Данилова, Н.К.Симеонова, 1978).

К сожалению, несмотря на имеющиеся указания (Г.Н.Крыжа-новский, 1958, 1970) о важности афферентных влияний для нормализации трофических нарушений нервно-мышечного аппарата, описания состояния двигательного окончания в деафферентированной мышце весьма скудны.

Tawer (1935) после удаления у кошки спинномозговых ганглиев, иннервирующих переднюю конечность, не обнаружил изменений в экст-рафузальных мышечных волокнах, хотя состояние деафферентации мышцы было подтверждено изменением интрафузальных волокон, входящих в состав мышечных веретен. Р.П.Женевская (1974) отмечает, что в деафферентированной мышце двигательные окончания существенно не изменяются. Barker et al. (1966), Ambrogini et al. (1992) после удаления спинномозговых узлов описывают в деафферентированной мышце спраутинг аксонов мотонейронов.

В последние годы в целях элективного выключения афферентного звена рефлекторной дуги применяется химическая деафферентация, позволяющая избежать порой непредсказуемых последствий оперативного вмешательства, связанного с ганглиоэктомией, невротомией, ризотомией.

Для достижения деафферентации химическим путем применяется капсаицин - алкалоид растительного происхождения, обладающий высокоизбирательным возбуждающим действием на чувствительный нейроцит (Hu-Tsai-M, Winter--J., Woolf-CJ, 1992), способствуя выбросу из С-проводников вещества Р (Н.А.Махорт, 1993; Pohl, Benoliel et al., 1990; Mione et al., 1992;Hiura,2000; Smith et al., 2000). При этом при низкой концентрации капсаицина изменения С-волокон обратимы.

Winter, Evison et al. (1992) отмечают возможность восстановления поврежденных капсаицином нейроцитов спинномозговых узлов, но не отходящих от них С-волокон.

Часть исследователей находят признаки повреждения капсаицином не только С-волокон и мелких нейроцитов. Longhurst et al. (1984) обнаружили повреждение в чревных нервах А-афферентов, a Watanabe, Kavada, Iwai (1988), Zhon at. al. (1990) - пептидергических нейроцитов, оказывающих модулирующее влияние на реакции эфферентов поджелудочной железы, надпочечников и печени или регулирующих углеводный обмен (В.К.Спиридонов, 1994; Lautt, 1980). По данным С.А.Субраковой с соавт. (1991), подкожное неонатальное введение капсаицина приводит к разрушению вещество Р - ергических нервных волокон, принимающих участие в иннервации вкусовых сосочков.

Bevan, Szolcsanyi (1990) считают, что капсаицин избирательно действует на чувствительный нейрон, вызывая стабильное увеличение ионов Са+ в популяции нейронов спинномозговых ганглиев у крысы.

Как явствует из обзора, изучению подвергались вопросы механизма действия капсаицина на афференты, функционального значения капсаицин чувствительных афферентных нейронов, механизмов активации различных видов чувствительности. Выделение группы капсаицин чувствительных С-афферентов послужило основанием для сложившегося мнения о повреждении капсаицином только мелких нейроцитов спинномозговых ганглиев, хотя C.Wu (1996) после неонатального введения капсаицина выявил изменения метаболической активности нейроцитов соматосенсорных тригиме-нальных ядер, а другие исследователи отмечают после неонатального введения капсаицина нарушение энзимохимической характеристики и структуры нейроцитов различных классов не только в чувствительных узлах спинномозговых нервов, но и в каудальном узле блуждающего нерва, три-геминальном узле, в нейроцитах интрамуральных ганглиев желудка и двенадцатиперстной кишки (В.В.Шилкин, Т.А.Румянцева, В.В. Филимонов, Т.Р.Ковригина, О.Б.Воробьева, 1999). В связи со скудностью характеристики самих чувствительных нейроцитов после неонатального введения капсаицина, исследование состояния органов и тканей у деафферентиро-ванных с помощью капсаицина животных является задачей будущего и требует подтверждения достигнутой деафферентации, выраженность которой зависит от вводимой дозы алкалоида (S.McMahon et.al., 1991), време

25 ни, прошедшего после его введения, конкретного ганглия, нейроны которого обеспечивают чувствительную иннервацию изучаемого органа (В.В.Шилкин, Т.А.Румянцева с соавт., 1999).

Таким образом, анализ литературы показывает, что влияние хирургической деафферентации на состояние нейромышечного синапса практически не изучено, а исследование влияния на него химической деафферентации даже не начиналось. Учитывая доказанность трофического влияния афферентного нейрона на мышцу, выявление закономерностей реакции нейромышечного синапса на деафферентацию представляет существенный интерес с позиций нейро-нерональных и нейро-тканевых отношений и может восполнить существенный пробел в современной нейроморфологии.

И. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 103 белых крысах, которые распределялись по сериям следующим образом:

Таблица 1

Количественная характеристика материала

Серия Опытов Возраст (сутки) Всего

1 3 4 5 10 14 30 60 90 180

Возрастная норма п J л j Я j 3 3 6 6 6 6 6 45

Деафферен-тация - - 3 3 3 5 5 5 5 5 34

Контроль с наполнителем - - 3 3 J 3 3 3 3 3 24

ИТОГО л J 3 9 9 9 14 14 14 14 14 103

Объектом исследования служила икроножная мышца, являвшаяся тест-объектом в работах сотрудников кафедры анатомии человека Ярославской государственной медицинской академии по исследованию влияния на нейромышечный синапс различных воздействий (В.И.Филимонов, 1992; В.В.Шилкин, В.И.Филимонов, 1997; В.И.Филимонов, 1998).

Для сопоставления динамики развития и характеристики нейромы-шечного синапса икроножной мышцы с изменениями в чувствительных ганглиях спинномозговых нервов исследованию подвергались также ней-роциты Si-S3 ганглиев крестцовых спинномозговых нервов, участвующих в формировании седалищного нерва белой крысы.

Как видно из таблицы 1, сроки выведения животных из-под наблюдения совпадали с периодом прогрессивного роста белой крысы и определенными функциональными характеристиками животного в постнаталь-ном онтогенезе (В.И.Махинько, В.Н.НикитинД975):

- ранний молочный период - 1,2,4,5 сутки (слепые крысята);

- средний молочный период - 10, 14 сутки (до и после открытия глаз);

- поздний молочный период - 30 сутки

- предпубертатный период - 60 сутки;

- пубертатный период - 90 сутки;

- репродуктивный период - 180 сутки.

Для достижения эффекта деафферентации животным на вторые сутки после рождения внутримышечно вводили смесь, состоящую из 1 части спирта, 1 части Твин-80, 8 частей физиологического раствора, в которой растворялось необходимое для достижения 10% концентрации количество капсаицина. Каждому крысенку вводился определенный объем конечной смеси, обеспечивающий получение 100 мг капсаицина на 1 кг массы. Это соответствовало наиболее часто употребляемой в других исследованиях дозе (Levine et al., 1990; Mione et al., 1992).

Учитывая малое число крупных исследований по химической деафферентации, принадлежащих отечественным ученым, было проведено контрольное исследование по изучению действия на нейромышечный синапс и афферентные нейроциты смеси указанных выше инградиентов (наполнителя) без действующего начала - капсаицина.

Особое значение при обработке мышцы и ганглия придавали соблюдению идентичности и стандартности условий эксперимента, выведения животных из опыта («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных»; Приказ Минвуза СССР от 13. 11. 1984 г. №724), забора материала, проведения гистохимических реакций и приготовления препаратов, что во многом определяло воспроизводимость, сравнимость и объективность результатов исследования.

Чувствительные ганглии крестцовых спинномозговых нервов S1-3, медиальную головку икроножной мышцы иссекали и после фиксации в течение 18-20 часов в охлажденном 10% растворе ацетат-формола (рН 6,87,0) разлагали на замораживающем микротоме на срезы толщиной 20 мкм (срезы ганглия) и 40 мкм (срезы мышцы).

Активность холинэстеразы на свободноплавающих срезах ганглия и мышцы определяли методом с тиоуксусной кислотой в модификации (Г.М.Николаев, В.В.Шилкин, 1983). Учитывая различную выраженность активности холинэстеразы в объектах исследования в первое полугодие постнатальной жизни животного, кинетику гистохимической реакции, продолжительность инкубации срезов ганглиев, нейроциты которых обладали слабой активностью фермента, не превышала 60 минут, а срезов икроножной мышцы, активность холинэстеразы в области нейромышечных синапсов которой была значительно выше, - не более 45 минут.

Оценку результатов гистохимической реакции проводили по характеристике топог рафии, выраженности ферментативной активности, а также по мерным параметрам, полученным на основе морфометрического исследования по специальной программе (В.И.Филимонов, 1992) с добавлениями.

При описании нейроцитов крестцовых спинномозговых ганглиев качественные критерии предусматривали описание выраженности (показатель обратно пропорциональный времени инкубации срезов) активности ХЭ, характера конечного продукта реакции, его распределения и топографии, наличия признаков патологических изменений в нейроцитах (В.Н.Ярыгин, Н.Е.Ярыгин, 1973).

Описание качественных особенностей конструкции фермен-тоактивных. зон нейромышечных синапсов предусматривало оценку выраженности ферментативной активности (выраженность ферментативной активности обратно пропорциональна времени инкубации), характера конечного продукта реакции, распределения и топографии активности холинэ-стеразы, по качественным признакам нарушений конструкции ферменто-активных зон НМС, разработанным на кафедре анатомии человека Ярославской медицинской академии (В.В.Шилкин, В.И.Филимонов, 1997, 1995).

Объективизация результатов исследования достигалась количественным анализом выявленных ХЭ-позитивных зон, на основе прямой и непрямой морфометрии, проводимой на стандартной площади среза, ограниченной окулярной сеткой с 912 равноудаленными узлами пересечения (С.А.Салтыков, 1958, Г.Г.Автандилов, 1988). При стандартном увеличении микроскопа "Биолам" (бинокулярная насадка 1,5, объектив 40, окуляр 7) площадь сетки составляла 5061 мкм", площадь, соответствующая одному узлу пересечения линий - 55,5 мкм2, расстояние между линиями сетки -7,1 мкм.

Прямая морфометрия заключалась в получении информации прямым подсчетом на стандартной площади сечения: в ганглии - количества нормальных и измененных нейроцитов, в мышце - количества ферментоактивных зон, количества сложных и простых ферментоактивных зон, количества мышечных волокон. Кроме того, на срезах мышцы определялся диаметр мышечных волокон и располагающихся на них сечений НМС.

Непрямая морфометрия заключалась в получении первичных данных, характеризующих значения площади (количество узлов пересечения, падающих на сечение нейроцита, область НМС и его ферментоактивную зону) и периметра (число пересечений с линиями сетки контуров нейроцита, области НМС).

Значение площади определяли по формуле S = 55,5 X, где 55,5 - значение одного узла пересечения в мкм2, X - количество узлов пересечений, падающих на сечение нейроцита (его ядра), сечение области нейромышечного синапса, ферментоактивной зоны нейромышечного синапса.

Отношение площади сечения ферментоактивной зоны НМС к площади сечения области нейромышечного синапса, включающую и фермен-тонегативную зону, позволяло вычислить долю площади ФАЗ на площади НМС.

Значение периметра (длины контура) определяли по формуле

71.А

L= — Z, где ж - число л (3,1336666.), А - расстояние между линиями сетки в мкм, Z - число пересечений линий сетки с контуром исследуемого объекта.

Получение данных о площади и периметре объекта позволило определить значение его коэффициента окатанности, более известного как показатель формы или форм-фактор (Ff) - цифровое выражение формы, оп

4х ределяемое по формуле С.А.Салтыкова (1958): Ff =4, 51—, где 4,51 - расчетный коэффициент, х - количество узлов пересечений сетки, падающих на объект исследования, Z - количество пересечений линий сетки с контуром исследуемого объекта.

Значение Ff равно или близко к единице при круглой форме биологического объекта. Исходя из опыта определения Ff сечения нейромышечного синапса, в проведенном исследовании сечение НМС считались близкими к кругу (округлым) при значении Ff большим 0,70. При значении Ff= 0,70 или менее сечение НМС считали овальным (овоидным, вытянутым). При исследовании нейроцита его сечение признавали округлым при Ff > 0,8; при значении Ff = 0,8 или менее сечение нейроцита считали овальным.

На основе полученных значений площади сечения нейроцитов определяли содержание 7 их мерных классов. Количество классов рассчитывали по формуле: K = l + 3,321gп, где п - количество объектов исследования (Лакин Г.Ф. Биометрия.- М.: Высшая школа, 1980.- С.31).

Кроме первичных данных определяли интегральные показатели, характеризующие систему двигательное окончание - мышечное волокно. К таковым отнесены:

- отношение диаметра области нейромышечного синапса к диаметру мышечного волокна,

- количество выявленных НМС (ферментоактивных зон), приходящихся на одно волокно.

Статистическая обработка цифрового материала включала нахождение средних значений каждого параметра (X), коэффициента репрезентативности (Sx), t - критерия Стьюдента для суждения о достоверности средних значений и разницы между средними. Статистический анализ проведен с использованием стандартных программ «Эксель-98».

Фотографирование микрообъектов проводили на микроскопе ЛОМО МБ И-15 при объективе 10 и 40, окуляре 10 с использованием фотопленки Микрат 200 или Микрат 300 (Казань, Шостка). Отпечатки с негативов готовили при стандартной позиции увеличителя. Фотографии сканировали на Mustek 12000SP Plus и монтировали в блоки, обозначенные в работе как рисунки.

Принятые в тексте диссертации сокращения:

АХЭ - ацетилхолинэстераза,

MB - мышечное волокно,

НМС - нейромышечный синапс,

ФАЗ - ферментоактивная зона,

ФНЗ - ферментонеганивная зона,

ХЭ - холинэстераза.

III. ХАРАКТЕРИСТИКА НЕЙРОЦИТОВ КРЕСТЦОВЫХ СПИННОМОЗГОВЫХ ГАНГЛИЕВ В ПОСТНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ БЕЛОЙ КРЫСЫ

выводы

1. Неонатальное разовое подкожное введение капсаицина в дозе 100 мг/кг массы приводит к гибели значительного количества нейроцитов разных размерных классов в чувствительных узлах крестцовых спинномозговых нервов, принимающих участие в формировании седалищного нерва белой крысы.

2. В каждом из изученных периодов постнатальной жизни белой крысы выраженность изменений нейроцитов в крестцовых спинномозговых ганглиях после введения капсаицина превосходит естественные инво-лютивные и деструктивные изменения в них после неонатального введения «наполнителя».

3. Развитие ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса икроножной мышцы на протяжении первого полугодия постнатальной жизни интактных белых крыс характеризуется этапностью изменений качественных и морфометрических показателей. Существенные изменения топографии ферментативной активности в области нейромышечного синапса отмечены в раннем и среднем молочном периодах, изменения степени активности ХЭ - в позднем молочном и предпубертатном периодах. В пубертатном периоде по качественной и морфометрической характеристике ферментоактивную зону НМС икроножной мышцы интактных животных можно считать сформированной.

4. В шестимесячном возрасте (репродуктивный период) ХЭ-позитивная зона нейромышечного синапса икроножной мышцы характеризуется признаками дистрофических и регенераторных изменений, отражающих процесс возрастной инволюции структур нейромышечного синапса.

5. Химическая деафферентация мышц задней конечности приводит к нарушению развития ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса икроножной мышцы, что проявляется в раннем, по сравнению с интакт-ными животными, массовом появлении изолированных глобул ферментативной активности (пятисуточный возраст), признаков дифференци-ровки ферментоактивных зон на простые и сложные (десятисуточный возраст), развитии в них признаков дистрофии и деструкции (двухме

159 сячный возраст), а также компенсаторных регенераторных процессов (трехмесячный возраст). Характерным признаком реакции ХЭ-позитивной зоны на деафферентацию является обнаружение с раннего молочного периода постнатальной жизни белой крысы явления спрау-тинга.

6. Выявленные изменения ферментоактивной зоны нейромышечного синапса деафферентированной икроножной мышцы белой крысы обратимы: обнаруживаемые регенераторные изменения ведут к нормализации морфометрической характеристики ХЭ-позитивной зоны к шестимесячному возрасту.

7. Дистрофические, деструктивные и регенераторные изменения ХЭ-позитивной зоны нейромышечного синапса деафферентированной мышцы в целом отражают реакцию ферментоактивной зоны на действие повреждающего фактора. Специфичным следствием деафферентации и, возможно, нарушения нейротрофического контроля мышцы, является ускоренное развитие ХЭ-позитивной зоны на фоне замедления роста диаметра мышечных волокон икроножной мышцы, раннее наступление дистрофических изменений, которые компенсируются за счет регенераторных процессов, приводящих к формированию новой по качественной характеристике совокупности нейромышечных синапсов.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ